JPWO2015080273A1 - イソプレンモノマーの製造方法 - Google Patents

イソプレンモノマーの製造方法 Download PDF

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義教 田島
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Abstract

本発明は、イソプレン生産能を向上させる生物学的方法を提供する。具体的には、本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上したイソプレンシンターゼ発現微生物、および当該イソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。当該微生物は、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能、またはメバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有していてもよい。

Description

本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上したイソプレンシンターゼ発現微生物、および当該イソプレンシンターゼ発現微生物を用いるイソプレンモノマーの製造方法などに関する。
タイヤ業界及びゴム工業界において、天然ゴムは非常に重要な原材料である。新興国を中心とするモータリゼーションで今後需要が拡大していく中で、森林伐採規制やパームとの競合で農園拡大は容易でないことから天然ゴムの収量増加は見込みにくく、需給バランスはタイトになっていくことが予想される。天然ゴムに代わる材料として、合成ポリイソプレンがあるが、原料モノマー（イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン））は、主にナフサのクラッキングにより得られたＣ５留分から抽出することで得られる。しかし近年、クラッカーのフィードのライト化に伴い、イソプレンの生産量は減少傾向にあり、供給が懸念されている。また、近年では石油価格の変動の影響も強く受けることから、イソプレンモノマーの安定した確保のために、非石油資源由来でイソプレンを安価に生産する系の確立が要望されている。
このような要望に対して、単離された葛又はポプラ由来のイソプレンシンターゼ遺伝子及びこれらの変異体を発酵生産用の菌に組み込むことにより得られる形質転換体を用いて、イソプレンモノマーを生産する方法が開示されている（特許文献１〜４参照）。
イソプレンシンターゼの反応機構も既に明らかになっており、ＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を基質として、ピロリン酸とイソプレンを生成する（非特許文献１）。また、生成物であるピロリン酸がイソプレンシンターゼの活性に及ぼす影響として、柳由来（Ｓａｌｉｘ ｄｉｓｃｏｌｏｒ Ｌ．）のイソプレンシンターゼの酵素活性が、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムにより低下する事が知られていた（非特許文献２）。発酵生産菌として幅広く利用されているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの野生株などでは、ピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質により、細胞内のピロリン酸濃度が０．５ｍＭ程度に維持されている事が知られている（非特許文献３）。
しかしながら、イソプレンを過剰に生産する微生物内のピロリン酸濃度に関する知見は無い。したがって、このような微生物においてピロリン酸がイソプレンシンターゼの活性を低下させるかについては未知であり、また、イソプレン生産能に及ぼすピロリン酸の影響についても未知であった。
特表２０１１−５０５８４１号公報 特表２０１１−５１８５６４号公報 国際公開第２０１０／０３１０７６号 国際公開第２０１４／０５２０５４号
Ｇａｒｙ Ｍ． Ｓｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｒａｙ Ｆａｌｌ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９１） ９７：１５８８−１５９１ Ｍａｒｙ Ｃ． ｗｉｌｄｅｒｍｕｔｈ ａｎｄ Ｒａｙ Ｆａｌｌ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９８） １１６：１１１１−１１２３ Ｋｕｋｋｏ−Ｋａｌｓｋｅ Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８９） １７１：４４９８−４５００
本発明は、イソプレン生産に優れる生物学的方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、イソプレンシンターゼ発現微生物においてピロリン酸ホスファターゼの発現量を向上させることにより、イソプレンモノマー生産能が向上することなどを見出し、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレンシンターゼ発現微生物。
〔２〕前記微生物が、イソプレンシンターゼ発現ベクターで形質転換された微生物である。〔１〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔３〕ピロリン酸ホスファターゼが前記微生物に対して同種である、〔１〕または〔２〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔４〕ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上が、前記微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼのプロモーター領域の改変によるものである、〔３〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔５〕ピロリン酸フォスファターゼの発現の向上が、ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数の上昇によるものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔６〕前記微生物が、腸内細菌科に属する微生物に由来する、〔１〕〜〔５〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔７〕前記微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔１〕〜〔６〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔８〕前記微生物がエシェリヒア属細菌である、〔７〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔９〕前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、〔８〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１０〕前記微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、〔１〕〜〔７〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１１〕前記微生物がパントエア属細菌である、〔１〕〜〔７〕および〔１０〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１２〕前記パントエア属細菌がパントエア・アナナティスである、〔１１〕のイソプレンシンターゼ発現微生物。
〔１３〕〔１〕〜〔１２〕のいずれかのイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
〔１４〕以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
（Ｉ）〔１３〕の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
〔１５〕〔１３〕の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
〔１６〕〔１５〕のポリマーを含むゴム組成物。
〔１７〕〔１６〕のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレン生産能に優れ、また、グルコース収率も顕著に改善される。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物はまた、ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上に伴って、その生育も改善される（例、図１３を参照）。
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＰＰＡの発現解析を示す図である。レーン１，２のＣｏｎｔｒｏｌはＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株から調製したサンプルを意味する。レーン３，４のＰｔａｃ−ｐｐａは、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株から調製したサンプルを意味する。Ｍはタンパク質分子量マーカーを意味する。 図２は、種々の植物の葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量を示す図である。 図３は、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を示す図である。 図４は、染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。 図５は、染色体におけるｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流とその周辺領域の概要を示す図である。 図６は、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ プラスミドのマップを示す図である。 図７は、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のマップを示す図である。 図８は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のマップを示す図である。 図９は、ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＣ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｂ）は、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１０は、ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるａｍｐＨ遺伝子のλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｂ）は、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１１は、ｐＥＡ３２０メガプラミドのΔｃｒｔ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体の構築を示す図である。Ａ）は、ｐＥＡ３２０メガプラスミド中に配置されたＰ． ａｎａｎａｔｉｓ ｃｒｔローカスの構造を示す図である。Ｂ）は、ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントによるｃｒｔオペロンのλＲｅｄ依存性置換を示す。Ｃ）は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドのｐｈｉ８０Ｉｎｔ依存性組込みを示す。Ｄ）は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分のｐｈｉ８０Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性除去を示す。 図１２は、ＡＧ１０２６５株におけるピロリン酸ホスファターゼのタンパク質発現量を示す図である。２１．７ｋＤはＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子によりコードされるピロリン酸ホスファターゼの想定分子量を示し、１９．８ｋＤはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子遺伝子によりコードされるピロリン酸ホスファターゼの想定分子量を示す。レーン１：ＡＧ１０２６５株由来可溶性タンパク質；レーン２〜４：ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株由来可溶性タンパク質；レーン５〜６：ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株由来可溶性タンパク質；Ｍ：分子量マーカー。 図１３は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養における生育変化を示す図である。 図１４は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養におけるイソプレン生産量を示す図である。バッチ（Ｂａｔｃｈ）当たりのイソプレン生産量（ｍｇ）を記す。 図１５は、ｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳのマップを示す図である。 図１６は、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳ染色体固定用プラスミドを示す図である。 図１７は、ＰｐｈｏＣの転写制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを示す図である。 図１８は、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターの構築を示す図である。 図１９は、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ組込み型発現ベクターを示す図である。 図２０は、化学合成ＫＤｙＩオペロン中のコドン最適化を示す図である。 図２１は、最適化コドンを有するＫＤｙＩオペロンを保持する、（Ａ）ｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、および（Ｂ）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの組込み型プラスミドを示す図である。 図２２は、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のメバロン酸キナーゼ遺伝子を保持する組込み型プラスミドを示す図である。 図２３は、（Ａ）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、（Ｂ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、および（Ｃ）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム改変体のマップを示す図である。 図２４は、（Ａ）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）、および（Ｂ）Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｘ）のゲノム改変物のマップを示す図である。 図２５は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ、及び（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩの染色体改変物のマップを示す図である。 図２６は、（Ａ）ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ、および（Ｂ）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳの染色体改変物のマップを示す図である。 図２７は、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａにおけるＰＰＡの発現確認を示す図である。ＣｏｎｔはＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ株由来サンプル、ＭＧ−ｐｐａはＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ株由来サンプルを泳動したことを表す。
本発明は、ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレン発現微生物を提供する。
ピロリン酸ホスファターゼは、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する酵素である。ピロリン酸ホスファターゼとしては、例えば、宿主として後述する微生物に由来するピロリン酸ホスファターゼが挙げられる。ピロリン酸ホスファターゼとしてはまた、腸内細菌科に属する微生物、特に、後述する微生物のうち腸内細菌科に属する微生物に由来するピロリン酸ホスファターゼも好ましい。
具体的には、ピロリン酸ホスファターゼは、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
ピロリン酸ホスファターゼはまた、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。ピロリン酸ホスファターゼ活性とは、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する活性をいう。
ピロリン酸ホスファターゼはさらに、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつピロリン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。
ピロリン酸ホスファターゼ活性は、同一条件（例、緩衝液、濃度、温度、反応時間）で測定された場合、配列番号１３６、配列番号１３７、または配列番号１３８のアミノ酸配列からなるタンパク質のピロリン酸ホスファターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
アミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ Ｓｉｚｅ ｔｏ Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
ピロリン酸ホスファターゼは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、ピロリン酸ホスファターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
イソプレンシンターゼ発現微生物におけるピロリン酸ホスファターゼの発現の向上は、イソプレンシンターゼ発現微生物において発現されるピロリン酸ホスファターゼの量を増加させる任意の様式で行うことができる。イソプレンシンターゼ発現微生物において発現が向上されるべきピロリン酸ホスファターゼは、イソプレンシンターゼおよび／またはイソプレンシンターゼ発現微生物に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のピロリン酸ホスファターゼである。イソプレンシンターゼ発現微生物に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）のピロリン酸ホスファターゼは、イソプレンシンターゼ発現微生物に固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）のピロリン酸ホスファターゼであってもよく、または外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）のピロリン酸ホスファターゼであってもよい。イソプレンシンターゼ発現微生物において発現が向上されるべきピロリン酸ホスファターゼはまた、１種または複数種（例、２または３個）であってもよい。
イソプレンシンターゼ発現微生物におけるピロリン酸ホスファターゼの発現の向上は、例えば、イソプレンシンターゼ発現微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の周辺領域を改変することにより、またはピロリン酸ホスファターゼ発現ベクターでイソプレンシンターゼ発現微生物を形質転換して、ピロリン酸ホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位をイソプレンシンターゼ発現微生物に導入することにより、行われてもよい。本発明で用いられる発現ベクターはまた、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする１以上の領域をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明で用いられる発現ベクターは、所定のポリヌクレオチドを含む発現単位が一対の相同領域（例、宿主ゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位とは、発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生を可能にする単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。
本発明で用いられる発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させるベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、上述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。
ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子について改変されるべき周辺領域としては、例えば、プロモーター領域、シャインダルガノ（ＳＤ）配列、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域（特に、開始コドンのすぐ上流の配列（５’−ＵＴＲ））が挙げられる。改変としては、例えば、上記周辺領域における１〜複数個（例、１〜５００、１〜３００、１〜２００または１〜１００個）のヌクレオチドの置換、挿入または欠失が挙げられる。好ましくは、周辺領域の改変は、プロモーター領域の置換、および必要に応じてＳＤ配列の置換である。置換後に導入されるべきプロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）、ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）等の誘導プロモーターが挙げられる。ＳＤ配列の置換後に導入されるべき配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Ｏｌｉｎｓ Ｐ． Ｏ． ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８８，７３，２２７−２３５）。
本発明においては、ピロリン酸フォスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数が上昇することにより、活性が強化されていることが望ましい。染色体上に複数コピー、望ましくは２コピー以上、さらに好ましくは３コピー以上搭載されていることが好ましい。コピー数の上昇は、ピロリン酸フォスファターゼ遺伝子を搭載するプラスミドを宿主細胞に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Ｍｕファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にピロリン酸フォスファターゼ遺伝子を転移させることによっても達成できる。
イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼを産生する微生物である。好ましくは、イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼ発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、イソプレンシンターゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現単位を宿主細胞に導入することにより得られる微生物である。発現単位および発現ベクターは、上述のとおりである。イソプレンシンターゼ発現微生物においては、複数コピー、望ましくは２コピー以上、さらに好ましくは３コピー以上のイソプレンシンターゼ遺伝子がその染色体上に搭載されていることが好ましい。このようなイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼ発現ベクターを宿主に導入することにより得ることができる。また、このようなイソプレンシンターゼ発現微生物は、トランスポゾン、Ｍｕファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にイソプレンシンターゼ遺伝子を転移させることによっても得ることができる。宿主細胞は、イソプレンシンターゼに対して同種であっても異種であってもよいが、異種であることが好ましい。イソプレンシンターゼ発現ベクター中に含まれるイソプレンシンターゼ遺伝子としては、例えば、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ）、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔａ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｒｉａ）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、茶ノ木（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）由来イソプレンシンターゼ遺伝子等が挙げられる（例、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ６７ （４），１０２６−１０４０（２０１３）を参照）。イソプレンシンターゼ発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、イソプレンシンターゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターまたは誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。好ましくは、イソプレンシンターゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。構成型プロモーターとしては、例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、およびＳＰ６プロモーターが挙げられる。
一実施形態では、イソプレンシンターゼは、例えば、以下のタンパク質であってもよい：
１）葛に由来し得る全長タンパク質（配列番号８のアミノ酸配列）；
２）上記１）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号８のアミノ酸配列において１〜４５番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
３）ポプラに由来し得る全長タンパク質（配列番号１１のアミノ酸配列）；
４）上記３）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号１１のアミノ酸配列において１〜３７番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）；
５）ムクナに由来し得る全長タンパク質（配列番号７のアミノ酸配列）；および
６）上記５）の全長タンパク質から葉緑体移行シグナルが除去されたタンパク質（配列番号１４６のアミノ酸配列において１〜４４番目のアミノ酸残基が除去されたアミノ酸配列）。
好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、葛に由来し得る。別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ポプラに由来し得る。さらに別の好ましい実施形態では、イソプレンシンターゼは、ムクナに由来し得る。
別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）〜６）のタンパク質のアミノ酸配列に対して７０％以上のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列同一性％は、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列同一性％は、上述したとおり決定することができる。イソプレンシンターゼ活性とは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からイソプレンを生成する活性をいう。
さらに別の実施形態では、イソプレンシンターゼは、上記１）〜６）のタンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が変異しているアミノ酸配列を含み、かつイソプレンシンターゼ活性を有するタンパク質である。アミノ酸残基の変異としては、例えば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入が挙げられる。１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個もしくは数個」は、タンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１もしくは数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個である。
イソプレンシンターゼ活性は、同一条件（例、緩衝液、濃度、温度、反応時間）で測定された場合、上記１）〜６）のタンパク質のイソプレンシンターゼ活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。また、イソプレンシンターゼは、安定性の観点から、所定の緩衝液〔例、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液〕中で４℃にて４８時間保存した場合に、残存活性が３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上または６５％以上であることが好ましい。
イソプレンシンターゼは、目的活性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に変異が導入されていてもよい。目的活性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に自明である。具体的には、当業者は、１）同種の活性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、イソプレンシンターゼのアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、上述したような保存的置換であってもよい。
好ましくは、イソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンシンターゼに加えて、メバロン酸キナーゼを発現する微生物であってもよい。したがって、イソプレンシンターゼ発現微生物は、メバロン酸キナーゼ発現ベクターが宿主に導入されていてもよい。メバロン酸キナーゼ発現ベクターにより宿主に導入されるべきメバロン酸キナーゼ遺伝子としては、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）等のメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）等のメタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ）等のメタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、およびニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）等のニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物の遺伝子が挙げられる。メバロン酸キナーゼ発現ベクターは、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。発現ベクターにおいて、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、上述したような構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。好ましくは、メバロン酸キナーゼをコードする遺伝子は、構成型プロモーターの制御下に配置され得る。
本発明で用いられるイソプレンシンターゼ発現微生物（宿主細胞）としては、細菌又は真菌が好ましい。細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。イソプレンシンターゼ発現微生物としては、腸内細菌科に属する微生物、特に後述する微生物のうち腸内細菌科に属する微生物もまた好ましい。
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。
グラム陰性細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された株を使用してもよい。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開０９５２２２１号に開示されるパントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５）、およびパントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株が挙げられる。ＳＣ１７（０）は、２００５年９月２１にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ），ＧＮＩＩ Ｇｅｎｅｔｉｋａ）（住所：Ｒｕｓｓｉａ，１１７５４５ Ｍｏｓｃｏｗ，１ Ｄｏｒｏｚｈｎｙ ｐｒｏｅｚｄ．１）に受託番号ＶＫＰＭ Ｂ−９２４６のもとに寄託されている。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開０９５２２２１号に例示された菌株を使用してもよい。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００７ Ｍａｒ ２７；９８（２）：３４０−３４８）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、さらにイソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する経路が強化されていてもよい。このような強化のため、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換能を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼの発現ベクターが、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入されてもよい。また、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生成に関連するメバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の発現ベクターが、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入されてもよい。このような酵素の発現ベクターは、組込み型ベクターであっても、非組込み型ベクターであってもよい。このような酵素の発現ベクターはさらに、メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する複数の酵素（例、１種、２種、３種または４種以上）を一緒または個別に発現するものであってもよく、例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現ベクターであってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する１以上の酵素の由来は、宿主に対して同種であってもよいし、異種であってもよい。メバロン酸経路および／またはメチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素の由来が宿主に対して異種である場合、例えば、宿主が上述したような細菌（例、大腸菌）であり、かつ、メバロン酸経路に関与する酵素が真菌（例、サッカロミセス・セレビシエ）に由来するものであってもよい。また、宿主が、メチルエリスリトールリン酸経路に関与する酵素を固有に産生するものである場合、宿主に導入される発現ベクターは、メバロン酸経路に関与する酵素を発現するものであってもよい。
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（ＥＣ:５．３．３．２）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９７１４８）、およびＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７３６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＡＡＧ０２４３９）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関与する１以上の酵素（例、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ）をコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＩＤ ＮＰ＿５６７９６５）が挙げられる。発現ベクターにおいて、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関与する１以上の酵素をコードする遺伝子は、後述の増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下に配置されてもよい。
遺伝子が組込まれた発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
更に、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物において、イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。このような酵素としては、ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートに転換する１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートシンターゼ；イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リン酸に転換するイソペンチルジホスフェートイソメラーゼ等が挙げられる。発現ベクターにおいて、ジメチルアリル二リン酸を合成するメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路の酵素をコードする遺伝子は、上述したような構成型プロモーター、または誘導型プロモーター（例、後述の増殖促進剤逆依存プロモーター）の制御下に配置され得る。
イソプレンの基質であるＤＭＡＰＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、ペプチドグリカンや電子受容体（メナキノン等）の前駆体であり、微生物の増殖に必須であることが知られている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８６；９９：１１３７−１１４６）。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、効率的なイソプレンの製造の観点から、微生物の増殖期に対応する工程１）（十分な濃度の増殖促進剤の存在下でイソプレン発現微生物を培養して、イソプレン発現微生物を増殖させること）、およびイソプレンの生成期に対応する工程３）（イソプレン発現微生物を培養してイソプレンモノマーを生成すること）が分離された、イソプレンの製造方法で用いられてもよい。また、このイソプレンの製造方法は、微生物の増殖期からイソプレンの生成期に移行させるため、イソプレン生成の誘導期に対応する工程２）（増殖促進剤の十分な濃度を減少させて、イソプレン発現微生物によるイソプレンモノマーの生成を誘導すること）を含んでいてもよい。
本発明では、増殖促進剤とは、微生物により消費され得る、微生物の増殖に必須の因子または微生物の増殖の促進作用を有する因子であって、微生物により消費され培地中の量が減少すると微生物の増殖が喪失または低減するものをいう。例えば、ある量の増殖促進剤を用いた場合、その量の増殖促進剤が消費されるまで微生物は増殖し続けるが、一旦増殖促進剤が全て消費されると、微生物は増殖し得ず、または増殖速度が低下し得る。したがって、増殖促進剤により、微生物の増殖の程度を調節することができる。このような増殖促進剤としては、例えば、酸素（ガス）等の物質；鉄、マグネシウム、カリウム、カルシウムのイオン等のミネラル；リン酸（例、モノリン酸、ニリン酸、ポリリン酸）またはその塩等のリン化合物；アンモニア、硝酸、亜硝酸、尿素等の窒素化合物（ガス）；硫酸アンモニウム、チオ硫酸等の硫黄化合物；ビタミン（例、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、アスコルビン酸）、およびアミノ酸（例、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチヂン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、セレノシステイン）等の栄養素が挙げられる。本発明の方法では、１種の増殖促進剤を用いてもよいし、２種以上の増殖促進剤を組み合わせて用いてもよい。
増殖促進剤が用いられる場合、本発明のイソプレン発現微生物は、増殖促進剤に依存して増殖する能力、および増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレンを生成する能力を有していてもよい。イソプレン生成微生物は、イソプレン生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下で、増殖できる。ここで、「十分な濃度」とは、イソプレン生成微生物の増殖に有効な濃度で増殖促進剤が用いられることをいい得る。表現「増殖促進剤逆依存プロモーターに依存してイソプレンを生成する能力」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、イソプレンを生成できず、またはイソプレンの生成効率が低いが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、イソプレンを生成できること、またはイソプレンの生成効率が高いことを意味し得る。したがって、本発明で用いられるイソプレン生成微生物は、十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、良好に増殖し得るが、イソプレンを生成できず、またはイソプレンの生成効率が低い。イソプレン生成微生物はまた、不十分な濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、良好に増殖し得ないが、イソプレンを生成でき、またはイソプレンの生成効率が高い。
このようなイソプレン生成微生物では、上述した酵素をコードする遺伝子が増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にあり得る。表現「増殖促進剤逆依存性プロモーター」とは、相対的に高い濃度の増殖促進剤の存在下では、転写活性を有しない、または低い転写活性を有するが、相対的に低い濃度の増殖促進剤の存在下または増殖促進剤の不在下では、転写活性を有する、または高い転写活性を有するプロモーターを意味し得る。したがって、増殖促進剤逆依存性プロモーターは、イソプレン生成微生物の増殖に十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、上述した酵素をコードする遺伝子の発現を抑制でき、一方、イソプレン生成微生物の増殖に不十分な濃度の増殖促進剤の存在下では、上述した酵素をコードする遺伝子の発現を促進できる。好ましくは、イソプレン生成微生物は、増殖促進剤逆依存性プロモーターの制御下にある上述した酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物である。
例えば、増殖促進剤が酸素である場合、微好気誘導型プロモーターを利用することができる。微好気誘導型プロモーターとは、微好気条件下で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。一般的に、飽和溶存酸素濃度は７．２２ｐｐｍである（気圧７６０ｍｍＨｇ、温度３３℃、酸素２０．９％の水蒸気が飽和した大気中）。微好気条件とは、（溶存）酸素濃度０．３５ｐｐｍ以下の条件をいい得る。微好気条件下の（溶存）酸素濃度は、０．３０ｐｐｍ以下、０．２５ｐｐｍ以下、０．２０ｐｐｍ以下、０．１５ｐｐｍ以下、０．１０ｐｐｍ以下、または０．０５ｐｐｍ以下であってもよい。微好気誘導型プロモーターとしては、例えば、Ｄ−またはＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ｌｌｄ、ｌｄｈＡ）のプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（例、ａｄｈＥ）のプロモーター、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（例、ｐｆｌＢ）のプロモーター、およびα−アセトラクテイトデカルボシラーゼをコードする遺伝子（例、ｂｕｄＡ）のプロモーターが挙げられる。
また、増殖促進剤がリン化合物である場合、リン欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。表現「リン欠乏誘導型プロモーター」とは、低濃度のリン化合物で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低濃度のリン化合物とは、（遊離）リン濃度１００ｍｇ／Ｌ下の条件をいい得る。用語「リン」は、用語「リン化合物」と同義であり、交換可能に使用され得る。リン欠乏条件下の（遊離）リン濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。リン欠乏誘導型プロモーターとしては、例えば、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＡ）のプロモーター、酸性フォスファターゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＣ）のプロモーター、センサーヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＲ）のプロモーター、レスポンスレギュレーターをコードする遺伝子（例、ｐｈｏＢ）のプロモーター、およびリン取り込み担体をコードする遺伝子（例、ｐｓｔＳ）のプロモーターが挙げられる。
増殖促進剤がアミノ酸である場合、アミノ酸欠乏誘導型プロモーターを利用することができる。アミノ酸欠乏誘導型プロモーターとは、低アミノ酸濃度で下流遺伝子の発現を促進できるプロモーターをいい得る。低アミノ酸濃度とは、（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度が１００ｍｇ／Ｌ以下である条件をいい得る。アミノ酸欠乏条件下の（遊離）アミノ酸またはその塩の濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、１ｍｇ／Ｌ以下、０．１ｍｇ／Ｌ以下、または０．０１ｍｇ／Ｌ以下であってもよい。アミノ酸欠乏型プロモーターとしては、例えば、トリプトファンリーダーペプチドをコードする遺伝子（例、ｔｒｐＬ）のプロモーター、およびＮ−アセチルグルタメイトシンターゼをコードする遺伝子（例、ＡｒｇＡ）のプロモーターが挙げられる。
＜イソプレンモノマーおよびイソプレンポリマーの製造方法＞
本発明は、イソプレンモノマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む。
本発明のイソプレンモノマーの製造方法は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物の培養により行うことができる。イソプレンモノマーの原料となるジメチルアリル二リン酸は、本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物により、培地中の炭素源から効率的に供給される。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、培地中の炭素源から、イソプレンモノマーを主にアウトガスとして生産するため、形質転換体から発生するガスを採取することにより、イソプレンモノマーが回収される。イソプレンシンターゼの基質であるジメチルアリル二リン酸は、培地中の炭素源を素に、宿主細胞内のメバロン酸経路又はメチルエリスリトールリン酸経路で合成される。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養する培地としては、イソプレンに転換されるための炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
微生物性タンパク質としては、酵母または細菌由来のポリペプチドが挙げられる。
植物性タンパク質としては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチドが挙げられる。
脂質としては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられる。
オイルとしては、Ｃ４以上の飽和、不飽和脂肪酸が１以上含み、室温で液体の脂質が好ましく、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ、又はこれらの２以上の組み合わせからなるものが挙げられる。
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられる。
不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。
飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。
中でも、脂肪酸としては、１以上のＣ２からＣ２２の脂肪酸が含まれるものが好ましく、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸が含まれるものがより好ましい。
また、炭素源としては、これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
また、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源としては、加水分解されたバイオマス炭素源が挙げられる。
バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。
バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。
バイオマス等の再生可能な炭素源を細胞培地に添加する際には、前処理することが好ましい。前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、酵素的前処理と化学的前処理の組み合わせが挙げられる。
再生可能な炭素源を細胞培地に添加する前に、その全部または一部を加水分解することが好ましい。
また、炭素源としては、酵母エキス、または酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ１化合物との組み合わせが好ましい。
本発明において、形質転換体の培養方法としては、細胞を生理食塩水と栄養源を含む標準的培地で培養することが好ましい。
培養培地としては、特に限定されず、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の一般的に市販されている既成の培地が挙げられる。特定の宿主細胞の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
細胞培地には適切な炭素源の他に、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、及び培養に適していること、またはイソプレン産出を促進することが当業者にとって公知の成分が含まれていることが望ましい。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物の培養条件としては、ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上により、イソプレンシンターゼ発現微生物によるイソプレン生成能を改善できる条件であれば特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、ガス組成としては、ＣＯ２濃度が約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５〜約９であることが好ましい。
また、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
培養方法としては、形質転換体をバッチ培養法、流加培養法、連続培養法等の公知の発酵方法を用いて培養する方法が挙げられる。
バッチ培養法は、発酵開始時に培地組成物に仕込み、宿主細胞を培地に植菌し、ｐＨや酸素濃度等の制御を行いながら形質転換体の培養を行う方法である。
バッチ培養法による形質転換体の培養において、形質転換体は、穏やかな誘導期から対数増殖期を経て最終的に成長速度が減少または停止する定常期に至る。イソプレンは、対数増殖期や定常期の形質転換体によって産出される。
流加培養法は、上述したバッチ法に加えて、発酵プロセスが進行するに従い徐々に炭素源を添加する方法である。流加培養法は、カタボライト抑制により形質転換体の代謝が抑制される傾向があり、培地中の炭素源の量を制限することが好ましいときに有効である。流加培養法は、制限された量または過剰な量のグルコース等の炭素源を用いて行うことができる。
連続培養法は、一定の速度でバイオリアクターに所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養法では培養物を一定の高密度に保つことができ、培養液中の形質転換体は主に対数増殖期にある。
適宜、培地の一部または全部を入れ換えることにより、栄養素の補給を行うことができ、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある代謝副産物、及び死細胞の蓄積を防ぐことができる。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入される発現ベクターが有するプロモーターとしては、上述のプロモーターが挙げられる。本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物に導入される発現ベクターがｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターを有している場合には、培養液中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加して、タンパク質の発現を誘導してもよい。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養することにより得られるイソプレンモノマーの生産量の評価方法としては、ヘッドスペース法により気相を採取し、この気相をガスクロマトグラフィー法で分析する方法が挙げられる。
詳細には、密封したバイアル中で形質転換体を含む培養液を振蕩しながら培養したときのヘッドスペース中のイソプレンモノマーを、標準的なガスクロマトグラフィーを用いて分析する。次いで、検量線を用いて、ガスクロマトグラフィー測定カーブから得られる面積を、形質転換体のイソプレンモノマー生産量に換算する。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養することにより得られるイソプレンモノマーの回収方法としては、ガスストリッピング、分留、或いは、固相に吸着させたイソプレンモノマーの熱若しくは真空による固相からの脱着、又は溶媒による抽出等が挙げられる。
ガスストリッピングでは、アウトガスから連続的にイソプレンガスを除去する。このようなイソプレンガスの除去は種々の方法で行うことができ、固相への吸着、液相への分離、又はイソプレンガスを直接凝縮させる方法が挙げられる。
イソプレンモノマーの回収は一段階又は多段階で行うことができる。イソプレンモノマーを一段階で回収する場合には、アウトガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換を同時に行う。イソプレンモノマーをアウトガスから直接凝縮させて液相にすることもできる。イソプレンモノマーを多段階で回収する場合には、オフガスからのイソプレンモノマーの分離と、イソプレンモノマーの液相への変換とを順次行う。例えば、イソプレンモノマーを固相に吸着させ、溶媒で固相から抽出する方法が挙げられる。
更に、イソプレンモノマーの回収方法は、イソプレンモノマーを精製する工程が含まれていてもよい。精製工程としては、液相抽出物からの蒸留による分離や各種クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明はまた、イソプレンポリマーの製造方法を提供する。本発明のイソプレンポリマーの製造方法は、以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む：
（Ｉ）本発明の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
（ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
工程（Ｉ）は、上述した本発明のイソプレンモノマーの製造方法と同様にして行うことができる。工程（ＩＩ）におけるイソプレンモノマーの重合は、当該分野で公知の任意の方法（例、有機化学的な合成法）、例えば、付加重合により行うことができる。
本発明のゴム組成物は、本発明のイソプレンの製造方法により製造されるイソプレンに由来するポリマーを含む。イソプレンに由来するポリマーは、同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）、またはイソプレンおよびイソプレン以外の１以上のモノマー単位を含む異種ポリマー（例、ブロック共ポリマー等の共ポリマー）であり得る。好ましくは、イソプレンに由来するポリマーは、本発明のイソプレンポリマーの製造方法により製造される同種ポリマー（即ち、イソプレンポリマー）である。本発明のゴム組成物はさらに、上記ポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、および／または他の成分を含んでいてもよい。本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを用いて製作することができる。例えば、本発明のゴム組成物は、イソプレンに由来するポリマーを、このポリマー以外の１以上のポリマー、１以上のゴム成分、ならびに／または他の成分（例、補強材、架橋剤、加硫促進剤、および抗酸化剤）と混合することにより調製することができる。
本発明のタイヤは、本発明のゴム組成物を用いることにより製作される。本発明のゴム組成物は、制限されることなく、タイヤの任意の部分に利用することができ、その目的に応じて適切に選択され得る。例えば、本発明のゴム組成物は、タイヤのトレッド、ベーストレッド、サイドウォール、サイド補強ゴムおよびビードフィラーにおいて用いてもよい。タイヤを製造する方法としては、慣用の方法を用いることができる。例えば、タイヤ未加硫ゴムから構成されるカーカス層、ベルト層、トレッド層、および通常のタイヤ製造に用いられる他の部材をタイヤ成形用ドラム上に順次貼り重ね、ドラムを抜き去ってグリーンタイヤとする。次いで、このグリーンタイヤを常法に従って加熱加硫することにより、所望のタイヤ（例、空気式タイヤ）を製造することができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株におけるｐｐａ遺伝子発現強化
Ｅ．ｃｏｌｉ株において、内因性ｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）に固有のプロモーターが別の強力なプロモーターに置換され、内因性ｐｐａ遺伝子の発現が増強された株を、以下の手順により作製した。
先ず、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株（参考例７−４）を参照。なお、本株は、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換体である。）のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、新たな５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．５ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
次に、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルにｐＫＤ４６をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、電場強度１８ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で導入した。エレクトロポレーション法によりｐＫＤ４６が導入された菌体に、ＳＯＣ培地（バクトトリプトン２０ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ）１ｍＬを添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株を取得した。
取得したＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株を、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、１００（ｍｇ／Ｌ）のアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．３ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
次に染色体上のｐｐａ遺伝子のプロモーター領域を置換する為の遺伝子断片を調製した。ｐｐａ遺伝子の塩基配列とそのプロモーター領域については、既存のデーターベースより入手が可能である（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＮＣ＿０００９１３．２， ｐｐａ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ ｔａｇ： ｂ４２２５， Ｒａｎｇｅ： ４４４７１４５．．４４４７６７５， ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）。ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域の置換は、λ−ｒｅｄ法により実施した。ＰＣＲの鋳型として、λａｔｔＬ−Ｔｅｔ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）とテトラサイクリン耐性薬剤マーカー（Ｔｅｔ）、及びλファージのアタッチメントサイトであるλａｔｔＬ及びλａｔｔＲが含まれる。これらのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。配列番号２と配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ社より販売されているＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５４℃、２０秒、７２℃、２分）×４０サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。前記ＰＣＲにより、λａｔｔＬ−Ｔｅｔ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ、更にその外側にそれぞれｐｐａ遺伝子のプロモーター領域の上流６０ｂｐ、下流６０ｂｐの配列を付加した遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片をＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。以降、得られた遺伝子断片をＴｅｔ−Ｐｔａｃ−ｐｐａと命名する。
次に、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６株のコンピテントセルに、Ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ｐｐａをエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、電場強度１８ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、２５（ｍｇ／Ｌ）のテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同じ寒天培地を用いて純化した。その後、配列番号４と配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域がｔａｃプロモーターに置換されている事を確認した。ｐｐａ遺伝子のプロモーター領域がｔａｃプロモーターに置換された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株と命名した。
実施例２：ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株におけるＰＰＡ発現解析
ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株とＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）で３回洗浄を行い、超音波破砕装置（Ｂｉｏ−ｒｕｐｔｏｒ：３０秒ＯＮ ３０秒ＯＦＦ ２０ｍｉｎ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１５０００ｒｐｍで１０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をブラッドフォード法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図１にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株において、ＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した（図１）。電気泳動後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株におけるＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量は、元の菌株（コントロール）のものに比し、約２〜５倍であると見積もられた。
実施例３：ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ株の構築
ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株のエレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株を５ｍＬのＬＢ培地にて、一晩、３７℃で振盪培養を実施した。その後、培養液５０μＬを、新たな５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃でＯＤ６００が０．６付近になるまで振盪培養を実施した。その後、菌体を集菌し、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄した後、最終的に０．５ｍＬの１０％グリセロールに懸濁したものをコンピテントセルとした。
ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ株のコンピテントセルに葛由来イソプレンシンターゼ発現プラスミド、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ（参考例３−５）を参照）を前記の条件でエレクトロポレーション法により導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫが導入されたＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ株を取得した。
その後、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ株にｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ（参考例７−３）を参照）の導入を行った。前記と同様に、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ株のコンピテントセルを調製後、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを前記の条件でエレクトロポレーション法により導入した。その後、コンピテンセルに、１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で２時間振盪培養を行った後、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３７℃で一晩培養後、出現したコロニーを同寒天培地で純化する事で、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐが導入されたＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ株を取得した。以後、ｐｐａ遺伝子の発現が強化されたＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ Ｐｔａｃ−ｐｐａ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ株をｐｐａ発現強化株と記載する。
実施例４：ｐｐａ発現強化株のジャー培養評価
ｐｐａ発現強化株と、対照株（ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ／ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐ株）のジャー培養評価を実施した。６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。次に表１に記載したグルコール培地０．３Ｌを１Ｌの容積の発酵槽に投入し、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を行った。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎの通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。ＯＤ６００が２０付近に到達後、Ｌ−アラビノースを終濃度２０ｍＭになるように培地に添加し、４５時間の培養を実施した。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０（ｇ／Ｌ）以上になるよう５００（ｇ／Ｌ）に調製したグルコースを適宜、添加した。経時的に排ガスを１Ｌのガスバックに回収し、排ガスに含まれるイソプレンガスの濃度を測定した。イソプレンガスの分析条件を以下に記載した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は、参考例４−３）に記載されるものと同様である。
Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調製後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと１００（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシンを添加し、培地として使用した。
対照株とｐｐａ発現強化株における、４５時間培養後のジャー１基あたりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｂ）と対グルコース消費収率％を表２に記載した。ｐｐａ発現強化株は、対照株と比較してジャー１基あたりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｂ）、更には対グルコース消費収率（％）が高い事が確認できた。
参考例１：植物におけるイソプレン生産能の検討
１−１）葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量の測定
先ず、植物におけるイソプレン生産能を検討するため、植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、葛を用いた。
イソプレン発生量測定には、ガス交換式デシケーター（商品名：真空デシケーター、アズワン社製）を、インキュベーター（商品名：グロースチェンバーＭＬＲ−３５１ＨＳＡＮＹＯ社製）内に収容し、ガス交換式デシケーター内に設置した気体攪拌用ファンを作動させガス交換式デシケーターの空間内の雰囲気を攪拌させつつ、インキュベーターを高温誘導条件（照度１００μｍｏｌＥ／ｍ２／ｓで４０℃）に設定した。ガス交換式デシケーター内の雰囲気の温度が４０℃になった後、プランターに植えられたムクナ植物体を収容し、ガス交換式デシケーターを密閉した状態で３時間保持した。次いで、吸引ポンプにより、シリコンチューブ、吸着管および気体採取管を介して、ガス交換式デシケーター内の空間から、ムクナが放出したガス成分を吸引した。これにより、吸着管において、ムクナが放出したガス成分に含まれる水蒸気（水分）を吸着、分離するとともに、水蒸気が分離されたガス成分を気体採取管に導き、気体採取管において、そのガス成分を採取した。次いで、ガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、気体採取管に採取されたガス成分に含まれるイソプレンを定量分析した。
植物の葉乾燥重量は、新鮮個葉の葉面積と、８０℃の乾熱器によって新鮮個葉を８時間乾燥させたときの乾燥重には非常に良い正の相関関係が成り立つので、葉面積からの乾燥重換算式を導いておき、イソプレン発生量測定に用いたムクナ植物体の全葉面積から乾燥重を推定した。
植物における葉乾燥重量１ｇあたりのイソプレン発生量はムクナ植物体全体からのイソプレン発生量を植物体全体の葉の乾燥重量推定値で割ることにより求めた。
その結果、ムクナが葉乾燥物の単位重量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図２）。
１−２）総タンパク質量あたりのイソプレン発生量の測定
次いで、種々の植物の葉から抽出された総タンパク質量あたりのイソプレン発生量を測定した。植物としては、ムクナ（サンプル１、２）、ヤナギ（シダレヤナギ）、モミジバフウ、ギンコウバイ、クズを用いた。
タンパク質抽出には、バッファー液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ ＭｇＣｌ， ５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ， ０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００， ｐＨ８．０）を作成し、使用直前にＰｏｌｙｃｌａｒ ＡＴ １０％、ＤＴＴ ２０ｍＭ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔａｂｌｅｔ （１ｔａｂｌｅｔ／５０ｍｌ）Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ １ｍＭ（それぞれ終濃度）となるように加え蛋白抽出バッファーとして用いた。５ｇサンプルに対してタンパク抽出バッファー５０ｍｌ加えて、氷上で冷やしておいた乳鉢でよく摩砕した後、２重に重ねたＭｉｒａｃｌｏｔｈで摩砕液を濾過し、濾液を１２０００Ｇで２０分、４００００Ｇで４０分遠心分離した上清を取得し粗抽出液とした。
次いで、この粗抽出液について硫安分画を行った。硫安の終濃度４０％から５５％の範囲で析出する蛋白を４００００Ｇで４０分遠心分離し、得られた沈殿を蛋白抽出バッファーに再溶解させて硫安画分を得た。
総（硫安画分）タンパク質量は、ブラッドフォード法で硫安画分を測定することで求めた。標準蛋白Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎについて、ブラッドフォード試薬を反応させ分光光度計で測定した波長５９５ｎｍの吸光度に対する蛋白量の検量線を作成した。５０倍希釈した硫安画分液について同様に波長５９５ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白の検量線から総（硫安画分）蛋白量を推定した。
イソプレン発生量は、４ｍｌガラスバイアルに粗抽出液ないしは１００℃で煮沸処理した粗酵素液を１００μｌ入れ、次いで０．５Ｍ ＭｇＣｌ２溶液を２μｌ、０．２Ｍ ＤＭＡＰＰ溶液を５μｌ加え、セプタム付きスクリューキャップをしっかり締めたあと、ゆるやかに振とう撹拌し４０℃恒温漕にセットした。０．５時間、１時間、２時間後に、ガスタイトシリンジでＨｅａｄｓｐａｃｅ気層を０．５〜２ｍｌサンプリングしガスクロマトグラフ（商品名：ＧＣ−ＦＩＤ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてイソプレン発生量を測定した。粗酵素での０．５時間、１時間、２時間後の発生量は、それぞれの測定値から１００℃で煮沸処理した粗酵素液の測定値を引いて求めた。１時間あたりのイソプレン発生量からＴｏｔａｌ蛋白１ｍｇあたりの酵素活性（比活性）を求めた。なお、イソプレン発生量の測定は、イソプレンシンターゼの基質であるＤＭＡＰＰの量を一定にして行った。
その結果、ムクナが総タンパク質量あたりのイソプレン発生量に優れることが明らかとなった（図３、表３）。以上より、ムクナがイソプレン生産能に優れることが示された。
参考例２：ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
２−１）サンプリング時間の検討
４０℃の温度下で１，２，３，５時間光照射したムクナの葉が放出するイソプレンガスをサンプリングし、後述するガスクロマトグラフィーにてイソプレン生産量を定量したところ、それぞれ４，８，１２，１０μｇ ｉｓｏｐｒｅｎｅ／ｇ ＤＷ ｌｅａｆのイソプレンの生産が確認され、最適な光照射時間は、３時間であることが確認された。
２−２）Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶解液の抽出
以下の手順でムクナの葉からＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶解液を抽出した。
（１）４０℃の温度下で３時間光照射したムクナの葉をサンプリングした。
（２）葉組織１００ｍｇを液体窒素ですばやく凍結しながら乳鉢で粉砕した後、ＲＮａｓｅフリーの２ｍｌエッペンドルフチューブに液体窒素ごと分注し、液体窒素を気化させた。
（３）このエッペンドルフチューブに、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（キアゲン社製）に備え付けの溶解バッファーＲＬＴ（２−メルカプトエタノール含有）を４５０μｌ添加し、ボルッテックスで激しく混和し、葉組織溶解物を得た。
（４）この葉組織溶解物をＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けのＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムにかけ、１５０００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行った。
（５）カラム濾液の上清のみを、ＲＮａｓｅフリーの新たな２ｍｌエッペンドルフチューブに分注した後、このカラム濾液上清の１／２容量の特級エタノールを添加し、ピペッティングにより混和し、約６５０μｌの溶液を得た。
（６）この溶液をＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けのＲＮｅａｓｙスピンカラムにかけ、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（７）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けのＲＷ１バッファー７００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（８）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けのＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、１５秒間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（９）このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、再度、ＢＰＥバッファー５００μｌを添加し、１００００ｒｐｍ、２分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１０）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けの２ｍｌ回収用チューブにセットし、１５０００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、濾液を捨てた。
（１１）このＲＮｅａｓｙスピンカラムを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けの１．５ｍｌ回収用チューブにセットした。
（１２）ピペットマンを用いて、このＲＮｅａｓｙスピンカラムに、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔに備え付けのＲＮａｓｅフリーの蒸留水を、ＲＮｅａｓｙスピンカラムの膜に直接添加し、１００００ｒｐｍ、１分間、遠心分離を行い、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。このステップを２回繰り返し、約１００μｌのＴｏｔａｌ ＲＮＡを得た。
２−３）ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の塩基配列の解析
抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶解液について、バイオアナライザ（アジレント・テクノロジー社）のＲＮＡ用ｎａｎｏチップを用いて、ＲＮＡの品質チェックを行い、溶解液中にゲノムＤＮＡの混入がなく、溶解液中のＲＮＡが分解していないことを確認した。
このＴｏｔａｌ ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて二本鎖化した後、ネブライザーを用いて断片化した。３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有する１９８１７９個の断片の塩基配列を、４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ＦＬＸ高速シークエンサー（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いて解析した。得られた断片配列において、重複する配列を連結し、１３４８５個のコンティグ配列を得た。これらコンティグ配列に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、登録されている既知の葛及びポプラのイソプレンシンターゼ遺伝子配列と相同性（塩基配列の同一性）を有する６個のコンティグ配列が抽出された。更に配列を詳細に解析したところ、この６個のコンティグ配列のうち３個は、同一の遺伝子由来のものであることが分かり、ムクナ由来イソプレンシンターゼ遺伝子の部分配列が得られた。この部分配列に基づき、５’ＲＡＣＥを行い、配列番号６で表されるムクナ由来イソプレンシンターゼｃＤＮＡの完全長の塩基配列を得た。
参考例３：各植物種由来イソプレンシンターゼの発現プラスミドの調製
３−１）Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ由来、イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列、及びアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： ＡＡＱ８４１７０：Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛） ｉｓｏｐｒｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＩｓｐＳ））。Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及びｃＤＮＡの塩基配列を配列番号８、及び配列番号９にそれぞれ示す。ＩｓｐＳ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉで効率的に発現させる為にＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＫと名付けた。ＩｓｐＳＫの塩基配列を配列番号１０に示す。ＩｓｐＳＫ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫと名付けた。
３−２）Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ ｘ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ（ポプラ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｐ．ａｌｂａ ｘ Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来、イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列、及びイソプレンシンターゼのアミノ酸配列は既に知られている（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ： ＣＡＣ３５６９６：Ｐ．ａｌｂａ ｘ Ｐ． ｔｒｅｍｕｌａ （ポプラ）ｉｓｏｐｒｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）。Ｐ．ａｌｂａ ｘ Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ由来ＩｓｐＳタンパク質のアミノ酸配列、及びｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１、及び配列番号１２にそれぞれ示す。この塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化し、更に葉緑体移行シグナルが切断されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、これをＩｓｐＳＰと名付けた。ＩｓｐＳＰの塩基配列を配列番号１３に示す。ＩｓｐＳＰ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰと名付けた。
３−３）Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔａ（ムクナ）由来イソプレンシンターゼの化学合成
Ｍｕｃｕｎａ ｂｒａｃｔｅａｔａ由来イソプレンシンターゼｃＤＮＡの塩基配列を基に、前記と同様に、Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化されたＩｓｐＳ遺伝子を設計し、葉緑体移行シグナルが付与されたものをＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付け、葉緑体移行シグナルを切断したものをＩｓｐＳＭと名付けた。ＩｓｐＳＭ（Ｌ）の塩基配列を配列番号１４に、ＩｓｐＳＭの塩基配列を配列番号１５に示す。ＩｓｐＳＭ遺伝子とＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子は、それぞれ化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭとｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）と名付けた。
３−４）発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの構築
Ｅ．ｃｏｌｉで各植物種由来ＩｓｐＳを発現させる為の発現用プラスミドｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを構築した。始めに、ｔａｃプロモーター（同意語：Ｐｔａｃ）領域（ｄｅＢｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，２１−２５）及びＥ．ｃｏｌｉ由来トリプトファンオペロンのターミネーター（同意語Ｔｔｒｐ）領域（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９７８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，５４４２−５４４６）を含み、５’末端にＫｐｎＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩサイトを有するＤＮＡ断片（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ）を化学合成した（Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１６に示す）。得られたＰｔａｃ−ＴｔｒｐのＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて消化処理し、同様にＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩで消化処理したｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）とをＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅによるライゲーション反応によって連結した。得られたプラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐと名付けた（塩基配列を配列番号１７に示す）。本プラスミドは、Ｐｔａｃ下流にＩｓｐＳ遺伝子をクローニングすることで、ＩｓｐＳ遺伝子の発現増幅が可能となる。
３−５）各植物種由来ＩｓｐＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（L）遺伝子を発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号１８と配列番号１９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＰを鋳型として、配列番号２０と配列番号２１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭを鋳型として、配列番号２２と配列番号２３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、更にはｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＭ（L）を鋳型として、配列番号２４と配列番号２５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号２６と配列番号２７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子、ＩｓｐＳＰ遺伝子、ＩｓｐＳＭ遺伝子、及びＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ＩｓｐＳＰ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ＩｓｐＳＭ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、ＩｓｐＳＭ（Ｌ）遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（L）と命名した。
参考例４：Ｅ．ｃｏｌｉ由来粗酵素抽出液を用いた各植物種由来イソプレンシンターゼの酵素活性測定
４−１）イソプレン生産能を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ７００９２６）のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）が導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株と命名した。
４−２）粗酵素抽出液の調製方法
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１／６プレート分の菌体を６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢ２０ｍｌを張り込んだ坂口フラスコに接種し、３７℃にて６時間培養した。培養液より菌体を５０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、氷冷したイソプレンシンターゼバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・２０ｍＭ ＭｇＣｌ２・５％グリセロール）にて２回洗浄した。洗浄菌体を同バッファー１．８ｍｌに懸濁した。２ｍｌ容のマルチビーズショッカー専用チューブに約０．９ｍｌの破砕用ビーズ（ＹＢＧ０１，直径０．１ｍｍ）と菌体懸濁液０．９ｍｌを入れ、安井器械製マルチビーズショッカー（ＭＢ７０１（Ｓ）型）にて２５００ｒｐｍ、４℃、３０秒ＯＮ・３０秒ＯＦＦを３サイクルの条件で菌体を破砕した。破砕後チューブを２００００ｇ、４℃、２０分の条件で遠心し、上清を粗酵素抽出液とした。
４−３）イソプレンシンターゼ活性の測定
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株の粗酵素抽出液（総タンパク量として２ｍｇを含む量）とイソプレンバッファーを合わせて０．５ｍｌをヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 ２２ｍＬ ＣＬＥＡＲ ＣＲＩＭＰ ＴＯＰ ＶＩＡＬ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）に入れ、０．５Ｍ ＭｇＣｌ２溶液０．０２５ｍｌと０．２Ｍ ＤＭＡＰＰ（ｃａｙｍａｎ製，Ｃａｔｌｏｇ Ｎｏ．６３１８０）溶液０．０１ｍｌを加えて軽く攪拌した後、すぐにヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓、３７℃にて２時間保温した。
反応終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。以下にガスクロマトグラフィーの分析条件を記載する。
Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｓａｍｐｌｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 Ｔｕｒｂｏ Ｍａｔｒｉｘ ４０）
バイアル保温温度 ４０℃
バイアル保温時間 ３０ｍｉｎ
加圧時間 ３．０ｍｉｎ
注入時間 ０．０２ｍｉｎ
ニードル温度 ７０℃
トランスファー温度 ８０℃
キャリアガス圧力（高純度ヘリウム） １２４ｋＰａ
ガスクロマトグラフィー（島津社製 ＧＣ−２０１０ Ｐｌｕｓ ＡＦ）
カラム（Ｒｘｉ（登録商標）−１ｍｓ： 長さ３０ｍ、内径０．５３ｍｍ、液相膜厚１．５μｍ ｃａｔ♯１３３７０）
カラム温度 ３７℃
圧力 ２４．８ｋＰａ
カラム流量 ５ｍＬ／ｍｉｎ
流入方法 スプリット １：０（実測１：１８）
トランスファー流量 ９０ｍＬ
ＧＣ注入量 １．８ｍＬ（トランスファー流量×注入時間）
カラムへの試料注入量 ０．１ｍＬ
注入口温度 ２５０℃
検出機 ＦＩＤ（水素 ４０ｍＬ／ｍｉｎ、空気 ４００ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップガス ヘリウム ３０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器温度 ２５０℃
イソプレン標準試料の調整
試薬イソプレン（比重０．６８１）を冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍希釈し、添加用標準溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたヘッドスペースバイアルに各添加用標準溶液を、それぞれ１μＬ添加し、標準試料とした。
表５に各菌株の反応２時間後のイソプレン生成量を記載した。
表５の結果から、イソプレン生成量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ（Ｌ）株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株となり、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株とＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株はほぼ同等の値となった。上記の結果から、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株の粗酵素抽出液が最も高いイソプレン生成活性を示した。
参考例５：Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
参考例４の粗酵素活性の結果から、葉緑体移行シグナルを欠失したムクナ由来のイソプレンシンターゼで最も高い活性が確認された。その為、葉緑体移行シグナルを欠失した全てのイソプレンシンターゼ導入株について、グルコースからのイソプレン生産能を比較した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、及びＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中のＭ９グルコース培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）で密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて２４時間培養を行った。Ｍ９グルコース培地の組成は表６に記載のとおりである。
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。また、ＯＤ値は分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｕ−２９００）によって６００ｎｍで測定した。表７に各菌株の培養終了時のイソプレン濃度とＯＤ値を記載した。
表７の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、野生株では、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
参考例６：ＭＥＰ（メチルエリスリトール）経路を強化したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
６−１）ｄｘｓ遺伝子発現用プラスミド（ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ）の構築
イソプレンシンターゼを導入したＥ．ｃｏｌｉでＭＥＰ経路を構成するｄｘｓ遺伝子（１−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現強化を行うと、イソプレン生成量が向上する事が既に報告されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１１）９０，１９１５−１９２２）。そこで、ｄｘｓ遺伝子の発現を強化した株においても、イソプレンシンターゼの由来の違いで、イソプレン生産能に相違が生じるかを確認した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株のゲノムの全塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）は既に明らかにされている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９７）２７７，１４５３−１４７４）。遺伝子増幅を行うためにｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）を用いた。本プラスミドは、マルチクローニングサイトに目的遺伝子を導入する事で、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加時に目的遺伝子の発現量を増加させる事が出来る。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノム配列のｄｘｓ遺伝子の塩基配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：９４５０６０ Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ｂ０４２０）に基づいて、配列番号２８と配列番号２９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを合成した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株のゲノムを鋳型として、配列番号２８と配列番号２９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｄｘｓ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９を鋳型として、配列番号３０と配列番号３１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２４０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたｄｘｓ遺伝子断片と、ｐＭＷ２１９のＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたｄｘｓ遺伝子発現用プラスミドをｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。
６−２）イソプレン生産能を有するＥ.ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株へのｐＭＷ２１９−ｄｘｓの導入
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＭＷ２１９−ｄｘｓを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコールとカナマイシンに耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株にｐＭＷ２１９−ｄｘｓがそれぞれ導入された株をＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓと命名した。
６−３）ＤＸＳの発現を強化したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、更にＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールと５０（ｍｇ／Ｌ）のカナマイシン塩酸塩を含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、参考例５に記載したヘッドスペースバイアルでの培養評価を実施した。培養終了時のイソプレン生産量（μｇ/L）とＯＤ値を表９に記載した。
表９の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、ＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株、そしてＭＧ１６５５／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ／ｐＭＷ２１９−ｄｘｓ株となった。上記の結果から、ＭＥＰ経路強化株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
参考例７：ＭＶＡ（メバロン酸）経路を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
７−１）酵母由来のメバロン酸経路下流遺伝子のクローニング
メバロン酸経路の下流領域はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅより取得した（ＷＯ２００９０７６６７６，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｊａｎ ２０１２；４０：Ｄ７００−Ｄ７０５）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を次に示すプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅した（表１０）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ Ｐｒｅｍｉｘを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５５℃、５秒、７２℃、５秒／ｋｂ）×３０サイクルの条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐベクター（配列番号１７）にｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。これら増幅した遺伝子の塩基配列、およびその遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／＃にて取得可能である。
７−２）メバロン酸経路下流の人工オペロンの構築
メバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８遺伝子を表１１に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＵＣ１１８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋと名付けた。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋの塩基配列を配列番号４０に示す。
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９遺伝子、イソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをコードするＩＤＩ１遺伝子を表１２に示すプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ酵素には東洋紡より販売されているＫＯＤ ｐｌｕｓを利用し、９４℃、２分、（９４℃、１５秒、４５℃、３０秒、６８℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、６８℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＴＷＶ２２８ベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、クローニングと発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換を行い、各遺伝子の想定配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。作成したプラスミドをｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉと名付けた。ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉの塩基配列を配列番号４５に示す。
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列の構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋを鋳型とし表１３に示すプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉを鋳型とし表１３に示すプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）の塩基配列を配列番号５０に示す。
７−３）メバロン酸経路下流の染色体固定
メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を染色体上で発現させる事とした。遺伝子の発現にはグルコースイソメラーゼプロモーターを利用し、転写終結にはＥ．ｃｏｌｉのａｓｐＡ遺伝子の転写終結領域を利用した（ＷＯ２０１００３１０６２）。染色体固定部位としてＴｎ７の転移部位を用いた（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９８１；１８３（２）：３８０−７）。染色体固定後の薬剤マーカーとしてはｃａｔ遺伝子を利用した。表１４に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７下流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。表１４に示すプライマーを利用して、ｐＭＷ１１８−ａｔｔＬ−Ｃｍ−ａｔｔＲプラスミドを鋳型としたＰＣＲによりλファージアッタチメント部位を含むｃａｔ遺伝子領域の増幅を行った（ＷＯ２０１０−０２７０２２）。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９５℃、３分、（９５℃、１分、３４℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２サイクル、（９５℃、３０秒、５０℃、３０秒、７２℃、４０秒）×２５サイクル、７２℃、５分の条件で反応を行った。表１４に示すプライマーを利用して、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（β）を鋳型としたＰＣＲによりプロモータと転写終結領域を付与したメバロン酸経路下流配列（以下ＫＫＤｙＩと略す）の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。これらのＰＣＲ産物と、制限酵素ＳｍａＩで処理したｐＭＷ２１９を用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡと名づけた。ｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡの塩基配列を配列番号５５に示す。
次に、表１４に示すプライマーを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムを鋳型としたＰＣＲにより染色体固定領域の内、Ｔｎ７上流領域の増幅を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物と、制限酵素ＳａｌＩで処理したｐＭＷ２１９−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡを用い、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法によりベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。得られたプラスミドをｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７と名づけた。構築したプラスミドの配列を配列番号５６に示す。
続いて、λ−Ｒｅｄ法を用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子、グルコースイソメラーゼプロモーター、メバロン酸経路下流オペロン、ａｓｐＡ遺伝子転写終結領域を含む領域の染色体固定を行った。染色体固定用の断片は、プラスミドｐＭＷ−Ｔｎ７−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ−ＴａｓｐＡ−Ｔｎ７を抽出後、制限酵素ＰｖｕＩとＳａｌＩで処理した後、精製することで調整した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（以下ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号 Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。エレクトロポレーションの後、クロラムフェニコール耐性を獲得したコロニーを取得した。続いてゲノムＤＮＡを抽出し、表１６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより目的領域が染色体に固定されていることを確認した。更に、ＰＣＲ断片の配列を確認することで目的領域の配列を確認した。染色体固定したメバロン酸経路下流とその周辺領域の塩基配列を配列番号５７に、構築概要を図４に示す。得られた変異体をＭＧ１６５５ ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。
ＭＧ１６５５ ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩの薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５ ｃａｔ−Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。
ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるクロラムフェニコール耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はクロラムフェニコール耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからクロラムフェニコール感受性株を取得した。この後、４２度、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。このようにして取得した変異体をＭＧ１６５５ Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩと名づけた。
７−４）染色体上メバロン酸経路下流のプロモーター置換
染色体上のメバロン酸経路下流オペロンのプロモーターをλ−ｒｅｄ法により置換した。ＰＣＲの鋳型として、ａｔｔＬ−Ｔｅｔ−ａｔｔＲ−Ｐｔａｃを有するゲノム断片を使用した。これは、ｔａｃプロモーターとテトラサイクリン耐性薬剤マーカー及びλファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲが並ぶものである。これらの配列を配列番号６８に示す。表１７に示すプロモーターを用いてＰＣＲ断片を調整した。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼを利用し、９２℃、１分、（９２℃、１０秒、５０℃、２０秒、７２℃、１分／ｋｂ）×４０サイクル、７２℃、７分の条件で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＭＧ１６５５ Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ（以下ＭＧ１６５５ Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６と表記する）をエレクトロポレーションするために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０−６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号 Ｊ０２４５９，第３１０８８番目〜３３２４１番目）を含む。プラスミドｐＫＤ４６はＰＣＲ産物をＭＧ１６５５ Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩに組み込むために必要である。
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含んだＬＢ培地中で３０℃、一晩培養したＭＧ１６５５ Ｐｇｉ−ＫＫＤｙＩ／ｐＫＤ４６を、アンピシリンとＬ−アラビノース（１ｍＭ）を含んだ５ｍＬのＬＢ培地で１００倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ６００が約０．６になるまで生育させた後、氷冷した１０％ グリセロール溶液で３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは５０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地［モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）］を加えて３７℃で１時間培養した後、ＬＢ寒天培地上、３７℃で平板培養し、クロラムフェニコール耐性組換え体を選択した。次に、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために、テトラサイクリン入りのＬＢ寒天培地上、３７℃で継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、ｐＫＤ４６が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。テトラサイクリン耐性遺伝子によって識別できるｔａｃプロモーター置換を含む変異体を取得した。得られた変異体をＭＧ１６５５ ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。
薬剤マーカーを以下の手順で除去した。ＭＧ１６５５ ｔｅｔ−Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩのコンピテントセルを作成後ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓを導入した。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである（ＷＯ２００７／０３７４６０、特開２００５−０５８８２７）。ｐＭＷ−ｉｎｔ−ｘｉｓの導入により、λファージのアタッチメントサイトであるａｔｔＬ及びａｔｔＲで挟まれた領域にあるテトラサイクリン耐性遺伝子が染色体から脱落する。その結果として、宿主はテトラサイクリン耐性を失うことが知られている。そこで、得られたコロニーからテトラサイクリン感受性株を取得した。この後、４２℃、ＬＢ培地で６時間培養の後、ＬＢプレート培地に塗布し、コロニーを出現させた。この中からアンピシリン耐性を失ったクローンを選抜することで、薬剤耐性を除去した。得られた変異体をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩと名づけた。染色体上にてｔａｃプロモーターで支配されたメバロン酸経路下流およびその周辺領域の塩基配列を配列番号６９に、概要を図５に示す。
７−５）ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株への各植物種由来イソプレンシンターゼの導入
ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株のコンピテントセルを調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ、更にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰを導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ株にｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐが導入された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫが導入された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭが導入された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰが導入された株をＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株と命名した。
７−６）ＭＶＡ経路を強化したＭＧ１６５５株における、各植物種由来イソプレンシンターゼの導入効果
ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、更にＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株を、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。得られたプレートから、１白金耳分の菌体を、ヘッドスペースバイアル中（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 ２２ ｍＬ ＣＬＥＡＲ ＣＲＩＭＰ ＴＯＰ ＶＩＡＬ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）のＭ９グルコース（メバロン酸含有）培地１ｍＬに接種し、その後、参考例２に記載した方法に従って、培養評価を実施した。Ｍ９グルコース（メバロン酸含有）培地の組成を表１８に記載した。培養終了時のイソプレン生産量とＯＤ値を表１９に記載した。
表１９の結果から、イソプレン生産量は高い順に、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ株、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫ株、ＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＰ株、そしてＭＧ１６５５ Ｐｔａｃ−ＫＫＤｙＩ／ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ株となった。上記の結果から、ＭＶＡ経路導入株においても、ムクナ由来イソプレンシンターゼを導入した株が最も高いイソプレン生産能を示した。
実施例５：Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＧ１０２６５の構築
５−１）ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
５−１−１）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥ遺伝子の化学合成
ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、（１４７９．．３８９０）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３９）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号７２、及び配列番号７３にそれぞれ示す。ｍｖａＥ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＥ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＥと名付けた。この塩基配列を配列番号７４に示す。ｍｖａＥ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥと名付けた。
５−１−２）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳ遺伝子の化学合成
ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈａｓｅをコードするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＦ２９００９２．１、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１４２．．１２９３）、アミノ酸配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＡＡＧ０２４３８）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１５），４３１９−４３２７（２０００））。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＳタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号７５、及び配列番号７６にそれぞれ示す。ｍｖａＳ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したｍｖａＳ遺伝子を設計し、これをＥＦｍｖａＳと名付けた。この塩基配列を配列番号７７に示す。ｍｖａＳ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。
５−１−３）アラビノース誘導型ｍｖａＥＳ発現ベクターの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現ベクターは次の手順で構築した。プラスミドｐＫＤ４６を鋳型として配列番号７８と配列番号７９に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ由来ａｒａＣとａｒａＢＡＤプロモーター配列からなるＰａｒａを含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを鋳型として配列番号８０と配列番号８１に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを鋳型として配列番号８２と配列番号８３に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ断片を得た。プラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを鋳型として配列番号８４と配列番号８５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲによりＴｔｒｐ配列を含むＰＣＲ断片を取得した。これら４つのＰＣＲ断片を得るためのＰＣＲにはＰｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。精製したＰａｒａを含むＰＣＲ産物とＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号７８と配列番号８１に示す合成オリゴヌクレオチドを、精製したＥＦｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を鋳型として配列番号８２と配列番号８５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果、ＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子、ＥＦｍｖａＳとＴｔｒｐ含むＰＣＲ産物を取得した。プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製）は常法に従ってＳｍａＩ消化した。ＳｍａＩ消化後ｐＭＷ２１９と精製したＰａｒａとＥＦｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物、ＥＦｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物はＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドは、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと命名した。
５−２）ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築
先ず、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼを直鎖状に並べた配列を含む発現ベクターの構築を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて行った。ｐＵＣ−ｍｖｋ−ｐｍｋ（参考例７−２）を参照）（配列番号４０）を鋳型とし配列番号８６〜８９の塩基配列からなるプライマーを用いてメバロン酸キナーゼとホスホメバロン酸キナーゼ配列をＰＣＲ法により増幅し、ｐＴＷＶ−ｄｍｄ−ｙｉｄｉ（参考例７−２）を参照）（配列番号４５）を鋳型とし配列番号８６〜８９の塩基配列からなるプライマーを用いてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとイソペンテニルニリン酸デルタイソメラーゼをＰＣＲ法により増幅した後、ｐＴｒｃＨｉｓ２ＢベクターにＩｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にてクローニングを行うことで４種の酵素遺伝子を直鎖状に並べた発現プラスミドの構築を行った。ＰＣＲ酵素にはタカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５２℃、５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×３０サイクル、７２℃、１０分の条件で反応を行った。ＰＣＲ断片は、制限酵素ＮｃｏＩとＰｓｔＩで処理したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにｉｎ−ｆｕｓｉｏｎクローニング法にて挿入し、発現ベクター構築を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に形質転換を行い、目的配列長を有するクローンを選抜した後、定法に従いプラスミド抽出を行い、シーケンスを確認した。構築した発現ベクターをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）と名付けた。ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）の塩基配列を配列番号９０に示す。
次いで、得られたｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）（配列番号９０）にＩｓｐＳ（Ｋ）を付加したプラスミドｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築は以下の手順で行った。
ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）を制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で消化処理し、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを得た。ｐＵＣ５７−ｉｓｐＳＫを鋳型とし、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＳ＿６０８３−１０−１（配列番号９１）、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＳＡ＿６０８３−１０−２（配列番号９２）をプライマーとし、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ（α）／ＰｓｔＩを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（配列番号９３）と命名した。
５−３）ｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ−Ｍｍａｍｖｋの構築
５−３−１）Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来メバロン酸キナーゼの化学合成
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ Ｇｏ１由来、メバロン酸キナーゼの塩基配列、及びアミノ酸配列はすでに知られている（塩基配列のＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＣ＿００３９０１．１（２１０１８７３．．２１０２７７８、ＬＯＣＵＳ ＴＡＧ ＭＭ＿１７６２，アミノ酸配列の番号：ＮＰ＿６３３７８６．１））。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来ＭＶＫタンパク質のアミノ酸配列、及び遺伝子の塩基配列を配列番号９４、及び配列番号９５にそれぞれ示す。ＭＶＫ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで効率的に発現させるためにＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度に最適化したＭＶＫ遺伝子を設計し、これをＭｍａｍｖｋと名付けた。Ｍｍａｍｖｋの塩基配列を配列番号９６に示す。Ｍｍａｍｖｋ遺伝子は化学合成された後、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングされ、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
５−３−２）Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ（葛）由来イソプレンシンターゼとＭＶＫ遺伝子発現用プラスミドの構築
Ｅ．ｃｏｌｉでＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子とを発現させる為のプラスミドは次の手順で構築した。ｐＵＣ５７−ＩｓｐＳＫを鋳型として、配列番号９７と配列番号９８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて１２０秒の反応を４０サイクル行った。その結果ＩｓｐＳＫ遺伝子を含む、ＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、配列番号９９と配列番号１００の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５４℃にて２０秒、６８℃にて２１０秒の反応を４０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＩｓｐＳＫ遺伝子断片と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫと命名した。次に、ｐＵＣ５７−Ｍｍａｍｖｋを鋳型として、配列番号１０１と配列番号１０２の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｍａｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫを、配列番号１０３と配列番号１０４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｍａｍｖｋ遺伝子と、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＫのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＩｓｐＳＫ遺伝子とＭｍａｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＫ−Ｍｍａｍｖｋと名付けた。
５−４）ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐの構築
次に、ＭＶＫ発現プラスミド（ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ−Ｔｔｒｐ）を構築した。
ｐＵＣ５７−Ｍｃｌｍｖｋを鋳型として、Ｍｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｎ（配列番号１０５）とＭｃｌ＿ｍｖｋ＿Ｃ（配列番号１０６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果Ｍｃｌｍｖｋ遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。同様に、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐ（ＷＯ２０１３０６９６３４Ａ１を参照）を、ＰｔＴｔ２１９ｆ（配列番号１０７）とＰｔＴｔ２１９ｒ（配列番号１０８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて１分／ｋｂの反応を３０サイクル行った。その結果、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを含む、ＰＣＲ産物を取得した。その後、精製されたＭｃｌｍｖｋ遺伝子と、ｐＭＷ２１９−Ｐｔａｃ−ＴｔｒｐのＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたＭｃｌｍｖｋ遺伝子の発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−Ｔｔｒｐと名付けた。
５−５）メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐａｒａプロモーターおよびリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図６）。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ遺伝子、および葛由来ｉｓｐＳ遺伝子のコーディング部分を含むｐＴｒｃ−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）プラスミドのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ部位中にサブクローニングし、得られたプラスミドを、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）と命名した（図７）。
Ｐｔａｃの制御下にあるｉｓｐＳ（ムクナ）およびｍｖｋ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）遺伝子を含むｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ−ＭｍａｍｖｋのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、組込み型ベクターｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲのＢａｍＨＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｍ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、図８に示す。
５−６）ｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位をゲノムの異なる部位に保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導体の構築
ａｍｐＣ遺伝子、ａｍｐＨ遺伝子またはｃｒｔオペロンを置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導体を構築した（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として入手可能）。これらの株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ−アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるａｍｐＣおよびａｍｐＨ遺伝子ならびにｃｒｔオペロンの置換に用いたＤＮＡフラグメントを、それぞれ、オリゴヌクレオチド１および２、３および４、ならびに５および６（表２０）を用いた反応で増幅した。ＰＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を、これらの反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と命名した。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表２０）を、それぞれ、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０、ゲノム改変体のマップを、それぞれ、図９Ａ）、図１０Ａ）および図１１Ａ）に示す。
カナマイシン耐性マーカーからの構築株のキュアリングを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った。オリゴヌクレオチド７および８、９および１０、ならびに１１および１２（表２０）を、それぞれ、得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、およびＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲによる検証のために用いた。
５−７）ＩＳＰ３−Ｓ株の構築
５−５）に記載されるｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法にしたがい、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３−ｃａｔを用いて、５−６）に記載されるＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株に組み込んだ。オリゴヌクレオチド対１３−７および１４−８（表２０）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。得られたＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、λファージのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子を保有するｐＭＷｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）のベクター部分からキュアした。その結果、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株を得た。オリゴヌクレオチド７および１５（表２０）を、カナマイシン感受性誘導体のＰＣＲによる検証のために用いた。ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）の構築を図９に示す。
ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて上記ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０株から単離したゲノムＤＮＡを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法にしたがって、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株にエレクトロポレーションした。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０変異の移入を、プライマー９および１０を用いたＰＣＲにより確認した。
最後の株を、ｐｈｉ８０ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性手法（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いてカナマイシン耐性マーカーからキュアした。得られたＫｍＳ組換え体においてプライマー７および１５を用いてΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）改変体をＰＣＲにより検証した後、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ） ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株を選択した。
上記ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳプラスミドを、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミド（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０に組み込んだ。オリゴヌクレオチド１３および９、ならびにオリゴヌクレオチド１４および１０（表２０）を、得られた組込み体のＰＣＲによる検証のために用いた。この組込み体を、ファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳのベクター部分からキュアした。染色体からのベクターの除去は、プライマー９および１６を用いたＰＣＲにより確認した。その結果、マーカーを含まないＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳを得た。ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ染色体改変体の構築物を、図１０に示す。
５−５）に記載されるｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）プラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）に記載されるプロトコルを用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミド組込みを、プライマー１１−１３および１２−１４を用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。
このようにして構築された染色体改変体ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）を、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡによるエレクトロポレーションの方法を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）ΔａｍｐＨ：：Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ株に移した。得られた組込み体を、ファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性技術（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）を用いて、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）のベクター部分からキュアした。最終構築物Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）の構造（図１１）は、プライマー１１および１７を用いたＰＣＲで確認した。
この最終株に導入された組込み型発現カセットをＰＣＲにより検証したところ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を含むＫＫＤｙＩオペロンの５’−部分で幾つか予想外に再構成していることが判明した。このカセットを修復するため、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがい、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ細菌性ゲノムＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）株から単離したゲノムＤＮＡをこの株にエレクトロポレーションした。得られた株は、イソプレン産生に必要な全ての遺伝子を含んでいた。
ｐＡＨ１６２−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）（上記を参照）のベクター部分からファージλ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存性でキュアした後、マーカーを含まないＩＳＰ３−Ｓ株（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ｍｖｋ（Ｍｍａ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０）を得た。
５−８）異なるメバロン酸キナーゼ遺伝子を保有する組込み型プラスミドの構築
ｐＭＷ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＫｐｎＩ−Ｅｃｌ１３６ＩＩ認識部位中にサブクローニングした。その結果、ｔａｃプロモーターの制御下にあるＭ．ｃｏｎｃｉｌｌｉ由来ＭＶＫ遺伝子を保有するｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを構築した。
５−９）ＡＧ１０２６５株の構築
５−８）に記載されるｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）のプロトコルにしたがい、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノム中に組み込んだ。
構築されたΔｃｒｔ：：ｐＡＨ１２３−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）染色体改変体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋから単離したゲノムＤＮＡのエレクトロポレーションを介して、ＩＳＰ３−Ｓ株〔５−７）を参照〕に移入した。得られた組込み体を、ＡＧ１０２６５（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ＫＫＤｙＩ−ｉｓｐＳ（Ｋ）−ａｔｔＲｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ａｔｔＲｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ−Ｐｔａｃ−Ｍｃｌｍｖｋ−ａｔｔＲｐｈｉ８０）と命名した。
実施例６：ｐｐａ遺伝子の発現が向上したＰａｎｔｏｅａ株の作製およびそれを用いた培養によるイソプレンの生産
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ株において、内因性ｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）に固有のプロモーターが別の強力なプロモーターに置換され、内因性ｐｐａ遺伝子の発現が増強された株を、以下の手順により作製した。
６−１）ＡＧ１０２６５株におけるｐｐａ遺伝子発現強化
６−１−１）野生型ＳＣ１７（０）株ｐｐａ遺伝子プロモーター置換株の作製
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ にはＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）の２種類のピロリン酸ホスファターゼをコードする遺伝子が存在する。ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子の発現を強化すべく、Ｐ． ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）株でＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子とＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子のプロモーター配列とＳＤ配列をそれぞれＰｔａｃとφ１０に置換した株をλＲｅｄ法で作製した。λＲｅｄ法はＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９； １０：３４に記載の方法に従った。アノテーションが付与されたＰ． ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５のゲノム配列情報はＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１とＡＰ０１２０３３．１で利用可能である。
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） 株Ｐｔａｃ−ｌａｃＺ（ＲＵ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ２００６１３４５７４，ＷＯ２００８／０９０７７０，ＵＳ２０１００６２４９６）よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲの鋳型として利用した。Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０） 株Ｐｔａｃ−ｌａｃＺにおいて、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲの下流にＰｔａｃプロモーターが連結された、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−ＰｔａｃがｌａｃＺ遺伝子の上流に組み込まれている（ＷＯ２０１１／８７１３９ Ａ１を参照）。
ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子のプロモーター領域を置換するために、表２１のＰＡＪ＿２３４４−Ｆ及び ＰＡＪ＿２３４４−Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとし、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子のプロモーター領域を置換するために、表２１のＰＡＪ＿２７３６−Ｆ及び ＰＡＪ＿２７３６−Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、５５℃にて５秒、７２℃にて２０秒の反応を３０サイクル行った。その結果、λａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−φ１０を含むプロモーター置換用断片を取得した。
ＳＣ１７（０）にＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲ（ＵＳ７９１９２８４Ｂ２）プラスミドを常法に従いエレクトロポレーションにより導入し、得られた株をＳＣ１７（０）／ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲと命名した。ＳＣ１７（０）／ＲＳＦ−Ｒｅｄ−ＴＥＲのコンピテントセルを調整後、精製したλａｔｔＬ−Ｋｍｒ−λａｔｔＲ−φ１０を含むプロモーター置換用断片をエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションの後、カナマイシン耐性を獲得したコロニーを取得した。
次に、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子上流領域、あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子上流領域にＰＣＲ断片由来の配列が挿入されたことを、ｐｐａ＿ｐ１−Ｆ（表２１）とｐｐａ＿ｐ１−Ｒ（表２１）あるいはｐｐａ＿ｐ２−Ｆ（表２１）とｐｐａ＿ｐ２−Ｒ（表２１）に示される合成ＤＮＡプライマー２本を用いたＰＣＲにより確認し、断片の挿入が確認できた菌株を取得した。このようにして得られた菌株をＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１及びＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２と命名した。
６−１−２）ＡＧ１０２６５株でのｐｐａ遺伝子プロモーター置換株作成
ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１からＰｕｒＥｌｕｔｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型にＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを表２１のｐｐａ−１−ｇ１０００−Ｆとｐｐａ−１−ｇ１０００−Ｒ ｐｒｉｍｅｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲで増幅した。また、ＳＣ１７（０）Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを表２１のｐｐａ−２−ｇ１０００−Ｆとｐｐａ−２−ｇ１０００−Ｒ ｐｒｉｍｅｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲで増幅した。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、反応溶液はキットに添付された組成に従って調整し、９８℃にて１０秒、６０℃にて１５秒、６８℃にて５分の反応を４０サイクル行った。その結果、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子の上流１ｋｂから下流１ｋｂを含む断片を取得した。得られた断片を精製し、当該ＰＣＲ産物６００ｎｇをエレクトロポレーションによりＡＧ１０２６５に導入して形質転換を行い、カナマイシン耐性を獲得したコロニーを取得した。
得られた形質転換体について、ＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子のプロモーターが置換されていることを、表２１のＰｐａ＿ｐ１−ＦとＰｐａ＿ｐ１−Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたコロニーＰＣＲにより確認した。同様に、ＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子のプロモーターが置換されていることを、表２１のＰｐａ＿ｐ２−ＦとＰｐａ＿ｐ２−Ｒに示す塩基配列からなる合成ヌクレオチドをプライマーとしたコロニーＰＣＲにより確認した。これらの株はＰＡＪ＿２３４４（ｐｐａ−１）遺伝子、あるいはＰＡＪ＿２７３６（ｐｐａ−２）遺伝子のプロモーター領域がＰｔａｃ−φ１０に置換されている。そのうちのそれぞれ１クローンを選び、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２と名付けた。
６−１−３）ピロリン酸ホスファターゼ発現量の確認
ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。ＡＧ１０２６５株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株を３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加したＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）で２回洗浄を行い、マルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ Ｋｉｋａｉ， Ｊａｐａｎ、４℃、６０秒ＯＮ ６０秒ＯＦＦ、２５００ｒｐｍ、５ｃｙｃｌｅｓ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をＢＣＡ法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図１２にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株において、それぞれＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した。電気泳動後のＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドの濃さから、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株、およびＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株におけるＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量は、元の菌株（ＡＧ１０２６５）のものに比し、約１．５〜２．０倍であると見積もられた。
６−１−４）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
常法に従いＡＧ１０２６５株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ１株、ＡＧ１０２６５ Ｐｔａｃ−φ１０−ｐｐａ２株のエレクトロセルを作成し、エレクトロポレーションによりｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ＩｓｐＳＭ〔参考例３−５を参照〕を導入した。得られたイソプレン生産菌株をそれぞれ、ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ２と命名した。
６−２）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌のジャー培養条件
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌の培養には１Ｌ容積の発酵槽を使用した。グルコース培地は表２２に示す組成になるように調整した。クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢプレートにイソプレン生産菌株を塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。０．３Ｌのグルコース培地を１Ｌ容積の発酵槽に投入後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／ｍｉｎの通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。最終的に、７１時間の培養でＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は９２．２ｇ、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ１は９５．８ｇ、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ２は８５．７ｇのグルコースを消費した。
Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調整後、１１５℃、１０ｍｉｎで加熱滅菌を行った。放冷後Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。
６−３）イソプレン生産期への誘導方法
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業）存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。イソプレン生産期への誘導方法として、発酵槽におけるブロスを経時的に分析し、６００ｎｍの吸光度が１６になった時点で終濃度２０ｍＭとなるようにＬ−アラビノースを添加した。
６−４）発酵ガス中のイソプレンガス濃度測定方法
培養開始直後から、経時的に排ガスを１Ｌのガスバックに回収し、排ガスに含まれるイソプレンガスの濃度を、参考例４−３）に記載される条件に基づきガスクロマトグラフィーにより測定した。
６−５）ジャー培養におけるイソプレン生成量
ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ２を上記のジャー培養条件にて培養を行い、イソプレンの生成量を測定した。図１３に菌体生育のプロファイルを、図１４に培養開始後７１時間までのイソプレン生産量を測定した結果を示す。全イソプレン生産量の高い順に、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ２、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ１、ＡＧ１０２６５ Ｃｏｎｔｒｏｌであった（図３）。それぞれの全イソプレン生成量はＡＧ１０２６５ ＰＰＡ２が２４７８ｍｇ、ＡＧ１０２６５ ＰＰＡ１が２３６５ｍｇ、ＡＧ１０２６５（Ｃｏｎｔｒｏｌ）が２０１３ｍｇであった。このことから、ピロリン酸ホスファターゼの発現量が増加したＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌は、ピロリン酸ホスファターゼの発現量を強化していないＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌よりも優れたイソプレン生産能を示した。
参考例８．ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株の作製
＜１．ＭＶＡ経路上流染色体固定用プラスミドの作成＞
ＭＶＡ経路上流染色体固定用プラスミドｐＡＨ１６２−ＰｐｈｏＣ−ｍｖａＥＳを、以下のとおり構築した。
（１−１）アラビノース誘導型のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
（１−１−１）ｍｖａＥＳ（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）遺伝子の化学的合成及びクローニング
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のメバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ））をコードするｍｖａＥＳ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＡＦ２９００９２．１）、及びアミノ酸配列（ｍｖａＳ， ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＡＡＧ０２４３８．１， ｍｖａＥ， ＧｅｎＰｅｐｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＡＡＧ０２４３９．１）は公知である（Ｗｉｌｄｉｎｇ，ＥＩ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８２ （１５）， ４３１９−４３２７ （２０００）参照）。これらの情報に基づいて、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のコドン使用頻度に最適化されたｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を設計し、これらを、それぞれＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳと名付けた。ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号１３９に、ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号１４０に示す。化学合成により準備されたＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳのＤＮＡ配列を、常法により発現用プラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドを、それぞれ、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥ、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号１４１に、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号１４２に示す。
（１−１−２）Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるためのプラスミドｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを、下記の手順に従って構築した。
プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製、品番：３１０−０２５７１）を、ＳｍａＩで消化処理し、この消化処理したプラスミドを精製した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９／ＳｍａＩと名付けた。
ｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＰｔｒｃ領域を有するプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂを、プライマーとして配列番号１４３及び配列番号１４４の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｍｖａＥ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを、プライマーとして配列番号１４５及び配列番号１４６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｍｖａＳ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを、プライマーとして配列番号１４６及び配列番号１４７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｔｒｐターミネーター（Ｔｔｒｐ）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＴｔｒｐ領域を有するプラスミドｐＳＴＶ−Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐを、プライマーとして配列番号１４８と配列番号１４９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
上記４つのＰＣＲ反応においては、酵素としてＰｒｉｍｅ Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、反応溶液は、酵素の製造業者により提供される説明書に従って調製し、反応条件は、９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：６０秒／ｋｂ、サイクル数：３０とした。その結果、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、Ｔｔｒｐ領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。
（１−１−３）Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
続いて、鋳型として精製したＰｔｒｃを含むＰＣＲ産物とｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物とを、プライマーとして配列番号１４３及び配列番号１４６からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。また、鋳型として精製したｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴｔｒｐを含むＰＣＲ産物を、プライマーとして配列番号１４７及び配列番号１５０からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
その結果、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐ領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物を取得した。
その後、Ｐｔｒｃ領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴｔｒｐ領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、前述の消化処理したプラスミドｐＭＷ２１９／ＳｍａＩ とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドを、ｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと名付けた。得られたｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの配列を配列番号１５１に示す。
（１−１−４）プラスミドｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現用プラスミドｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを、下記の手順に従って構築した。
鋳型として（１−２−３）で調製したプラスミドｐＭＷ−Ｐｔｒｃ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを、プライマーとして配列番号１５２及び配列番号１５３の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
鋳型としてＰａｒａＣ領域の遺伝子、ａｒａＣ遺伝子、及びＰａｒａＢＡＤ領域の遺伝子を含む領域の遺伝子（以下、合わせて「Ｐａｒａ領域の遺伝子」ともいう）を含むプラスミドｐＫＤ４６（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ２０００， ｖｏｌ．９７， Ｎｏ．１２， ｐ６６４０−６６４５参照）を、プライマーとして配列番号１５４及び配列番号１５５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
その結果、ｐＭＷプラスミドとｍｖａＥＳ遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、Ｐａｒａ領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物とを取得した。精製したこれらのＰＣＲ産物同士を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたアラビノース誘導型のＥ． ｆａｅｃａｌｉｓ由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと名付けた。ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号１５６に示す。
１−２）メバロン酸経路上流を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流および下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。
オペロンのプロモーター欠損バリアントを得るために、ｐＭＷ−Ｐａｒａ−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲベクター中にサブクローニングした。得られたプラスミドのマップを、図１５に示す。
異なるプロモーターの制御下にあるｍｖａＥＳ遺伝子を保持する染色体固定用プラスミドのセットを構築した。この目的のために、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位を含むポリリンカーを、ｍｖａＥＳ遺伝子の上流に位置する唯一のＨｉｎｄＩＩＩ認識部位中に挿入した。この目的を達成するために、配列番号１５７及び配列番号１５８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドキナーゼを用いてアニーリングを行い、得られたフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＡＨ１６２−ｍｖａＥＳプラスミドにライゲーション反応により挿入した。得られたｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳプラスミド（図１６）は、ｍｖａＥＳ遺伝子の前で所望の配向性を保ちながらプロモーターをクローニングに都合が良いものである。ｐｈｏＣ遺伝子の調節領域を保持するＤＮＡフラグメントを、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）株（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ならびに配列番号１５９及び配列番号１６０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより生成し、ｐＡＨ１６２−ＭＣＳ−ｍｖａＥＳの適切な制限酵素認識部位中にクローニングした。得られたプラスミドを、図１７に示す。クローニングされたプロモーターフラグメントの配列決定を行い、予想されるヌクレオチド配列に正確に対応することを確認した。得られたプラスミドをｐＡＨ１６２−ＰｐｈｏＣ−ｍｖａＥＳと命名した。
＜２．ＭＶＡ経路下流染色体固定用プラスミドの作成＞
ＭＶＡ経路下流染色体固定用プラスミドとして、ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ組込み型プラスミドを、以下のとおり構築した。
ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを、プライマーとして配列番号１６１（プライマー１１）および配列番号１６２（プライマー１２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、ならびにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ ＬＡおよびＲｏｓｅ ＲＥ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲが得られた（図１８）。
Ｐｔａｃプロモーターを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃＲ−λａｔｔＲ組込み型ベクター（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８；８：６３）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ認識部位に挿入した。その結果、組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃが構築された。クローニングされたプロモーターフラグメントを配列決定した。ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃのマップを、図１９に示す。
ＡＴＧ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｇｅｎｅ（ロシア）により化学合成された、置換レアコドンを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＰＭＫ、ＭＶＤおよびｙｌｄＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（図２０）を、組込み型ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位中にサブクローニングした。化学合成されたＫＤｙＩオペロンを含むＤＮＡ配列を配列番号１８４に示す。Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ発現カセットを保持する得られたプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩを、図２１Ａに示す。その後、ｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲの対応フラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを得た（図２１Ｂ）。
＜３．ＭＶＡ遺伝子組込み型プラスミドの作成＞
古典的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ［完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照］由来の推定ｍｖｋ遺伝子のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメントを、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−ＰｔａｃのＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ認識部位中にクローニングした。
ｍｖｋ遺伝子を保持する組込み型プラスミドのマップを、図２２に示す。
＜４．レシピエント株ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築＞
ａｔｔＬｐｈｉ８０およびａｔｔＲｐｈｉ８０に隣接した遺伝子ｋａｎ、ならびに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーのファージｐｈｉ８０ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存切除（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１およびＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド［Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８；８：６３］を鋳型として用いて、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６４（プライマー１４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６５（プライマー１５）と配列番号１６６（プライマー１６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨおよびａｍｐＣ遺伝子中への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。配列番号１６７（プライマー１７）と配列番号１６８（プライマー１８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号１６９（プライマー１９）と配列番号１７０（プライマー２０）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。
並行して、（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０ ３２０ｋｂメガプラスミド上に位置する）ｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４）にしたがって行った。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、配列番号１７１（プライマー２１）と配列番号１７２（プライマー２２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ ＮＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０と名付けた。配列番号１７３（プライマー２３）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１１；３１８（１）：５５−６０）。配列番号１７３（プライマー２３）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０およびΔｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図２３Ａ）、７Ｂ）、および７Ｃ）に示す。
上記ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０のゲノムに組み込んだ。プラスミドの組込みを、配列番号１７１（プライマー２１）と配列番号１７３（プライマー２３）、配列番号１７２（プライマー２２）と配列番号１７４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図２４Ａ）に示す。
その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４）を介したＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）からＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０への移入を行った。得られた株を、既報のｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミド［Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４］を用いてｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分からキュアリングした。その結果、マーカー欠損株ＳＣ１７（０） ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０ ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図２４Ｂ）に示す。
＜５．ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ株の構築＞
ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１１；３１８（１）：５５−６０）にしたがい、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０ ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３−ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。電気泳動後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍＲクローンを、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６７（プライマー１７）、及び、配列番号１６３（プライマー１３）と配列番号１６９（プライマー１９）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ８０またはｐＣ：：ａｔｔＢφ８０ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ染色体改変物のマップを、図２５（ＡおよびＢ）に示す。
ｐＡＨ１６２−ＰｐｈｏＣ−ｍｖａＥＳを、既報のプロトコル［Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１１；３１８（１）：５５−６０］にしたがってｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）およびＳＣ１７（０） ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢｐｈｉ８０ ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ Δｃｒｔ：：Ｐｔａｃ−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株の染色体中に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１およびＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−ＰｐｈｏＣ−ｍｖａＥＳおよびΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−ＰｐｈｏＣ−ｍｖａＥＳ染色体改変物のマップを図２６に示す。
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１からのテトラサイクリン及びカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いファージｐｈｉ８０ Ｉｎｔ／Ｘｉｓ依存的な除去により行った（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ． ＢＭＣ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００９；１０：３４）。得られた株をＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株と命名した。
実施例７．ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株におけるＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ｂ４２２６）のｐｐａ遺伝子を高発現させたＰａｎｔｏｅａ株の作製およびそれを用いた培養によるイソプレン生産
Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ株において、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５（ｂ４２２６）のｐｐａ遺伝子（ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子）を強力なプロモーターで発現が増強された株を以下の手順により作製した。
７−１）ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株より単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１７５と配列番号１７６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてｐｐａ遺伝子（ｂ４２２６）をＰＣＲにより単離し、ｐＳＴＶ２８Ｐｔａｃ−Ｔｔｒｐベクター（参考例３）を制限酵素ＳｍａＩで切断した部位に、ＰＣＲで単離したｐｐａ遺伝子をｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法で導入し、プラスミドｐＳＴＶ２８Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ−Ｔｔｒｐを構築した。次に、このプラスミドを鋳型に配列番号１７７と配列番号１７８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＴａｃプロモーター、ｐｐａ遺伝子、Ｔｒｐターミネーターを含む領域をＰＣＲにより単離し、ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−ａｔｔＬＲベクターを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断した部位にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてで導入し、プラスミドｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａを構築した。
７−２）Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５ ｐｐａ遺伝子発現強化イソプレン生産菌株及びコントロール株の構築
先ず、ｙｄｃＩ遺伝子（ＰＡＪ＿１３２０、Ｈａｒａ Ｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ ＡＪ１３３５５， ａｎ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１２ Ｊａｎ；９３（１）：３３１−４１）を置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導体を構築した。この株を得るために、配列番号１７９と配列番号１８０の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）のゲノムを鋳型として用いて、ゲノム中のｙｄｃＩ標的部位に相同である４０ｂｐ領域に隣接した部位に、ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０を保有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを取得した。続いて、ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存性組込みを、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の手法にしたがって行った。エレクトロポレーション後、５０ｍｇ／ｌカナマイシン含有Ｌ−アガー上で細胞を培養した。ａｔｔＬｐｈｉ８０−ｋａｎ−ａｔｔＲｐｈｉ８０によるｙｄｃＩ遺伝子の置換株は配列番号１８１と配列番号１８２の塩基配列からなるプライマーで確認した。次に、ｐＡＨ１６２−Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａのプラスミドを、既報（Ａｎｄｒｅｅｖａ ＩＧ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）の手法に従い、ヘルパープラスミドｐＡＨ１２３−ｃａｔを用いて組み込んだ株ＳＣ１７（０）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａを作製した。この株より単離したゲノムＤＮＡを既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法に従って、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株にエレクトロポレーションした。配列番号１８２と配列番号１８３の塩基配列からなるプライマーを用いてΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ改変体がＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株の染色体に組み込まれた事をＰＣＲにより検証した。このようにして、Ｅ．ｃｏｉ ＭＧ１６５５ 由来のｐｐａ遺伝子を導入したイソプレン生産株であるＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ株を取得した。
次に、ｙｄｃＩ遺伝子を置換したｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保有するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ ＳＣ１７（０）誘導株よりゲノムＤＮＡを単離し、既報（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ ＪＩ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）の染色体エレクトロポレーションの方法に従って、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）株にエレクトロポレーションした。配列番号１８１と配列番号１８２からなる塩基配列のプライマーを用いてΔｙｄｃＩ改変体をＰＣＲにより検証した後、コントロール用のイソプレン生産株ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ株を選択した。
７−３）ピロリン酸ホスファターゼ発現量の確認
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ株におけるピロリン酸ホスファターゼ（ＰＰＡ）のタンパク質発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認した。この株を３ｍＬの５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加したＬＢ培地にて、一晩、３０℃で振盪培養を実施した。集菌後の菌体は、氷冷した５０ｍＭのトリスバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）で２回洗浄を行い、マルチビーズショッカー（Ｙａｓｕｉ Ｋｉｋａｉ， Ｊａｐａｎ、４℃、６０秒ＯＮ ６０秒ＯＦＦ、２５００ｒｐｍ、５ｃｙｃｌｅｓ）にて菌体を破砕した。破砕した菌体溶液は、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心を行い、未破砕細胞を取り除いた。得られた上清画分を可溶性タンパク質画分として取り扱った。可溶性タンパク質画分をＢＣＡ法にて定量後、５μｇの可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＮｕＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｇｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ）にて電気泳動を行った。その後、定法に従って、ＣＢＢ染色と脱色を行った。図２７にＰＰＡタンパク質量付近のゲルの写真を示した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ株において、ＰＰＡと推定されるタンパク質の発現量の増加を確認した。
７−４）イソプレンシンターゼ発現プラスミドの導入
常法に従いＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ：：Ｐｔａｃ−ＭＧ−ｐｐａ株及びＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ（コントロール）のエレクトロセルを作製し、ｐＳＴＶ２８−Ｐｔａｃ−ｉｓｐＳＭ（ＵＳ２０１４１１３３４４Ａ１）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。得られたイソプレン生産菌株をそれぞれ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ−ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ／ｉｓｐＳＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と命名した。
７−５）イソプレンシンターゼ活性測定
ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ−ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ株、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ／ｉｓｐＳＭ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株を、各々クロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３４℃にて１６−２４時間培養した。得られたプレートから１白金耳分の菌体をヘッドスペースバイアル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 ２２ｍＬ ＣＬＥＡＲ ＣＲＩＭＰ ＴＯＰ ＶＩＡＬ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２３６）中のＰＳ培地１ｍＬに接種し、ヘッドスペースバイアル用キャップブチルゴムセプタム付（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製ＣＲＩＭＰＳ ｃａｔ♯Ｂ０１０４２４０）にて密栓後、往復振とう培養装置（１２０ｒｐｍ）で、３０℃にて４８時間培養を行った。
ＰＳ培地の組成は表２３の記載の通りである。
培養終了後、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン濃度をガスクロマトグラフィーにより測定した。表２４に各菌株のイソプレン生成量を記載した。
表２４の結果から、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のｐｐａ遺伝子を導入したＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ｙｄｃＩ：：ＭＧ−ＰＰＡ／ｉｓｐＳＭ株は、ＳＷＩＴＣＨ−ＰｐｈｏＣ−１（Ｓ）ΔｙｄｃＩ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）株より高いイソプレン生成活性を示した。
実施例８：ポリイソプレンの製造
イソプレンを、発酵排気管を通過させることにより液体窒素冷却トラップで回収する。回収したイソプレンを、十分に乾燥した１００ｍＬガラス容器中で、窒素雰囲気下で３５ｇのヘキサン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびに１０ｇのシリカゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２３６７７２）、および１０ｇのアルミナ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２６７７４０）と混合する。得られた混合液を、室温で５時間放置する。次いで、上清液を採取し、十分に乾燥した５０ｍＬガラス容器中に加える。
一方で、グローブ・ボックスにおいて窒素雰囲気下、４０．０μｍｏｌのトリス［ビス（トリメチルシリル）アミド］ガドリニウム、１５０．０μｍｏｌのトリブチルアルミニウム、４０．０μｍｏｌのビス［２−（ジフェニルホスフィノ）フェニル］アミン、４０．０μｍｏｌのトリフェニルカーボニウム・テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート（Ｐｈ３ＣＢＣ６Ｆ５）４）をガラス溶液に用意し、これを５ｍＬのトルエン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号２４５５１１）中に溶解させて、触媒液を得る。その後、触媒液をグローブ・ボックスから採り、モノマー液に加え、次いで、これをポリマー反応（５０℃で１２０分間）に供する。
ポリマー反応後、５質量％の２，２’−メチレン−ビス（４−エチル−６−ｔ−ブチルフェノール）（ＮＳ−５）を含む１ｍＬのイソプロパノール溶液を加えて、反応を停止させる。次いで、多量のメタノールをさらに加えて、ポリマーを単離し、７０℃で真空乾燥させて、ポリマーを得る。
実施例９：ゴム組成物の製造
表２５に示されるように処方されるゴム組成物を調製し、１４５℃で３５分間加硫処理する。
その好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記述したが、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更が為され得ること、および均等物が採用され得ることは、当業者に明らかである。本明細書中の全ての引用文献は、本願の一部として参照により援用される。
本発明のイソプレンシンターゼ発現微生物は、イソプレンの生産に有用である。

Claims (17)

  1. ピロリン酸ホスファターゼの発現が向上した、イソプレンシンターゼ発現微生物。
  2. 前記微生物が、イソプレンシンターゼ発現ベクターで形質転換された微生物である。請求項１記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  3. ピロリン酸ホスファターゼが前記微生物に対して同種由来である、請求項１または２記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  4. ピロリン酸ホスファターゼの発現の向上が、前記微生物に固有のピロリン酸ホスファターゼ遺伝子のプロモーター領域の改変によるものである、請求項３記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  5. ピロリン酸フォスファターゼの発現の向上が、ピロリン酸ホスファターゼ遺伝子の染色体でのコピー数の上昇によるものである、請求項１〜４のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  6. 前記微生物が、腸内細菌科に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  7. 前記微生物が、メチルエリスリトールリン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜６のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  8. 前記微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項７記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  9. 前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項８記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  10. 前記微生物が、メバロン酸経路によるジメチルアリル二リン酸の合成能を有する、請求項１〜７のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  11. 前記微生物がパントエア属細菌である、請求項１〜７および１０のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  12. 前記パントエア属細菌がパントエア・アナナティスである、請求項１１記載のイソプレンシンターゼ発現微生物。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項記載のイソプレンシンターゼ発現微生物を培養培地中で培養してイソプレンモノマーを生成することを含む、イソプレンモノマーの製造方法。
  14. 以下（Ｉ）および（ＩＩ）を含む、イソプレンポリマーの製造方法：
    （Ｉ）請求項１３記載の方法によりイソプレンモノマーを生成すること；
    （ＩＩ）イソプレンモノマーを重合してイソプレンポリマーを生成すること。
  15. 請求項１３記載の方法により製造されるイソプレンモノマーに由来するポリマー。
  16. 請求項１５記載のポリマーを含むゴム組成物。
  17. 請求項１６記載のゴム組成物を使用することにより製造されるタイヤ。
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