CN102226163B - 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102226163B CN102226163B CN201110161533A CN201110161533A CN102226163B CN 102226163 B CN102226163 B CN 102226163B CN 201110161533 A CN201110161533 A CN 201110161533A CN 201110161533 A CN201110161533 A CN 201110161533A CN 102226163 B CN102226163 B CN 102226163B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- salt
- clostridium acetobutylicum
- butanols
- inorganic
- nitrogen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 title claims abstract description 34
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 76
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 28
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- -1 nitrogenous compound Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 21
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 19
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 18
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 18
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 18
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 17
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 16
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 13
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 13
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 13
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 12
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 12
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 8
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 8
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 8
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 3
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 3
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 229920002522 Wood fibre Polymers 0.000 claims 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 24
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 22
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 10
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 10
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DNZWLJIKNWYXJP-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCCCO DNZWLJIKNWYXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 3
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 241000768750 Clostridium acetobutylicum DSM 1731 Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- HNBDQABBWNOTRU-UHFFFAOYSA-N thalline Chemical compound C1=CC=[Tl]C=C1 HNBDQABBWNOTRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，属于生物发酵技术领域。本发明的丙酮丁醇梭杆菌菌株分类命名为ClostridiumacetobutylicumBD518，其保藏登记号为CCTCCNO：M2010308。本发明通过连续培养驯化筛选得到一株高浓度丁醇耐受性菌株BD518，其丁醇耐受性达到了18g/L，比出发菌株（13g/L）提高了38.5%；以葡萄糖为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂和丁醇产量分别达到21.1g/L和13.2g/L，分别比出发菌株提高了16.6%和15.8%；其丁醇耐受性强，溶剂产量高，重复性好，具有重大的社会意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用，具体是通过连续培养装置连续培养驯化选育得到的耐高浓度丁醇量和高溶剂产量的丙酮丁醇梭杆菌菌株，以及该菌株发酵丁醇工业中的应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术
作为燃料，丁醇具有能量密度大，对水的稳定性高、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。丁醇又是重要的有机化工原料，广泛应用于油漆、表面涂料、皮革处理、塑料等领域。
丁醇的生产方法主要有乙醛缩合法，丙烯羰基合成法和发酵法。乙醛缩合法工艺流程长，收率低，成本较高，目前在国外已被淘汰；丙烯羰基合成法生产丁醇的原料为石化下游产品丙烯；随着石油价格飞涨和资源加速枯竭，发酵法生产丁醇受到了广泛的重视，逐渐成为生物能源的研究热点之一。
