CN107354118B - 一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有γ‑松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明工程大肠杆菌是通过异源表达羟甲基戊二酰辅酶A合成酶mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶mvaE、甲羟戊酸激酶Erg12、磷酸甲羟戊酸激酶Erg8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶Erg19和异戊烯基焦磷酸异构酶Idi1来重建甲羟戊酸合成MVA途径，同时向菌体内导入香叶基焦磷酸合成酶GPPS2和γ‑松油烯合成酶TPS2，利用该基因工程菌的生物转化能力，能够高效、绿色、环保地生产γ‑松油烯。利用本发明基因工程菌发酵，γ‑松油烯的产量可达80mg/L。本发明基因工程菌以及合成γ‑松油烯的方法适用于实际工业生产。

Description

一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与 应用
技术领域
本发明涉及一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
γ-松油烯，即1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯，是一种单萜类化合物，可用做香料和食品添加剂。γ-松油烯不溶于水，溶于大多数有机溶剂和非挥发性油，能量密度为0.85g/cm3，在标准大气压下沸点为183℃，闪点为53℃，具有高能量密度、低冰点、高闪点的优点，经催化加氢或聚合后可作为高密度燃料应用于航空航天等领域，可有效的替代金刚烷、降冰片烯等高密度燃料前体。
目前γ-松油烯的来源主要是从马缨丹(Lantana camara)精油、甜橙油和松节油中分离，或通过Birch反应而得，但是耗能高，工艺流程复杂且含量较低。γ-松油烯来源的短缺限制了其作为前体在高性能燃料行业的大宗应用。近年来γ-松油烯因其在高密度燃料行业的潜在应用价值引起了人们的关注。随着合成生物学的发展，越来越多的化学品通过反应条件温和，对环境友好的生物催化法合成。目前尚没有将MVA途径及香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)和γ-松油烯合成酶(TPS2)共表达利用甘油和葡萄糖等作为碳源合成γ-松油烯的报道。
发明内容
为解决现有技术中没有以甘油或葡萄糖作为碳源合成γ-松油烯的方法，本发明提供了一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌，所述基因工程菌是在微生物中异源表达羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、焦磷酸异戊烯脂异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2得到的重组菌。
所述γ-松油烯合成酶基因TPS2来源于百里香(Thymus vulgaris)，的GenBank序列登记号为KR920616；所述香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)来源于冷衫针茅(Abiesgrandis)，的GenBank序列登记号为AAN01134.1；所述羟甲基戊二酰辅酶A合成酶mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶mvaE均来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，的GenBank序列登记号分别为AAG02439.1；所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1均来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae ATCC4040002)，的GenBank序列登记号分别为:AJS99582.1、AJS99594.1、KZV08671.1、AJU24162.1。
进一步地，所述微生物为大肠埃希式菌(E.coli)(出发菌株)。
本发明的另一目的是提供一种上述基因工程菌的构建方法，该方法是通过基因工程在大肠杆菌细胞中引入羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(mvaS)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)、甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19)和异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI1)来重建MVA途径，同时通过过量表达香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)和引入γ-松油烯合成酶(TPS2)，从而在工程大肠杆菌中实现了γ-松油烯的生物合成。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
1)羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到商品质粒pACYC-Dute1，得到重组质粒；
2)以商品质粒pTrcHis2B和甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1构建重组质粒pTrc-low；
3)将上述步骤得到的两个重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，得到大肠杆菌基因工程菌。
更进一步地，所述方法包括如下步骤：
1)先将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE以串连的方式连接到商品质粒pACYC-Dute1中，得到质粒pACYC-mvaS-mvaE，再分别将香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到质粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重组质粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2；
