CN102174434B

CN102174434B - 一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用

Info

Publication number: CN102174434B
Application number: CN201110020105XA
Authority: CN
Inventors: 姜岷; 郭亭; 汤艳; 奚永兰; 陈可泉; 李志刚; 吴昊; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: CN102174434A

Abstract

本发明公开了一株高丁醇比贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌Clostridiumbeijerinckii ART124，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M 2010309。本发明还公开了上述贝氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用。本发明采用等离子体诱变贝氏梭菌，利用刃天青平板筛选出还原力较强的菌株，该菌株能高效地利用不同碳源发酵制备丁醇，糖的转化率高、总溶剂产量高、丁醇的比例高；葡萄糖为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了13.7g/L和10.4g/L，分别比出发菌提高了21.2％和31.6％，丁醇比高达76％，糖转化率高达0.46，具有重大的社会意义和经济价值。

Description

一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株高丁醇比和高溶剂产量的贝氏梭菌，以及其在溶剂发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

丁醇作为优良的有机溶剂和重要的化工原料，已广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业领域；同时，作为新一代的液体能源，丁醇正在被越来越多的国家重视，其具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。

由于世界经济的高速发展，石油消耗量快速增长，石油价格持续攀升，丁醇价格长期高位徘徊，古老的丁醇发酵技术，作为一种有效的、利用生物质资源生产重要平台化合物及燃料的生物转化技术，又开始重新被人们重视。丁醇生物发酵一般是利用丙酮丁醇梭菌或贝氏梭菌在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，简称AB或ABE。而传统法生产溶剂，丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6∶3∶1，同时还伴随着副产物乙酸和丁酸，释放H₂和CO₂，导致底物的转化利用率仅在35％左右。因此，提高ABE中丁醇的含量，并有效改善底物的转化率成为近年来丁醇发酵的热点问题之

近年来，国内外对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工程改造、溶剂提取等方面进行。中国专利申请ZL200810032581.1报道了通过化学诱变处理丙酮丁醇梭杆菌，总溶剂产量在22g/L左右，丁醇比在73％左右；美国专利US2005/0089979A1报道了利用gas-stripping和连续发酵耦合来生产丙酮丁醇，在1L发酵罐中，以葡萄糖为底物，丁醇比停留在60～70％之间；1996年，上海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高产丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018(中国专利ZL95111733.5)，最终发酵产溶剂比为B∶A∶E＝7∶2∶1；O.Mutschlechner(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000，2：101～105)等利用贝氏梭菌NRRLB592，通过两阶段调控的方法连续发酵产溶剂，在稳定期丁醇比例的平均值为61％，溶剂产率平均值为0.25。

可见，提高溶剂中的丁醇比例在丙酮-丁醇发酵工业中，起着至关重要的作用，而利用菌种改良是提高丁醇比，增强发酵竞争力的关键手段之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株高丁醇比贝氏梭菌，使其发酵的丁醇比高、总溶剂产量高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述高丁醇比贝氏梭菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株高丁醇比贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M 2010309。

本发明所述的高丁醇比贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124的筛选方法，将贝氏梭菌出发菌株NCIMB 8052(购于美国菌种保藏中心(ATCC))经等离子体诱变后，利用刃天青平板筛选得到还原力强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁醇比高和总溶剂产量高的丙酮丁醇梭菌目标菌株。

其具体步骤如下：

a)等离子体诱变：将贝氏梭菌原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～16h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD₆₀₀＝0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80～120W作为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变；

b)刃天青平板初筛：将诱变后的载片置于装有1～2mL生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含刃天青(0.002％)的培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落；

c)刃天青平板复筛：将步骤b)筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10mL，充氮气3min，33～37℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.1的菌悬液，吸取2μL点滴到含有刃天青(0.002％)的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～24h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；

d)厌氧瓶发酵筛选：将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33～37℃，厌氧培养培养时间10～24h，然后在发酵培养基中发酵，接种量5％～15％(v/v)，发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～80h；考察步骤c)筛选出的菌落发酵产总溶剂的量和溶剂中的丁醇比，同时选出丁醇比和总溶剂产量最高的菌株。

在上述筛选方法中：步骤a)中所述的等离子体诱变方法中，优选100W作为射频功率，10SLM作为气体流量，180s作为辐照时间。

在上述筛选方法中：步骤b)和c)所采用的常规固体培养基、碳源为葡萄糖、淀粉中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，固体培养基中添加琼脂。

在上述筛选方法中：步骤d)所采用的种子培养基和发酵培养基中，碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖中的一种或几种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

上述高丁醇比贝氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用。

其中，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：

1)平板培养：将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；

2)种子培养：将平板培养的贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种到种子培养基中，培养温度33～37℃，100mL厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3～5min，培养温度33～37℃，培养时间12～24h；

3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5～15％(v/v)，充氮气3～5min，发酵温度33～37℃，发酵培养时间为60～80h。

其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.3％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、琼脂1.5％～2％、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合。

其中，所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1％、氮源0.5％～1％、无机盐0.5％～0.8％、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵和氯化铵中的一种或两种的混合，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆中的一种或几种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合。

其中，所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源3％～6％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.1％～0.2％、生长因子0.05～0.1％、其余为水；其中所述碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖和糖蜜中的一种或多种的混合；所述氮源为乙酸铵、氯化铵和酵母粉中的一种或多种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和亚铁盐中的一种或几种的混合；所述生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B1、生物素和玉米浆中的一种或几种的混合。

本发明的有益效果在于：

本发明采用等离子体诱变贝氏梭菌，利用刃天青平板筛选出还原力较强的菌株，该菌株能高效地利用不同碳源发酵生产丁醇，糖的转化率高、总溶剂产量高、丁醇的比例高；在2L发酵罐中，以葡萄糖为碳源，总溶剂产量和丁醇产量分别达到了13.7g/L和10.4g/L，分别比出发菌提高了21.2％和31.6％，丁醇比高达76％，糖转化率高达0.46，具有重大的社会意义和经济价值。

附图说明

本发明的微生物分类命名为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2010309，保藏日期2010年11月23日。

图1为贝氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明将贝氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。

贝氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：

将贝氏梭菌NCIMB 8052原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，50ml肖特厌氧瓶装液量为15～20ml，充氮气3min，培养时间12～18h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD₆₀₀＝1～1.5，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，180s是最佳的诱变辐照时间。

实施例2

本实例说明筛选优良贝氏梭菌的方法。

其中，所使用的培养基配方(％为质量百分比)：

(1)固体平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，pH 6。

(2)刃天青平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，刃天青0.002％，pH 6。

(3)种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，pH 6。

(4)摇瓶发酵筛选培养基：葡萄糖3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，pH 6.6。

筛选步骤：

1、刃天青平板初筛

将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含刃天青(0.002％)的培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落50株。

2、刃天青平板复筛

将筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶，装液量10mL，充氮气3min，33～37℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.1的菌悬液，吸取2uL点滴到含有刃天青(0.002％)的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～24h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；最终菌株ART86和ART124显示了较强的还原活力。

2、摇瓶发酵筛选

将菌株ART86，ART124和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度35℃，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养时间12h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，发酵时间72h后检测各菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：

表1

经过平板组合筛选获得的两株突变株在发酵过程中总溶剂产量和丁醇产量均明显高于出发菌株，其中ART124具有较高的丁醇比，其总溶剂产量和丁醇产量也最高。这与平板筛选的结果一致。

实施例3

本实施例说明突变株ART124的传代稳定性。

在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株ART124的传代稳定性，菌株ART124传代发酵试验结果如表2所示：

表2

从实验结果可知，经过7次连续传代，两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例4

本实施例说明贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124发酵生产丁醇的工艺。

本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：

平板培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，其余为水，pH 6。

种子培养基：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6。

发酵培养基：木糖3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。

将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的ART124接种到种子培养基中，培养温度35℃，50mL肖特厌氧瓶装液量30mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，充氮气3min，发酵培养72h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了9.7g/L和7.8g/L，比同等培养条件下的出发菌提高了32.9％和36.8％，丁醇比达到了80％。

实施例5

本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：

发酵培养基：蔗糖3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。

将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的ART124接种到种子培养基中，培养温度35℃，50mL肖特厌氧瓶装液量30mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，充氮气3min，发酵培养72h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.3g/L和9.6g/L，比同等培养条件下的出发菌提高了23.4％和28.9％，丁醇比达到了85％。

实施例6

本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：

发酵培养基：混合糖3％(葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖＝18∶11∶1)，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。

将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的ART124接种到种子培养基中，培养温度35℃，50mL肖特厌氧瓶装液量30mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，充氮气3min，发酵培养72h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.7g/L和7.9g/L，比同等培养条件下的出发菌提高了33.9％和39.8％，丁醇比达到了74％。

实施例7

本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：

发酵培养基：甘蔗糖蜜(总还原糖3％)，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。

将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的ART124接种到种子培养基中，培养温度35℃，50mL肖特厌氧瓶装液量30mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，100mL肖特厌氧瓶装液量50mL，充氮气3min，发酵培养72h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了10.4g/L和8.6g/L，比同等培养条件下的出发菌提高了24.3％和29.1％，丁醇比达到了83％。

实施例8

本实施例说明贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124在2L发酵罐中发酵生产丁醇的工艺。

本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比)：

发酵培养基：葡萄糖3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6。

将贝氏梭菌C.beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h。将平板培养的ART124接种到种子培养基中，250mL肖特厌氧瓶装液量100mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；将种子接种到装有1L发酵培养基的2L发酵罐中，接种量10％(v/v)，发酵温度35℃，发酵过程中连续通入氮气，流速为0.3L/min，发酵培养72h后检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了13.7g/L和10.4g/L，分别比同等培养条件下的出发菌提高了21.2％和31.6％，丁醇比高达76％，糖转化率高达0.46。

Claims

1.一株高丁醇比贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌(Clostridium beijerinckii)ART124，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M 2010309。

2.权利要求1所述的高丁醇比贝氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用；

其中，所述的发酵生产丁醇的方法包含如下步骤：

1)平板培养：将贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种至平板培养基厌氧培养，培养温度35℃，培养时间12h；

2)种子培养：将平板培养的贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124接种到种子培养基中，100mL厌氧瓶装液量40～60mL，充氮气3min，培养温度35℃，培养时间12h；

3)发酵产丁醇：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量10％(v/v)，充氮气3min，发酵温度35℃，发酵培养时间为72h；

所述的平板培养基包含如下质量百分数的组分：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，琼脂1.5％，其余为水，pH 6；

所述的种子培养基包含如下质量百分数的组分：酵母粉0.3％，蛋白胨0.5％，可溶性淀粉1％，乙酸铵0.2％，氯化钠0.2％，七水合硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钾0.1％，七水合硫酸亚铁0.01％，其余为水，pH 6；

发酵培养基：碳源3％，乙酸铵0.22％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠0.001％，七水合硫酸镁0.02％，七水合硫酸亚铁0.001％，一水合硫酸锰0.001％，玉米浆0.1％，其余为水，pH 6.6；所述的碳源为木糖、或蔗糖、或混合糖、或甘蔗糖蜜、或葡萄糖；所述的混合糖为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖按质量比18∶11∶1的混合物。