CN103898149B - 一种利用蛋白支架提高大肠杆菌中异戊二烯合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用蛋白支架将大肠杆菌MEP途径中的脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶和2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶共区域化，提高异戊二烯生产的方法，属于生物化工领域。本发明从枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中分别克隆了所需靶酶分子的基因，构建成增强MEP代谢途径的重组质粒，合成银白杨异戊二烯合成酶基因并构建外源表达蛋白支架以及异戊二烯合成酶的重组质粒，将两种重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得可以通过蛋白支架将三种靶酶分子共区域化提高异戊二烯合成的大肠杆菌工程菌株。

Description

一种利用蛋白支架提高大肠杆菌中异戊二烯合成的方法

技术领域

本发明涉及一种提高大肠杆菌中异戊二烯合成的方法，属于生物化工领域。

背景技术

异戊二烯即2-甲基-1，3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，作为一种重要的五碳平台化合物用途十分广泛，主要用于橡胶工业（如：轮胎，粘合剂的生产），是合成橡胶（SR）的重要单体，其用量约占异戊二烯总产量的95%，主要用于合成异戊橡胶（IR）以及丁基橡胶（IIR），其次，在精细化工领域还可以作为合成香精香料、维生素E、农药的原料，也可用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等，除此之外，生物来源的异戊二烯还可以加工成航空燃料，高分子材料等，在天然产物方面，异戊二烯也是合成萜类化合物的前体物质。

工业上生产异戊二烯的方法有很多种，目前异戊二烯的生产方法主要有C5馏分萃取蒸馏法，异戊烷、异戊烯催化脱氢法，以及化学合成法。异戊二烯的化学法全合成过程复杂、原料难得、成本较高，而且随着化石燃料的消耗以及人们对环境问题的关注，利用生物法合成异戊二烯将具有不可比拟的优势。虽然植物可以释放少量的异戊二烯，但通过收集植物释放的异戊二烯操作困难，效率低，远远不能满足市场需求。利用微生物如大肠杆菌、酿酒酵母等进行发酵生产异戊二烯具有的优点包括，产物易于收集，纯化加工，微生物生长速度快、繁殖周期短、发酵成本低、易操作等，而且与植物相比这些微生物的遗传背景更加清晰，更易于进行遗传改造。

异戊二烯的生物合成方法主要依靠自然界中萜类代谢途径的酶系，即甲羟戊酸途径（MVApathway）和非甲羟戊酸途径（MEPpathway），异戊二烯经萜类共同合成途径的中间产物二甲基丙烯基焦磷酸及异戊二烯焦磷酸，通过异戊二烯合成酶催化形成，因此，增加异戊二烯前体物质二甲基丙烯基焦磷酸的积累量是提高异戊二烯产量的重要条件之一。另外，目前在微生物中还未发现异戊二烯合成酶，因此，异源表达植物来源的异戊二烯合成酶是实现微生物合成异戊二烯的必要条件。在工程大肠杆菌中利用MVA途径进行异戊二烯的生产已经取得一定的研究结果，相关研究表明MEP途径较于MVA途径具有更高的理论产率，而且通过模拟自然界中存在的多酶复合体拉近途径中的酶分子可以有效的增强底物隧道效应，缩短底物在酶分子之间的传输距离及时间，减少中间代谢产物扩散到主体相的损失，因此实现利用MEP途径生产异戊二烯将有助于生物法合成异戊二烯进一步的研究，利用蛋白支架将异戊二烯合成过程中的酶分子共区域化可以为异戊二烯的微生物法高效合成提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是为了解决化学法合成异戊二烯存在的问题，以及目前生物法合成异戊二烯过程中存在的不足等（如通过简单提高关键酶的表达量和酶活而造成代谢流不平衡），提供一种提高异戊二烯产量的新方法，该方法是利用蛋白支架将MEP途径中的三种酶分子共区域化，通过缩短底物在酶分子之间的传输距离及时间增强底物隧道效应，从而提高异戊二烯前体物质DMAPP及IPP的积累量，再表达植物来源的经密码子优化的异戊二烯合成酶实现异戊二烯的合成。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种提高异戊二烯合成量的大肠杆菌工程菌株构建方法，从枯草芽孢杆菌SL-14（Bacillussubtilis）中克隆脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因DXS，脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因DXR，从大肠杆菌C600（Escherichiacoli）中克隆2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶基因IspD，将三个靶酶基因分别与支架蛋白的配体通过一段甘氨酸与丝氨酸组成的九肽连接，将获得的基因片段通过Gibson组装的方法与pET28a质粒构建成重组质粒pET28a-scaffold。将银白杨（Populusalba）的异戊二烯合成酶基因IspS密码子优化并合成，与支架蛋白以及pET21b质粒进行Gibson组装，构建成重组质粒pET21b-GSP-IspS，将两种重组质粒共同转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得工程菌株BL21(DE3)-ScaS。

