JP6632976B2 - 藻類及びその製造方法、並びに該藻類を用いたバイオマスの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、藻類及びその製造方法、並びに該藻類を用いたバイオマスの製造方法に関する。より具体的には、光合成産物の生産性を向上させた藻類等に関する。

化石燃料に代わる燃料として、バイオマス由来の燃料、いわゆるバイオ燃料（例えば、バイオエタノール、バイオディーゼル等）が期待されている。

バイオ燃料の原料となる糖類（例えば、デンプン）や油脂等のバイオマスは、植物が光合成を行うことによって産生される。このため、光合成を活発に行い、糖類または油脂を細胞内に蓄積する能力を有する植物は、バイオマスの生産手段として利用可能である。現在、バイオマスを生産するために、主に、トウモロコシやダイズが利用されている。トウモロコシやダイズは、食料や飼料としても利用されている。このため、バイオ燃料の大幅な増産によって引き起こされる、食料および飼料の価格の高騰が問題視されている。

そこで、トウモロコシやダイズに代わるバイオマス生産手段として、藻類によるバイオマス生産が注目されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。藻類によるバイオマス生産は、食料や飼料と競合しない、大量に増殖させることができる、等の利点がある。

例えば、藻類の一種であるクラミドモナスについて、細胞壁が欠損した変異体あるいは細胞壁が薄くなる変異体が知られている（ｃｗ１５、ｃｗ９２等）。これらの変異体は、ＤＮＡを外部から細胞内へ導入する際に都合のよい性質であるため、遺伝子導入実験では広く使われている。また細胞が壊れやすいため、細胞内容物の回収が容易という意味でバイオマスの生産性を高めることから、これらの変異体を利用したバイオマス生産について報告されている。例えば、特許文献３には、クラミドモナスにおける細胞壁が欠損した変異体を用いて油脂を生産させる技術が記載されている。また、非特許文献１には、細胞壁変異（ｃｗ１５）に加え、デンプン合成遺伝子の欠損を有しているクラミドモナスでは、油脂からなる油滴が細胞外へ放出されることが報告されている。非特許文献２には、クラミドモナスの細胞壁変異体（ｃｗ１５）において、デンプン合成の遺伝子を破壊することで油脂の生産性が高まることが報告されている。また、クラミドモナス細胞壁の変異に関するレポートとして、非特許文献３が知られている。

また、藻類の一種であるクロレラを材料として、生産したデンプンを細胞外へ放出させ、続いてエタノール発酵を行う技術も報告されている（特許文献４）。さらに、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることにより、デンプンの産生能を向上させる技術も報告されている（特許文献５）。

特開平１１−１９６８８５号公報 特開２００３−３１０２８８号公報 国際公開第２００９／１５３４３９号 特開２０１０−８８３３４号公報 国際公開第２０１２／０２９７２７号

Zi Teng Wang, Nico Ullrich, Sunjoo Joo, Sabine Waffenschmidt, and Ursula Goodenough (2009) Eukaryotic Cell Vol. 8 (12): 1856-1868. Algal Lipid Bodies: Stress Induction, Purification, and Biochemical Characterization in Wild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardtii. Yantao Li, Danxiang Han, Guongrong Hu, David Dauvillee, Milton Sommerfeld, Steven Ball and Qiang Hu (2010) Metabolic Engineering Vol. 12 (4): 387-391. Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose pyrophosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol. Jerry Hyams, D. Roy Davies (1972) Mutation Research 14 (4): 381-389. The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardi.

しかし、特許文献１〜４及び非特許文献１〜３に記載される藻類を用いたバイオマスの生産技術では、生産性の面で問題がある。例えば、酢酸などの炭素源を用いて従属栄養条件にて藻類を培養しバイオマスを生産する場合、藻類におけるバイオマスの生産・蓄積を誘導するためには、窒素飢餓状態にする等の栄養制限工程が必要となる。一般的に、窒素を含有している培養液を用いて藻類を増殖培養させるため、窒素飢餓状態にするためには、窒素を含有しない培養液に交換する必要がある。このため、工程が複雑化し生産性が低下したりコストが高くなったりするという問題点がある。特許文献５では上述の問題点が解決されているが、さらなる生産性の向上が求められていた。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、バイオマスの生産性を向上させ得る新規な藻類およびその利用を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として、種々の検討を重ねた結果、藻類におけるＡＴＧ８の発現を抑制させることにより、藻類の細胞内におけるバイオマスの生産性を向上させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の［１］〜［１６］である。
［１］ＡＴＧ８の発現が基準株に比して抑制された藻類。
［２］ＭＥＸ１が過剰発現されている、［１］に記載の藻類。
［３］ＭＥＸ１をコードする外因性ポリヌクレオチドが導入されている、［２］に記載の藻類。
［４］前記外因性ポリヌクレオチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される一以上である、［３］に記載の藻類：
（ａ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［５］ＡＴＧ８遺伝子がサイレンシングされている、［１］に記載の藻類。
［６］配列番号５に示される塩基配列を有するｍｉＲＮＡが導入されている、［５］に記載の藻類。
［７］葉緑体内のグルタチオン濃度が基準株に比して増加している、［１］〜［６］のいずれかに記載の藻類。

［８」ＡＴＧ８の発現を抑制するＡＴＧ８発現抑制工程を含む、改変藻類の製造方法。
［９］葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるグルタチオン濃度増加工程を含む、［８］に記載の改変藻類の製造方法。

［１０］ＡＴＧ８の発現が基準株に比して抑制された藻類を用いる、バイオマスの製造方法。
［１１］前記藻類に対して光を照射する光照射工程を含む、［１０］に記載のバイオマスの製造方法。
［１２］葉緑体内のグルタチオン濃度が基準株に比して増加した藻類を用いる、［１０］または［１１］に記載のバイオマスの製造方法。
［１３］前記光照射工程を実質的に窒素飢餓ではない条件において行う、［１２］に記載のバイオマスの製造方法。
［１４］藻類の細胞を破砕する細胞破砕工程を含まない、［１３］に記載のバイオマスの製造方法。

［１５］ＡＴＧ８の発現が基準株に比して抑制された藻類を用いて取得されるデンプン。
［１６］葉緑体内のグルタチオン濃度が基準株に比して増加している藻類を用いて取得される、［１５］に記載のデンプン。

本発明において、「基準株」の用語は、本発明に係る改変を施す前の藻類株を意味するものとする。具体的には、ＡＴＧ８の発現抑制のための処理を施す前の藻類株を意味し、より具体的には、ＭＥＸ１の過剰発現又はＡＴＧ８のサイレンシングを施す前の藻類株を意味するものとする。基準株は、本発明に係る改変を野生型の藻類株に施す場合、当該野生型株あるいはこれと同一種の藻類株を意味する。また、基準株は、他の改変（例えば葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる改変）が施された藻類株に対して、さらに本発明に係る改変を加える場合、当該他の改変が施された藻類株あるいはこれと同一種の藻類株を意味する。

本発明に係る藻類は、ＡＴＧ８の発現が抑制されていることにより、藻類の細胞内における光合成産物の生産性を向上させ得る。それゆえ、本発明に係るバイオマスの製造方法によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造できる。

実施例１で作製した「ＡＴＧ８発現抑制株」におけるＡＴＧ８タンパク質の発現量を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＡＴＧ８発現抑制株」のデンプン産生量を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株」のＡＴＧ８タンパク質の発現量を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現+ＡＴＧ８発現抑制株」を培養し、デンプン産生量を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株」を培養し、（ａ）細胞数と（ｂ）微粒子数を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株」を培養し、デンプン産生量を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株」を培養し、（ａ）細胞数と（ｂ）微粒子数を測定した結果を示す図である。 実施例１で作製した「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株」を培養し、（ａ）脂肪酸量と（ｂ）細胞数を測定した結果を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。

１．本発明に係る藻類
本発明に係る藻類は、細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制されたものであればよく、その他の構成は限定されないが、光合成産物の生産性が向上している藻類であることが好ましい。

ＡＴＧ８は、「Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ８」の略である。ＡＴＧ８は、ＡＰＧ８とも称される。ＡＴＧ８は、ユビキチン様タンパク質であり、フォスファチジルエタノールアミンと結合体を形成し（以下「ＡＴＧ８−ＰＥ」という）、オートファゴソーム膜の形成に関与することが知られている（非特許文献Nakatogawa H et al. (2007) Cell 130: 165-178を参照）。本発明において、「ＡＴＧ８の発現が抑制された」とは、基準株のＡＴＧ８の発現量と比較して、細胞内のＡＴＧ８の発現量が低下していることを意味する。同一条件で培養した基準株の細胞内のＡＴＧ８の発現量と比較して、細胞内のＡＴＧ８の発現量が０．９倍以下である場合に、細胞内のＡＴＧ８の発現量が低下していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、細胞内のＡＴＧ８の発現量が低下していると判断することがより好ましい。本発明に係る藻類におけるＡＴＧ８の発現量は、基準株に比べて例えば９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、あるいは０％（検出下限値未満）である（実施例２，４参照）。

なお、基準株の細胞内のＡＴＧ８の発現量は同一の方法で同時に測定したものであることが好ましいが、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。藻類の細胞内のＡＴＧ８の発現量は、従来公知の手法によって測定でき、例えばウェスタンブロット法により測定できる。

また、「光合成産物の生産性が向上する」とは、基準株の光合成産物の生産性と比較して、光合成産物の生産量が多いことを意味する。同一条件で培養した基準株の光合成産物の生産量と比較して、光合成産物の生産量が１．１倍以上である場合に、光合成産物の生産性が向上していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、光合成産物の生産性が向上していると判断することがより好ましい。例えば、照射する光の条件（光量、強度、時間等）、投与する栄養素、単位時間あたり、飢餓状態とさせる工程が必須か否か、培養温度等の種々の観点で生産性を評価することができる。