2)以质粒pTrcHis2B和酿酒酵母S.cerevisiae ATCC 4040002的基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装pTrc-low质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并将扩增的6个SFs片段以等摩尔比例在EP管中混匀，沸水浴使其变性，室温自然冷却，得到载体连接液；之后将载体连接液转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养过夜后，进行菌落PCR，鉴定并得到重组质粒pTrc-low；
3)将上述步骤得到的两个重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，得到大肠杆菌基因工程菌。
本发明中羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(mvaS)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(mvaE)均是由来源于美国标准菌物保藏中心的粪肠球菌(E.faecalis ATCC 700802)的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(mvaS)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)在大肠杆菌细胞内异源表达获得；甲羟戊酸激酶(Erg12)、磷酸甲羟戊酸激酶(Erg8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Erg19)和异戊烯基焦磷酸异构酶(Idi1)都是由来源于酿酒酵母(S.cerevisiae ATCC4040002)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸磷酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI1)在大肠杆菌细胞内异源表达获得；香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)是由来源于冷杉针茅(A.grandis)的香叶基焦磷酸合成酶基因(GPPS2)在大肠杆菌细胞内异源表达获得。γ-松油烯合成酶(TPS2)是由来源于百里香(T.vulgaris)的γ-松油烯合成酶基因(TPS2)在大肠杆菌细胞内异源表达获得。
在本发明所述的重组大肠杆菌构建方法中，相关质粒的构建以及感受态细胞的转化方法不受限制，可以采用本领域中已知的常规方法，即利用热激转化法将单个或两个重组质粒转移大肠杆菌感受态细胞中，采用双抗生素筛选平板对阳性转化子进行筛选。
本发明的再一目的是提供一种上述基因工程菌的应用，尤其是该基因工程菌在生物合成γ-松油烯中的应用。
在一个优选的实施方案中，所述的基因工程菌是以甘油或葡萄糖为原料生物合成γ-松油烯的。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种基因工程菌在生物合成γ-松油烯中的应用，即提供一种生物合成γ-松油烯的方法，即利用本发明中构建的重组大肠杆菌菌株，在含有合适碳源、氮源及其他生长因子的条件下，通过合适浓度诱导物的诱导，并且在培养过程中不断通入空气，大肠杆菌基因工程菌能够转化发酵液中的糖类生产γ-松油烯，利用气相色谱等检测设备，从尾气或发酵液中能够检测到γ-松油烯。
进一步地，所述的应用，包括如下步骤：
1)羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到商品质粒pACYC-Dute1，得到重组质粒；
2)以商品质粒pTrcHis2B和甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1构建重组质粒pTrc-low；
3)将上述步骤得到的两个重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，得到大肠杆菌基因工程菌；
4)利用步骤3)获得的基因工程菌以可持续再生的甘油或葡萄糖为原料在有氧条件下生物合成γ-松油烯。
更进一步地，所述应用，包括如下步骤：
1)先将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE以串连的方式连接到商品质粒pACYC-Dute1中，得到质粒pACYC-mvaS-mvaE，再分别将香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到质粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重组质粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2；
2)以质粒pTrcHis2B和酿酒酵母S.cerevisiae ATCC 4040002的基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装pTrc-low质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并将扩增的6个SFs片段以等摩尔比例在EP管中混匀，沸水浴使其变性，室温自然冷却，得到载体连接液；之后将载体连接液转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养过夜后，进行菌落PCR，鉴定并得到重组质粒pTrc-low；
3)将上述步骤得到的两个重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，得到大肠杆菌基因工程菌；
4)利用步骤3)获得的基因工程菌以可持续再生的甘油或葡萄糖为原料在有氧条件下生物合成γ-松油烯。