本发明的大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)-ScaS，其中强化表达了脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶DXS，脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR，2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶IspD，导入了外源的蛋白支架和异戊二烯合成酶IspS，其中DXS、DXR及IspD在大肠杆菌细胞质内表达后可在蛋白支架的作用下共区域化而发挥作用。

本发明通过蛋白支架方法获得的大肠杆菌工程菌株能够发酵生产异戊二烯并提高其产量，具有以下优点：

1、本发明构建的异戊二烯工程菌株中重组质粒的构建采用Gibson组装的方式进行连接，实现了多个片段的同时组装，与传统的限制性酶切、连接组装方法相比，不需要重复的酶切和连接反应，基因操作容易，基因组装过程高效省时，简化了实验步骤。

2、本发明构建的异戊二烯工程菌，有效的增强了MEP途径的代谢流，并利用蛋白支架将靶酶分子共区域化，组装成多酶复合体发挥催化作用，与游离形式过表达三种靶酶相比，异戊二烯的产量从17.68mg/L提高到24mg/L。

附图说明

图1是本发明实验例中大肠杆菌工程菌发酵生产异戊二烯的气相色谱图；

图2是本发明实验例中大肠杆菌工程菌发酵生产异戊二烯的气相-质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：大肠杆菌工程菌株的构建

1、从枯草芽孢杆菌SL-14（Bacillussubtilis）中克隆出脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶的基因片段DXS以及脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶的基因片段DXR，从大肠杆菌C600（Escherichiacoli）中克隆出2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶的基因片段IspD，将克隆的三个基因分别与支架蛋白GBD、SH3及PDZ的配体GBDlig、SH3lig、PDZlig通过一段甘氨酸与丝氨酸组成的九肽连接，获得的片段DXS-L-GBDlig、DXR-L-SH3lig、IspD-L-PDZlig。

扩增引物序列为：

引物1：5’>TTGGATCTTTTATCAATACA<3’

引物2：5’>CAGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCTGATCCAATTCCTTTGTGTG<3’，引物1和2用于DXS基因片段的扩增。

引物3：5’>CCACCAAAGACACACAAAGGAATTGGATCAGGTTCTGGTTCTGGTTCTGG<3’

引物4：5’>TTAGTCTTCGTCTTCGTCACCAG<3’，引物3和4用于GBDlig基因片段的扩增。

引物5：5’>TTGAAAAATATTTGTCTTTT<3’

引物6：5’>GGCGGACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCTGTGAGTATTGAATTGACGT<3’引物5和6用于DXR-L-SH3lig基因片段的扩增。

引物7：5’>TTATGTATTCTCCTGATGGA<3’

引物8：5’>AACCAGAGATTCTTTAACACCACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCATGGCAACCACTCATTTGGA<3’引物7和8用于IspD-L-PDZlig基因片段的扩增。

