CN115820527B - 一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌及构建方法与应用，其构建方法为：1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中基因phaB和基因phaC；2)将基因mvaElac和基因mvaSlac表达单元靶向整合至步骤1)所得菌株基因组G7位点；得到在G7位点整合有mvaElac和mvaSlac表达单元的重组菌株；3)将基因mvaEef和mvaSef表达单元靶向整合至步骤2)所得菌株基因组G4位点，得到生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌；本发明构建的重组菌，有效利用不同碳源发酵生产甲羟戊酸，其甲羟戊酸产量和底物转化率高，稳定性好，无需诱导剂和抗生素。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌株及构建方法与应用。
背景技术
甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)又名甲瓦龙酸，分子式为C6H12O4，最初作为乳酸菌的乙酸替代生长因子在酒精发酵废液中被发现，后又在火落菌发酵的日本清酒中被发现。甲羟戊酸呈油状，易溶于水和极性有机溶液，在酸性条件下易内酯化形成甲羟戊酸内酯C6H10O3(mevalonlactone，MVAL)。甲羟戊酸是甲羟戊酸途径(MVApathway)的重要中间体，参与合成类固醇和萜烯，包括异戊二烯、蒎烯、类胡萝卜素、青蒿素和紫杉醇等。目前甲羟戊酸在生产抗疟疾药物青蒿素、抗癌化合物中间体紫杉醇、橡胶前体异戊二烯以及生物燃料3-甲基-3-丁烯-1-醇等领域已经有相关应用报道，具有广阔的应用前景。
甲羟戊酸普遍存在于大多数真核生物、病毒和高等植物中，其生物合成过程为，以三分子乙酰辅酶A为前体，经三步酶反应，消耗两分子还原力NADPH或NADH合成一分子甲羟戊酸。具体为首先乙酰辅酶A乙酰转移酶将两分子乙酰CoA缩合成乙酰乙酰CoA，进一步在3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶作用下引入第三个乙酰CoA分子缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)，最后HMG-CoA被3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶还原为甲羟戊酸。甲羟戊酸可进一步生成异戊二烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，用于合成下游的萜类和类固醇化合物。除生物合成法外，甲羟戊酸也可通过化学法合成，但由于生物合成法具有可持续性和绿色环保等优势，近年来利用多种微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，通过代谢工程手段改造合成甲羟戊酸的研究越来越多。
盐单胞菌TD01(Halomonas sp.TD01)是一株中度嗜盐嗜碱微生物，具有耐高盐(NaCl，50～60g/L)、高碱(pH，9～11)、鲁棒性强、底物利用谱广和耐受高浓度有机酸盐等特点。这些独特的生理特征赋予了盐单胞菌可在开放式、不灭菌条件下连续发酵培养，相比于普通模式微生物，以盐单胞菌为底盘细胞在工业应用上更能节约原料、设备和人工的投资成本，简化发酵工艺，具有更高的经济性和价值性。近年来针对盐单胞菌的相关分子生物学方法和基因操作技术都已建立，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计进行菌株改造。目前盐单胞菌已成为“下一代工业生物技术”的明星底盘，被广泛地改造用于生产各类高附加值产品，包括聚羟基脂肪酸酯、蛋白质、5-氨基乙酰丙酸、L-苏氨酸、四氢嘧啶、3-羟基丙酸、衣康酸等。
经检索，目前未见有在基因组上改造盐单胞菌Halomonas sp.TD01用于生产甲羟戊酸的相关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。
本发明的第二个目的是提供一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸的应用。
本发明的第四个目的是提供第二种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB和PHA合成酶编码基因phaC；
2)将乳杆菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaElac和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaSlac表达单元靶向整合至步骤1)所得菌株基因组G7位点；得到在G7位点整合有mvaElac和mvaSlac表达单元的重组菌株Halomonassp.