进一步地，步骤4)是将新鲜制备的步骤3)所得大肠杆菌基因工程菌的种子液按1％接种量接种到新鲜发酵培养基中，培养5h～10h后，待菌液OD600达到0.6～0.9时，添加诱导剂IPTG进行诱导培养，IPTG终浓度为0.05mM～0.25mM，同时盖上橡胶瓶塞,控制发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10～1/5，以保证菌体的生长处于有氧条件,将发酵瓶转入28℃～37℃、100rpm～160rpm的培养箱中振荡培养12～24h，利用气相色谱或气相色谱-质谱联用仪对产物γ-松油烯进行定性定量检测；所述新鲜发酵培养基中含有甘油或葡萄糖。
进一步地，所述新鲜发酵培养基中含有20g/L甘油或20g/L葡萄糖。
本发明所述的应用，即生物合成γ-松油烯的方法中，可使用适合于工程大肠杆菌的中等至大规模培养的任何液体培养基，例如M9液体培养基，在所述液体培养基中可以添加与所述工程大肠杆菌的抗生素抗性相对应的抗生素或组合以提高生长选择性，例如，如果在工程大肠杆菌的筛选过程中分别使用了氯霉素和氨苄霉素两种抗生素，则在摇瓶培养或发酵罐发酵中添加相同浓度的上述两种抗生素。此外，在本发明的生物合成过程中，可以在培养基中添加常规的诱导剂(例如IPTG)以进行诱导培养。
根据本发明所述的方法构建的大肠杆菌基因工程菌能够以可甘油或葡萄糖为原料生物合成单一组分的γ-松油烯。
根据本发明所述的方法构建的大肠杆菌基因工程菌，在摇瓶阶段，γ-松油烯的最高产量超过80mg/L。
所述大肠杆菌为大肠埃希式菌(E.coli)。
本发明的重组大肠杆菌细胞可在适宜条件下，在有合适的碳源和诱导剂的培养基中进行培养，在培养过程中不断通入空气，从尾气和发酵液中可以分离获得γ-松油烯产物。
本发明有益效果：
1.鉴于真核生物基因在原核宿主中表达的问题，多基因共表达的困难和微生物代谢的复杂性，是否能够通过在大肠杆菌细胞内构建MVA途径并联合香叶基焦磷酸合成酶基因(GPPS2)以及γ-松油烯合成酶基因(TPS2)构建生物法合成γ-松油烯具有较高的难度。本发明克服了上述难度，提出了一种能够以甘油和葡萄糖为原料生产高密度燃料γ-松油烯的基因工程菌，并且可以高效发酵生产γ-松油烯。利用本发明基因工程菌发酵生产γ-松油烯的产量高，高达到80mg/L，弥补了缺乏生物化工合成松油烯的空缺。
2.根据本发明构建的大肠杆菌菌株，在适宜条件下获得的产物γ-松油烯纯度高，无其他杂质出现。
3.本发明所涉及的γ-松油烯生产工艺不涉及高温、高压操作，经济、绿色，从根本上解决了目前γ-松油烯只能从植物或精油中分离提取的不足，提供了一条利用可持续的方法合成γ-松油烯，用于缓解高密度燃料行业原料不足的问题。
附图说明
图1为γ-松油烯生物合成代谢途径。
图2为羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(mvaS)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(mvaE)、香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)、γ-松油烯合成酶(TPS2)共表达载体pHW2示意图。
图3为甲羟戊酸激酶(Erg12)、磷酸甲羟戊酸激酶(Erg8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Erg19)和异戊烯基焦磷酸异构酶(Idi1)共表达载体pTrc-low示意图。
图4为工程菌合成γ-松油烯的气相-质谱检测图；
(A：气相图谱，B：质谱图谱)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1携带有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、香叶基焦磷酸合成酶和γ-松油烯合成酶编码基因的重组质粒pHW2的构建
通过分子生物学相关实验操作构建重组质粒pHW2，该重组质粒携带有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS(序列登记号为GenBank：AAG02439.1)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE(序列登记号为GenBank：AAG02439.1)、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2(序列登记号为GenBank：AAN01134.1)和γ-松油烯合成酶基因TPS2(序列登记号为GenBank：ID：KR920616)，通过该重组载体的异源表达，使上述外源基因在大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3))中过量表达，实现γ-松油烯的生物合成。
MVA途径首先在甲基戊二酰辅酶A合成酶(mvaS)和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(mvaE)的作用下将葡萄糖转化成甲羟戊酸(MVA)，然后甲羟戊酸(MVA)再在甲羟戊酸激酶(Erg12)、磷酸甲羟戊酸激酶(Erg8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Erg19)的作用下转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)，异戊烯基焦磷酸(IPP)再在异戊烯基焦磷酸异构酶(Idi1)的作用下转化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)，IPP与DMAPP在香叶基焦磷酸合成酶(GPPS2)的催化下合成单萜的前体香叶基焦磷酸(GPP)。通过继续导入松油烯合成酶基因TPS2，通过该基因的异源表达，能够将GPP转化成γ-松油烯。
以上基因序列均能够在NCBI数据库中查询获得，因此可以采用基因合成或选择合适的基因组DNA作为模板PCR扩增获得，以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