近年来，国内对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工程改造、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。丙酮丁醇工业发酵中溶剂对微生物细胞的毒性，是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所生产的丁醇、丙酮和乙醇三种溶剂中，丁醇是毒性最大的。当其浓度达到 13 g/L(Journal of Proteome Research2010, 9: 3046～3061)，利用梭菌C. acetobutylicum发酵就基本停止，造成低丁醇产量和低底物转化率。据分析，如果丁醇发酵的产物浓度由12 g/L 提高的19 g/L，产物分离的后续蒸馏成本将可降低一半(Curr Opin Biotechnol, 2008, 19(5): 420～429)。现有技术报道C. beijerinckii BA101 在MP2培养基以及发酵调控条件下的丁醇产物浓度可达到20.9 g/L（总溶剂为32.6 g/L），是目前报道的产溶剂最高的菌株。为了提高产溶剂梭菌本身的丁醇耐受性，Tomas 等（Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4951～4965）在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白的groESL基因，使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了85%，并最终使产物浓度提高了33%。Borden 等(Appl Environ Microbiol, 2007, 73(9): 3061～3068)在丙酮丁醇梭菌中过表达来源于基因组DNA 文库中筛选过程中确定的2个与丁醇耐受性相关的基因，即可使重组菌体细胞的丁醇耐受水平分别提高了13%和81%。中科院微生物研究院毛绍明等（Journal of Proteome Research2010, 9: 3046～3061）利用原生质体的方法以Clostridium acetobutylicum DSM 1731为出发菌株筛选出一株能够耐受19 g/L丁醇的突变株Rh8，通过发酵调控手段，单批发酵总溶剂产量为19.2 g/L。
可见，提高菌株的丁醇的耐受性是提高丙酮丁醇产量的重要手段之一，在丙酮-丁醇发酵工业中，起着至关重要的作用，而利用连续培养驯化菌种是提高丁醇耐受性，增强发酵竞争力的关键手段之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一株耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），使其相对于现有技术的产丁醇的丙酮丁醇梭菌而言具有丁醇耐受性极强、总溶剂产量极高的优势。
本发明要解决的技术问题之二在于提供所述耐高浓度丁醇的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）的应用方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一、本发明选育得到的一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，分类命名为Clostridium acetobutylicum BD 518，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010308。
本发明所述的高丁醇耐受丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518的筛选方法是：将丙酮丁醇梭菌出发菌株Clostridium acetobutylicum XY16（CCTCC NO：M 2010011）经连续培养驯化后，利用丁醇平板筛选得到丁醇耐受强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁醇比高和总溶剂产量高的丙酮丁醇梭菌目标菌株，即命名为Clostridium acetobutylicum BD 518。
其具体的筛选步骤如下：
a）连续培养驯化诱变：将丙酮丁醇梭菌原始菌株Clostridium acetobutylicum XY16（CCTCC NO：M 2010011）活化培养，即培养温度33～37℃，在25 mL 的肖特厌氧瓶装液量为10～15 mL，培养时间12～18 h，得到处于对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制连续培养装置中连续培养，接种量为5%～15%（v/v）。以葡萄糖为限制因子，在培养基中加入10～30mL/L正丁醇驯化600～1000 h，初步筛选到耐丁醇的丙酮丁醇梭菌菌株；
b）丁醇平板初筛：将连续培养装置（本发明人团队在先专利申请，专利申请公开号CN101709263A）中驯化筛选得到的菌液稀释至OD600=0.1～1.0涂布于含丁醇1.7%的培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36 h，挑选出10～50株单菌落；
c）丁醇平板复筛：将步骤b）筛选的菌株接种于25 mL 的肖特厌氧瓶装液量10 mL，充氮气2 min，33～37℃厌氧培养10～14 h，无菌生理盐水制成浓度OD=0.1的菌悬液，吸取2 μL点滴到含有丁醇1.7%的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～24 h，挑选菌落较大的菌株；
d）厌氧瓶发酵筛选：将步骤c）筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33～37℃，厌氧培养培养时间10～24 h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5%～15%（v/v），发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～80 h；考察步骤c）筛选出的菌落发酵产总溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出丁醇比和总溶剂产量最高的目标菌株，即命名为Clostridium acetobutylicum BD 518。
在上述筛选方法中：步骤a）中所述的连续培养驯化方法中，优选限制因子葡萄糖浓度为10～30g/L，驯化时间为600～1000h。
在上述筛选方法中：步骤b）和c）所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。
在上述筛选方法中：步骤d）所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖中的一种或几种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
二、本发明所述的Clostridium acetobutylicum BD 518在发酵生产丁醇中的应用。
具体的，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：
1）平板培养：将丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24 h；
2）种子培养：将平板培养的丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518接种到种子培养基中，培养温度33～37℃，100 mL 厌氧瓶装液量40～60 mL，充氮气2～4min，培养温度33～37 ℃，培养时间12～24h；