TDMVA-01；
3)将粪肠球菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaEef和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaSef表达单元靶向整合至步骤2)所得菌株基因组G4位点，得到生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌；
所述基因phaB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述基因phaC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述基因mvaElac和mvaSlac表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述基因组G7位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述基因mvaEef和mvaSef表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述基因组G4位点的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
上述方法构建的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。
上述生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸中的应用。
第一种应用，包括如下步骤：
(1)活化菌株：将上述生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60LB固体培养基中划线，35-37℃培养8-16h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，35-37℃，180-240rpm培养8-16h，将所得菌液按照体积比为1％-2％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35-37℃，180-240rpm培养8-20h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为1％-5％的比例接种到装有20-100mL的发酵培养基的500mL锥形瓶中，32-37℃，180-240rpm培养48-80h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
第二种应用，包括如下步骤：
(1)活化菌株：将上述生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60LB固体培养基中划线，35-37℃培养8-16h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，35-37℃，180-240rpm培养8-16h，将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35-37℃，180-240rpm培养8-20h，获得种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为1％-10％的比例接种到装有2-3L的第二种发酵培养基的5L发酵罐中，pH始终维持7-12，在32-37℃，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，溶氧关联转速控制在10％-30％，在开始发酵的8小时至22小时内补加氮源，补加的氮源与第二种发酵培养基的比为1g/L；当发酵培养基中碳源浓度降到1-5g/L时，采用连续流加或间歇流加的方式补充补料培养基，维持碳源浓度在10-80g/L，继续培养，当发酵液中的甲羟戊酸浓度停止增加时，结束发酵，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
所述发酵培养基由下述组分组成：碳源20-80g，氯化钠40-80g，酵母提取物1-5g，氯化铵1-10g，玉米浆干粉0-5g，硫酸镁0.1-5g，十二水合磷酸氢二钠5-15g，磷酸二氢钾1-10g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L；调节pH为7-12；
所述碳源为葡萄糖、乙酸钠和葡萄糖酸钠中至少一种；
所述微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5-10g，氯化钙1-5g，加1M HCl水溶液至1L；
所述微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50-200mg，氯化锰10-50mg，硼酸100-300mg，氯化钴100-200mg，硫酸铜1-10mg，氯化镍10-50mg，钼酸钠10-50mg，加蒸馏水至1L。
补料培养基的组成：500-800g的碳源和5-50g氮源，加蒸馏水至1L；所述碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠或葡萄糖和乙酸钠的混合物；所述氮源为酵母提取物。
60LB固体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠60g，琼脂粉20g，加蒸馏水至1L，调节pH为7-12；
60LB液体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠60g，加蒸馏水至1L，调节pH为7-12。
本发明的优点：
本发明构建的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌，可有效利用不同碳源发酵生产甲羟戊酸，在摇瓶发酵中甲羟戊酸产量达8.28g/L-33.83g/L，底物转化率29％-45％；5L发酵罐中发酵产量达71.08g/L-82.40g/L，底物转化率达到26-45％；本发明构建的重组菌的甲羟戊酸产量和底物转化率高，稳定性好，无需诱导剂和抗生素。
附图说明
图1为重组盐单胞菌TDMVA-02在摇瓶发酵中细胞生物量和甲羟戊酸产量示意图。
图2为重组盐单胞菌TDMVA-02在5L发酵罐中细胞生物量和甲羟戊酸产量示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的盐单胞菌Halomonas sp.TD01，保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2010年11月19日，保藏登记号为CGMCC No.4353，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所用到的大肠杆菌Escherichia coli S17-1，购自Biovector质粒载体菌株细胞蛋白抗体基因保藏中心，20191011，http://www.biovector.net/。
所用胶回收试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)；高保真扩增聚合酶从南京诺唯赞生物科技有限公司购买(http://www.vazyme.com/)；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(https://www.solarbio.com/)；Seamless Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)购自碧云天(https://www.beyotime.com/index.htm)。
所用发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司(http://www.blbio.com/)。
所用PCR仪和电转仪购自Bio-Rad(http://www.bio-rad.com/)。
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。
60LB液体培养基：胰蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)10g，酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)5g，氯化钠60g，加蒸馏水至1L，5M NaOH水溶液调pH至9.0(也可以选用pH＝7-12的任一值，如pH＝7、8、10、11或12)。需要时添加抗性氯霉素(25mg/L)或/和壮观霉素(100mg/L)。
60LB固体培养基：胰蛋白胨(英国OXID公司，产品目录号LP0042)10g，酵母提取物(英国OXID公司，产品目录号LP0021)5g，氯化钠60g，琼脂粉20g，加蒸馏水至1L，5M NaOH水溶液调pH至9.0(也可以选用pH＝7-12的任一值，如pH＝7、8、10、11或12)。需要时添加抗性氯霉素(25mg/L)或/和壮观霉素(100mg/L)。
生物量(OD600)测定：采用紫外分光光度计TU-1801(北京普析)测600nm波长下的吸光度。
高效液相色谱检测甲羟戊酸含量，采用安捷伦1100高效液相色谱仪，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm,9μm,Bio-Rad)，5mM H2SO4为流动相，流速0.4mL/min，进样量10μL，示差检测器，柱温设置为60℃。甲羟戊酸标准品购于Sigma-Aldrich(货号M4667)。
实施例1
一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
1)敲除盐单胞菌Halomonas sp.TD01中3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB(SEQ IDNo.1)和PHA合成酶编码基因phaC(SEQ ID No.2)；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行，phaB和phaC基因的具体敲除方法在文献“Qin Q,Ling C,Zhao Y,Yang T,Yin J,GuoY,et al.(2018).Crispr/cas9 editing genome of extremophile Halomonasspp.Metabolic Engineering,47,219-229”中有公开报道，所需工具质粒有pQ08(SEQ IDNo.7)和pSEVA341-gRNA(SEQ IDNo.8)，公众可按照文献说明进行操作，敲除phaB和phaC后获得菌株Halomonas sp.TD01△CB。
实施例2
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将乳杆菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶编码基因mvaElac和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶编码基因mvaSlac表达单元(SEQ ID No.3)靶向整合至实施例1所得菌株Halomonas sp.TD01△CB基因组的G7位点，G7位点的gRNA序列为acaccattacgggggtgtca(SEQ ID No.4)，按照文献Qin Q,Ling C,Zhao Y,Yang T,Yin J,Guo Y,et al.(2018).Crispr/cas9 editinggenome of extremophile Halomonas spp.Metabolic Engineering,47,219-229所述，具体操作如下：
用引物对G7gRNA-F/gRNA-R(SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)以质粒pSEVA341-gRNA(SEQ ID No.8)为模板，扩增获得含有启动子、靶向G7的gRNA和sgRNA骨架的片段；利用引物对G7-U-F/G7-U-R(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)以Halomonas sp.TD01基因组为模板，扩增出G7上游同源臂片段；利用引物对MVAlac-F/MVAlac-R(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)以人工合成片段SEQ ID No.3为模板，扩增出含有mvaElac和mvaSlac表达单元的片段；利用引物对G7-D-F/G7-D-R(SEQ ID No.15和SEQ ID No.16)以Halomonas sp.TD01基因组为模板，扩增出G7下游同源臂片段；利用引物对pSEVA341-F/pSEVA341-R(SEQ IDNo.17和SEQ IDNo.18)以质粒pSEVA341-gRNA(SEQ ID No.8)为模板，扩增pSEVA341质粒骨架，将上述片段与质粒骨架利用Seamless Cloning Kit(品牌：碧云天，货号：D7010S)进行连接，得到重组质粒pG7-mvaESlac。
首先将质粒pQ08(SEQ ID No.7)转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法(FuXZ，Tan D，Aibaidula G，Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014).Development of Halomonas TD01as a host for open production of chemicals.Metabolic Engineering,23，78-91)转入实施例1得到的盐单胞菌Halomonas sp.TD01△CB中，获得重组菌Halomonas sp.TD01△CB(pQ08)。
将重组质粒pG7-mvaESlac转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法(Fu XZ，TanD，Aibaidula G，Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014).Development of Halomonas TD01 as ahost for open production ofchemicals.Metabolic Engineering,23，78-91)转入重组菌Halomonas sp.TD01△CB(pQ08)中，接合菌斑涂布在含有氯霉素和壮观霉素抗性的60LB固体平板上培养得到单克隆，用引物对G7-F/G7-R(SEQ ID No.19和SEQ ID No.20)进行菌落PCR验证，在G7位点成功整合上表达基因的克隆扩增得到的条带大小为4143bp，未整合上的克隆扩增得到的条带大小为1323bp。进一步测序验证，最后将验证正确的重组菌株在60LB培养基中传代丢失质粒，得到在G7位点整合有mvaElac和mvaSlac表达单元的重组菌株Halomonas sp.TDMVA-01。
实施例3
采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将粪肠球菌来源的HMG-CoA合成酶编码基因mvaEef和HMG-CoA还原酶编码基因mvaSef表达单元(SEQ ID No.5)靶向整合至实施例2获得的菌株Halomonas sp.TDMVA-01基因组的G4位点，G4位点的gRNA序列为ttcacctagctagatgagac(SEQ ID No.6)，按照文献Qin Q,Ling C,Zhao Y,Yang T,Yin J,Guo Y,et al.(2018).Crispr/cas9editing genome of extremophile Halomonas spp.MetabolicEngineering,47,219-229所述，具体操作如下：
用引物对G4gRNA-F/gRNA-R(SEQ ID No.21和SEQ ID No.10)以质粒pSEVA341-gRNA(SEQ ID No.8)为模板，扩增获得含有启动子、靶向G4的gRNA和sgRNA骨架的片段；利用引物对G4-U-F/G4-U-R(SEQ ID No.22和SEQ ID No.23)以Halomonas sp.TD01基因组为模板，扩增出G4上游同源臂片段；利用引物对MVAef-F/MVAef-R(SEQ ID No.24和SEQ IDNo.25)以人工合成片段SEQ ID No.5为模板，扩增出含有mvaEef和mvaSef表达单元的片段；利用引物对G4-D-F/G4-D-R(SEQ ID No.26和SEQ ID No.27)以Halomonas sp.TD01基因组为模板，扩增出G4下游同源臂片段；利用引物对pSEVA341-F/pSEVA341-R(SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18)以质粒pSEVA341-gRNA(SEQ ID No.8)为模板，扩增pSEVA341质粒骨架，将上述片段与质粒骨架利用Seamless Cloning Kit(品牌：碧云天，货号：D7010S)进行连接，得到重组质粒pG4-mvaESef。
首先将质粒pQ08(SEQ ID No.7)转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法(FuXZ，Tan D，Aibaidula G，Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014).Development of Halomonas TD01as a host for open production of chemicals.Metabolic Engineering,23，78-91)转入实施例2得到的重组菌Halomonas sp.TDMVA-01中，获得重组菌Halomonas sp.TDMVA-01(pQ08)。
将重组质粒pG4-mvaESef转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法(Fu XZ，Tan D，Aibaidula G，Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014).Development of Halomonas TD01 as ahost for open production ofchemicals.Metabolic Engineering,23，78-91)转入重组菌Halomonas sp.TDMVA-01(pQ08)中，接合菌斑涂布在含有氯霉素和壮观霉素抗性的60LB固体平板上培养得到单克隆，用引物对G4-F/G4-R(SEQ ID No.28和SEQ ID No.29)进行菌落PCR验证，在G4位点成功整合上表达基因的克隆扩增得到的条带大小为5325bp，未整合上的克隆扩增得到的条带大小为1334bp。进一步测序验证，最后将验证正确的重组菌株在60LB培养基中传代丢失质粒，得到同时在G4位点整合有mvaEef和mvaSef表达单元的重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)。
实施例4
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖单一碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，35℃培养16h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，35℃，180rpm培养16h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35℃，180rpm培养20h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1％的比例接种到装有20mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，35℃，180rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到8.28g/L，底物转化率为41％。
本实施例的发酵培养基由下述组分组成：葡萄糖20g，氯化钠40g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钾1g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L，用5M NaOH水溶液调节pH为9；
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙1g，加1M HCl水溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰20mg，硼酸100mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
实施例5
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖单一碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，37℃培养10h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h，然后将所得菌液按照体积比为2％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，37℃，220rpm培养8h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养60h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到16.06g/L，底物转化率为40％。
本实施例的发酵培养基由下述组分组成：葡萄糖40g，氯化钠80g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁5g，十二水合磷酸氢二钠15g，磷酸二氢钾10g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L，用5M NaOH水溶液调节pH为10；
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵10g，氯化钙2g，加1M HCl水溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌100mg，氯化锰50mg，硼酸200mg，氯化钴200mg，硫酸铜1mg，氯化镍20mg，钼酸钠50mg，加蒸馏水至1L。
实施例6
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以乙酸钠单一碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，36℃培养8h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，36℃，240rpm培养14h，然后将所得菌液按照体积比为2％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，36℃，240rpm培养16h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有100mL发酵培养基的的500mL锥形瓶中，36℃，240rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到8.79g/L，底物转化率为29％。
本实施例的发酵培养基配方为：乙酸钠30g，氯化钠60g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁1g，十二水合磷酸氢二钠10g，磷酸二氢钾5g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。pH用5M NaOH溶液调至10。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙5g，加1M HCl溶液至1L。微量元素溶液II的组成为：硫酸锌200mg，氯化锰20mg，硼酸300mg，氯化钴200mg，硫酸铜10mg，氯化镍50mg，钼酸钠20mg，加蒸馏水至1L。
实施例7
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖和乙酸钠混合碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，36℃培养10h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，36℃，220rpm培养14h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到10.78g/L，底物转化率为45％。
本实施例的发酵培养基配方为：葡萄糖20g，乙酸钠5g，氯化钠70g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁0.2g，十二水合磷酸氢二钠8g，磷酸二氢钾5g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。pH用5M NaOH溶液调至12。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙3g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰20mg，硼酸100mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
实施例8
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖酸钠单一碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，35℃培养8h，使菌株复壮；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有30mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，37℃，220rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到15.56g/L，底物转化率为31％。
本实施例的发酵培养基配方为：葡萄糖酸钠50g，氯化钠60g，酵母提取物2.5g，玉米浆干粉2.5g，氯化铵5g，硫酸镁0.5g，十二水合磷酸氢二钠9.5g，磷酸二氢钾1g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。培养基的pH用5M NaOH溶液调至7。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙1g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰20mg，硼酸100mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
实施例9
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖酸钠单一碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，35℃培养8h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌接种到60LB液体培养基中，35℃，240rpm培养12h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35℃，240rpm培养12h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有50mL发酵培养基的500mL锥形瓶中，32℃，240rpm培养80h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到33.83g/L，底物转化率为42％，发酵曲线见图1。
本实施例的发酵培养基配方为：葡萄糖酸钠80g，氯化钠50g，酵母提取物2.5g，玉米浆干粉5g，氯化铵5g，硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钾1g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。培养基的pH用5M NaOH溶液调至9。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙1g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰20mg，硼酸100mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
实施例10
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的摇瓶发酵方法，以葡萄糖酸钠和乙酸钠混合碳源发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，36℃培养9h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，36℃，220rpm培养14h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，36℃，220rpm培养12h，获得种子液；
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有40mL发酵培养基的的500mL锥形瓶中，36℃，220rpm培养48h，得到含有甲羟戊酸的发酵液，甲羟戊酸产量达到11.70g/L，底物转化率为39％。
本实施例的发酵培养基配方为：葡萄糖酸钠20g，乙酸钠10g，氯化钠60g，酵母提取物5g，氯化铵10g，硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠10g，磷酸二氢钾1g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。培养基的pH用5M NaOH溶液调至11。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙1g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰10mg，硼酸100mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
实施例11
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的5L发酵罐发酵方法，以葡萄糖单一碳源和连续流加方式发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，35℃培养16h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，35℃，240rpm培养16h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，35℃，240rpm培养20h，获得种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为10％的比例接种到装有2L的发酵培养基的5L发酵罐中，pH始终维持7，在37℃，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，溶氧关联转速控制在30％，在开始发酵的8小时内补加氮源(氯化铵)，补加的氮源与第二种发酵培养基的比为1g/L；当发酵培养基中碳源(葡萄糖)浓度降到1g/L时，采用连续流加的方式补充补料培养基，维持碳源浓度在10g/L，继续培养，当发酵液中的甲羟戊酸浓度停止增加时(约89h发酵)，结束发酵，得到含有甲羟戊酸的发酵液；
细胞量OD600为35，甲羟戊酸产量达到82.40g/L，底物转化率为45％，发酵曲线如图2示。
发酵培养基配方为：葡萄糖20g，氯化钠40g，酵母提取物1g，氯化铵1g，硫酸镁0.1g，十二水合磷酸氢二钠15g，磷酸二氢钾1g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L，其pH用5M NaOH水溶液调至7。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙1g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50mg，氯化锰10mg，硼酸300mg，氯化钴100mg，硫酸铜1mg，氯化镍10mg，钼酸钠10mg，加蒸馏水至1L。
本实施例的补料培养基组成包括：葡萄糖800g，酵母提取物50g，加蒸馏水至1L。
实施例12
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的5L发酵罐发酵方法，以葡萄糖和乙酸钠混合碳源和连续流加方式发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将重组菌株Halomonas sp.TDMVA-02(即生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌)在60LB固体培养基中划线，37℃培养8h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，37℃，180rpm培养10h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，37℃，180rpm培养8h，获得种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为5％的比例接种到装有2L的发酵培养基的5L发酵罐中，pH始终维持为10，在37℃，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，溶氧关联转速控制在20％，在开始发酵的22小时内补加氮源(氯化铵)，补加的氮源与发酵培养基的比为1g/L；当发酵培养基中碳源浓度降到5g/L时，采用连续流加的方式补充补料培养基，维持碳源浓度在20g/L，继续培养，当发酵液中的甲羟戊酸浓度停止增加时(86h发酵)，结束发酵，得到含有甲羟戊酸的发酵液；
细胞量OD600最大为50.15，甲羟戊酸产量达到80.00g/L，底物转化率为37％。
发酵培养基配方为：葡萄糖40g，乙酸钠8g，氯化钠60g，酵母提取物5g，氯化铵5g，硫酸镁5g，十二水合磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钾10g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L。其pH用5M NaOH水溶液调至10；
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵10g，氯化钙5g，加1M HCl溶液至1L。微量元素溶液II的组成为：硫酸锌200mg，氯化锰50mg，硼酸100mg，氯化钴200mg，硫酸铜10mg，氯化镍50mg，钼酸钠50mg，加蒸馏水至1L。
本实施例所用的补料培养基组成为：葡萄糖680g，乙酸钠120g和酵母提取物5g，加蒸馏水至1L。
实施例13
实施例3获得的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株的5L发酵罐发酵方法，以葡萄糖酸钠单一碳源和间歇补料方式发酵，具体包括如下述步骤：
(1)活化菌株：将权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌菌株在60LB固体培养基中划线，36℃培养14h，得到活化菌株；
(2)种子液的制备：将步骤(1)获得的活化菌株接种到60LB液体培养基中，36℃，180rpm培养8h，然后将所得菌液按照体积比为1％的接种量接种到新制备的60LB液体培养基中，36℃，220rpm培养12h，获得种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)获得的种子液按照体积比为1％的比例接种到装有3L的发酵培养基的5L发酵罐中，pH始终维持12，在32℃，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，溶氧关联转速控制在10％，在开始发酵的20小时内补加氮源(氯化铵)，补加的氮源与第二种发酵培养基的比为1g/L；当发酵培养基中碳源(葡萄糖酸钠)浓度降到5g/L时，采用间歇流加的方式补充补料培养基，维持碳源浓度在80g/L，继续培养，当发酵液中的甲羟戊酸浓度停止增加时(92h发酵)，结束发酵，得到含有甲羟戊酸的发酵液；
经过92h发酵，细胞量OD600最大为42.57，甲羟戊酸产量达到71.08g/L，底物转化率为26％。
发酵培养基配方为：葡萄糖酸钠80g，氯化钠80g，酵母提取物5g，玉米浆干粉5g，氯化铵10g，硫酸镁0.2g，十二水合磷酸氢二钠9.5g，磷酸二氢钾2g，10mL微量元素溶液I和1mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1L，其pH用5M NaOH水溶液调至12。
其中微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5g，氯化钙2g，加1M HCl溶液至1L。
微量元素溶液II的组成为：硫酸锌100mg，氯化锰20mg，硼酸200mg，氯化钴100mg，硫酸铜5mg，氯化镍20mg，钼酸钠20mg，加蒸馏水至1L。
本实施例的补料培养基组成：葡萄糖酸钠500g，酵母提取物5g，加蒸馏水至1L。
Claims (7)
1.一种生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
1）敲除盐单胞菌Halomonas sp. TD01中3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因phaB和PHA合成酶编码基因phaC；所述TD01保藏登记号为CGMCC No.4353；
2）将乳杆菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE lac 和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS lac 表达单元靶向整合至步骤1）所得菌株基因组G7位点；得到在G7位点整合有mvaE lac 和mvaS lac 表达单元的重组菌株Halomonas sp. TDMVA-01；
3）将粪肠球菌来源的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A合成酶编码基因mvaE ef 和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶编码基因mvaS ef 表达单元靶向整合至步骤2）所得菌株基因组G4位点，得到生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌；
所述基因phaB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述基因phaC的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述基因mvaE lac 和mvaS lac 表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述基因组G7位点的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述基因mvaE ef 和mvaS ef 表达单元的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述基因组G4位点的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.权利要求1的方法构建的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌。
3.权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在发酵生产甲羟戊酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）活化菌株：将权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60 LB固体培养基中划线，35-37 ℃培养8-16 h，得到活化菌株；
所述60 LB固体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 60 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水至1 L，调节pH为7-12；
（2）种子液的制备：将步骤（1）获得的活化菌株接种到60 LB液体培养基中，35-37 ℃，180-240 rpm培养8-16 h，将所得菌液按照体积比为1%-2%的接种量接种到新制备的60 LB液体培养基中，35-37 ℃，180-240 rpm培养8-20 h，获得种子液；
所述60 LB液体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 60 g，加蒸馏水至1 L，调节pH为7-12；
（3）摇瓶发酵：将步骤（2）获得的种子液按照体积比为1%-5%的比例接种到装有20-100mL的发酵培养基的500 mL锥形瓶中，32-37 ℃，180-240 rpm培养48-80 h，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
（1）活化菌株：将权利要求2的生产甲羟戊酸的重组盐单胞菌在60 LB固体培养基中划线，35-37 ℃培养8-16 h，得到活化菌株；
所述60 LB固体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 60 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水至1 L，调节pH为7-12；
（2）种子液的制备：将步骤（1）获得的活化菌株接种到60 LB液体培养基中，35-37 ℃，180-240 rpm培养8-16 h，将所得菌液按照体积比为1%的接种量接种到新制备的60 LB液体培养基中，35-37 ℃，180-240 rpm培养8-20 h，获得种子液；
所述60 LB液体培养基由下述组分组成：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 60 g，加蒸馏水至1 L，调节pH为7-12；
（3）发酵罐发酵：将步骤（2）获得的种子液按照体积比为1%-10%的比例接种到装有2-3L的第二种发酵培养基的5 L发酵罐中，pH始终维持7-12，在32-37 ℃，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，溶氧关联转速控制在10%-30%，在开始发酵的8小时至22小时内补加氮源，补加的氮源与第二种发酵培养基的比为1 g/L；当发酵培养基中碳源浓度降到1-5 g/L时，采用连续流加或间歇流加的方式补充补料培养基，维持碳源浓度在10-80 g/L，继续培养，当发酵液中的甲羟戊酸浓度停止增加时，结束发酵，得到含有甲羟戊酸的发酵液。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是所述发酵培养基由下述组分组成：碳源20-80 g，氯化钠40-80 g，酵母提取物1-5 g，氯化铵1-10 g，玉米浆干粉0-5 g，硫酸镁0.1-5g，十二水合磷酸氢二钠5-15 g，磷酸二氢钾1-10 g，10 mL微量元素溶液I和1 mL微量元素溶液II，加蒸馏水至1 L；调节pH为7-12；
所述碳源为葡萄糖、乙酸钠和葡萄糖酸钠中至少一种；
所述微量元素溶液I的组成为：柠檬酸铁铵5-10 g，氯化钙1-5 g，加1 M HCl水溶液至1L；
所述微量元素溶液II的组成为：硫酸锌50-200 mg，氯化锰10-50 mg，硼酸100-300 mg，氯化钴100-200 mg，硫酸铜1-10 mg，氯化镍10-50 mg，钼酸钠10-50 mg，加蒸馏水至1 L。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征是所述补料培养基的组成：500-800 g的碳源和5-50 g氮源，加蒸馏水至1 L；所述碳源为葡萄糖、葡萄糖酸钠或葡萄糖和乙酸钠的混合物；所述氮源为酵母提取物。
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