获得相应基因片段后，通过限制性内切酶NcoI和PstI，用串连的方式将羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，序列登记号为GenBank：AAG02439.1)和羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(mvaS，序列登记号为GenBank：AAG02439.1)连接到载体pACYC-Dute1(购自Novagen)中，得到重组质粒pACY-mvaS-mvaE。再将冷杉针茅(A.grandis)的香叶基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，序列登记号为GenBank:AAN01134.1)和来源于百里香(T.vulgaris)的γ-松油烯合成酶基因(TPS2，序列登记号为GenBank：ID：KR920616)，利用限制性内切酶BglII和XhoI将两个基因以串连的方式连接到pACY-mvaS-mvaE质粒中，并得到重组质粒pACY-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2(如图2所示)。
以上质粒构建方法涉及到PCR基因克隆技术、核酸合成技术、质粒限制性酶切技术、酶切片段回收技术、酶切片段连接技术等，以上方法属于成熟的分子生物学方法，不存在特殊性。
实施例2携带有甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸磷酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因和异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因的重组质粒pTrc-low的构建
pTrc-low载体根据实验室建立的DNA片段热变性组装(Lego DNA assembling)方法构建，含有来源于酿酒酵母(S.cerevisiae ATCC 4040002)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸磷酸激酶基因(ERG8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(ERG19)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI1)。DNA片段热变性组装方法已经由本实验室发表在相关国际期刊上，属于成熟的分子操作方法(PloS one 2012doi:10.1371/journal.pone.0030267.g001)。
pTrc-low载体构建过程如下：
分别以商品化质粒pTrcHis2B质粒(购自Invitrogen)和酿酒酵母(S.cerevisiaeATCC4040002)基因组为模板，扩增出质粒pTrchHis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因的片段ERG12(SF128h12，SFB12h12)；ERG8(SF128h8，SF819h8)；ERG19(SF819h19，SF19IhI)；IDI1(SF19IhI，SFIBhI)，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠延伸PCR扩增出组装质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SF。4个基因ERG12、ERG8、ERG19、IDI1之间的3个RBS序列是在PCR扩增时，通过设计引物时引入，使得4个基因在单一的Trc(trp-lac promoter)启动子作用下进行表达。表1为pTrc-low质粒构建的过程中片段扩增的引物及模板，表2为所用到的引物序列汇总。
表1片段扩增的引物与模板
Table 1PCR templates and primers for fragment construction
Figure GDA0001402658220000071
Figure GDA0001402658220000081
表2pTrc-low构建引物序列汇总
Table 2Primer sequences used to construct pTrc-low
Figure GDA0001402658220000082
将扩增的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB按等摩尔比例在1.5mLEP管中混匀，密封后沸水浴使其变性，室温自然冷却(退火)。取适量体积连接液转化大肠杆菌感受态细胞，活化后，取100μL涂布LB平板(Amp抗性)，37℃培养过夜。
对阳性转化子的酶切验证方法如下：挑取10～20个已长出的细菌菌落，将其转接到新鲜的LB培养基中，添加适当浓度的抗生素，37℃、180rpm振荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒提取质粒，分别用不同的限制性内切酶进行单酶切和双酶切鉴定，以验证重组质粒的正确性。
实施例3以甘油为原料合成γ-松油烯
1、γ-松油烯发酵
质粒转化：分别吸取2μL质粒pHW2和pTrc-low于还处于冻结状态下的大肠杆菌感受态(E.coli BL21(DE3))中，冰浴10～30min；然后在42℃水浴中热激60～90s，立即放入冰浴中静止1～3min；加入400μL的LB培养基，在37℃、180rpm摇床上活化1h；吸取100μL菌液均匀涂在含有氯霉素和氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，挑取单克隆接种于培养瓶中培养。
培养基：20g/L甘油、5g/L酵母提取物、1.5g/L MgSO4、微量元素100μL、抗生素100μL、菌液1mL，置于37℃、180rpm摇床中振荡培养。
上述微量元素为1000×微量元素母液，每100mL中含有以下无机盐：四水钼酸铵0.37g；七水硫酸锌0.29g；硼酸2.47g；五水硫酸铜0.25g；四水氯化锰1.58g。在培养基中使用的终浓度为1‰。
菌体发酵：将新鲜制备的种子液按1％接种量接种到新鲜发酵培养基中，培养5～10h后，待菌液OD600达到0.7时，添加诱导剂IPTG进行诱导培养，IPTG终浓度为0.1mM，同时盖上橡胶瓶塞，以防止产物溢出。需要控制发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10，以保证菌体的生长处于有氧条件。将发酵瓶转入28℃、100rpm的培养箱中振荡培养20h，利用气相色谱(GC)或气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对产物γ-松油烯进行定性定量检测。
2、γ-松油烯产物检测
通过气相色谱(GC)或气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对发酵产物γ-松油烯进行分析测定。GC检测系统为SP-6890型气相色谱仪(山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)，毛细管色谱柱Agilent HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)。升温程序为：初始柱温为75℃，维持0.5min；以10℃/min升温速度升至100℃，维持5min；检测器温度240℃，气化室温度为220℃。γ-松油烯的产物鉴定结果如图4-A和图4-B所示，根据气相检测结果，γ-松油烯的的产量达到80mg/L。
实施例4以葡萄糖为原料合成γ-松油烯的生物
1、γ-松油烯发酵
质粒转化：分别吸取2μL质粒pHW2和pTrc-low于还处于冻结状态下的大肠杆菌感受态(E.coli BL21(DE3))中，冰浴10～30min；然后在42℃水浴中热激60～90s，立即放入冰浴中静止1～3min；加入400μL的LB培养基，在37℃、180rpm摇床上活化1h；吸取100μL菌液均匀涂在含有氯霉素和氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养12h，挑取单克隆接种于培养瓶中培养。
培养基：20g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物、1.5g/L MgSO4、微量元素100μL、抗生素100μL、菌液1mL，置于37℃、180rpm摇床中振荡培养。
上述微量元素为1000×微量元素母液，每100mL中含有以下无机盐：四水钼酸铵0.37g；七水硫酸锌0.29g；硼酸2.47g；五水硫酸铜0.25g；四水氯化锰1.58g。在培养基中使用的终浓度为1‰。
菌体发酵：将新鲜制备的种子液按1％接种量接种到新鲜发酵培养基中，培养7h后，待菌液OD600达到0.7时，添加诱导剂IPTG进行诱导培养，IPTG终浓度为0.1mM，同时盖上橡胶瓶塞，以防止产物溢出。需要控制发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10，以保证菌体的生长处于有氧条件。将发酵瓶转入30℃、120rpm的培养箱中振荡培养20h，利用气相色谱(GC)或气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对产物γ-松油烯进行定性定量检测。
2、γ-松油烯产物检测
通过气相色谱(GC)或气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对发酵产物γ-松油烯进行分析测定。GC检测系统为SP-6890型气相色谱仪(山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)，毛细管色谱柱Agilent HP-INNOWAX(30m×0.25mm×0.25μm)。升温程序为：初始柱温为75℃，维持0.5min；以10℃/min升温速度升至100℃，维持5min；检测器温度240℃，气化室温度为220℃。γ-松油烯的产物鉴定结果如图4-A和图4-B所示，根据气相检测结果，γ-松油烯的的产量达到56mg/L。
本发明γ-松油烯生产工艺不涉及高温、高压操作，经济、绿色，从根本上解决了目前γ-松油烯只能从植物或精油中分离提取的不足，提供了一条利用可持续的方法合成γ-松油烯，用于缓解高密度燃料行业原料不足的问题。并且本发明构建的大肠杆菌菌株，在适宜条件下获得的产物γ-松油烯纯度高，无其他杂质出现。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> SF128Ws
<400> 1
tcattaccgt tcttaacttc tgcac 25
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> SF128Wa
<400> 2
attctgcatg cagctacctt aagttattta tcaagataag tttccggatc 50
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> SF819Ws
<400> 3
acccttaagg aggaaaaaaa catgtcagag ttgagagcct tca 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> SF819Wa
<400> 4
gcgatgcagc gaattgatct tattcctttg gtagaccagt ctt 43
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> SF19IWs
<400> 5
tcgcccttaa ggaggaaaaa aaaatgaccg tttacacagc atccg 45
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> SF19IWa
<400> 6
ttatagcatt ctatgaattt gcctgtc 27
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> SFIBWs
<400> 7
ccttaggagg taaaaaaaaa tgactgccga caacaatagt atgcc 45
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> SFIBWa
<400> 8
cacgaacccc ccgttcagc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> SFBWs
<400> 9
ctgcagctgg taccatatgg 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> SFBWa
<400> 10
catggtttat tcctccttat ttaat 25
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> SFB12Ws
<400> 11
cacacagccc agcttgg 17
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> SFB12Wa
<400> 12
gcaggcctat cgcaaattag cttatgaagt ccatggtaaa ttcg 44
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> SF128h12s
<400> 13
ctcccgtgga aagctagcg 19
<210> 14
<211> 70
<212> DNA
<213> SF128h12a
<400> 14
catgtttttt tcctccttaa gggtgcaggc ctatcgcaaa ttagcttatg aagtccatgg 60
taaattcgtg 70
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> SF128h8s
<400> 15
taagctaatt tgcgataggc ctgcaccctt aaggaggaaa aaaacatgtc agagttgaga 60
gccttcagt 69
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> SF128h8a
<400> 16
agattttgcc caagcccg 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> SF819h8s
<400> 17
agaaggcagt tctgccgca 19
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> SF819h8a
<400> 18
ttttttttcc tccttaaggg cgaattctgc atgcagctac cttaagttat ttatcaagat 60
aagtttccgg atc 73
<210> 19
<211> 68
<212> DNA
<213> SF819h19s
<400> 19
cttaaggtag ctgcatgcag aattcgccct taaggaggaa aaaaaaatga ccgtttacac 60
agcatccg 68
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> SF819h19a
<400> 20
tgttacagcc gcgttttgac 20
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> SF19I h19s
<400> 21
gcctcatcag ctccgcata 19
<210> 22
<211> 69
<212> DNA
<213> SF19I h19a
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gtcatttttt tttacctcct aagggcgatg cagcgaattg atcttattcc tttggtagac 60
cagtctttg 69
<210> 23
<211> 67
<212> DNA
<213> SF19IhIs
<400> 23
aataagatca attcgctgca tcgcccttag gaggtaaaaa aaaatgactg ccgacaacaa 60
tagtatg 67
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> SF19IhIa
<400> 24
tggtgggttt gtggccg 17
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> SFIBhIs
<400> 25
catgcggcta ttttgcctat 20
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> SFIBhIa
<400> 26
aattcccata tggtaccagc tgcagttata gcattctatg aatttgcctg 50
<210> 27
<211> 46
<212> DNA
<213> SFIBhBs
<400> 27
caggcaaatt catagaatgc tataactgca gctggtacca tatggg 46
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> SFIBhBa
<400> 28
cacgtagcga tagcggagtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> SFB12hBs
<400> 29
ttcaagaact ctgtagcacc 20
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> SFB12hBa
<400> 30
gcagaagtta agaacggtaa tgacatggtt tattcctcct tatt 44
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> SFB12h12s
<400> 31
attaaataag gaggaataaa ccatgtcatt accgttctta ac 42
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> SFB12h12a
<400> 32
ggtctgctta aatttcattc 20

Claims (8)

1.一种具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在微生物中异源表达羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2得到的重组菌；所述γ-松油烯合成酶基因TPS2来源于百里香（Thymus vulgaris），GenBank序列登记号为KR920616；所述香叶基焦磷酸合成酶（GPPS2）来源于冷衫针茅（Abiesgrandis），GenBank序列登记号为AAN01134.1；所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶mvaE来源于粪肠球菌（Enterococcusfaecalis），GenBank序列登记号为AAG02439.1；所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1均来源于酿酒酵母（SaccharomycescerevisiaeATCC 4040002），GenBank序列登记号分别为:AJS99582.1、AJS99594.1、KZV08671.1、AJU24162.1，出发菌株为大肠埃希氏菌（E. coli）。
2.一种权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到商品质粒pACYC-Dute1，得到重组质粒；
2）以商品质粒pTrcHis2B和甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1构建重组质粒pTrc-low；
3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）先将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE以串连的方式连接到商品质粒pACYC-Dute1中，得到质粒pACYC-mvaS-mvaE，再分别将香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到质粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重组质粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2；
2）以质粒pTrcHis2B和酿酒酵母S. cerevisiae ATCC 4040002的基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装pTrc-low质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并将扩增的6个SFs片段以等摩尔比例在EP管中混匀，沸水浴使其变性，室温自然冷却，得到载体连接液；之后将载体连接液转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养过夜后，进行菌落PCR，鉴定并得到重组质粒pTrc-low；
3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌。
4.权利要求1所述的基因工程菌在生物合成γ-松油烯中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌是以甘油或葡萄糖为原料生物合成γ-松油烯的。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到商品质粒pACYC-Dute1，得到重组质粒；
2）以质粒pTrcHis2B和甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1构建重组质粒pTrc-low；
3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌；
4）利用步骤3）获得的基因工程菌以可持续再生的甘油或葡萄糖为原料在有氧条件下生物合成γ-松油烯。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）先将羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因mvaS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE以串连的方式连接到商品质粒pACYC-Dute1中，得到质粒pACYC-mvaS-mvaE，再分别将香叶基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2连接到质粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重组质粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，将其命名为pHW2；
2）以质粒pTrcHis2B和酿酒酵母S. cerevisiae ATCC 4040002的基因组为模板，扩增出质粒pTrcHis2B的部分片段，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因片段，然后以这些片段或pTrcHis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装pTrc-low质粒的6个SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并将扩增的6个SFs片段以等摩尔比例在EP管中混匀，沸水浴使其变性，室温自然冷却，得到载体连接液；之后将载体连接液转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养过夜后，进行菌落PCR，鉴定并得到重组质粒pTrc-low；
3）将上述步骤得到的两个重组质粒导入E. coli BL21（DE3）中，得到大肠杆菌基因工程菌；
4）利用步骤3）获得的基因工程菌以可持续再生的甘油或葡萄糖为原料在有氧条件下生物合成γ-松油烯。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，步骤4）是将新鲜制备的步骤3）所得大肠杆菌基因工程菌的种子液按1%接种量接种到新鲜发酵培养基中，培养5h~10h后，待菌液OD600达到0.6~0.9时，添加诱导剂IPTG进行诱导培养，IPTG终浓度为0.05 mM ~0.25 mM，将发酵瓶转入28℃~37℃、100 rpm ~160 rpm的培养箱中振荡培养12h~24 h，对产物γ-松油烯进行定性定量检测；所述新鲜发酵培养基中含有甘油或葡萄糖。
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