3）发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为体积百分比5～15%，充氮气2～4 min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～80 h。
其中，本发明所述的平板培养基应理解为现有技术中任意适用于丙酮丁醇梭菌培养的常规平板培养基。例如，在本发明中所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合。
本发明所述的种子培养基应理解为现有技术中任意适用于丁酮丁醇梭菌培养的常规种子培养基。例如本发明所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合。
本发明所述的发酵培养基应理解为现有技术中任意适用于丁酮丁醇梭菌培养的常规发酵培养基。例如本发明所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源4%～7%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05～0.1%、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖和糖蜜中的一种或多种的混合；所述氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
本发明的有益效果在于：
本发明采用连续培养驯化筛选的丙酮丁醇梭菌，利用丁醇平板筛选出丁醇耐受强的菌株Clostridium acetobutylicum BD 518，该菌株能高效地利用不同碳源发酵生产丁醇，丁醇耐受性强，糖的转化率高、总溶剂产量高、丁醇的比例高；在5L发酵罐中，以葡萄糖为碳源，总溶剂产量和丁醇产量分别达到了21.1g/L和13.2g/L，分别比出发菌提高了16.6%和15.8%，耐受性提高到18g/L，比出发菌株提高了38.5%，具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1为丙酮丁醇梭菌连续培养驯化筛选的重要参数曲线。
本发明的微生物分类命名为丙酮丁醇梭菌命名为Clostridium acetobutylicum BD 518，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期为2010年11月23号，保藏编号为CCTCC NO：M 2010308。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明本发明所述的Clostridium acetobutylicum BD518的筛选方法。
将丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum XY16原始菌株活化培养，培养温度37℃，50 mL 肖特厌氧瓶装液量为15～20 mL，充氮气2 min，培养时间12～18 h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；接入装液量100～300 mL的自制连续培养装置中，接种量为5%～15%（v/v），培养12～18 h后，流加含丁醇的新鲜培养基驯化选育。如附图1所示，随着丁醇浓度的不断增加，菌株的OD逐渐下降，总驯化时间为744 h。在驯化时间为472 h，600 h，700 h时分别取样，涂布平板，进行高丁醇耐受性突变株的筛选。
在筛选方法中，所使用的培养基配方（%为质量百分比）：
（1）固体平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，pH 6。
（2）丁醇平板培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，琼脂1.5%，丁醇1.7%，pH 6。
（3）种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，pH 6。
（4）摇瓶发酵筛选培养基：葡萄糖6%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾 0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，pH 6.6。
筛选步骤：
1、丁醇平板初筛
将连续培养装置中驯化筛选得到的菌液稀释至OD600=0.1～1.0涂布于含丁醇1.7%的培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36 h，挑选出50株单菌落。
2、丁醇平板复筛
将筛选的菌株接种于25mL 的肖特厌氧瓶装液量10 mL，充氮气2 min，33～37℃厌氧培养10～14 h，无菌生理盐水制成浓度OD=0.1的菌悬液，吸取2 μL点滴到含有丁醇1.7%的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～24 h，挑选出生长好的的菌落；最终得到3株丁醇耐受性较高的菌株，分别为BD518，BD1202和BD2001。
3、摇瓶发酵筛选
将突变株BD518，BD1202，BD2001和原始菌株XY16接入种子培养基扩大培养，培养温度37℃，250 mL 肖特厌氧瓶装液量100 mL，充氮气2 min，培养时间16 h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10%（v/v），发酵温度37℃，100 mL肖特厌氧瓶装液量50 mL，发酵时间72 h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：
表1筛选培养基中BD518，BD1202，BD2001和原始菌发酵结果
发酵结果显示，丁醇耐受性较高的突变株BD1202和BD2001的总溶剂产量和丁醇产量大大降低。而突变株BD518的总溶剂产量和丁醇产量均明显高于出发菌株。
实施例2
本实施例说明丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518丁醇耐受性能。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
一级种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH 6。
二级种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH 6。
丁醇耐受测试培养基：葡萄糖6%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，丁醇（0%，1.2%，1.5%，1.7%，1.8%），其余为水，pH 6.6。
将丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518接种至一级种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，50mL 肖特厌氧瓶装液量20 mL，充氮气2min，培养时间16 h。将一级种子培养基培养的BD 518接种到二级种子培养基中，接种量5%(v/v)，培养温度37℃，500mL 肖特厌氧瓶装液量300 mL，充氮气2min，培养时间12 h；将二级种子接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度37℃，5L 韩国发酵罐装液量3L，充氮气5min，发酵培养72 h，每隔4h取一次样测定BD518的生长情况结果为在丁醇含量分别为0%，1.2%，1.5%，1.7%，1.8%的发酵罐中的最大OD600 值分别为9.8，4.0，2.4，2.2，0.8，在含丁醇1.8%时BD518基本无法生长，而同等条件下出发菌株在在含丁醇1.3%的发酵罐中无法生长，因此BD518的耐受性提高了38.5%。
实施例3
本实施例说明突变株BD518的传代稳定性。
在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株BD518的传代稳定性，菌株BD518传代发酵试验结果如表2所示：
表2菌株BD518传代发酵试验结果
从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例4
本实施例说明丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518发酵生产丁醇的应用方法。
本实施例所述的培养基配方（%为质量百分比）：
一级种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH 6。
二级种子培养基：酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，可溶性淀粉1%，乙酸铵0.2%，氯化钠0.2%，七水合硫酸镁0.3%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，七水合硫酸亚铁0.01%，其余为水，pH 6。
发酵培养基：葡萄糖6%，乙酸铵0.22%，磷酸二氢钾0.05%，磷酸氢二钾0.05%，氯化钠0.001%，七水合硫酸镁0.02%，七水合硫酸亚铁0.001%，一水合硫酸锰0.001%，玉米浆0.1%，其余为水，pH 6.6。
将丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum BD 518接种至一级种子培养基厌氧培养，培养温度37℃，30mL 肖特厌氧瓶装液量10 mL，充氮气2min，培养时间16 h。将一级种子培养基培养的BD 518接种到二级种子培养基中，接种量5%(v/v)，培养温度37℃，50 mL 肖特厌氧瓶装液量30 mL，充氮气2min，培养时间12 h；将二级种子接种到发酵培养基中，接种量10%(v/v)，发酵温度37℃，100 mL 肖特厌氧瓶装液量50 mL，充氮气,2min，发酵培养72 h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了21.1g/L和13.2g/L，比同等培养条件下的出发菌提高了16.5%和15.8%。
Claims (6)
1.一株丙酮丁醇梭杆菌菌株，其分类命名为Clostridium acetobutylicum BD 518，其保藏登记号为CCTCC NO：M 2010308。
2.权利要求1所述的Clostridium acetobutylicum BD 518在发酵生产丁醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于具体应用步骤如下：
1） 平板培养：将Clostridium acetobutylicum BD 518接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33～37 ℃，培养时间12～24 h；
2） 种子培养：将平板培养的Clostridium acetobutylicum BD 518接种到种子培养基中，100 mL的厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气2～4min，培养温度33～37 ℃，培养时间12～24 h；
3）发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为体积比5～15%，充氮气2～4min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～80 h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的平板培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.3%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、琼脂1.5%～2%、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、淀粉和纤维酸解糖液中的一种或多种；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的种子培养基包含如下质量百分比的组分：碳源0.5%～1%、氮源0.5%～1%、无机盐0.5%～0.8%、其余为水；所述的碳源为淀粉和葡萄糖的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下质量百分比的组分：碳源4%～7%、氮源0.1%～0.3%、无机盐0.1%～0.2%、生长因子0.05%～0.1%、其余为水；所述的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木质纤维酸解糖液和木质纤维酶解糖液中的一种或多种；所述的氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种；所述的无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110161533A CN102226163B (zh) | 2011-06-16 | 2011-06-16 | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110161533A CN102226163B (zh) | 2011-06-16 | 2011-06-16 | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102226163A CN102226163A (zh) | 2011-10-26 |
| CN102226163B true CN102226163B (zh) | 2012-08-29 |
Family
ID=44807161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110161533A Expired - Fee Related CN102226163B (zh) | 2011-06-16 | 2011-06-16 | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102226163B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103898127B (zh) * | 2012-12-28 | 2016-03-30 | 上海市农业科学院 | 来源于强烈火焰菌的小热激蛋白hsp基因、表达载体及其构建和应用 |