2、分别以克隆得到的基因片段DXS-L-GBDlig、DXR-L-SH3lig、IspD-L-PDZlig为模板，分别扩增得到添加了核糖体识别序列RBS并可用于Gibson组装的基因片段T7-DXS、RBS1-DXR、RBS2-IspD。

扩增引物序列为：

引物9：5’>CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATGGATCTTTTATCAATACA<3’，下划线序列为与pET28a质粒重叠序列。

引物10：5’>TAAAAGACAAATATTTTTCATACTAGTTTTCTCCTCTTTTTAGTCTTCGTCTTCGTCAC<3’，下划线序列为与DXR-L-SH3lig基因片段及RBS1重叠序列。引物9和10用于扩增Gibson组装的T7-DXS基因片段。

引物11：5’>GGTGACGAAGACGAAGACTAAAAAGAGGAGAAAACTAGTATGAAAAATATTTGTCTTTT<3’，下划线序列为与DXS-L-GBDlig基因片段及RBS1重叠序列。

引物12：5’>CAAATGAGTGGTTGCCATACTAGTTTTCTCCTCTTTAATTTAACGACGACGTTTCGGCG<3’，下划线序列为与IspD-L-PDZlig基因片段及RBS2重叠序列。引物11和12用于扩增Gibson组装的RBS1-DXR基因片段。

引物13：5’>CCGAAACGTCGTCGTTAAATTAAAGAGGAGAAAACTAGTATGGCAACCACTCATTTGGA<3’，下划线序列为与DXR-L-SH3lig基因片段及RBS2重叠序列。

引物14：5’>TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTAAACCAGAGATTCTTTAA<3’，下划线序列为与pET28a质粒重叠序列。引物13和14用于扩增Gibson组装的RBS2-IspD基因片段。

3、从Genbank基因库中查询获得银白杨异戊二烯合成酶IspS的基因片段，利用大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化并合成IspS基因片段。

引物序列为：

引物15：5’>GTTTCTCCGTACTTCAAATAAAAAGAGGAGAAAACTAGTATGCTCTGTTTCTACCGAAA<3’

引物16：5’>TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTAACGTTCGAACGGCAGGA<3’，引物15和16用于扩增Gibson组装的IspS基因片段。

4、将获得的基因片段T7-DXS、RBS1-DXR、RBS2-IspD通过Gibson组装的方法与双酶切回收后的pET28a质粒构建成重组质粒pET28a-scaffold，表达增强MEP途径的多基因串联表达盒T7-DXS-RBS1-DXR-RBS2-IspD，将酶切回收得到的蛋白支架基因GBD-SH3-PDZ以及异戊二烯合成酶基因IspS与双酶切回收后的pET-21b质粒通过Gibson组装的方法构建外源表达异戊二烯合成酶的重组质粒pET21b-GSP-IspS，具体过程如下：

利用引物1和引物2，以枯草芽孢杆菌SL-14（Bacillussubtilis）基因组为模板，克隆得到脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶DXS的基因片段；

利用引物3和引物4，以pUC57-GBDlig质粒为模板，克隆得到支架蛋白配体GBDlig的基因片段；

利用引物1和引物4，以基因片段DXS和GBDlig为模板，扩增得到基因片段DXS-L-GBDlig；

利用引物5和引物6，以枯草芽孢杆菌SL-14（Bacillussubtilis）基因组为模板，克隆得到添加了支架蛋白配体SH3lig的脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因片段DXR-L-SH3lig；

利用引物7和引物8，以大肠杆菌C600（Escherichiacoli）基因组为模板，克隆得到添加了支架蛋白配体PDZlig的2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶基因片段IspD-L-PDZlig；

利用引物9和引物10，以基因片段DXS-L-GBDlig为模板，克隆得到可用于Gibson组装的基因片段T7-DXS；

利用引物11和引物12，以基因片段DXR-L-SH3lig为模板，克隆得到添加了核糖体识别序列RBS1并可用于Gibson组装的基因片段RBS1-DXR；

利用引物13和引物14，以基因片段IspD-L-PDZlig为模板，克隆得到添加了核糖体识别序列RBS2并可用于Gibson组装的基因片段RBS2-IspD；

将回收纯化后得到的基因片段T7-DXS、RBS1-DXR、RBS2-IspD与利用NcoI与XhoI双酶切得到的pET28a线性化质粒通过Nanodrop测定DNA浓度，根据浓度不同进行混合，利用Gibson组装形成环状质粒，进行大肠杆菌Top10的转化；

利用引物15和引物16，以pUC19-IspS为模板，克隆得到异戊二烯合成酶IspS的基因片段；将IspS、GBD-SH3-PDZ及pET21b质粒通过Nanodrop测定DNA浓度，按照浓度不同进行混合，利用Gibson组装形成环状质粒，进行大肠杆菌Top10的转化；

5、通过菌落PCR验证及提取质粒酶切验证分别获得阳性转化子，提取重组质粒pET28a-scaffold及pET21b-GSP-IspS；

6、将重组质粒pET28a-scaffold及pET21b-GSP-IspS共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌BL21(DE3)-ScaS，并进行鉴定验证。将共转化后的大肠杆菌BL21(DE3)涂布在含有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的平板上，由于pET28a含有卡那霉素抗性基因，转化成功的工程菌株在卡那霉素的平板上生长，由于pET21b含有氨苄青霉素抗性基因，转化成功的工程菌株也可以在氨苄青霉素的平板上生长，并进一步验证获得阳性菌株。

实施例2：大肠杆菌工程菌株发酵生产异戊二烯的验证

将筛选出工程菌株的单菌落接种到LB培养基中，37℃摇瓶培养过夜后作为种子液按照接种量为1%转接到新鲜的LB培养基中，37℃，170rpm培养至OD600为0.6-0.8时加入0.1mM的IPTG进行诱导并进行密封培养，诱导温度为20℃，培养24小时后，将摇瓶在60℃下处理30min，抽取1mL顶空气体进行检测，以异戊二烯标准品作为参照。气相检测系统采用岛津GC2010气相色谱仪，色谱柱为TG-5，检测器为火焰离子化检测器，气化室温度100℃，检测器温度200℃。气相色谱分析结果中箭头所示的峰与异戊二烯标准品相对保留时间相同，均为2.69分钟，为进一步分析该峰结构，利用安装有Agilent色谱柱DB-1（30m*0.25mm*0.25um）的岛津气相色谱-质谱联用仪GCMS-QP2010进行气质分析，结果显示该峰为异戊二烯（图2）。结果说明工程菌中成功导入了异戊二烯合成酶，能够合成异戊二烯。

实施例3：大肠杆菌工程菌株发酵实验

将工程菌株的单菌落接种到LB培养基中，37℃摇瓶培养过夜后作为种子液按照接种量为1%转接到新鲜的LB培养基中，37℃，170rpm培养至OD600为0.6-0.8时加入0.1mM的IPTG进行诱导并进行密封培养，诱导温度为20℃，培养24小时后气相检测，异戊二烯的产量达到24mg/L。

Claims (4)

1.一种提高大肠杆菌异戊二烯合成的方法，其特征在于：利用支架蛋白将脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)及2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶(IspD)共区域化，提高异戊二烯前体物质二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)及异戊二烯焦磷酸(IPP)的积累量，再通过表达植物来源的异戊二烯合成酶(IspS)实现异戊二烯的合成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)及2-甲基赤藓糖醇-4-焦磷酸合成酶(IspD)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)枯草芽孢杆菌，或3)其他生物中具有相同或相似功能的基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述支架蛋白是起到能使酶分子共区域化的蛋白，包括通过成对的相互作用蛋白质、蛋白结构域和多肽链构建的蛋白支架，通过自组装蛋白质构建的蛋白支架和通过借助化学修饰蛋白构建的蛋白支架等。

4.如权利要求1所述方法所构建的大肠杆菌工程菌株在发酵生产异戊二烯中的应用。