なお、本明細書において、上記「光合成産物（photosynthate）」とは、藻類が光合成による炭素固定によって産生する物質を指し、具体的には、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂等のバイオマスおよびその派生物（代謝産物等）を指す。なお、ここで言う光合成による炭素固定とは、光エネルギーに由来する化学エネルギーを利用した炭素化合物の代謝全般を指す。従って、代謝系に取り込まれる炭素の由来は、二酸化炭素等の無機化合物に限らず、酢酸等の有機化合物も含まれる。

本明細書において、上記「藻類」は、光合成能力を有し、光合成産物を生成可能な藻類であれば、特に制限されない。このような藻類としては、例えば、緑藻植物門の緑藻綱に分類される微細藻類が挙げられ、さらに具体的には、緑藻綱のクラミドモナス属に属するクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・モエブシイ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・ユーガメタス（Chlamydomonas eugametos）、クラミドモナス・セグニス（Chlamydomonas segnis）等；緑藻綱のセネデスムス属に属するセネデスムス・アキュマナタス（Scenedesmus acumunatus）、セネデスムス・ジモルファス（Scenedesmus dimorphus）、セネデスムス・ジシフォルミス（Scenedesmus disciformis)、セネデスムス・オヴァルテルマス（Scenedesmus ovaltermus）、緑藻綱のドナリエラ属に属するドナリエラ・サリナ（Dunaliella salina）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Dunaliella tertiolecta）、ドナリエラ・プリモレクタ（Dunaliella primolecta）等；緑藻綱のクロレラ属に属するクロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）等；緑藻綱のヘマトコッカス属に属するヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）等；緑藻綱のクロロコックム属に属するクロロコックム・リトラエ（Chlorococcum littorale）等；緑藻綱または黄緑色藻綱のボトリオコッカス属に属するボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）等；緑藻綱のコリシスチス属に属するコリシスチス・マイナー（Choricystis minor）等；緑藻綱のシュードコリシスチス属に属するシュードコリシスチス・ エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）等；珪藻綱のアンフォーラ属に属するアンフォーラ（Amphora sp.）等；珪藻綱のニッチア属に属するニッチア・アルバ（Nitzschia alba）、ニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）、ニッチア・ラエビス（Nitzschia laevis）等；渦鞭毛藻綱のクリプセコディニウム属に属するクリプセコディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）等；ミドリムシ綱のミドリムシ属に属するユーグレナ・グラチリス（Euglena gracilis）、ユーグレナ・プロキシマ（Euglena proxima）等；繊毛虫門のゾウリムシ属に属するミドリゾウリムシ（Paramecium bursaria）等；藍藻門のシネココッカス属に属するシネココッカス・アクアティリス（Synechococcus aquatilis）、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）等；藍藻門スピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、スピルリナ・スブサルサ（Spirulina subsalsa）等；藍藻門のプロクロロコッカス属に属するプロクロロコッカス・マリウス（Prochlorococcus marinus）等；藍藻門のオーシスチス属に属するオーシスチス・ポリモルファ（Oocystis polymorpha）等；等が例示される。

細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制された藻類を取得する方法は特に制限されない。かかる方法については、後述する本発明に係る藻類の製造方法の項で具体的に説明する。

本発明に係る藻類の一形態では、細胞内において、ＭＥＸ１（マルトーストランスポーター遺伝子）の発現量および／または活性が基準株に比して増加していることが好ましい。ＭＥＸ１は、細胞内において、マルトースを葉緑体から細胞質へ輸送するトランスポーターとして機能していることが知られている（非特許文献Niittyla T et al．(2004)， Science 303 (5654): 87-89を参照）。藻類において、ＭＥＸ１を過剰発現させると、結果としてＡＴＧ８の発現が低下する。

また、本発明に係る藻類は、ＭＥＸ１のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現可能に導入されていてもよい。かかる外因性ポリヌクレオチドが導入されることにより、ＭＥＸ１を過剰発現する藻類では、細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制される。

換言すれば、本発明は、ＭＥＸ１のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されており、細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制された形質転換藻類（改変藻類）を提供するものであるといえる。かかる形質転換藻類は、後述するように、基準株に比べて光合成産物の生産性が向上している。

発現させるＭＥＸ１のタンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドの由来は、宿主藻類に導入されて発現し機能し得る限り特に限定されないが、宿主藻類自身のＭＥＸ１タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドであってよく、宿主藻類とは異なる種の藻類あるいは植物に由来するＭＥＸ１タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドであってもよい。植物由来のＭＥＸ１タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば双子葉植物綱のアラビトプシス属に属する植物が好ましく用いられる。

発現させるＭＥＸ１のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの具体例としては、（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアラビトプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（塩基配列を配列番号２に示す）、または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（塩基配列を配列番号４に示す）が挙げられる。

また、発現させるＭＥＸ１のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの具体例としては、
（ｂ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、も挙げられる。上記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの詳細については後述する。

また、上記以外にＭＥＸ１のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの具体例として、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるアラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（塩基配列を配列番号１８に示す）、または配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるクラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（塩基配列を配列番号２０に示す）が挙げられる。

本発明に係る藻類の別の一形態では、ＡＴＧ８遺伝子がサイレンシングされていることが好ましい。本発明において、「サイレンシング」とは、特定のメッセンジャーＲＮＡの量が低下することを意味する。「サイレンシング」には、転写型遺伝子サイレンシング（Transcriptional Gene Silencing）及び転写後型遺伝子サイレンシング（Post-Transcriptional Gene Silencing）が含まれる。転写型遺伝子サイレンシングとしては、エピジェネティックなサイレンシング、ゲノムインプリンティング、パラミューテーション、トランスポゾン抑制、トランスジーン抑制、配置効果を例示することができる。転写後遺伝子サイレンシングとしては、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）を用いたサイレンシング、ＲＮＡ干渉、ナンセンス仲介減衰を例示することができる。同一条件で培養した基準株の細胞内のメッセンジャーＲＮＡの量と比較して、細胞内のメッセンジャーＲＮＡ量が０．９倍以下である場合に、細胞内のメッセンジャーＲＮＡの量が低下していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、細胞内のメッセンジャーＲＮＡの量が低下していると判断することがより好ましい。

基準株の細胞内のメッセンジャーＲＮＡの量は同一の方法で同時に測定したものであることが好ましいが、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。なお、藻類の細胞内のメッセンジャーＲＮＡの量は、従来公知の手法によって測定でき、例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定できる。

本発明において用いることができるサイレンシングの一例として、ｍｉＲＮＡを用いたサイレンシングが挙げられる。ｍｉＲＮＡとは、種々の大きさの一次転写産物をコードする遺伝子から作られる低分子ＲＮＡである。一次転写産物（「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」という。）は、種々の核酸分解ステップを通してより短いｍｉＲＮＡ前駆体または「ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ」へプロセシングされる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、折り畳み形で存在し、その結果最終（成熟）ｍｉＲＮＡは二重鎖で存在し、この２本鎖がｍｉＲＮＡ（最終的に標的と塩基対形成する鎖）と呼ばれる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、前駆体からｍｉＲＮＡ二重鎖を取り出すダイサーの形のための基質であり、その後、ｓｉＲＮＡと同様に、二重鎖はＲＩＳＣ複合体中に取り込まれ得る。ｍｉＲＮＡは遺伝子導入で発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、部分的相補性のみを有する転写産物配列と結合し（Zeng Y et al. (2002), Mol. Cell 9: 1327-1333を参照）、定常状態における標的以外のＲＮＡのレベルに影響を与えずに翻訳を抑制する（例えば、Lee RC et al. (1993), Cell 75: 843-854およびWightman B et al. (1993), Cell 75: 855-862を参照）。本発明で用いられるｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡと同じ機構でサイレンシングが誘導できるよう設計された分子であるａｍｉＲＮＡ（人工的マイクロＲＮＡ）が挙げられる。具体的には、配列番号５に示される塩基配列を有するａｍｉＲＮＡが挙げられる。

ＡＴＧ８の発現が抑制されている本発明に係る藻類では、ＡＴＧ８の発現が抑制されていない基準株に比べて、光合成産物の生産および／または蓄積が増加する。そのため、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することができる。

さらに、本発明に係る藻類は、ＡＴＧ８が抑制されていることに加えて、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していることが好ましい。

本発明において、「葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している」とは、基準株の葉緑体内のグルタチオン濃度と比較して、葉緑体内のグルタチオン濃度が高いことを意味する。同一条件で培養した基準株の葉緑体内のグルタチオン濃度と比較して、葉緑体内のグルタチオン濃度が１．１倍以上である場合に、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していると判断することが好ましく、さらにｔ検定で５％レベルの有意差がある場合に、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していると判断することがより好ましい。なお、基準株の葉緑体内のグルタチオン濃度は同一の方法で同時に測定したものであることが好ましいが、背景データとして蓄積されているデータを用いてもよい。

藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度は、レドックス状態を反映して色調が変化する分子プローブである、ｒｏＧＦＰ２を葉緑体内に存在させる方法によって直接測定することができる（例えば、Meyer AJ et al. (2007), Plant Journal 52: 973-986. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer.およびGutscher M et al. (2009), Nat Methods 5: 553-559. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential.を参照）。また、これ以外にも、グルタチオン生合成系に関与するタンパク質の発現量、または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現量を指標として、これらが増加している場合にグルタチオン濃度が増加していると間接的に測定することもできる。タンパク質やポリヌクレオチドの発現量の測定方法については従来公知の手法を好適に利用できる。

上記「グルタチオン」としては、還元型グルタチオン（以下、「ＧＳＨ」という。）および酸化型グルタチオン（以下、「ＧＳＳＧ」という。）がある。本発明に係る方法においては、ＧＳＨまたはＧＳＳＧのどちらか一方のグルタチオンの濃度を増加させればよく、ＧＳＨおよびＧＳＳＧの両方の濃度を増加させてもよい。

本発明に係る藻類は、葉緑体において、γ−グルタミルシステイン合成酵素（以下、「ＧＳＨ１」と称する場合もある。）、グルタチオン合成酵素（以下、「ＧＳＨ２」と称する場合もある。）、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現量および／または活性が増加していることが好ましい。これらのタンパク質は、葉緑体内のグルタチオン生合成系に関与する酵素であり、これらの発現量の増加が、すなわち葉緑体内のグルタチオン濃度の増加と把握することができる。

また、本発明に係る藻類は、ＭＥＸ１をコードするポリヌクレオチドおよび／またはＡＴＧ８をサイレンシングする核酸に加えて、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。かかる外因性ポリヌクレオチドが導入され、且つ（過剰）発現されている藻類とは、すなわち葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した藻類であるといえる。

換言すれば、本発明は、ＭＥＸ１をコードするポリヌクレオチドおよび／またはＡＴＧ８をサイレンシングする核酸に加えて、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素およびセリンアセチル転移酵素からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入されており、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した形質転換藻類を提供するものであるといえる。かかる形質転換藻類は、当然のことながら、光合成産物の生産性が向上しているものである。

発現させる上記タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドの由来は、宿主藻類に導入されて発現し機能し得る限り特に限定されないが、宿主藻類自身の上記タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドであってよく、宿主藻類とは異なる種の藻類あるいは植物に由来する上記タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドであってもよい。植物由来の上記タンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば双子葉植物綱のアラビトプシス属に属する植物が好ましく用いられる。

発現させるγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの具体例としては、
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチド（塩基配列を配列番号７に示す）が挙げられる。

また、発現させるγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの具体例としては、
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、も挙げられる。上記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの詳細については後述する。

本発明の藻類において、上記ポリヌクレオチドが藻類の細胞内に導入されていることは、従来公知のＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって確認することができる。また、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を、従来公知の免疫学的手法により測定することでも確認可能である。また、ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が示す酵素活性を、従来公知の生化学的手法により測定することでも確認可能である。

ＡＴＧ８の発現が抑制された本発明に係る藻類では、基準株に比べて光合成産物の生産および／または蓄積を増加させることができる。また、本発明に係る藻類において、ＡＴＧ８の発現が抑制され且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している場合、基準株に比べて光合成産物の生産および／または蓄積がさらに増加する。

ＡＴＧ８の発現が抑制され且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類では、窒素欠乏培地への培地交換をすることなく窒素充足培地で光合成産物の生産および／または蓄積することが可能であるため、培地交換の手間を省くことができる。また、ＡＴＧ８の発現が抑制され且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類では、光条件をやや強くするだけで、光合成産物の生産および／または蓄積を増加させることができる。

さらに、ＡＴＧ８の発現が抑制され且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類では、藻類の細胞内に蓄積された光合成産物を細胞外に排出させることができるため、光合成産物の回収が容易である。例えば、光合成産物がデンプンである場合に、光合成によって蓄積したデンプンを、藻類の細胞を破砕しなくとも、デンプン粒として細胞外に排出させることができる。このため、ＡＴＧ８の発現が抑制され且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類を用いてバイオマスを製造すれば、デンプンの精製を比較的容易に行うことができる。

本発明の藻類を用いれば、光合成産物の蓄積の誘導および／または光合成産物の回収を、従来技術と比較して、容易に効率よく行うことができる。このため、本発明の藻類を、後述するバイオマスの製造方法において用いることにより、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することができる。

２．本発明に係る藻類により産生されるデンプン
本発明の藻類によって生成されたデンプン粒は微小であることが特徴である。例えば、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒は平均粒径が１０〜５０μｍであるのに対して、本発明の藻類によって生成されたデンプン粒は、その平均粒径が長径で１．３μｍ（標準偏差０．１８１）、短径で１．０μｍ（標準偏差０．２０４）である微小な、かつ大きさが揃った粒子である。イネやキヌア等は平均粒径が２〜３μｍ程度の微小なデンプン粒を造るが、それらは、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等が作るデンプン粒と同様に、密着により組織化した胚乳を形成する。従って、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、イネ、キヌア等を原材料にして、一つひとつがばらばらの状態になった微小なデンプン粒を調製するには、磨細など、コストにかかる処理が必要である。かかる微小なデンプン粒は、医薬品の製造において有用である。つまり、本発明の藻類を用いれば、微小で大きさの揃ったデンプン粒を大量に生産することができると共に、デンプン粒は藻類の細胞外に排出されるので精製を比較的容易に行うことができる。しかも、これらのデンプン粒は、磨砕等の処理をすることなく、一つひとつがばらばらの状態になっている。

このように、本発明の藻類によって生成されるデンプン粒は、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ等によって作られる一般的なデンプン粒に比べて微小である。かかる微小なデンプン粒は、医薬品の製造において有用である。具体的には、かかる微小なデンプン粒は肺の細気管支の径よりも小さいので、肺疾患の治療薬を細気管支にまで送達させるための担体（治療薬とデンプン微小粒とを組み合わせたドライパウダーインヘラー）としての利用が期待される。

また、デンプン粒の表面にペプチド性の抗原を提示させることによって、いわゆる「食べるワクチン」として活用することが期待される（例えば、Dauvillee D et al. (2010) PLoS ONE 5(12): e15424；特表２００３−５０００６０号公報（特願２０００−６２０１１１号公報）には、マラリア抗原をクラミドモナスのデンプン粒表面に提示させることが開示されている。）。

３．本発明に係る藻類の製造方法
本発明に係る藻類の製造方法は、上述した、基準株と比較して細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制され、光合成産物の生産性が向上している藻類（本発明の藻類）を製造する方法であって、藻類の細胞内のＡＴＧ８発現を抑制する、ＡＴＧ８発現抑制工程を少なくとも含んでいればよく、その他の条件、工程等の構成は限定されない。

本発明の藻類の製造方法について、以下に具体的に説明する。

（１）ＡＴＧ８発現抑制工程
ＡＴＧ８発現抑制工程は、藻類のＡＴＧ８の発現を抑制する工程である。

上記「ＡＴＧ８の発現を抑制させる」とは、基準株に比べてＡＴＧ８の発現を抑制させることを意味する。換言すれば、ＡＴＧ８発現抑制工程後の藻類は、基準株に比べてＡＴＧ８の発現量が少ない。藻類のＡＴＧ８発現量が基準株に比べて減少したことは、本発明に係る藻類の項で説明した方法によって判定することができる。

ＡＴＧ８発現抑制工程において、ＡＴＧ８の発現を抑制させる方法は、結果として、藻類のＡＴＧ８の発現量を抑制させることができる限り、特に限定されない。例えば、（ｉ）藻類にランダムに変異を導入する方法；（ｉｉ）ＡＴＧ８の発現を抑制する物質を細胞内（場合によっては藻類のゲノム中）に導入する方法；等により取得することができる。

以下に、上記（ｉ）および（ｉｉ）の方法について具体的に説明する。

（ｉ）藻類にランダムに変異を導入する方法
藻類にランダムに変異を導入する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、藻類を化学物質（例えば、ＥＭＳ、ＮＴＧなど）で処理する方法、放射線を利用する方法、トランスポゾンを利用する方法、Ｔ−ＤＮＡを利用する方法、原核真核細胞間接合を利用する方法、ジーンガンなどで物理的に導入する方法などを挙げることができる。かかる手法により、例えば、ＡＴＧ８遺伝子、又はＡＴＧ８の発現を正に制御するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、ＡＴＧ８の発現量を減少させる。あるいは、上記手法により、ＡＴＧ８の発現を負に制御するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、タンパク質の活性を高め、ＡＴＧ８の発現量を減少させる。

所望の変異が導入された藻類を選別する方法も公知の手法を利用でき、特に制限されない。例えば、上述した細胞内のＡＴＧ８の発現量を直接測定する方法を利用して、ＡＴＧ８の発現が抑制された変異藻類を取得する方法、あるいはＭＥＸ１のタンパク質の発現量および／または活性が増加した変異藻類を取得する方法等を挙げることができる。

（ｉｉ）ＡＴＧ８の発現を抑制させる物質を細胞内に導入する方法
上記「細胞内のＡＴＧ８の発現を抑制する物質」として、例えば、（Ａ）ＡＴＧ８の発現を抑制するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）ＡＴＧ８遺伝子をサイレンシングさせる機能を有するポリヌクレオチドを導入することにより、細胞内のＡＴＧ８の発現量が減少している藻類を取得することができる。上記（Ａ）および（Ｂ）のポリヌクレオチドは、単独で用いてもよく、併用してもよい。

なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。

上記「ポリヌクレオチドを導入する」とは、導入対象のポリヌクレオチドが藻類の細胞内に存在していればよく、導入対象のポリヌクレオチドが、藻類のゲノム中に挿入（導入）されている場合も含まれる。ポリヌクレオチドが藻類の細胞内に導入されたことは、従来公知のＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって確認することができる。

上記（Ａ）のポリヌクレオチドを少なくとも１種、藻類の細胞内に導入することによって、細胞内のＡＴＧ８の発現を抑制するタンパク質の発現量を増加させることができ、その結果として細胞内のＡＴＧ８の発現を抑制することができる。

このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、ＭＥＸ１をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＭＥＸ１遺伝子」と称する場合もある。）を好ましく例示できる。これらのポリヌクレオチドは、植物由来であることが好ましく、より好ましくは、宿主藻類自身が有するポリヌクレオチドであるが、宿主藻類と異なる藻類由来のポリヌクレオチドやその他高等植物由来のポリヌクレオチドも好適に用いることができる。

上記「ＭＥＸ１遺伝子」の具体例としては特に限定されないが、本発明に用いられる好適なＭＥＸ１遺伝子の１種として、本発明者らが実施例で用いているクラミドモナスのＭＥＸ１遺伝子を挙げることができる。クラミドモナスのＭＥＸ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、それをコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）は配列番号２に示される塩基配列からなる。

また、本発明に用いられる好適なＭＥＸ１遺伝子の１種として、上記の他、本発明者らが実施例で用いているシロイヌナズナのＭＥＸ１遺伝子を挙げることができる。シロイヌナズナのＭＥＸ１は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、それをコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）は配列番号４に示される塩基配列からなる。

すなわち、本発明においては、藻類に導入するヌクレオチドとして、下記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを好ましく例示できる：
（ａ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

ここで、上記「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。

タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。

代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。

本明細書において、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。

ハイブリダイゼーションは、Sambrooket J al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同性の高いポリヌクレオチドを取得することができる。

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S, Altschul SF (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268; Karlin S, Altschul SF (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410）。

クラミドモナス以外の植物由来のＭＥＸ１遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ（TAIR Accession Gene: 2157491、Name AT5G17520.1）、ダイズ（NCBI Reference Sequence: XP_003539988）、イネ（Genbank accession: AGR54532.1）、リンゴ（Genbank accession: DQ648082.1等のＭＥＸ１遺伝子が知られており、これらも本発明に好適に用いることができる。

また、上記（Ｂ）のポリヌクレオチドを藻類の細胞内に導入することによって、細胞内のＡＴＧ８の発現量を低下させることができる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、従来公知のＲＮＡ干渉（RNA interference；RNAi）法において用いられる、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、これらのＲＮＡの鋳型ＤＮＡ、およびｍｉＲＮＡ（micro RNA）等が挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、ＡＴＧ８遺伝子の転写および／または翻訳を阻害する。

上記ｍｉＲＮＡの具体例としては特に限定されないが、本発明に用いられる好適なｍｉＲＮＡの具体例として、配列番号５のｍｉＲＮＡが挙げられる。

本発明の藻類の製造方法において用いられる「ポリヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡに由来しても、ｃＤＮＡに由来してもよく、化学合成されたＤＮＡであってもよい。また、ＲＮＡでもよい。目的に応じて適宜選択され得る。

本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、例えば、ＭＥＸ１遺伝子を取得する場合は、公知の技術により、ＭＥＸ１をコードするＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。クラミドモナスのＭＥＸ１をコードするＤＮＡの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。

あるいは、本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、ＭＥＸ１遺伝子を取得する場合は、クラミドモナスのＭＥＸ１をコードするｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に用いられるＭＥＸ１をコードするＤＮＡ断片（ＭＥＸ１遺伝子）を大量に取得できる。

本発明の藻類の製造方法において用いられるポリヌクレオチドは、所望の藻類及び植物を供給源として取得することができる。

本発明の藻類の製造方法において、ポリヌクレオチドを藻類に導入する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、当該ポリヌクレオチドを備える発現ベクターを導入することによって、当該ポリヌクレオチドを藻類の細胞内に導入することができる。また、発現ベクターの構築方法としては、従来公知の方法を使用すればよく、特に限定されるものではない。例えば、日本国公開特許公報「特開２００７−４３９２６号公報」および日本国公開特許公報「特開平１０−０５７０８６８号公報」に開示された、発現ベクターの構築方法および藻類の形質転換方法に従って、導入対象ポリヌクレオチドの上流に藻類細胞で機能するプロモーターを、下流に藻類細胞で機能するターミネーターを連結した組換え発現ベクターを構築し、藻類に導入することができる。

上記「プロモーター」としては、例えば、Ｈｓｐ７０Ａ/ＲＢｃ＿Ｓ２プロモーターを好適に用いることができる。Ｈｓｐ７０Ａ/ＲＢｃ＿Ｓ２プロモーターは藻類において遺伝子発現用途のために汎用的に使われており、導入対象ポリヌクレオチドにコードされている転写産物やタンパク質を構成的に高発現できる。

（２）グルタチオン濃度増加工程
本発明に係る改変藻類の製造方法は、さらに藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるグルタチオン濃度増加工程を含んでいることが好ましい。

ここで、「葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる」とは、基準株に比べて葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることを意味する。換言すれば、グルタチオン濃度増加工程後の藻類は、基準株に比べて高いグルタチオン濃度を有している。藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度が当該藻類の基準株に比べて増加したことは、本発明に係る藻類の項で説明した方法によって判定することができる。

グルタチオン濃度増加工程において、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる方法は、結果として、藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる限り、特に制限されない。例えば、ＡＴＧ８発現抑制工程の方法と同様の方法、または特許文献５に記載された方法などを用いることができる。（ｉ）目的の藻類に、公知の変異導入法を用いてランダムに変異を導入する方法；（ｉｉ）葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質を細胞内（場合によっては、藻類のゲノム中）に導入する方法；等により取得することができる。

（ｉ）藻類にランダムに変異を導入する方法
藻類にランダムに変異を導入する方法は特に限定されず、公知の方法を適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、藻類を化学物質（例えば、ＥＭＳ、ＮＴＧなど）で処理する方法、放射線を利用する方法、トランスポゾンを利用する方法、Ｔ−ＤＮＡを利用する方法、原核真核細胞間接合を利用する方法、ジーンガンなどで物理的に導入する方法などを挙げることができる。かかる手法により、例えば、ＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素、セリンアセチル転移酵素等の葉緑体におけるグルタチオンの生合成系に関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入し、タンパク質の発現量および／または活性を高め、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度が増加した藻類を取得すればよい。

所望の変異が導入された藻類を選別する方法も公知の手法を利用でき、特に制限されない。例えば、上述した葉緑体内のグルタチオン濃度を直接測定する方法を利用して、グルタチオン濃度が増加した変異藻類を取得する方法、あるいはＧＳＨ１、ＧＳＨ２、ＡＴＰスルフリラーゼ、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素、亜硫酸還元酵素、システイン合成酵素、セリンアセチル転移酵素等のタンパク質の発現量および／または活性が増加した変異藻類を取得する方法等を挙げることができる。

（ｉｉ）葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質を細胞内に導入する方法
上記「葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させる物質」として、例えば、（Ａ）藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（Ｂ）藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質の発現量を低下させる機能を有するポリヌクレオチドを導入することにより、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類を取得することができる。上記（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドは、単独で用いてもよく、併用してもよい。

上記（Ａ）のポリヌクレオチドを少なくとも１種、藻類の細胞内に導入することによって、葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるタンパク質の発現量を増加させることができ、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる。

このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、γ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＳＨ１遺伝子」と称する場合もある。）、グルタチオン合成酵素をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＳＨ２遺伝子」と称する場合もある。）、ＡＴＰスルフリラーゼをコードするポリヌクレオチド、アデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素をコードするポリヌクレオチド、亜硫酸還元酵素をコードするポリヌクレオチド、システイン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、セリンアセチル転移酵素をコードするポリヌクレオチド等を好ましく例示できる。これらのポリヌクレオチドは、植物由来であることが好ましく、より好ましくは、宿主藻類自身が有するポリヌクレオチドであるが、宿主藻類と異なる藻類由来のポリヌクレオチドやその他高等植物由来のポリヌクレオチドも好適に用いることができる。

上記「γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＳＨ１）」は、グルタミン酸をγ位でシステインとアミド結合させることによってγ−グルタミルシステインを合成する酵素である。また、上記「グルタチオン合成酵素（ＧＳＨ２）」は、γ−グルタミルシステインにグリシンが付加することによってグルタチオンを合成する酵素である。

上記「ＧＳＨ１遺伝子」の具体例としては特に限定されないが、本発明に用いられる好適なＧＳＨ１遺伝子の１種として、本発明者らが実施例で用いているクラミドモナスのＧＳＨ１遺伝子（CHLREDRAFT_181975）を挙げることができる。クラミドモナスのＧＳＨ１は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、それをコードする遺伝子（全長ｃＤＮＡ）は配列番号７に示される塩基配列からなる。クラミドモナスＧＳＨ１遺伝子の翻訳産物は、Ｎ末端領域に葉緑体移行シグナルペプチドを有している。それゆえ、クラミドモナスのＧＳＨ１遺伝子の翻訳産物、すなわちクラミドモナスのＧＳＨ１は、通常、葉緑体に存在している。

すなわち、本発明においては、藻類に導入するヌクレオチドとして、下記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドを好ましく例示できる：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つγ−グルタミルシステイン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

本発明において、上記「γ−グルタミルシステイン合成酵素活性」とは、グルタミン酸をγ位でシステインとアミド結合させる反応を触媒する活性を意味する。「γ−グルタミルシステイン合成酵素活性」は、例えば、溶液を窒素置換するなどして酸化防止措置を講じつつ、破砕した藻類を遠心分離して得られる上清を試料として、システインおよびグルタミン酸、ＡＴＰを含む反応液に試料を添加した後、一定時間に合成されるγ−グルタミルシステイン量として求めることができる。その他、その反応に伴い、生成されるリン酸量を定量して求めることもできる。

クラミドモナス以外の植物由来のＧＳＨ１遺伝子としては、例えば、シロイヌナズナ（TAIR Accession Gene:2127172、Name AT4G23100.1）、ヒャクニチソウ（Genbank accession: AB158510）、イネ（Genbank accession: AJ508915）、タバコ（Genbank accession: DQ444219）等のＧＳＨ１遺伝子が知られており、これらも本発明に好適に用いることができる。これらの遺伝子の翻訳産物も、クラミドモナスと同様にＮ末端領域に葉緑体移行シグナルペプチドを有している。

また、上記（Ｂ）のポリヌクレオチドを藻類の細胞内に導入することによって、葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質の発現量を減少させることができ、その結果として葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させることができる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、従来公知のＲＮＡ干渉（RNA interference；RNAi）法において用いられる、２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、これらのＲＮＡの鋳型ＤＮＡ等が挙げられる。

上記「藻類の葉緑体内のグルタチオン濃度を低下させるタンパク質」としては、例えば、ＣＬＴ１等を好ましく例示できる。上記「ＣＬＴ１」は、グルタチオンを葉緑体から細胞質へ輸送するトランスポーターであり、最初にシロイヌナズナで見つけられ、ＣＬＴ１と命名された（Maughan SC et al. (2010), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (5): 2331-2336を参照）。つまり、上記（Ｂ）の例示として、ＣＬＴ１等のグルタチオントランスポーターの発現量を減少させることを意図したポリヌクレオチドを挙げることができる。

（３）その他の工程
本発明の藻類の製造方法では、上述した「ＡＴＧ８発現抑制工程」に加えて、細胞内のＡＴＧ８の発現量が抑制されている藻類をスクリーニングする、スクリーニング工程をさらに含んでいてもよい。また、本発明の藻類の製造方法では、上述した「グルタチオン濃度増加工程」に加えて、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類をスクリーニングする、スクリーニング工程をさらに含んでいてもよい。

例えば、目的の遺伝子が導入された形質転換藻類は、まず、カナマイシン耐性やハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性マーカーの発現を指標として、従来公知の薬剤選択法を用いて選択する。その後、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって、目的の遺伝子が藻類に導入されたか否かを確認することができる。例えば、形質転換藻類からＤＮＡを調製し、導入されたＤＮＡに特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウムなどによって染色し、目的の増幅産物を検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。

細胞内のＡＴＧ８の発現量が抑制されている形質転換体のスクリーニングには、上述した細胞内のＡＴＧ８発現量の測定方法等を用いればよい。また、葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している個体のスクリーニングには、上述した葉緑体内のグルタチオン濃度の測定方法等を用いればよい。

４．本発明に係るバイオマスの製造方法
本発明に係るバイオマスの製造方法は、上述した、基準株と比較して細胞内のＡＴＧ８の発現が抑制されている藻類、またはＡＴＧ８の発現が抑制されていることに加えて葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類の製造方法によって製造された藻類を用いてバイオマスを製造する方法である。

本発明の藻類については、本発明に係る藻類の項で説明しており、また、本発明の藻類の製造方法については、本発明に係る藻類の製造方法の項で説明したとおりであるので、ここでは省略する。

本明細書において、上記「バイオマス」とは、藻類が光合成による炭素固定によって産生する物質、例えば、糖類（例えば、デンプン）、油脂等を意図し、「光合成産物」とも言い換えられる。

本発明のバイオマスの製造方法では、藻類の細胞内において光合成産物の生産または蓄積を誘導する方法は、特に制限されない。例えば、本発明のバイオマスの製造方法では、藻類の細胞内における光合成産物の生産または蓄積を誘導するために、上記藻類に対して光を照射する、光照射工程を含んでいてもよい。

（１）光照射工程
（ｉ）ＡＴＧ８発現抑制藻類の場合
ＡＴＧ８の発現が抑制されており且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していない藻類（ＡＴＧ８発現抑制藻類）において、細胞内への光合成産物の蓄積を誘導するためには、窒素飢餓条件下にすることが望ましい。「窒素飢餓条件」とは、無機態窒素の含有量が窒素原子換算で０．００１重量％より少ない培養液中で培養することをいう。なお、上記「無機態窒素」とは、例えば、アンモニア態窒素、亜硝酸態窒素、硝酸態窒素等の窒素をいう。特に制限されないが、窒素を含有していない培養液として、例えば、公知のＴＡＰ培地の組成から窒素源を除いたＴＡＰ Ｎ−ｆｒｅｅ培地を好適に用いることができる。なお、ＴＡＰ培地は主成分がTris（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）、Acetate（酢酸塩）、Phosphate（リン酸塩）から成る培地で、窒素源として塩化アンモニウム（0.4 g/l）を含む。詳細な組成はFukuzawa H and Kubo T (2009), 低温科学 67: 17-21に記載されている。ＴＡＰ Ｎ−ｆｒｅｅ培地は、ＴＡＰ培地の組成を一部変更し、塩化アンモニウムの代わりに塩化カリウムを0.4 g/lとなるように加えた培地である。

ＡＴＧ８遺伝子をサイレンシングさせる機能を有するポリヌクレオチドを用いてＡＴＧ８の発現を抑制する場合、上記培地中に当該ポリヌクレオチドを含有させることが好ましい。培地中における当該ポリヌクレオチドの濃度は、例えば、１０μｇ／ｍｌであることが好ましく、４μｇ／ｍｌであることがより好ましい。

なお、ＡＴＧ８遺伝子をサイレンシングさせる機能を有するポリヌクレオチドの配列は、公知の手法により設計することができ、例えば配列番号５に挙げる配列を好適に用いることができる。また、ＡＴＧ８遺伝子をサイレンシングさせる機能を有するポリヌクレオチドは、対象となる藻類のゲノム中に、適切なプロモーターと共に組み込むことで、対象となる藻類の中に発現させ、その機能を発揮させることができるが、適切な条件で培地等に添加することでその機能を発揮させることもできる。

また、藻類に照射する光量を調節せずとも光合成産物の蓄積を誘導することが可能であるが、藻類に対して照射する光の光量は、例えば、４０Ｅ／ｍ²／秒以上であり、５０μＥ／ｍ²／秒以上であることが好ましく、６０μＥ／ｍ²／秒以上であることがより好ましく、７０μＥ／ｍ²／秒以上、８０μＥ／ｍ²／秒以上、９０μＥ／ｍ²／秒以上、１００μＥ／ｍ²／秒以上であることがさらに好ましい。また、例えば、１０００μＥ／ｍ²／秒以下であることが好ましく、５００μＥ／ｍ²／秒以下であることがより好ましく、１００μＥ／ｍ²／秒以下であることがさらに好ましい。

上述した範囲の光を照射するための光照射装置として、特別な光照射装置を必要としない。例えば、太陽光；太陽光を鏡、光ファイバー、フィルター、メッシュ等で質的および量的に調節を加えた光；白熱灯、蛍光灯、水銀ランプ、発光ダイオード等の人工光を用いることができる。また、照射する光は、一般的な藻類の光合成に好適な波長域の光を用いることができ、例えば、４００ｎｍ〜７００ｎｍであることが好ましい。

また、光照射工程は、独立栄養条件下において行ってもよい。ここで、上記「独立栄養条件」とは、二酸化炭素以外に炭素源を供給しないで培養する条件をいう。具体的には、例えば、本発明の藻類を、ＨＳＭ培養液中で、大気を送気しつつ光照射する方法によって培養することによって、光照射工程を独立栄養条件下において行うことができる。なお、二酸化炭素の供給源としては、大気に限定されず、火力発電所や製鉄所等の煙道中に含まれる二酸化炭素を活用して、大気より高い濃度で二酸化炭素を培地へ送り込み、生産性を高めることも可能である。

独立栄養条件下では、培養容器の底部付近から、二酸化炭素または二酸化炭素を含む気体を送る（通気する）。二酸化炭素の水中での拡散速度は、大気中と比べて極度に遅い。それゆえ、培地を攪拌する必要がある。培地を攪拌することによって、藻類に対して光をムラ無く照射することも可能となる。二酸化炭素は水中で陰イオンとなるため、培地の緩衝能が弱いと、通気により培地が酸性側に傾き、二酸化炭素の溶解度が低下し、光合成に利用されにくくなる。それゆえ、培地にはｐＨが中性付近またはアルカリ性側に保たれる緩衝能があることが好ましい。かかる培地としては、従来公知のＨＳＭ培地等が好ましく例示される。

（ｉｉ）ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類の場合
ＡＴＧ８の発現が抑制されており且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類（ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類）において、細胞内への光合成産物の蓄積を誘導するために、窒素飢餓条件下で藻類を培養する必要がない。このため、上記光照射工程は、窒素飢餓ではない条件において行ってもよい。ここで、上記「窒素飢餓ではない条件」とは、藻類が生育するために必要な量の無機態窒素を含有している培養液中で培養することをいう。ここで、藻類が生育するために必要な量とは、培養液中に含有されている無機態窒素が、窒素原子換算で０．００１〜０．１重量％であり、好ましくは０．００５〜０．０５重量％である。なお、後述する実施例で用いたＴＡＰ培地では、培養液中に含有されている無機態窒素が、窒素原子換算で約０．０１重量％である。

ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類が生育するために必要な量の無機態窒素を含有している培養液としては、藻類を培養するために通常用いられる培養液を用いればよく、特に制限されない。このような培養液としては、例えば、従来公知のＴＡＰ培地、ＨＳＭ培地、ＡＴＣＣ８９７培地等を挙げることができる。

また、藻類に照射する光量を調節せずとも光合成産物の蓄積を誘導することが可能であるが、藻類に対して照射する光の光量は、例えば、１０００μＥ／ｍ²／秒以下であり、５００μＥ／ｍ²／秒以下であることが好ましく、４００μＥ／ｍ²／秒以下、３００μＥ／ｍ²／秒以下、２００μＥ／ｍ²／秒以下、１５０μＥ／ｍ²／秒以下、１００μＥ／ｍ²／秒以下、あるいは８０μＥ／ｍ²／秒以下であることがさらに好ましい。照射する光量が小さいほど、エネルギー効率が高まり、生産性が向上する。ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類は、従来の野生型の藻類に比べて少ない光量でも、細胞内および細胞外へ光合成産物を産生させることができる点で優れる。なお、照射する光量の下限は特に制限されないが、例えば、４０μＥ／ｍ²／秒以上が現実的に設定できる。

上述した範囲の光を照射するための光照射装置としては、上記（ｉ）で列挙したものを挙げることができる。

一実施形態において、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類を、ＴＡＰ培地において、４５μＥ／ｍ²／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。別の実施形態において、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類を、ＴＡＰ培地において、８０μＥ／ｍ²／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。

なお、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類における光照射工程は、上記（ｉ）で説明した窒素飢餓条件下において行ってもよい。一実施形態において、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類を、窒素飢餓条件下（ＴＡＰ Ｎ−ｆｒｅｅ培地中）において、８０μＥ／ｍ²／秒の光を照射しながら培養することによって、細胞内へのデンプンの蓄積を誘導することができる。

上述したように、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類の特徴として、光合成産物を産生させる際に、窒素飢餓状態等の栄養制限工程を必要としない点を挙げることができる。つまり、ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類を用いる本発明の一実施形態では、実質的に窒素飢餓状態等の栄養制限工程を実施しない（実質的に窒素飢餓状態等の栄養制限工程を含まない）態様が可能である。かかる特徴により、工程を簡略化でき、光合成産物の生産性が向上する。

また、光照射工程は、上記（ｉ）で説明した独立栄養条件下において行ってもよい。

（２）その他の工程
本発明のバイオマスの製造方法では、上述した「光照射工程」に加えて、光合成産物を回収する工程をさらに含んでいてもよい。

（ｉ）ＡＴＧ８発現抑制藻類の場合
本発明に係るバイオマスの製造方法において、ＡＴＧ８の発現が抑制されており且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加していない藻類（ＡＴＧ８発現抑制藻類）を用いる場合、細胞を破砕し、例えば、静置による自然沈降、遠心分離、篩等により、デンプン粒および藻類の細胞破砕物の粒子径および／または比重等の物理的性質に基づく分離手段によりデンプン粒を回収すればよい。

（ｉｉ）ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類の場合
本発明に係るバイオマスの製造方法において、ＡＴＧ８の発現が抑制されており且つ葉緑体内のグルタチオン濃度が増加している藻類（ＡＴＧ８発現抑制＋グルタチオン濃度増加藻類）を用いる場合、細胞内に蓄積されたデンプンを、デンプン粒として細胞外に排出させることができるので、例えば、光合成産物がデンプンである場合、光合成産物を回収する工程では、細胞外に排出されたデンプン粒と藻類とを分離し、分離したデンプン粒を回収すればよい。細胞外に排出されたデンプン粒と藻類とを分離する方法は、特に制限されない。例えば、静置による自然沈降、遠心分離、篩等により、デンプン粒および藻類の細胞の粒子径および／または比重等の物理的性質に基づく分離手段によりなされ得る。

上記（ｉ）および（ｉｉ）のいずれについても、本発明のバイオマスの製造方法は、本発明の藻類または本発明の藻類の製造方法によって製造された藻類を用いてバイオマスの製造を行うので、光合成産物の蓄積の誘導および光合成産物の回収の両方を、従来技術と比較して、容易に、効率よく行うことができる。それゆえ、本発明のバイオマスの製造方法によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することできる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

〔実施例１：藻類の作成〕
＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製１＞
クラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質（配列番号３、以下「ＣｒＭＥＸ１」と称する。）をコードするＭＥＸ１遺伝子（配列番号４）を、Ｈｓｐ７０Ａ/ＲＢｃ＿Ｓ２プロモーターの下流に連結したプラスミドを作製した。

具体的には、以下の方法によった。クラミドモナス用ベクターである環状ＤＮＡ、pChlamy1 （ライフ・テクノロジーズ社製）を、制限酵素Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１を用いて逐次処理することによりで開環した（ＤＮＡ断片１）。配列番号８のうち第１６３位〜第１８３０位のポリヌクレオチド（約１．７キロ塩基対）は、以下の方法によって作製した。

クラミドモナス・ラインハルディＣＣ−５０３株（クラミドモナスセンター、米国、デューク大学より分譲を受けた）をＴＡＰ培地、２４℃、５０μＥ／ｍ²／秒の条件で４日間培養した。この培養物より集めた細胞を材料に、ｃＤＮＡ合成試薬キット（タカラバイオ社製、Solid phase cDNA synthesis kit）を用いｃＤＮＡの混合物を調製した。このｃＤＮＡ混合物を鋳型として、配列番号９および１０のオリゴヌクレオチドを用いて、公知の方法によりＰＣＲ反応（アニーリング温度は６８℃）を実施し、クラミドモナスＭＥＸ１遺伝子をＯＲＦとこれに続く3'ＵＴＲ領域を連続した約１．７キロ塩基対のポリヌクレオチドとして回収した。さらに、制限酵素Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１を用いて末端構造を加工した（ＤＮＡ断片２）。

上述のＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２を連結すると同時に再度環状化させた。この環状ＤＮＡを公知の方法で、大腸菌を用いて増幅させ、大腸菌より抽出・精製した。

この操作により環状ＤＮＡ分子中に配列番号８に示される塩基配列が作成された。このうち、第１位〜第３位が開始コドンであり、第１２８６位〜第１２８８位が終止コドンである。すなわち、クラミドモナスＭＥＸ１遺伝子は、配列番号８に示される塩基配列のうち、第１位〜第１２８８位をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有している。なお、第９位〜第１５３位はイントロンである。

上述のように作製した、Ｈｓｐ７０Ａ-Ｒｂｃ＿Ｓ２プロモーター−ＣｒＭＥＸ１のポリヌクレオチドを含むプラスミドを、制限酵素Ｓｃａ１により線状化し、ガラスビーズ法（Kindle KL (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228-1232を参照）により、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）ＣＣ−５０３株へ導入した。当該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡへ挿入され、細胞の複製に伴い子世代へ安定に受け継がれる形質転換株を、ＣＣ−５０３株がハイグロマイシン耐性を獲得したことを指標に選抜した。当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入はＰＣＲ法により確認した。

作製したＣｒＭＥＸ1過剰発現株を「ＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）」と称する。

＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製２＞
アラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質（配列番号１、以下「ＡｔＭＥＸ１」と称する。）をコードするＭＥＸ１遺伝子（配列番号２）を、Ｈｓｐ７０Ａ/ＲＢｃ＿Ｓ２プロモーターの下流に連結したプラスミドを作製した。

具体的には、以下の方法によった。クラミドモナス用ベクターである環状ＤＮＡ、pChlamy3 （ライフ・テクノロジーズ社製）を、制限酵素Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１を用いて逐次処理することによりで開環した（ＤＮＡ断片３）。配列番号１１のうち第１６３位〜第１４４２位のポリヌクレオチド（約１．３キロ塩基対）は、以下の方法によって作製した。

シロイヌナズナ、コロンビア株を２２℃、明期（１００μＥ／ｍ²／秒）１６時間／暗期８時間の日周条件で３週間栽培した。この植物体を材料に、＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製１＞における操作と同様の操作によりｃＤＮＡの混合物を調製した。このｃＤＮＡ混合物を鋳型として、配列番号１２および１３のオリゴヌクレオチドを用いて、公知の方法によりＰＣＲ反応（アニーリング温度は６８℃）を実施し、シロイヌナズナＭＥＸ１遺伝子のＯＲＦを約１．３キロ塩基対のポリヌクレオチドとして回収した。さらに、制限酵素Ｋｐｎ１およびＮｏｔ１を用いて末端構造を加工した（ＤＮＡ断片４）。

上述のＤＮＡ断片３とＤＮＡ断片４を連結すると同時に再度環状化させた。この環状ＤＮＡを公知の方法で、大腸菌を用いて増幅させ、大腸菌より抽出・精製した。

この操作により環状ＤＮＡ分子中に配列番号１１に示される塩基配列が作成された。このうち、第１位〜第３位が開始コドンであり、第１４１２位〜第１４１４位が終止コドンである。すなわち、シロイヌナズナＭＥＸ１遺伝子は、配列番号１１に示される塩基配列のうち、第１位〜第１４１４位をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有している。なお、第９位〜第１５３位はイントロンである。

上述のように作製した、Ｈｓｐ７０Ａ-Ｒｂｃ＿Ｓ２プロモーター−ＡｔＭＥＸ１のポリヌクレオチドを含むプラスミドを、制限酵素Ｓｃａ１により線状化し、ガラスビーズ法（Kindle KL (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228-1232を参照）により、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）ＣＣ−５０３株へ導入した。当該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡへ挿入され、細胞の複製に伴い子世代へ安定に受け継がれる形質転換株を、ＣＣ−５０３株がハイグロマイシン耐性を獲得したことを指標に選抜した。当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入はＰＣＲ法により確認した。

作製したＡｔＭＥＸ１過剰発現株を「ＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）」と称する。

＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製３＞
クラミドモナスの内生ＡＴＧ８遺伝子の発現を特異的に抑制するサイレンシングコンストラクト（配列番号５、以下「ATG8-amiRNA」と称する。）に相補的なＤＮＡを、ＰＳＡＤプロモーターの下流に連結したプラスミドを作製した。

具体的には、以下の方法によった。クラミドモナス用ベクターである環状ＤＮＡ、pChlamiRNA3（Molnar A et al. (2009), Plant Journal 58: 165-174）を、制限酵素Ｓｐｅ１で処理することによりで開環した（ＤＮＡ断片５）。配列番号１４からなるオリゴヌクレオチド（１３４塩基対）は、以下の方法によって作製した。配列番号１５および１６からなる２種類の１本鎖オリゴヌクレオチドを化学合成した。これら２種のオリゴヌクレオチドを混合し、１００℃に加熱した後、徐々に温度を下げることにより、５’末端の４塩基（5'-CTAG）が１本鎖ＤＮＡとして突出する構造を有した２本鎖オリゴヌクレオチドを調製した（ＤＮＡ断片６）。

上述のＤＮＡ断片５とＤＮＡ断片６とをＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて連結すると同時に再度環状化させた。この環状ＤＮＡを公知の方法で、大腸菌を用いて増幅させ、大腸菌より抽出・精製した。

この操作により環状ＤＮＡ分子中に配列番号１４に示される塩基配列が作成された。このうち、第６位〜第２８位および第７１位〜第９３位がクラミドモナスＡＴＧ８のサイレンシングに特異性を与える塩基配列である。すなわち、ATG8-amiRNAは、配列番号１４を含む配列番号５に示される塩基配列を鋳型として、細胞内でPSADプロモーターの制御のもとDNAからRNAへと転写される設計となっている。

上述のように作製した、PSADプロモーター−ATG8-amiRNAのポリヌクレオチドを含むプラスミドを、制限酵素Ｓｃａ１により線状化し、ガラスビーズ法（Kindle KL (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228-1232を参照）により、クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）ＣＣ−５０３株へ導入した。当該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡへ挿入され、細胞の複製に伴い子世代へ安定に受け継がれる形質転換株を、ＣＣ−５０３株がパロモマイシン耐性を獲得したことを指標に選抜した。当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入はＰＣＲ法により確認した。

作製したＡＴＧ８発現抑制株を「ＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）」と称する。

＜ＧＳＨ１過剰発現株の作製＞
特許文献５の実施例１に記載の方法に従って、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２と称する）を作製した。

＜ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株の作製１＞
上述のＣｒＧＳＨ１を過剰発現する細胞株２２−２株を、＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製１＞と同様の方法で、Ｈｓｐ７０Ａ-Ｒｂｃ＿Ｓ２プロモーター−ＣｒＭＥＸ１のポリヌクレオチドのゲノム上にもつ形質転換体を作製した。

作製したＡＴＧ８発現抑制株を「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）」と称する。

＜ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株の作製２＞
上述のＣｒＧＳＨ１を過剰発現する細胞株２２−２株を、＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製２＞と同様の方法で、Ｈｓｐ７０Ａ-Ｒｂｃ＿Ｓ２プロモーター−ＡｔＭＥＸ１のポリヌクレオチドのゲノム上にもつ形質転換体を作製した。

作製したＡＴＧ８発現抑制株を「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）」と称する。

＜ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株の作製３＞
上述のＣｒＧＳＨ１を過剰発現する細胞株２２−２株を、＜ＡＴＧ８発現抑制株の作製３＞と同様の方法で、ＰＳＡＤプロモーター−ATG8-amiRNAのポリヌクレオチドのゲノム上にもつ形質転換体を作製した。

作製したＡＴＧ８発現抑制株を「ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）」と称する。

〔実施例２：野生型株におけるＭＥＸ１過剰発現のＡＴＧ８発現への効果〕
実施例１で作製したＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）およびＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）を培養し、ＡＴＧ８の発現量を評価した。具体的には、ＡＴＧ８発現抑制株をＴＡＰ培地で振とう培養し、７２時間経過後に細胞を回収した。次いで、細胞を破砕して、ウエスタンブロッティング解析した。コントロールとして、野生型クラミドモナス株であるＣＣ−５０３株（以下、「親株（野生型株）」と称する）を用いた。

結果を、図１に示す。図１は、得られた複数のクローンにおけるＡＴＧ８のタンパク質発現量を示す図である。図１に示したように、ＭＥＸ１を過剰発現させた細胞では、ＡＴＧ８の発現が抑制されることがわかった（ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘのクローン１，２，３，１６およびＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘのクローン１，２，１１，１２，１５，１８参照）。各クローンにおけるＡＴＧ８のタンパク質発現量を、親株（野生型株）との発現量比（％）で以下の表に示す。

〔実施例３：野生型株におけるＭＥＸ１過剰発現及びＡＴＧ８サイレンシングのデンプン産生への効果〕
実施例１で作製したＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）およびＡＴＧ８発現抑制株（ＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）について、ＴＡＰ窒素充足培地に細胞密度が０．５×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように播種し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が対数増殖期に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、ＴＡＰ窒素欠乏培地（ＴＡＰ N−free）に細胞密度が５．０×１０⁶ｃｅｌｌs／ｍｌになるように再懸濁した（培地交換）。培地交換直後、およびＴＡＰ窒素欠乏培地（ＴＡＰ N−free）で２４時間振とう培養後に細胞を回収し、デンプン量を定量した。デンプン量は培養液あたりのデンプン量（グルコース換算）として示した。コントロールとして、野生型株ＣＣ−５０３を用いた。

また、ＡＴＧ８を標的とするＲＮＡサイレンシングコンストラクト（ATG8-amiRNA）を細胞内へ供給するようにした遺伝子組換え体をＴＡＰ窒素充足培地に細胞密度が０．５×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように播種し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が対数増殖期に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、ＴＡＰ窒素欠乏培地（ＴＡＰ N−free）に細胞密度が５．０×１０⁶ｃｅｌｌs／ｍｌになるように再懸濁した（培地交換）。培地交換直後、およびＴＡＰ窒素欠乏培地（ＴＡＰ N−free）で２４時間振とう培養した細胞を回収し、デンプン量を定量した。デンプン量は培養液あたりのデンプン量（グルコース換算）として示した。コントロールとして、野生型株ＣＣ−５０３を用いた。

結果を図２に示す。図２は、ＴＡＰ N−free培地へ培地交換０時間のデンプン量および培地交換２４時間後のデンプン量を示す図である。ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘはクローン３、ＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘはクローン１５のデータを代表例として示す。デンプン量は培養液あたりのグルコース換算（mg glucose/dL culture）として表した。

図２に示したように、ＭＥＸ１を過剰発現させた細胞（ＣＣ−５０３／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ、ＣＣ−５０３／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）、およびＡＴＧ８を発現抑制した細胞（ＣＣ−５０３／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）では、野生型株と比較して、２４時間後の培養液あたりのデンプン量（デンプン蓄積量）が増加した。この結果から、ＭＥＸ１の過剰発現を介した間接のＡＴＧ８発現抑制、あるいは直接のＡＴＧ８発現抑制によりデンプン量が増加することが示された。

〔実施例４：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＭＥＸ１過剰発現のＡＴＧ８発現への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）およびＧＳＨ過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）を培養し、ＡＴＧ８の発現量を評価した。具体的には、ＡＴＧ８発現抑制株をＴＡＰ培地で振とう培養し、９６時間経過後に細胞を回収した。次いで、細胞を破砕して、ウエスタンブロッティング解析した。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）を用いた。

結果を、図３に示す。図３（ａ）は、ＧＳＨ過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）を用いて得られた複数のクローンにおけるＡＴＧ８のタンパク質発現量を示す図であり、図３（ｂ）は、ＧＳＨ過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）を用いて得られた複数のクローンにおけるＡＴＧ８のタンパク質発現量を示す図である。図３中、一番左のレーンはコントロール（２２−２）を示す。図３に示したように、ＧＳＨ１およびＭＥＸ１を過剰発現させた細胞では、ＡＴＧ８およびＡＴＧ−８ＰＥの発現が抑制されることがわかった(２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘクローン１，３，５，６，７および２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘクローン１，２，３，４，６，７，１６参照）。各クローンにおけるＡＴＧ８のタンパク質発現量を、親株（野生型株）との発現量比（％）で以下の表に示す。

〔実施例５：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＭＥＸ１過剰発現のデンプン産生への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘおよび２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）を培養し、デンプン量を評価した。具体的には、ＴＡＰ寒天培地上で培養した細胞をプラスチックループで少量掻き取って、ＴＡＰ液体培地へ播種し、１０μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が定常期に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、新しいＴＡＰ液体培地に細胞密度が１．０×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように希釈し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（本培養）。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）を用いた。

結果を、図４に示す。図４（ａ）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）におけるデンプン量の推移を示す図であり、図４（ｂ）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）におけるデンプン量の推移を示す図である。２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘはクローン３、２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘはクローン７のデータを代表例として示す。図４のグラフにおいて、縦軸は、培養液あたりのデンプン量をグルコース換算（mg glucose/dL culture）として示し、横軸は、本培養後の培養時間を示す。

図４に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘおよび２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）では、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して、本培養開始９６時間以降の培養液あたりのデンプン量が増加した。この結果から、ＭＥＸ１の過剰発現およびＡＴＧ８発現抑制により、デンプン量が増加することが示された。

〔実施例６：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＭＥＸ１過剰発現の細胞増殖への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ、クローン３および２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ、クローン７）を培養し、デンプン量を評価した。具体的には、ＴＡＰ寒天培地上で培養した細胞をプラスチックループで少量掻き取り、ＴＡＰ液体培地へ播種し、１０μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が定常期に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、新しいＴＡＰ液体培地に細胞密度が１．０×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように希釈し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（本培養）。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）を用いた。

結果を、図５に示す。図５（ａ−１）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）の細胞数の推移を示す図であり、図５（ａ−２）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）の細胞数の推移を示す図である。また、図５（ｂ−１）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ）の微粒子数の推移を示す図であり、図５（ｂ−２）は、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）の微粒子数の推移を示す図である。図５（ａ）のグラフにおいて、縦軸は、培養液（mL culture）あたりの細胞数を示し、横軸は、本培養の培養時間を示す。また、図５（ｂ）のグラフにおいて、縦軸は、培養液（mL culture）あたりの細胞以外の微粒子数を示し、横軸は、本培養の培養時間を示す。

図５（ａ−１）、（ａ−２）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘおよび２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）では、コントロールのＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して細胞増殖の促進が見られた。また、図５（ｂ−１）、（ｂ−２）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘおよび２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ）ではＧＳＨ１過剰発現株（２２−２株）と比較して培養開始後おおむね９６時間以降において微粒子数が多かった。微粒子はデンプン粒が死んだ細胞の中から培地中に出てきたものと考えられるため、細胞外へのデンプン粒放出の促進が示唆された。

〔実施例７：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＡＴＧ８サイレンシングのデンプン産生への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）を培養して、細胞増殖とデンプン量を評価した。具体的には、ＴＡＰ寒天培地上で培養した細胞をプラスチックループで少量掻き取ってＴＡＰ液体培地へ播種し、１０μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が定常期に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、新しいＴＡＰ液体培地に細胞密度が１．０×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように希釈し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（本培養）。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）を用いた。

結果を図６に示す。図６は、デンプン量の推移を示す図である。図６のグラフにおいて、縦軸は、培養液あたりのデンプン量をグルコース換算（mg glucose/dL culture）として示し、横軸は、本培養の培養時間を示す。

図６に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２/ａｍｉＡＴＧ８）では、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して、本培養開始７２時間以降の培養液あたりのデンプン量が増加した。この結果から、ＧＳＨ１過剰発現株においても、ＡＴＧ８遺伝子の発現抑制により、デンプン蓄積量が増加することが示された。

〔実施例８：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＡＴＧ８サイレンシングの細胞増殖への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）を培養して、細胞増殖とデンプン量を評価した。具体的には、ＴＡＰ寒天培地上で培養した細胞をプラスチックループで少量掻き取り、ＴＡＰ液体培地へ播種し、１０μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（前培養）。前培養が定常期付近に達した段階で遠心して細胞を回収した。次いで、新しいＴＡＰ液体培地に細胞密度が１．０×１０⁴ｃｅｌｌs／ｍｌになるように希釈し、１００μＥ／ｍ²／秒の連続光下で振とう培養した（本培養）。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２株）を用いた。

結果を、図７に示す。（ａ）は、細胞数の推移を示す図であり、（ｂ）は、微粒子数の推移を示す図である。（ａ）のグラフにおいて、縦軸は、培養液（mL culture）あたりの細胞数を示し、横軸は、本培養の培養時間を示す。また、（ｂ）のグラフにおいて、縦軸は、培養液（mL culture）あたりの微粒子数を示し、横軸は、本培養の培養時間を示す。

（ａ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２ａｍｉＡＴＧ８）では、コントロールのＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して細胞増殖の促進が見られた。また、（ｂ）に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２ａｍｉＡＴＧ８）では、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して培養開始１２０時間以降において微粒子数が多かった。微粒子はデンプン粒が死んだ細胞の中から培地中に出てきたものと考えられるため、細胞外へのデンプン粒放出の促進が示唆された。

〔実施例９：ＧＳＨ１過剰発現株におけるＡＴＧ８発現抑制の油脂産生への効果〕
実施例１で作製したＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株（２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘ、２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘ及び２２−２／ＡＴＧ８ａｍｉＲＮＡ）を培養し、油脂量を評価した。コントロールとして、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）を用いた。培養条件は、本培養において照射する連続光の光強度を１７０μＥ／ｍ²／秒とした以外は、実施例６に記載の条件と同一とした。一日毎に培養液の一部をガラス管に回収し、凍結保存した後、分析に供した。

細胞からの油脂の回収は以下のようにして行った。ガラス管の気相を窒素ガスで置換し、油脂定量のための内部標準としてペンタデカン酸２０μgを加え、適量のメタノール−ヘキサン混合液（１：１）を添加して撹拌した。静置後、遠心分離を行って水相と有機溶媒相を分離させた。有機溶媒画分を別のガラス管に移し、減圧乾固した。乾固物を適量のヘキサンで溶解し、適量の２．５％硫酸メタノール溶液と混和した。ガラス管の気相を窒素ガスで置換し、８０℃で１時間加熱した。室温まで冷却した後、飽和炭酸ナトリウム水溶液１ｍｌを加えて撹拌した。遠心分離を行って有機溶媒相を回収し、減圧乾固した。乾固物にヘキサン２００μＬを加えて溶解したものを、ガスクロマトグラフィー・質量分析計（パーキンエルマー社製、Clarus SQ８）へ注入し、脂肪酸メチルエステル体の定量分析を行った。カラムには、パーキンエルマー社製Ｅｌｉｔｅ−２２５型（全長 30 m、内径 0.25 mm、 膜厚 0.25 μm）を用い、オーブン昇温条件は２００℃まで３℃/分、その後２００℃で６．５分維持した。

市販の脂肪酸メチルエステルを用いて検量線を作成し、パルミチン酸（C16:0）、ステアリン酸（C18:0）、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、及びリノレン酸（C18:3）の総和を脂肪酸量として算出した。図８に、脂肪酸量（ａ）と細胞数（ｂ）の測定結果を示す。縦軸は培養液（mL culture）あたりの脂肪酸量（μg）あるいは培養液あたりの細胞数（x 10⁶ cells）を示し、横軸は本培養開始後の培養日数を示す。２２−２／ＣｒＭＥＸ１ｏｘはクローン１、２２−２／ＡｔＭＥＸ１ｏｘはクローン７のデータを代表例として示す。

図８に示したように、ＧＳＨ１過剰発現＋ＡＴＧ８発現抑制株では、ＧＳＨ１過剰発現株（２２−２）と比較して、脂肪酸の蓄積量が多く、最大量に到達するのに要する培養時間も短かった。この結果から、ＡＴＧ８の発現抑制により、油脂量が増加することが示された。

本発明によれば、従来よりも安価に、効率よく藻類からバイオマスを製造することができる。バイオマスは、バイオ燃料の原料として利用が期待されている。このため、本発明は、エネルギー産業等の広範な産業において利用可能性がある。

配列番号１：アラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２：アラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号３：クラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：クラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号５：ATG8-amiRNAの塩基配列
配列番号６：クラミドモナス・ラインハルディ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素のアミノ酸配列
配列番号７：クラミドモナス・ラインハルディ由来のγ−グルタミルシステイン合成酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号８：Chlamydomonas reinhardtii MEX1 cDNAの鋳型の塩基配列
配列番号９：Chlamydomonas reinhardtii MEX1 cDNAの鋳型の増幅に用いたプライマーの塩基配列
配列番号１０：Chlamydomonas reinhardtii MEX1 cDNAの鋳型の増幅に用いたプライマーの塩基配列
配列番号１１：Arabidopsis thaliana MEX1 cDNAの鋳型の塩基配列
配列番号１２：Arabidopsis thaliana MEX1 cDNAの鋳型の増幅に用いたプライマーの塩基配列
配列番号１３：Arabidopsis thaliana MEX1 cDNAの鋳型の増幅に用いたプライマーの塩基配列
配列番号１４：ATG8-amiRNAの鋳型の塩基配列
配列番号１５：ATG8-amiRNAを合成するための１本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列
配列番号１６：ATG8-amiRNAを合成するための１本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列
配列番号１７：アラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１８：アラビトプシス・サリアナ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列
配列番号１９：クラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２０：クラミドモナス・ラインハルディ由来のＭＥＸ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列

Claims (11)

1. ＡＴＧ８の発現が基準株に比して抑制された緑藻綱藻類を用いる、バイオマスの製造方法。
2. 前記藻類に対して光を照射する光照射工程を含む、請求項１に記載のバイオマスの製造方法。
3. 葉緑体内のグルタチオン濃度が基準株に比して増加した藻類を用いる、請求項１または２に記載のバイオマスの製造方法。
4. 前記光照射工程は、実質的に窒素飢餓ではない条件において行われる、請求項３に記載のバイオマスの製造方法。
5. 藻類の細胞を破砕する細胞破砕工程を含まない、請求項４に記載のバイオマスの製造方法。
6. ＭＥＸ１が過剰発現されＡＴＧ８の発現が基準株に比して抑制された緑藻綱藻類。
7. ＭＥＸ１をコードする外因性ポリヌクレオチドが導入されている、請求項６に記載の藻類。
8. 前記外因性ポリヌクレオチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される一以上である、請求項７に記載の藻類：
   （ａ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１または３に示されるアミノ酸配列において、１−１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＭＥＸ１の機能を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
9. 葉緑体内のグルタチオン濃度が基準株に比して増加している、請求項６〜８のいずれか１項に記載の藻類。
10. ＭＥＸ１を過剰発現させることによりＡＴＧ８の発現を抑制するＡＴＧ８発現抑制工程を含む、改変緑藻綱藻類の製造方法。
11. 葉緑体内のグルタチオン濃度を増加させるグルタチオン濃度増加工程を含む、請求項１０に記載の製造方法。

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