| CN105505849B (zh) * | 2016-01-22 | 2019-09-20 | 南京工业大学 | 联产丁醇与2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 |
| CN105936920A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-09-14 | 广西南宁荣威德新能源科技有限公司 | 一种利用蚕豆秸秆制备丁醇的方法 |
| CN111500485B (zh) * | 2020-03-19 | 2022-04-15 | 南京工业大学 | 一株可以共利用葡萄糖和木糖的丙酮丁醇梭菌及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101250496A (zh) * | 2008-03-25 | 2008-08-27 | 中国科学院微生物研究所 | 一株丙酮丁醇梭菌及其应用 |
| CN101353632A (zh) * | 2008-01-11 | 2009-01-28 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一株丙酮丁醇梭菌及其筛选方法和用途 |
| CN101864389A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-10-20 | 南京工业大学 | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用 |
-
2011
- 2011-06-16 CN CN201110161533A patent/CN102226163B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101353632A (zh) * | 2008-01-11 | 2009-01-28 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一株丙酮丁醇梭菌及其筛选方法和用途 |
| CN101250496A (zh) * | 2008-03-25 | 2008-08-27 | 中国科学院微生物研究所 | 一株丙酮丁醇梭菌及其应用 |
| CN101864389A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-10-20 | 南京工业大学 | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shaoming Mao 等.Proteome Reference Map and Comparative Proteomic Analysis between a Wild Type Clostridium acetobutylicum DSM 1731 and its Mutant with Enhanced Butanol Tolerance and Butanol Yield.《Journal of Proteome Research》.2010,第9卷(第2010/6期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102226163A (zh) | 2011-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Svetlitchnyi et al. | Single-step ethanol production from lignocellulose using novel extremely thermophilic bacteria | |
| Dhaliwal et al. | Enhanced ethanol production from sugarcane juice by galactose adaptation of a newly isolated thermotolerant strain of Pichia kudriavzevii | |
| CN102791869B (zh) | 通过发酵的酸产生 | |
| CN101240259B (zh) | 新构建的高产富马酸基因工程菌及其生产富马酸的方法 | |
| CN102174433B (zh) | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 | |
| CN104946576B (zh) | 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用 | |
| CN103820346B (zh) | 一株酿酒酵母及其在发酵产乙醇中的应用 | |
| CN106554931B (zh) | 一株拜氏羧菌及其应用 | |
| CN103571772B (zh) | 一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法 | |
| JP2012235729A (ja) | アルコール発酵性酵母及びこれを用いたエタノール製造方法 | |
| CN102226163B (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其应用 | |
| CN102533612A (zh) | 拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用 | |
| CN103695329B (zh) | 具有高木糖消耗率的分离酵母菌株和使用所述菌株产生乙醇的方法 | |
| CN101307354A (zh) | 一种筛选乳酸生产率高的菌株的方法 | |
| CN104673712A (zh) | 一株同步利用葡萄糖与木糖生产醇类燃料的菌株及其应用 | |
| CN102146345B (zh) | 一种乙酸耐性乙醇生产酿酒酵母菌株及菌株筛选方法 | |
| CN102604863A (zh) | 一种红树林克雷伯氏菌及其在生产1,3-丙二醇中的应用 | |
| CN101864389B (zh) | 一株丙酮丁醇梭杆菌菌株及其筛选方法和应用 | |
| CN102174434B (zh) | 一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用 | |
| CN108384730B (zh) | 一种副干酪乳杆菌及其在转化合成苯乳酸中的应用 | |
| CN102492634B (zh) | 一株耐高温酵母菌及其应用 | |
| CN107400646A (zh) | 一株高产丁醇梭菌及其筛选与应用 | |
| Saeid et al. | Isolation and Identification of the Hanseniaspora opuntiae MK 460485 as an efficient strain for ethanol production | |
| CN103667147B (zh) | 一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用 | |
| CN102827800B (zh) | 一种大肠杆菌工程菌株及其低氧发酵生产琥珀酸的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120829 Termination date: 20150616 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |