WO2024075729A1 - タンパク質の製造方法、植物、及び植物ウイルスベクターの生産方法 - Google Patents

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WO2024075729A1
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protein
gene
amino acid
acid sequence
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健二 中原
税 増田
航 松永
深雪 須藤
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国立大学法人北海道大学
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein, a plant, and a method for producing a plant virus vector.
  • Non-Patent Document 1 plant-made pharmaceuticals (PMP), which uses plants to produce useful proteins such as medical proteins, has been attracting worldwide attention, and methods are converging on transient expression using Agrobacterium (agroinfiltration) and methods using viral vectors.
  • Agrobacterium agroinfiltration
  • viral vectors such as the MagNICON (registered trademark) system
  • MagNICON registered trademark
  • a viral vector carrying a gene for a target protein to be produced can be infected and propagated in a plant, whereby the target protein expressed by the virus can be produced.
  • agroinfiltration for example, Agrobacterium transformed with a binary vector in which a polynucleotide encoding a target protein is linked downstream of a promoter in a T-DNA region is infected throughout the plant body by infiltration, and the target protein can be transiently produced in the infected cells.
  • wild-type plants e.g., Nicotiana benthamiana
  • Nicotiana benthamiana are usually used as they are to produce target proteins, and there is still room for improvement in plant modification to improve the productivity of target proteins.
  • the present invention aims to provide a method for producing a protein that can improve the production yield of a target protein in a plant.
  • the present invention also aims to provide a plant that can be used in the method for producing a protein.
  • the present invention also aims to provide a method for producing a plant virus vector that can improve the production yield of the plant virus vector.
  • the present inventors hypothesized that by inhibiting autophagy, the main protein degradation system in this plant, the degradation of the target protein could be inhibited, and as a result, the production yield of the target protein could be improved.
  • a plant with a suppressed autophagy system and its use can improve the production amount of plant viral vectors and the production amount of a target protein expressed from the viral vector, and thus completed the present invention. That is, the present invention has the following aspects.
  • a method for producing a protein comprising a production step of causing a plant into which a nucleic acid fragment encoding a target protein has been introduced to produce the target protein, wherein the plant is a plant in which the autophagy system is suppressed.
  • the plant is a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost,
  • the production method described in (1) above, wherein the autophagy-related gene includes any one or more genes selected from the group consisting of ATG6 gene, ATG7 gene, ATG5 gene, and ATG8 gene.
  • the ATG6 gene is a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (b1) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system.
  • proteins a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (b1) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by S
  • the ATG7 gene is a polynucleotide that encodes any one of the following proteins (a2) to (c2), (a2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b2) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system; (c2) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG5 gene is a polynucleotide encoding any one of the proteins (a3) to (c3) below, (a3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b3) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system; (c3) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG8 gene is a polynucleotide encoding any one of the proteins (a4) to (c4) below.
  • (a4) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • (b4) A protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added, and having activity in the autophagy system.
  • (c4) A protein having an amino acid sequence having 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having activity in the autophagy system.
  • the plant is a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost,
  • the plant described in (8) above, wherein the autophagy-related gene includes any one or more genes selected from the group consisting of ATG6 gene, ATG7 gene, ATG5 gene, and ATG8 gene.
  • the ATG6 gene is a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (b1) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG7 gene is a polynucleotide that encodes any one of the following proteins (a2) to (c2), (a2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b2) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system; (c2) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG5 gene is a polynucleotide that encodes any one of the proteins (a3) to (c3) below, (a3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added, and having activity in the autophagy system; (c3) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG8 gene is a polynucleotide encoding any one of the proteins (a4) to (c4) below.
  • (a4) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • (b4) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having activity in the autophagy system;
  • a method for producing a plant comprising the steps of: replicating a plant viral vector having a nucleic acid fragment encoding a target protein in a plant, A method for producing a plant viral vector, wherein the plant is a plant in which the autophagy system is suppressed.
  • the plant is a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost,
  • the production method described in (15) above, wherein the autophagy-related gene includes any one or more genes selected from the group consisting of ATG6 gene, ATG7 gene, ATG5 gene, and ATG8 gene.
  • the ATG6 gene is a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (b1) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system.
  • proteins a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; (b1) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by S
  • the ATG7 gene is a polynucleotide that encodes any one of the following proteins (a2) to (c2), (a2) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b2) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system; (c2) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG5 gene is a polynucleotide that encodes any one of the proteins (a3) to (c3) below, (a3) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b3) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system; (c3) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system.
  • the ATG8 gene is a polynucleotide that encodes any one of the proteins (a4) to (c4) below.
  • (a4) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
  • (b4) a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having activity in the autophagy system;
  • the present invention provides a method for producing a protein that can improve the production yield of a target protein in a plant.
  • the present invention also provides a plant that can be used in the method for producing the protein.
  • the present invention also provides a method for producing a plant virus vector that can improve the production yield of the plant virus vector.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining an overview of the autophagy system in plants.
  • 1 is a graph showing the results of experiment 1, in which the production amount of plant viral vectors was increased by suppressing the autophagy system.
  • This is a schematic diagram showing the structure of the construct prepared in the examples for producing ATG knockdown (KD) plants.
  • ILRa interleukin-1 receptor antagonist
  • This shows the results of obtaining ATG8 KD plants in Experiment 2-2.
  • This is a Western blotting image (A) and a graph (B) showing the improved productivity of ⁇ FGF in ATG8 KD plants in Experiment 2-2.
  • CMV Cucumber mosaic virus
  • (A) is an image detecting GFP produced in ATG7 KO plants by introducing a viral vector of Clover yellow vein virus (CIYVV), and (B) is an image showing the results of Western blotting.
  • Western blotting image (A) and graph (B) showing improved ⁇ Gal productivity by agroinfiltration in ATG5 KO plants in Experiment 3-5.
  • This is a Western blotting image showing the improved productivity of ⁇ FGF by agroinfiltration in the ATG8 KD plant in experiment 2-3 and the ATG7 KO plant in experiment 3-6.
  • a method for producing a protein includes a production step of causing a plant into which a nucleic acid fragment encoding a target protein has been introduced to produce the target protein, the plant being a plant in which the autophagy system is suppressed.
  • the autophagy system is one of the major protein degradation systems in eukaryotes, and it surrounds unnecessary proteins or proteins that show abnormal properties with a lipid bilayer membrane called an autophagosome, guides them to a vacuole, and degrades them.
  • pathogenic bacteria and viruses including CMV and tobacco mosaic virus, are also degraded by autophagy. These pathogenic bacteria and viruses can also be used as viral vectors, as shown in the examples below. The inventors therefore hypothesized that the autophagy system degrades viral vectors and target proteins, and that production of target proteins can be further increased by inhibiting the autophagy system.
  • the plant according to the embodiment of the method for producing a protein is a plant in which the autophagy system is suppressed.
  • autophagy system is inhibited refers to the fact that the function of autophagy is inhibited in the plant compared to a wild-type control plant.
  • autophagy system is inhibited also includes cases where a wild-type plant has been modified so that the original function of autophagy is inhibited.
  • the inhibition of the autophagy system may be the partial or complete inactivation of at least a part of the process of the autophagy system.
  • the plant is preferably a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or a plant in which the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost.
  • a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed means that the function of a factor encoded by the autophagy-related gene is reduced compared to a wild-type control plant of the plant.
  • a plant lacking the function of an autophagy-related gene refers to a plant in which, compared to a wild-type control plant, the function of a factor encoded by the autophagy-related gene has been lost or the factor itself is defective.
  • a plant in which the expression of an autophagy-related gene is suppressed refers to a plant in which the expression level of the gene product of the autophagy-related gene is reduced, as compared to a wild-type control plant of the plant.
  • a plant in which expression of an autophagy-related gene has been lost refers to a plant in which the expression of the gene product of the autophagy-related gene has been lost, as compared to a wild-type control plant of the plant.
  • the gene products include the mRNA of the gene and translation products (peptides, proteins), and the expression levels of these can be measured by known measurement methods.
  • the degree of suppression of the function of the autophagy-related gene may be such that an improvement in the production amount of the target protein is observed, compared to a wild-type control plant of the plant.
  • the degree of suppression of the expression of the autophagy-related gene may be such that an improvement in the production amount of the target protein is observed, compared to a wild-type control plant of the plant.
  • the autophagy-related gene may be any gene that is a factor that contributes to the autophagy system.
  • the autophagy-related gene may be a part of many autophagy-related genes that are responsible for the autophagy system, and may include one or more types of autophagy-related genes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining the outline of the autophagy system in plants.
  • autophagy abnormal proteins and unnecessary organelles are transported surrounded by a lipid bilayer membrane called an autophagosome, and are finally taken up into a vacuole for degradation.
  • ATG8 is an activator of decomposition induction involved in autophagy, and binds directly or indirectly via another receptor factor to proteins to be decomposed, such as aggregated or inactivated abnormal proteins and viruses, and takes up the target for degradation into the autophagosome by forming an isolation membrane (phagophore).
  • a part of ATG8 is recycled and matured (i.e., activated) so that it can be involved in the autophagic degradation of the next target protein.
  • Factors involved in this maturation include ATG5 and ATG7. Factors such as ATG6 are also known to induce the formation of phagophores.
  • one or more of the group consisting of ATG6, ATG7, ATG5, and ATG8 can be selected as suitable target ATG genes for suppressing the autophagy system.
  • the term “ATG5 gene” refers to a concept that includes a homologue (including a paralogue) of the ATG5 gene.
  • the term “ATG6 gene” refers to a concept that includes a homologue (including a paralogue) of the ATG6 gene.
  • the term “ATG7 gene” refers to a concept that includes a homologue (including a paralogue) of the ATG7 gene.
  • the term “ATG8 gene” refers to a concept that includes a homologue (including a paralogue) of the ATG8 gene.
  • the plant in the embodiment of the protein production method may be a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or a plant in which the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost, and the autophagy-related gene preferably includes one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, the ATG5 gene, and the ATG8 gene.
  • the autophagy-related gene may also include one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, and the ATG8 gene.
  • the ATG6 gene may be a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has a sequence identity of 40% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having activity in the autophagy system.
  • proteins a1) to (c1): (a1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (b1) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c1) a protein having an amino acid sequence that has a sequence identity of 40% or more with the amino acid sequence represented by
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 is the amino acid sequence encoded by the ATG6a gene of Nicotiana benthamiana.
  • polynucleotide encoding the protein (a1) is a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO:5.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:5 is the base sequence of the coding region of the ATG6a gene of Nicotiana benthamiana.
  • the activity of ATG6, encoded by the ATG6 gene, in the autophagy system includes activity that contributes to the formation of phagophores.
  • ATG6 is considered to be a factor responsible for the addition of phosphatidylinositol triphosphate (PI3P) to the phagophore membrane.
  • P3P phosphatidylinositol triphosphate
  • the autophagy-related gene includes the ATG6 gene, it is preferable that the function of the ATG6 gene or the expression of the ATG6 gene in the plant is suppressed.
  • the ATG7 gene may be a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a2) to (c2): (a2) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b2) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c2) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and having activity in the autophagy system.
  • proteins a2) to (c2): (a2) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (b2) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c2) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2 is the amino acid sequence encoded by the ATG7a gene of Nicotiana benthamiana.
  • polynucleotide encoding the protein (a2) is a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO:6.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:6 is the base sequence of the coding region of the ATG7a gene of Nicotiana benthamiana.
  • ATG7 encoded by the ATG7 gene
  • ATG7 is considered to be a factor responsible for the addition of phosphatidylethanolamine (PE) to ATG8.
  • PE phosphatidylethanolamine
  • the ATG5 gene may be a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a3) to (c3): (a3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c3) a protein having an amino acid sequence that has a sequence identity of 40% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having activity in the autophagy system.
  • proteins a3) to (c3): (a3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; (b3) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c3) a protein having an amino acid sequence that has a sequence identity of 40% or more with the amino acid sequence represented by
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3 is the amino acid sequence encoded by the ATG5a gene of Nicotiana benthamiana.
  • polynucleotide encoding the protein (a3) is a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO:7.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:7 is the base sequence of the coding region of the ATG5a gene of Nicotiana benthamiana.
  • ATG5 encoded by the ATG5 gene, in the autophagy system is its activity in contributing to the maturation of ATG8.
  • ATG5 is considered to be a factor responsible for the addition of phosphatidylethanolamine (PE) to ATG8.
  • PE phosphatidylethanolamine
  • the ATG8 gene may be a polynucleotide encoding any one of the following proteins (a4) to (c4): (a4) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4; (b4) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one to several amino acids have been substituted, deleted, inserted, or added, and having activity in the autophagy system; (c4) a protein having an amino acid sequence that has 40% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and having activity in the autophagy system.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4 is the amino acid sequence encoded by the ATG8a gene of Nicotiana benthamiana.
  • polynucleotide encoding the protein (a4) is a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:8 is the base sequence of the coding region of the ATG8a gene of Nicotiana benthamiana.
  • the activity of ATG8, encoded by the ATG8 gene, in the autophagy system includes the activity of contributing to the induction of target degradation.
  • ATG8 binds to targets for degradation and is considered to be a factor responsible for the incorporation of the targets into autophagosomes for degradation.
  • the autophagy-related gene includes the ATG8 gene, it is preferable that the function of the ATG8 gene or the expression of the ATG8 gene in the plant is suppressed.
  • the number of amino acids that may be deleted, inserted, substituted or added is preferably 1 to 500, preferably 1 to 400, preferably 1 to 300, preferably 1 to 200, preferably 1 to 150, more preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, even more preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 5.
  • sequence identity in (c1), (c2), (c3) and (c4) is preferably 40% or more, preferably 45% or more, preferably 50% or more, preferably 55% or more, preferably 60% or more, preferably 65% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more.
  • sequence identity of amino acid sequences can be calculated using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), a known sequence alignment algorithm, such as blastp.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • blastp a known sequence alignment algorithm
  • the ATG5-8 gene can be identified by the amino acid sequence encoded by its base sequence.
  • a functional protein (having the activities exemplified above) encoded by a gene may include a form of a protein that has been modified, such as by methylation, acetylation, phosphorylation, or the like, or that has been partially cleaved and thus matured.
  • the gene here may be one that is retained in a region of nucleic acid that the plant according to the embodiment naturally possesses.
  • the gene may be a polynucleotide, and is usually deoxyribonucleic acid (DNA).
  • the gene may be contained in the nuclear genome or the genome of an organelle.
  • the base sequences of the coding regions are specified as follows: instead of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, the base sequence represented by SEQ ID NO:6 instead of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2, the base sequence represented by SEQ ID NO:7 instead of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3, and the base sequence represented by SEQ ID NO:8 instead of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4. Substitutions, deletions, insertions, or additions, as well as identity of the base sequences, can be used in place of the amino acid sequences.
  • the number and identity of bases (nucleosides) that may be deleted, inserted, substituted or added can be numerical values equivalent to those given as examples of the amino acid sequences above.
  • the method and form of the plant in which the autophagy system is suppressed according to the embodiment are not particularly limited.
  • the plant in which the autophagy system is suppressed according to the embodiment may be a plant in which the autophagy system is artificially suppressed.
  • the expression or function of an autophagy-related gene may be suppressed by, for example, RNA silencing.
  • RNA silencing include RNAi using siRNA or microRNA, and may be virus-induced gene silencing (VIGS).
  • RNA silencing for example, a nucleic acid (e.g., double-stranded RNA, antisense nucleic acid, etc.) capable of inducing RNA silencing against a target autophagy-related gene can be introduced or expressed in a plant, thereby obtaining a plant in which the expression or function of the autophagy-related gene is suppressed.
  • the nucleic acid capable of inducing RNA silencing may be introduced into a plant as a gene and expressed. Examples of genes include those having a promoter, an inverted repeat structure of the sequence of a target gene, and a terminator.
  • the nucleic acid capable of inducing RNA silencing may be introduced via a virus vector, such as the above-mentioned VIGS.
  • RNA silencing when a nucleic acid fragment encoding a target protein is introduced using a viral vector or the like, superinfection is not necessary, and silencing can be induced constitutively in plants, so it is preferable to induce RNA silencing by plant transformation.
  • a preferred method is to create a transformed plant that constitutively expresses an inverted repeat sequence in which partial sequences of a target gene are linked in inverted tandem under the control of a constitutive promoter such as the 35S promoter.
  • the inhibition or deficiency of the function of autophagy-related genes, and the inhibition or loss of expression of autophagy-related genes also include conditionally induced forms achieved by conditional gene modification using, for example, inducible promoters such as heat shock protein promoters and dexamethasone (DEX)-inducible promoters, the Cre/loxP system, etc.
  • inducible promoters such as heat shock protein promoters and dexamethasone (DEX)-inducible promoters, the Cre/loxP system, etc.
  • the functional inhibition or deficiency of autophagy-related genes, and the inhibition or loss of expression of autophagy-related genes also include site-specific or time-specific inhibition or loss, for example, by using tissue-specific promoters.
  • the suppression or deletion of the function of an autophagy-related gene and the suppression or loss of the expression of an autophagy-related gene may be achieved by modifying the genomic sequence of the plant so that the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost.
  • the modification is preferably a modification of the sequence of an autophagy-related gene and/or an expression regulatory region of an autophagy-related gene.
  • an autophagy-related gene includes the sequence of the coding region of the gene.
  • autophagy-related genes it is possible to suppress or eliminate the expression of autophagy-related genes by modifying the sequence of the expression regulatory region of the autophagy-related gene.
  • expression regulatory region of an autophagy-related gene include promoters, enhancers, etc.
  • sequence modification is not particularly limited, and examples include substitution, deletion, insertion, addition, or a combination of these, of a part or all of the base sequence in an autophagy-related gene and/or an expression regulatory region of an autophagy-related gene. Such modifications can suppress or eliminate the production of a functional protein encoded by an autophagy-related gene.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of a base sequence of about 1 to 10 bases it is preferable that the substitution, deletion, insertion, or addition causes a frameshift in the coding region.
  • the plant according to the embodiment may have the modified sequence in a homozygous or heterozygous state.
  • the method for modifying the sequence is not particularly limited, and examples include methods such as mutagen treatment, radiation exposure, and genome editing.
  • Genome editing may be, for example, genome editing using CRISPR/Cas9.
  • the type of plant in which the autophagy system is suppressed is not particularly limited, but may be angiosperms, and examples thereof include Solanaceae plants such as tobacco, tomato, potato, etc.; Asteraceae plants such as lettuce; Brassicaceae plants such as cabbage, broccoli, Arabidopsis, etc.; Gramineae plants such as rice and wheat; Cucurbitaceae plants such as cucumber, melon, watermelon, etc.; Legumes such as kidney bean, soybean, mung bean, etc.; and Rosaceae plants such as apple and strawberry.
  • the concept of plants also includes algae such as green algae, red algae, diatoms, and blue-green algae.
  • Solanaceae plant is preferably a Nicotiana plant, and more preferably Nicotiana.
  • tobacco include Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, with Nicotiana benthamiana being preferred. Nicotiana plants are also preferred because they allow efficient infection and proliferation of viral vectors and/or Agrobacterium.
  • plant in this specification refers not only to the plant body, but also to its parts such as tissues, organs, cells, callus, and cell masses.
  • the cells may be cultured plant cells.
  • the target protein When a nucleic acid fragment encoding a target protein is introduced into a plant, the target protein can be expressed using the plant's protein biosynthetic pathway, making it possible to efficiently produce the target protein.
  • Publicly known plant cultivation and culture methods can be used to produce the target protein, and appropriate cultivation and culture conditions can be selected depending on the type of plant and its growth stage.
  • the plant used in the protein production method of the embodiment is a plant into which a nucleic acid fragment encoding a target protein has been introduced.
  • the plant used in the protein production method of the embodiment has a nucleic acid fragment encoding a target protein introduced therein in an expressible manner.
  • the nucleic acid fragment that encodes the target protein may further include structures such as other nucleic acid regions, so long as it contains a region of nucleic acid that encodes the target protein.
  • the plant used in the protein production method of the embodiment can contain the nucleic acid fragment encoding the target protein within the plant.
  • the plant used in the protein production method of the embodiment can contain the target protein expressed from the nucleic acid fragment during the production process.
  • the nucleic acid fragment encoding the target protein may be introduced into the plant in any manner, for example, via a carrier such as a liposome, exosome, plant virus vector, or Agrobacterium carrying the nucleic acid fragment.
  • a carrier such as a liposome, exosome, plant virus vector, or Agrobacterium carrying the nucleic acid fragment.
  • a plant virus vector and/or Agrobacterium for introducing the nucleic acid fragment.
  • a plant virus refers to a virus that infects plants, but the infectivity of a plant virus vector used as a vector may be modified.
  • Agrobacterium allows for highly efficient infection, and by applying techniques such as vacuum infiltration, it is easy to produce large amounts of protein through systemic infection.
  • the plant used in the protein production method of the embodiment may contain within the plant a plant virus vector and/or an Agrobacterium T-DNA region having the nucleic acid fragment encoding the target protein.
  • a target protein by introducing the nucleic acid fragment it is not essential to modify the plant's genome by inserting a nucleic acid fragment that encodes the target protein. Since the target protein can be produced highly efficiently with a short preparation period, it is preferable to have the plant produce the target protein by transient expression in the protein production method of the embodiment.
  • Transient expression can be readily achieved by introducing the nucleic acid fragment into a plant via, for example, a plant viral vector and/or Agrobacterium. Furthermore, suppression of the autophagy system improves the production yield of plant virus vectors, Agrobacterium, and the like in plants. Due to these advantages, the effect of improving the productivity of target proteins can be more effectively exerted when using plant virus vectors and/or Agrobacterium.
  • the nucleic acid fragment encoding the target protein is introduced via a plant virus vector and/or Agrobacterium, and it is preferable that it is introduced via a plant virus vector and/or Agrobacterium and expressed transiently.
  • Transient expression via Agrobacterium is also called agroinfiltration, and is a method that includes a form in which the target protein is translated from a nucleic acid fragment on the T-DNA region introduced into a plant.
  • the method for producing a protein according to the embodiment may further include an introduction step of introducing a nucleic acid fragment encoding a target protein into a plant.
  • the introducing step may include introducing a nucleic acid fragment encoding a target protein into a plant via a plant virus vector and/or Agrobacterium. More preferably, the introducing step may comprise introducing a nucleic acid fragment encoding a protein of interest into the plant via a plant viral vector and/or Agrobacterium.
  • Introduction of the nucleic acid fragment encoding a target protein into a plant via a plant virus vector and/or Agrobacterium includes a state in which the T-DNA region of the plant virus vector and/or Agrobacterium carrying the nucleic acid fragment is contained within the plant.
  • the introduction of the nucleic acid fragment using the plant virus vector may be via a plant virus vector and Agrobacterium.
  • the agroinfection method can be said to be a method of introducing a plant virus vector into a plant using Agrobacterium.
  • agroinfection method for example, a plant is infected with Agrobacterium having a T-DNA region into which a polynucleotide having an infectious genomic base sequence of a plant virus vector is inserted, and the plant virus vector expressed from the base sequence can be self-propagated.
  • the infectious genomic base sequence of the plant virus vector can have a nucleic acid fragment encoding the above-mentioned target protein in an expressible manner.
  • the introducing step includes a step of introducing a nucleic acid fragment encoding a target protein into a plant via a plant virus vector by agroinfection.
  • the MagNICON system is known as an example of a method of introduction via a plant virus vector and Agrobacterium, and the protein production method of this embodiment can also be applied to the MagNICON system.
  • the plant virus vector may be appropriately selected depending on the plant species to be introduced, and examples include virus vectors such as cucumber mosaic virus (CMV), clover yellow vein virus (CIYVV), tobacco mosaic virus (TMV), plum pox virus (PPV), potato virus X (PVX), alfalfa mosaic virus (AIMV), cowpea mosaic virus (CPMV), and zucchini yellow mosaic virus (ZYMV).
  • CMV cucumber mosaic virus
  • CMVV clover yellow vein virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • PV plum pox virus
  • PVX potato virus X
  • AIMV alfalfa mosaic virus
  • CPMV cowpea mosaic virus
  • ZYMV zucchini yellow mosaic virus
  • the nucleic acid fragment may be introduced into a plant in which the autophagy system has already been suppressed, or the autophagy system of the plant may be suppressed after the introduction of the nucleic acid fragment into the plant, or the introduction of the nucleic acid fragment and the suppression of the autophagy system may be performed simultaneously.
  • the target protein can be appropriately selected from proteins having desired types, properties, etc.
  • the target protein may be a peptide.
  • the target protein may be a foreign protein that is not naturally present in a plant in which the autophagy system is suppressed.
  • the target protein may include, for example, a medical protein.
  • the medical protein may be a protein or peptide used in the treatment, prevention, or diagnosis of any disease, in addition to a protein used as a pharmaceutical having a pharmacological action.
  • Examples of the medical protein include an antigen protein used as a vaccine.
  • the medical protein may be, for example, an enzyme, an antibody, various factors such as growth factors, hormones, interleukins, agonists, antagonists, or the like.
  • target proteins include any type of protein used in food, cosmetics, insecticides, etc.
  • the method for producing a protein according to the embodiment may further include a recovery step of recovering the target protein from the plant after the production step.
  • the recovery method can be, for example, obtaining the target protein from a crushed liquid or extract of a plant containing the produced target protein, and if necessary, purifying or isolating the target protein.
  • the purification or isolation method can be a known method, for example, various chromatographic methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC), and ultrafiltration.
  • the embodiment of the protein production method by using a plant in which the autophagy system is suppressed, it is possible to improve the production amount of the target protein compared to the use of a control plant in which the autophagy system is not suppressed.
  • it is suitable for the production of the target protein in the plant into which a nucleic acid fragment encoding the target protein has been introduced via a plant virus vector and/or Agrobacterium.
  • the plant of the embodiment is a plant in which the autophagy system is suppressed, which is used in the method for producing a protein of the embodiment.
  • Examples of the method for producing a protein according to the embodiment and the plant in which the autophagy system is suppressed include those described above in the section entitled "Method for producing a protein.”
  • the plant of the embodiment may be a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or a plant in which the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost, and it is preferable that the autophagy-related gene includes any one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, the ATG5 gene, and the ATG8 gene.
  • the autophagy-related gene may include any one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, and the ATG8 gene.
  • the ATG6 gene, ATG7 gene, ATG5 gene, and ATG8 gene in the plant of the embodiment include those described above in the section entitled "Method for Producing Proteins.”
  • the plant of the embodiment preferably contains the nucleic acid fragment encoding the target protein, or the target protein expressed from the nucleic acid fragment.
  • examples of the target protein and the nucleic acid fragment encoding the target protein include those described above in the section "Method for Producing Protein".
  • the plant of the embodiment preferably comprises a plant virus vector and/or an Agrobacterium T-DNA region carrying the nucleic acid fragment encoding the target protein.
  • plant virus vectors in the plant of the embodiment include those described above in the section "Method for Producing Protein.”
  • the target protein preferably includes a medical protein.
  • the plant of this embodiment is preferably a Nicotiana plant.
  • the plant of the embodiment is suitable as a platform plant for use in the manufacturing method of the embodiment, and the use of the plant of the embodiment makes it possible to produce a target protein with high efficiency.
  • the plant in which the autophagy system of the embodiment is suppressed can also be suitably used as a plant for use in the method for producing a plant viral vector of the embodiment described below.
  • a method for producing a plant viral vector includes a manufacturing step of replicating a plant viral vector containing a nucleic acid fragment encoding a target protein in a plant, the plant having an autophagy system suppressed.
  • plants and plant virus vectors in the production method of the embodiment include those described above in the "Protein Production Method.”
  • the plant in the production method of the embodiment may be a plant in which the function of an autophagy-related gene is suppressed or deleted, or a plant in which the expression of an autophagy-related gene is suppressed or lost, and it is preferable that the autophagy-related gene includes any one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, the ATG5 gene, and the ATG8 gene.
  • the autophagy-related gene may include any one or more genes selected from the group consisting of the ATG6 gene, the ATG7 gene, and the ATG8 gene.
  • the ATG6 gene, ATG7 gene, ATG5 gene, and ATG8 gene in the production method of the embodiment include those described above in the "Protein production method.”
  • the production method of the embodiment preferably includes an introduction step of introducing the nucleic acid fragment into the plant via the plant virus vector.
  • the target protein preferably includes a medical protein.
  • the plant in the production method of the embodiment is preferably a Nicotiana plant.
  • the viral vector can be produced more efficiently than when a control plant in which the autophagy system is not suppressed is used.
  • gene functional deficiency may be abbreviated as KO
  • functional inhibition may be abbreviated as KD.
  • ATG knockout plant (1) Virus-induced RNA silencing (VIGS)
  • VIGS Virus-induced RNA silencing
  • the target sequences for each ATG gene are shown below.
  • ATG8 (5'-GAAAGGCGACAGGCCGAAGCTGCTGCTCGTATCAGGGAGAAGTATCCTGATAGAATACCGGTTATTGTGGAGAAGGCTGAAAGAAGTGACATTCCTGACATTGACAAAGAAAAATACTTGGTTCCTGCTGATCTGACTGTGGGGCAATTTGT-3': sequence number 9)
  • ATG6 (5'-AAGCTTGCCTTCAGCGACTAGAGGGAGAAAGCAAAGTTCTTAGTGAGGCTGATTTTCTGAAGGAAAATTGAAGATAGAAGAAGAAGAGCGGAAAACTTGAAGCAGCAATAGAAACAGAAAGCAAATCTGAAGCAGCAATAGAAACAGAAGCAATGTGC-3': SEQ ID NO: 11)
  • Double-stranded DNA containing the target sequence was synthesized, and oligo DNA was synthesized with StuI and MluI restriction sites added to the 5' and 3' ends, respectively, for cloning, and made double-stranded by PCR. This was then inserted into the cloning site (StuI and MluI restriction sites) of the infectious cDNA clone plasmid of the CMV-A1 vector (Otagaki et al., Plant Biotech 23, 259-265, 2006) in the usual manner.
  • RNA2 The CMV-A1 vector (RNA2) having the target sequence of each ATG gene obtained above was in vitro transcribed using T7 RNA polymerase. This was mixed with RNA1 and RNA3 transcribed in vitro from the CMV-Y RNA1 infectious clone pCY1 and the RNA3 infectious clone pCY3, and mechanically inoculated into Nicotiana benthamiana. Seven days after inoculation, RNA was extracted from the infected leaves, and the expression of the CMV-A1 vector was confirmed, and this was used as the inoculum source. ATG5 KD plants, ATG6 KD plants, ATG7 KD plants, and ATG8 KD plants were obtained by infection with a CMV vector targeting each ATG gene.
  • RNA was extracted from the leaves of each of the above-mentioned KD plants using TRIzol reagent (Invitrogen) according to the manual.
  • the extracted RNA was purified using Recombinant DNase I (Takara) and then AMV reverse transcriptase (Nippon Gene) according to the manual to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA was used as a template, and the Power Up SYBR Green Master was used.
  • the amount of CMV vector was measured using a PCR primer set containing CMV-DET-5-340 (5'-CCATCGATTGGTCTCCTTTTTGGAGGCC-3': SEQ ID NO: 13) and CMV-DET-3-340 (5'-GCGCGTCGACGTTGACGTCGAGCACCAAC-3': SEQ ID NO: 14) as primers for amplifying CMV, and PCR was performed according to the manual.
  • primers Nb-L23-5-110 (5'-AAGGATGCCGTGAAAGAAGATGT-3': SEQ ID NO: 15)
  • Nb-L23-3-110 5'-GCATCGTAGTCAGGAGTCAACC-3': SEQ ID NO: 16) were used as internal standard genes.
  • Experiment 2-1 Creation of ATG6 KD plants and production of ILRa using a CMV vector (creation of ATG6 KD plants and confirmation of reduced expression)
  • oligo DNAs ATG6-attB1 (5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTgagcaaccgttgtgtcttgaatgc-3': SEQ ID NO:17) and ATG6-attB2 (5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAAGCTGGGTggcaagcttggccccatgctgc-3': SEQ ID NO:18) having an attB sequence were synthesized, and double-stranded DNA was obtained by PCR using these as primers and N.
  • benthamiana cDNA as a template.
  • the amplified DNA fragment was inserted into pBI-sense-antisense-GW-GFP Vector (Implanta Innovations) according to the manual to obtain the ATG6-KD construct. This was then introduced into Agrobacterium in a conventional manner, and Nicotiana benthamiana was transformed to obtain an ATG6 KD plant.
  • the amount of ATG6 mRNA was measured using Power Up SYBR Green Master Mix (manufactured by Applied Biosystems), and the expression level of ATG6 was analyzed.
  • PCR was performed according to the manual using ATG6-5-F (5'-CGAATCTTCCTCCGGTACCTCTGTCAGAACTG-3': SEQ ID NO: 19) and ATG6-3-R (5'-TGCTTTGGCAATACGACGTAGGAATTTCCA-3': SEQ ID NO: 20) as primers for amplifying the ATG6 cDNA fragment. Furthermore, primers Nb-L23-5-110 (5'-AAGGATGCCGTGAAAGAAGATGT-3': SEQ ID NO: 15) and Nb-L23-3-110 (5'-GCATCGTAGTCAGGAGTCAACC-3': SEQ ID NO: 16) were used as internal standard genes.
  • ILRa human interleukin 1 receptor antagonist
  • the target protein was selected to be human interleukin 1 receptor antagonist (ILRa).
  • ILRa is a useful protein that has the effect of inhibiting inflammatory cytokines and is also used as an antirheumatic drug.
  • ORF sequence NCBI NM_173841
  • StuI and MluI restriction sites were added to the 5' and 3' ends, respectively, by PCR, and the resulting plasmid was inserted into the cloning site (StuI and MluI restriction sites) of an infectious cDNA clone plasmid of the CMV-H1 vector (Matsuo et al. Planta 225, 277-286, 2007) in a standard manner.
  • RNA2 CMV-H1 vector carrying the ILRa gene sequence was in vitro transcribed using T7 RNA polymerase. This was mixed with RNA1 and RNA3 transcribed in vitro from the CMV-Y RNA1 infectious clone pCY1 and the RNA3 infectious clone pCY3, respectively, and mechanically inoculated into Nicotiana benthamiana. Seven days after inoculation, RNA was extracted from the infected leaves, and the expression of the CMV-H1 vector was confirmed, after which this was used as the inoculum source.
  • ATG6 KD plants were inoculated with a CMV vector carrying a polynucleotide encoding ILRa to obtain plants into which a nucleic acid fragment encoding the target protein had been introduced.
  • ILRa was detected in tissues infected with ILRa-expressing CMV. Detection was performed by Western blotting according to a conventional method. Anti-ILRa monoclonal antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology Inc.) was used to detect ILRa. In addition, anti-CMV CP polyclonal antibody (manufactured by Plant Protection Association) was used to detect viral proteins.
  • Experiment 2-2 Creation of ATG8 KD plant and production of ⁇ FGF using CMV vector
  • the amplified DNA fragment was inserted into pDONR221 vector (Invitrogen) and further into pBI-sense-antisense-GW-GFP vector (Implanta Innovations) according to the manual to obtain the ATG8-KD construct.
  • the obtained vector was introduced into Agrobacterium in a conventional manner, and Nicotiana benthamiana was transformed therewith to obtain an ATG8 KD plant.
  • ATG8-5-134 (5'-ACGCGTATGTTGTTCGTAAGAGAA-3': SEQ ID NO: 23) and ATG8-3-134 (5'-AGGCCTGATACAGGAAGCCATCCT-3': SEQ ID NO: 24) were used as primers to amplify ATG8, and PCR was performed according to the manual.
  • primers Nb-L23-5-110 (5'-AAGGATGCCGTGAAAGAAGATGT-3': SEQ ID NO: 15) and Nb-L23-3-110 (5'-GCATCGTAGTCAGGAGTCAACC-3': SEQ ID NO: 16) were used as internal standard genes.
  • T 0 primary transformant
  • the expression level of the ATG8 gene was suppressed to a low level in the ATG8 knockdown line, even after 5 weeks, when the expression level of the ATG8 gene increases in the wild type.
  • Acidic fibroblast growth factor was selected as the target protein.
  • ⁇ FGF is a useful protein that has the effect of inhibiting inflammatory cytokines and is also used as an anti-rheumatic drug.
  • StuI and MluI restriction sites were added to the 5' and 3' ends, respectively, by PCR, and the resulting plasmid was inserted into the cloning site (StuI and MluI restriction sites) of an infectious cDNA clone plasmid of the CMV-H1 vector (Matsuo et al. Planta 225, 277-286, 2007) in a standard manner.
  • the ATG8 KD plant was inoculated with a CMV vector carrying ⁇ FGF to obtain a plant into which a nucleic acid fragment encoding the target protein had been introduced.
  • ⁇ FGF ⁇ FGF was detected in tissues infected with ⁇ FGF-expressing CMV. Detection was performed by Western blotting according to a conventional method. Anti- ⁇ FGF monoclonal antibody (manufactured by Santa Cruz Biotechnology Inc.) was used to detect ⁇ FGF.
  • the culture solution of the transformed Agrobacterium was infiltrated into the entire three ATG8 KD plants to transiently express ⁇ FGF.
  • Five days after infiltration the leaves were harvested and disrupted in physiological saline (PBS) to obtain a disruption solution containing soluble proteins.
  • the disruption solution was centrifuged to precipitate and remove insoluble proteins, and the soluble protein aqueous solution was used as a sample to perform Western blotting by a conventional method to evaluate the amount of accumulated soluble ⁇ FGF (i.e., active ⁇ FGF).
  • anti- ⁇ FGF monoclonal antibody for detection of ⁇ FGF, anti- ⁇ FGF monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology Inc.) was used.
  • FIG. 13 The results of Western blotting are shown in Figure 13.
  • the rightmost lane in Figure 13 shows a standard sample containing 300 ng of FGF1.
  • the accumulation level of soluble ⁇ FGF was increased by 2.92-fold on average compared to the non-transformed plants (WT), indicating that useful proteins were sufficiently produced.
  • the amount of soluble ⁇ FGF contained in the sample recovered from the leaves of the ATG8 KD plant was approximately 162.4 ng, as calculated by comparison with the concentration of the band of the standard sample, and the amount of soluble ⁇ FGF contained in the sample recovered from the leaves of the non-transformed plant (WT) was approximately 50.49 ng.
  • ATG KO plant body ⁇ Experiment 3-1 Creation of ATG7 KO plant body and production of ILRa using CMV vector A KO plant was created using genome editing (CRISPR/Cas9) for the ATG7 gene.
  • CRISPR/Cas9 Cas9 protein, which cuts double-stranded DNA, and guide RNA (gRNA) that guides Cas9 to the target gene are simultaneously expressed in the cell, and the target protein can be knocked out by mutation during repair after cleavage by Cas9.
  • Nicotiana benthamiana has two ATG7 genes (ATG7a and ATG7b), and both of these genes were knocked out using the genome editing CRISPR/Cas9 method.
  • the binary vector for CRISPR/Cas9 was prepared essentially according to standard methods (Osmani et al., Methods Mol Biol 2028, 153-165, 2019). However, in order to increase the efficiency of genome editing, the sequences of the guide RNA, backbone RNA, and tRNA were linked in tandem according to the method of Xie et al.
  • a binary vector was constructed by modifying pZK_AtU6gRNA_FFCas9_NPTII.
  • mutations such as one-base insertion and one-base deletion were introduced in the target regions of the guide RNAs of the ATG7a and ATG7b genes, ATG7-gRNA2 and ATG-gRNA3. Since both of these mutations involve a frameshift in the translation of the ATG7 protein, they are considered to be knockout mutations that significantly impair protein function, and ATG7 KO plants were obtained. Mutations due to genome editing were also found in the sequences of the ATG7 loci (ATG7a and ATG7b), and ATG7 KO plants homozygous for these mutations were obtained.
  • the mutation site of ATG7 in the ATG7 KO plant was a mutation that caused a frameshift at or after the 477th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • Figure 8 shows the results for the T2 generation selected from the T1 generation.
  • the amount of ILRa accumulated was increased. Although the fresh weight of the aboveground part tended to decrease slightly, there was no statistically significant difference, and the growth condition was good. From the above, it was demonstrated that the production amount of the target protein, ILRa, can be increased by disrupting the ATG7 gene.
  • the amount of CMV CP accumulated was statistically significantly increased, and it was considered that both the stabilization of the ILRa protein and the improvement of the amount of CMV vector contributed to the increase in the amount of ILRa accumulated.
  • Experiment 3-2 Creation of ATG5 KO plant and production of ILRa using CMV vector A mutation was introduced into the ATG5 gene by genome editing in the same manner as in the case of the ATG7 gene described above.
  • Nicotiana benthamiana has two ATG5 genes (ATG5a and ATG5b), and both of these genes were knocked out using the genome editing CRISPR/Cas9 method.
  • the sequences of the guide RNA, backbone RNA, and tRNA were linked in tandem according to the method of Xie et al.
  • a binary vector was constructed by modifying pZK_AtU6gRNA_FFCas9_NPTII.
  • ATG5-gRNA1 ATG-gRNA3. Since both of these mutations involve a frameshift in the translation of the ATG5 protein, they are considered to be knockout mutations that significantly impair protein function, and ATG5 KO plants were obtained. Mutations due to genome editing were also found in the sequences of the ATG5 loci (ATG5a and ATG5b), and ATG5 KO plants homozygous for these mutations were obtained.
  • the mutation site of ATG5 in the ATG5 KO plant was a mutation that caused a frameshift at or after the 255th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • ATG5 KO plants were inoculated with a CMV vector carrying a polynucleotide encoding ILRa, and the amount of ILRa accumulation was compared by Western blotting.
  • Experiment 3-3 GFP expression by CMV vector in ATG7 KO plant
  • the ATG7-KO plant obtained above was inoculated with a CMV vector that expresses GFP.
  • the results are shown in Figure 10. Fluorescence derived from dead cells was also observed in the non-transformed control plant, but it was confirmed that CMV had migrated more widely in the apical leaves of the ATG7 KO plant.
  • Experiment 3-4 GFP expression by CIYVV vector in ATG7 KO plants. Instead of CMV, the clover yellow vein virus (ClYVV) vector was inoculated.
  • the GFP-expressing clover yellow vein virus vector (ClYVV-GFP) used was that prepared as previously reported (Masuta et al., Plant J 23, 539-546, 2000), and the inoculation method was also as previously reported. The results are shown in FIG. 11. GFP fluorescence was detected in the infected upper leaves 14 days after inoculation (FIG. 11: A), and the amount of GFP accumulation was comparatively analyzed by Western blotting (FIG. 11: B).
  • HC-Pro indicates the helper component protease of ClYVV
  • CP indicates the coat protein of ClYVV
  • RbcL indicates the Rubiscollage subunit.
  • Anti-ClYVV CP polyclonal antibody and anti-ClYVV HC-Pro monoclonal antibody were used to detect the above viral proteins.
  • H indicates a non-transformed N. benthamiana negative control sample not inoculated with the virus.
  • ATG7 KO plant significantly stronger GFP fluorescence was observed in the upper leaves indicated by the arrows compared to the non-transformed plant, and the amount of GFP accumulation was improved by an average of 72.8 times. Since the accumulation of viral proteins, HC-Pro and coat protein (CP), was also significantly increased in the ATG7 KO plants, it is believed that the increase in the amount of ClYVV vector contributed to the increase in the accumulation of GFP protein.
  • Experiment 3-5 Expression of ⁇ -galactosidase ( ⁇ Gal) by agroinfiltration in ATG5 KO plants
  • a Flag tag was added to the 3' end of the open reading frame (ORF) expressing ⁇ -galactosidase ( ⁇ Gal) and integrated between the restriction enzyme sites BamHI and SacI of the binary vector pBE2113.
  • the constructed pBE2113- ⁇ Gal-Flag was transformed into Agrobacterium LB4404 strain and used for transient expression of ⁇ Gal by agroinfiltration.
  • the sequence of the constructed ⁇ Gal-Flag is shown in SEQ ID NO:31.
  • Co-expression of ⁇ Gal and GFP was achieved by mixing the culture fluid of the above-mentioned transformed Agrobacterium with the culture fluid of Agrobacterium transformed with pIG121-GFP (Yambao et al., Archives of Virology 153. 105-115, 2008) incorporating the GFP gene, and infiltrating the mixture into leaves.
  • the accumulation of ⁇ Gal and GFP was compared by Western blotting.
  • Anti-Flag monoclonal antibody (1E6 clone, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and anti-GFP polyclonal antibody (MBL Life Sciences, Ltd.) were used to detect both proteins.
  • Agrobacterium cell fluid rather than a viral vector, was injected into the leaves by infiltration to co-express ⁇ Gal and GFP.
  • Experiment 3-6 Expression of ⁇ FGF by agroinfiltration in ATG7 KO plants
  • Agrobacterium LB4404 strain was transformed with the binary vector pBE2113- ⁇ FGF encoding ⁇ FGF.
  • the culture solution was infiltrated into the entire three ATG7 KO plants to transiently express ⁇ FGF.
  • the amount of soluble ⁇ FGF accumulated in the leaves of each plant was detected by Western blotting, and the results are shown in Figure 13.
  • the accumulation level of soluble ⁇ FGF was increased by an average of 1.95 times compared to the non-transformed plants, indicating that useful proteins were sufficiently produced.
  • the amount of soluble ⁇ FGF contained in the sample recovered from the leaves of the ATG7 KO plant was approximately 113.2 ng, as calculated by comparing with the concentration of the band of the standard sample, and the amount of soluble ⁇ FGF contained in the sample recovered from the leaves of the non-transformed plant (WT) was approximately 50.49 ng.

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Abstract

目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物に、目的タンパク質を製造させる製造工程を含み、前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である、タンパク質の製造方法。前記植物は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であってよく、前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含むことが好ましい。

Description

タンパク質の製造方法、植物、及び植物ウイルスベクターの生産方法
　本発明は、タンパク質の製造方法、植物、及び植物ウイルスベクターの生産方法に関する。本願は、２０２２年１０月６日に、日本に出願された特願２０２２－１６１６７７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、医療用タンパク質などの有用タンパク質生産を植物で行う、Ｐｌａｎｔ－ｍａｄｅ　Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（ＰＭＰ）が世界的に注目されており、アグロバクテリウムを用いた一過性発現（アグロインフィルトレーション）や、ウイルスベクターを使用した方法に収束しつつある。なかでも、ＭａｇＮＩＣＯＮ（登録商標）システムなど、ウイルスベクターとアグロインフィルトレーションとを併用する方法が、最も先行している技術である（非特許文献１）。
　ウイルスベクターを用いたタンパク質生産では、例えば、生産する目的タンパク質遺伝子を搭載したウイルスベクターを植物に感染増殖させることで、ウイルスから発現する目的タンパク質を生産できる。
　アグロインフィルトレーションを用いたタンパク質生産では、例えば、Ｔ－ＤＮＡ領域に、プロモーターの下流に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結したバイナリーベクターで形質転換したアグロバクテリウムを、インフィルトレーションで植物体全身に感染させ、感染細胞で一過的に目的タンパク質を生産できる。
　これらの技術は、植物ゲノムを改変する必要がないため、短期間の準備で大量に目的タンパク質を生産できる優れた方法である。
　タンパク質の生産量の向上のため、これまでは、主にウイルスベクターや、バイナリーベクター、それらの接種法、宿主植物の育成法の改良などにより、目的タンパク質の発現量を向上させる試みが行われてきた。
MAGNICON IN PLANTA EXPRESSION TECHNOLOGY ［online］、〔令和４年９月３０日検索〕、インターネット〈URL：https://www.icongenetics.com/technology/>
　しかし、通常、目的タンパク質の製造に用いられる植物としては野生型の植物（例えば、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））をそのまま使用しており、植物の改良による目的タンパク質の生産性の向上については、未だ検討の余地がある。
　本発明は、植物における目的タンパク質の生産量を向上可能な、タンパク質の製造方法の提供を目的とする。また本発明は、前記タンパク質の製造方法に使用される、植物の提供を目的とする。また本発明は、植物ウイルスベクターの生産量を向上可能な、植物ウイルスベクターの生産方法の提供を目的とする。
　目的タンパク質の製造に用いられる植物の細胞内では、オートファジーと呼ばれる真核生物の主要なタンパク質分解系により、目的タンパク質のみならず、核酸断片の導入に用いられ得るウイルスベクターやアグロバクテリウム等の一定程度が分解されてしまっていることが考えられた。
　そこで、本発明者らは、この植物の主要なタンパク質分解系であるオートファジーを抑制することにより、それらの分解が抑制され、結果として目的タンパク質の生産量を向上させることができると考えた。
　そして、本発明者らによる検証の結果、オートファジー系が抑制された植物と、その使用により、植物ウイルスベクターの生産量や、ウイルスベクターに由来して発現される目的タンパク質の生産量を向上可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を有する。
（１）　目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物に、目的タンパク質を製造させる製造工程を含み、前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である、タンパク質の製造方法。
（２）　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、前記（１）に記載の製造方法。
（３）　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記（２）に記載の製造方法。
　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
（４）　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して前記植物に導入する導入工程を含む、前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（５）　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（６）　前記製造工程の後に、前記植物から前記目的タンパク質を回収する回収工程を含む、前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（７）　前記植物がタバコ属植物である、前記（１）～（６）のいずれか一つに記載の製造方法。
（８）　前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の製造方法に使用される、オートファジー系が抑制された植物。
（９）　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、前記（８）に記載の植物。
（１０）　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記（９）に記載の植物。
　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
（１１）　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片、又は前記核酸断片から発現した前記目的タンパク質を含む、前記（８）～（１０）のいずれか一つに記載の植物。
（１２）　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を有する植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ領域を含む、前記（８）～（１１）のいずれか一つに記載の植物。
（１３）　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、前記（８）～（１２）のいずれか一つに記載の植物。
（１４）　タバコ属植物である、前記（８）～（１３）のいずれか一つに記載の植物。
（１５）　目的タンパク質をコードする核酸断片を有する植物ウイルスベクターを含む植物に、前記植物ウイルスベクターを複製させる製造工程を含み、
　前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である、植物ウイルスベクターの生産方法。
（１６）　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、前記（１５）に記載の生産方法。
（１７）　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、前記（１６）に記載の生産方法。
　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
（１８）　前記核酸断片を、前記植物ウイルスベクターを介して前記植物に導入する導入工程を含む、前記（１５）～（１７）のいずれか一つに記載の生産方法。
（１９）　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、前記（１５）～（１８）のいずれか一つに記載の生産方法。
（２０）　前記植物がタバコ属植物である、前記（１５）～（１９）のいずれか一つに記載の生産方法。
　本発明によれば、植物における目的タンパク質の生産量を向上可能な、タンパク質の製造方法を提供できる。また本発明によれば、前記タンパク質の製造方法に使用される、植物を提供できる。また本発明によれば、植物ウイルスベクターの生産量を向上可能な、植物ウイルスベクターの生産方法を提供できる。
植物におけるオートファジー系の概要を説明するための模式図である。 実験１において、オートファジー系の抑制により植物ウイルスベクターの生産量が増加した結果を示すグラフである。 実施例において、ＡＴＧ ノックダウン（ＫＤ）植物体の作出のために作製したコンストラクトの構成を示す模式図である。 実験２－１において、ＡＴＧ６ ＫＤ植物体で、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬＲａ）の生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験２－２において、ＡＴＧ８ ＫＤ植物体の取得結果を示すグラフである。 実験２－２において、ＡＴＧ８ ＫＤ植物体で、αＦＧＦの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験３－１において、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体で、ＩＬＲａの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験３－１において、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体で、ＩＬＲａの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験３－２において、ＡＴＧ５ ＫＯ植物体で、ＩＬＲａの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験３－３において、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体で、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のウイルスベクター導入により生産されたＧＦＰの検出画像である。 実験３－４において、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体で、クローバ葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）のウイルスベクター導入により生産されたＧＦＰの検出画像（Ａ）、及びウェスタンブロッティングの結果を示す画像（Ｂ）である。 実験３－５において、ＡＴＧ５ ＫＯ植物体で、アグロインフィルトレーションにより、αＧａｌの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。 実験２－３におけるＡＴＧ８　ＫＤ植物体と、実験３－６におけるＡＴＧ７　ＫＯ植物とで、アグロインフィルトレーションにより、αＦＧＦの生産性が向上された結果を示すウェスタンブロッティングの画像である。
　以下、本発明の、タンパク質の製造方法、植物、及び植物ウイルスベクターの生産方法の実施形態を説明する。
≪タンパク質の製造方法≫
　実施形態のタンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物に、目的タンパク質を製造させる製造工程を含み、前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である。
＜製造工程＞
（オートファジー系が抑制された植物）
　オートファジー系は、真核生物の主要なタンパク質分解系の一つであり、不要になったタンパク質や異常な性質を示すタンパク質を、オートファゴソームと呼ばれる脂質二重膜で取り囲み液胞に導いて分解する。最近、ＣＭＶやタバコモザイクウイルスを含む病原細菌及びウイルスも、オートファジーで分解されていることが明らかになりつつある。これら病原細菌及びウイルスは、後述の実施例に示すように、ウイルスベクターとしても用いられる。
　そこで発明者らは、このオートファジー系がウイルスベクターや目的タンパク質を分解しており、オートファジー系を抑制することで目的タンパク質生産をより増大できると考えた。
　オートファジーの分子機構については、ノーベル賞を取られた大隅良典先生による酵母の研究を契機に、現在までに４０あまりのオートファジー関連遺伝子（ＡｕＴｏｐｈａＧｙ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ；ＡＴＧ）が同定及び解析されている。
　実施形態のタンパク質の製造方法に係る前記植物は、オートファジー系が抑制された植物である。
　オートファジー系が抑制されていることとは、当該植物の野生型の対照植物と比較して、オートファジーの機能が抑制されていることをいう。オートファジー系が抑制されていることには、野生型の植物における、本来のオートファジーの機能が抑制されるように改変されている場合が含まれる。オートファジー系の抑制は、オートファジー系のプロセスの少なくとも一部が部分的又は完全に不活性化していてよい。
　前記植物は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であることが好ましい。
　オートファジー関連遺伝子の機能が抑制されている植物とは、当該植物の野生型の対照植物と比較して、オートファジー関連遺伝子にコードされる因子の機能が低下していることをいう。
　オートファジー関連遺伝子の機能が欠損されている植物とは、当該植物の野生型の対照植物と比較して、オートファジー関連遺伝子にコードされる因子の機能を喪失しているか、因子自体が欠損していることをいう。
　オートファジー関連遺伝子の発現が抑制されている植物とは、当該植物の野生型の対照植物と比較して、オートファジー関連遺伝子の遺伝子産物の発現量が低下していることをいう。
　オートファジー関連遺伝子の発現が喪失されている植物とは、当該植物の野生型の対照植物と比較して、オートファジー関連遺伝子の遺伝子産物の発現を喪失していることをいう。
　前記遺伝子産物としては、当該遺伝子のｍＲＮＡや、翻訳産物（ペプチド、タンパク質）等が挙げられ、これらの発現量は、公知の測定方法により測定可能である。
　実施形態に係る植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制されている植物の場合、オートファジー関連遺伝子の機能の抑制の程度は、当該植物の野生型の対照植物と比較して、目的タンパク質の生産量の向上が認められる程度であればよい。
　実施形態に係る植物が、オートファジー関連遺伝子の発現が抑制されている植物の場合、オートファジー関連遺伝子の発現の抑制の程度は、当該植物の野生型の対照植物と比較して、目的タンパク質の生産量の向上が認められる程度であればよい。
　前記オートファジー関連遺伝子は、オートファジー系に寄与する因子の遺伝子であれば、いかなるものであってもよい。当該オートファジー関連遺伝子は、オートファジー系を担う多数のオートファジー関連遺伝子のうちの一部であってよく、１種又は２種以上のオートファジー関連遺伝子を含むことができる。
　なお、或るオートファジー関連遺伝子に関して、同等の機能を有する２つ以上のホモログが認められる場合では、ホモログの全てで遺伝子の発現又は機能が抑制されている必要はなく、当該植物の野生型の対照植物と比較して、目的タンパク質の生産量の向上が認められる場合であればよい。
　図１は、植物におけるオートファジー系の概要を説明するための模式図である。オートファジーでは、異常タンパク質や、不要になった細胞小器官などが、オートファゴソームと呼ばれる脂質二重膜に囲まれて輸送され、最終的に液胞に取り込まれ分解される。ＡＴＧ８はオートファジーに関わる分解誘導の実行因子であり、凝集又は不活化した異常タンパク質やウイルスなどの分解されるべきタンパク質に直接または別の受容体因子を介して間接に結合して、隔離膜（ファゴフォア）形成により分解対象をオートファゴソームに取り込む。
　ＡＴＧ８の一部は再利用され、成熟化（すなわち活性化）されて、次のターゲットタンパク質のオートファジー分解に関わることができる。その成熟化に関わるのが、ＡＴＧ５、ＡＴＧ７等の因子である。また、ＡＴＧ６等の因子も、ファゴフォアの形成を誘導する因子として知られる。
　本実施形態では、オートファジー系を抑制するための、好適なターゲットＡＴＧ遺伝子として、ＡＴＧ６と、ＡＴＧ７と、ＡＴＧ５と、ＡＴＧ８とからなる群から選択される１種以上を選定できる。
　本明細書においてＡＴＧ５遺伝子とは、ＡＴＧ５遺伝子のホモログ（パラログを含む）を包含する概念である。本明細書においてＡＴＧ６遺伝子とは、ＡＴＧ６遺伝子のホモログ（パラログを含む）を包含する概念である。本明細書においてＡＴＧ７遺伝子とは、ＡＴＧ７遺伝子のホモログ（パラログを含む）を包含する概念である。本明細書においてＡＴＧ８遺伝子とは、ＡＴＧ８遺伝子のホモログ（パラログを含む）を包含する概念である。
　例えば、ベンサミアナタバコの場合、ＡＴＧ５～７遺伝子には、それぞれパラログが存在する（例えば、ＡＴＧ７遺伝子のパラログの場合は、ＡＴＧ７ａとＡＴＧ７ｂの２つが知られる。）。ベンサミアナタバコの場合、ＡＴＧ８遺伝子は１２個のホモログが存在するとされる。
　例えば、後述の実施例に示されるように、ＲＮＡｉやゲノム編集等の技術を用いることで、複数のホモログをまとめてターゲットとすることが容易である。
　実施形態のタンパク質の製造方法に係る前記植物は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であってよく、前記オートファジー関連遺伝子は、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含むことが好ましい。前記オートファジー関連遺伝子は、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含んでもよい。
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子は、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってよい。
　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ６ａ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。
　（ａ１）のタンパク質をコードするものとしては、配列番号５で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
　配列番号５で表される塩基配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ６ａ遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。
　ＡＴＧ６遺伝子にコードされるＡＴＧ６のオートファジー系における活性とは、ファゴフォアの形成に寄与する活性が挙げられる。ＡＴＧ６は、ファゴフォア膜へのフォスファチジルイノシトール３リン酸（ＰＩ３Ｐ）の付加を担う因子とされる。
　前記オートファジー関連遺伝子がＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記植物におけるＡＴＧ６遺伝子は、ＡＴＧ６遺伝子の機能が抑制されている、又はＡＴＧ６遺伝子の発現が抑制されていることが好ましい。
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子は、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってよい。
　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ７ａ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。
　（ａ２）のタンパク質をコードするものとしては、配列番号６で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
　配列番号６で表される塩基配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ７ａ遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。
　ＡＴＧ７遺伝子にコードされるＡＴＧ７のオートファジー系における活性とは、ＡＴＧ８の成熟化に寄与する活性が挙げられる。ＡＴＧ７は、ＡＴＧ８へのフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の付加を担う因子とされる。
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子は、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってよい。
　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　配列番号３で表されるアミノ酸配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ５ａ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。
　（ａ３）のタンパク質をコードするものとしては、配列番号７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
　配列番号７で表される塩基配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ５ａ遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。
　ＡＴＧ５遺伝子にコードされるＡＴＧ５のオートファジー系における活性とは、ＡＴＧ８の成熟化に寄与する活性が挙げられる。ＡＴＧ５は、ＡＴＧ８へのフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の付加を担う因子とされる。
　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子は、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってよい。
　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
　配列番号４で表されるアミノ酸配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ８ａ遺伝子にコードされるアミノ酸配列である。
　（ａ４）のタンパク質をコードするものとしては、配列番号８で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
　配列番号８で表される塩基配列は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＡＴＧ８ａ遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。
　ＡＴＧ８遺伝子にコードされるＡＴＧ８のオートファジー系における活性とは、標的の分解誘導に寄与する活性が挙げられる。ＡＴＧ８は、分解の標的に結合して、分解対象のオートファゴソームへの取り込みを担う因子とされる。
　前記オートファジー関連遺伝子がＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記植物におけるＡＴＧ８遺伝子は、ＡＴＧ８遺伝子の機能が抑制されている、又はＡＴＧ８遺伝子の発現が抑制されていることが好ましい。
　（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）及び（ｂ４）において、欠失、挿入、置換若しくは付加されてよいアミノ酸の数としては、１～５００個が好ましく、１～４００個が好ましく、１～３００個が好ましく、１～２００個が好ましく、１～１５０個が好ましく、１～１００個がより好ましく、１～５０個がより好ましく、１～４０個がより好ましく、１～３０個がより好ましく、１～１５個がより好ましく、１～１０個が更に好ましく、１～５個が最も好ましい。
　（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）及び（ｃ４）における配列同一性としては、４０％以上が好ましく、４５％以上が好ましく、５０％以上が好ましく、５５％以上が好ましく、６０％以上が好ましく、６５％以上が好ましく、７０％以上が好ましく、７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
　アミノ酸配列の配列同一性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）、例えばｂｌａｓｔｐにより算出可能である。
　上記に挙げたように、ＡＴＧ５～８遺伝子は、その塩基配列にコードされるアミノ酸配列により特定可能である。
　なお、遺伝子にコードされる機能的な（上記に例示した活性を有する）タンパク質とは、場合により、メチル化、アセチル化、リン酸化等の修飾を受けたり、部分的に切断されたりなどして成熟化されたタンパク質の形態を含む。
　ここでの遺伝子は、実施形態に係る植物が本来有する核酸上の一領域に保持されるものであってよい。当該遺伝子としては、ポリヌクレオチドであってよく、通常は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。遺伝子は、核ゲノムに含まれていてもよく、細胞小器官のゲノムに含まれていてもよい。
　ＡＴＧ５～８遺伝子を塩基配列により特定する場合には、コーディング領域の塩基配列として、配列番号１で表されるアミノ酸配列の代わりに配列番号５で表される塩基配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列の代わりに配列番号６で表される塩基配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列の代わりに配列番号７で表される塩基配列、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列の代わりに配列番号８で表される塩基配列で特定し、アミノ酸配列に代えて、塩基配列の置換、欠失、挿入、又は付加並びに同一性を採用できる。欠失、挿入、置換若しくは付加されてよい塩基（ヌクレオシド）の数及び同一性としては、上記のアミノ酸配列として例示した数値に相当する数値が挙げられる。
　実施形態に係るオートファジー系が抑制された植物の製造方法や形態は、特に制限されるものではない。実施形態のタンパク質の製造方法に係る前記植物は、オートファジー系が人為的に抑制された植物であってよい。
　例えば、オートファジー関連遺伝子の発現又は機能の抑制は、例えば、ＲＮＡサイレンシングによるものであってよい。ＲＮＡサイレンシングとしては、ｓｉＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡ等によるＲＮＡｉ等を例示でき、ウイルス誘導型遺伝子サイレンシング（ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ；ＶＩＧＳ）であってもよい。
　ＲＮＡサイレンシングを利用し、例えば、標的のオートファジー関連遺伝子に対してＲＮＡサイレンシングを誘導可能な核酸（例えば、２本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸など）を植物に導入又は発現させることで、オートファジー関連遺伝子の発現又は機能が抑制された植物を得ることができる。
　ＲＮＡサイレンシングを誘導可能な核酸は、遺伝子として植物に導入され、発現されてよい。遺伝子としては、例えば、プロモーター、標的遺伝子の配列のインバーテッドリピート構造、及びターミネーターを有するものが挙げられる。ＲＮＡサイレンシングを誘導可能な核酸は、上記のＶＩＧＳのようにウイルスベクターを介して導入されてもよい。
　一方、ウイルスベクター等を用いて目的タンパク質をコードする核酸断片を導入させる場合に重複感染の必要がなく、植物において恒常的にサイレンシングを誘導可能である観点から、植物の形質転換によりＲＮＡサイレンシングを誘導させることが好ましい。例えば、標的遺伝子の部分配列を逆向きタンデムに繋いだインバーテッドリピート配列を、３５Ｓプロモーター等の恒常的プロモーターの支配下で恒常的に発現する形質転換植物を作出する方法が好ましい。
　オートファジー関連遺伝子の機能抑制若しくは欠損、及びオートファジー関連遺伝子の発現抑制若しくは喪失は、例えば、ヒートショックタンパク質プロモーターや、デキサメタゾン（ＤＥＸ）誘導性プロモーター等の誘導型プロモーター、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム等を利用したコンディショナルな遺伝子改変により、条件的に誘導された形態も包含される。
　また、オートファジー関連遺伝子の機能抑制若しくは欠損、及びオートファジー関連遺伝子の発現抑制若しくは喪失は、例えば、組織特異的プロモーター等の利用により、部位特異的又は時期特異的に生じた形態も包含される。
　オートファジー関連遺伝子の機能の抑制若しくは欠損、及びオートファジー関連遺伝子の発現の抑制若しくは喪失は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損するよう、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失するよう、前記植物のゲノム配列が改変されたものであってもよい。
　改変は、オートファジー関連遺伝子及び／又はオートファジー関連遺伝子の発現調節領域の配列の改変であることが好ましい。
　例えば、オートファジー関連遺伝子の配列の改変により、オートファジー関連遺伝子の機能を抑制若しくは欠損させることが可能である。オートファジー関連遺伝子の配列とは、遺伝子のコーディング領域の配列が挙げられる。
　例えば、オートファジー関連遺伝子の発現調節領域の配列の改変により、オートファジー関連遺伝子の発現を抑制若しくは喪失させることが可能である。オートファジー関連遺伝子の発現調節領域とは、プロモーター、エンハンサー等の領域が挙げられる。
　配列の改変の種類は特に制限されず、例えば、オートファジー関連遺伝子及び／又はオートファジー関連遺伝子の発現調節領域における、一部又は全部の塩基配列の置換、欠失、挿入、付加又はそれらの組み合わせが挙げられる。かかる改変により、オートファジー関連遺伝子にコードされる機能的なタンパク質の生産を、抑制又は喪失させることができる。１～１０塩基程度の塩基配列の置換、欠失、挿入、又は付加の場合には、コーディング領域でフレームシフトが生じる置換、欠失、挿入、又は付加であることが好ましい。
　個々のオートファジー関連遺伝子について、実施形態に係る植物は、改変された配列をホモ接合で有していてもよく、ヘテロ接合で有していてもよい。
　配列の改変の手法は特に制限されず、例えば、変異原処理、放射線照射、ゲノム編集等の手法を例示できる。ゲノム編集は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集であってよい。
　オートファジー系が抑制された植物の種類は、特に制限されるものではないが、被子植物であってよく、タバコ、トマト、ジャガイモなどのナス科植物、レタスなどのキク科植物、キャベツ、ブロッコリー、シロイヌナズナなどのアブラナ科植物、イネ、コムギなどのイネ科植物、キュウリ、メロン、スイカなどのウリ科植物、インゲンマメ、ダイズ、リョクトウなどのマメ科植物、リンゴ、イチゴなどのバラ科植物等が挙げられる。
　なお、本明細書では、緑藻、紅藻、珪藻、藍藻などの藻類も、植物の概念に包含されるものとする。
　上記のナス科植物としては、タバコ属植物であることが好ましく、タバコであることがより好ましい。タバコとしては、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）や、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）等を例示でき、ベンサミアナタバコが好ましい。タバコ属植物は、ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムの効率的な感染増殖が可能であることからも好ましい。
　また、本明細書における植物とは、植物体のみならず、その一部である組織、器官、細胞や、カルス、細胞塊なども包含する概念である。細胞は植物培養細胞であってもよい。
　目的タンパク質をコードする核酸断片が植物に導入されると、植物が備えるタンパク質の生合成経路を利用して目的タンパク質を発現させることができ、効率的に目的タンパク質を生産可能である。目的タンパク質の生産にあたっては、公知の植物の栽培方法や培養方法を採用でき、植物の種類や成長段階に応じて、適切な栽培条件や培養条件を選択できる。
（核酸断片の導入）
　実施形態のタンパク質の製造方法で使用される植物は、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物である。実施形態のタンパク質の製造方法で使用される植物は、目的タンパク質をコードする核酸断片が発現可能に導入されている。
　目的タンパク質をコードする核酸断片は、目的タンパク質をコードする核酸の領域を含むものであれば、それ以外の核酸の領域等の構造をさらに含んでもよい。
　実施形態のタンパク質の製造方法で使用される植物は、該植物内に、前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を含むことができる。実施形態のタンパク質の製造方法で使用される植物は、製造工程の過程で前記核酸断片から発現した前記目的タンパク質を含むことができる。
　目的タンパク質をコードする核酸断片は、植物に対してどのように導入されていてもよいが、例えば、前記核酸断片を有する、リポソーム、エキソソーム、植物ウイルスベクター、アグロバクテリウム等のキャリアを介して導入されてよい。
　上記に例示したなかでも、前記核酸断片の導入には、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを使用することが好ましい。
　植物ウイルスベクターを使用することで、植物ウイルスベクターの増殖に伴い、目的タンパク質をコードする核酸断片自体も増やすことが可能であるため、高効率に目的タンパク質を生産可能である。
　なお、植物ウイルスとは、植物に感染するウイルスを指すが、ベクターとして利用される植物ウイルスベクターでは、感染性が改変されていてもよい。
　また、アグロバクテリウムを使用することで高効率な感染が可能であり、更には、バキュームインフィルトレーション等を適用すれば、全身感染によって多量のタンパク質の生産を容易に実施できる。
　実施形態のタンパク質の製造方法で使用される植物は、該植物内に、前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を有する、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ領域を含むことができる。
　前記核酸断片の導入による目的タンパク質の発現において、前記目的タンパク質をコードする核酸断片の挿入による植物のゲノムの改変は必須ではない。短期間の準備で高効率に目的タンパク質を生産可能であることから、実施形態のタンパク質の製造方法では、一過性発現により植物に目的タンパク質を製造させることが好ましい。
　一過性発現は、例えば、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して、前記核酸断片を植物に導入することで、容易に実施可能である。
　更には、オートファジー系が抑制されることで、植物内の植物ウイルスベクター、アグロバクテリウム等の生産量が向上されるので、これらの利点により、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを使用する場合で、目的タンパク質の生産性向上の効果が、より一層効果的に発揮される。
　当該観点から、目的タンパク質をコードする核酸断片は、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して導入されたものであることが好ましく、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して導入され、一過性発現されたものが好ましい。アグロバクテリウムを介した一過性発現は、アグロインフィルトレーションとも称され、植物に導入されたＴ－ＤＮＡ領域上の核酸断片から目的タンパク質が翻訳される形態を含む方法である。
　実施形態のタンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸断片を植物に導入する導入工程を更に含むことができる。
　好ましくは、前記導入工程は、目的タンパク質をコードする核酸断片を植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して、植物に導入することを含んでよい。
　より好ましくは、前記導入工程は、目的タンパク質をコードする核酸断片を、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して、前記植物に導入することを含んでよい。
　植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して、目的タンパク質をコードする前記核酸断片を植物に導入することは、前記核酸断片を備える植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ領域が、植物内に含有された状態を経ることを含む。
　上記の植物ウイルスベクターによる前記核酸断片の導入は、植物ウイルスベクター及びアグロバクテリウムを介した導入であってもよい。
　植物ウイルスベクター及びアグロバクテリウムを介した導入の一例として、アグロインフェクション法が挙げられる。アグロインフェクション法は、アグロバクテリウムを使用して、植物ウイルスベクターを植物に導入する方法といえる。アグロインフェクション法では、例えば、植物ウイルスベクターの感染性ゲノム塩基配列を有するポリヌクレオチドが挿入されたＴ－ＤＮＡ領域を有するアグロバクテリウムを植物に感染させ、該塩基配列から発現する植物ウイルスベクターを自己増殖させることができる。植物ウイルスベクターの感染性ゲノム塩基配列は、上記目的タンパク質をコードする核酸断片を発現可能に有することができる。
　前記導入工程は、アグロインフェクション法により、植物ウイルスベクターを介して、目的タンパク質をコードする核酸断片を植物に導入する工程を含むことがさらに好ましい。
　植物ウイルスベクター及びアグロバクテリウムを介した導入方法の一例としては、ＭａｇＮＩＣＯＮシステムが知られており、本実施形態のタンパク質の製造方法は、ＭａｇＮＩＣＯＮシステムにも適用可能である。
　植物ウイルスベクターとしては、導入対象の植物種に応じて適宜選定されてよく、例えば、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、クローバ葉脈黄化ウイルス（ＣＩＹＶＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭＶ）、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ズッキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）などのウイルスベクターが挙げられる。
　実施形態のタンパク質の製造方法が、上記の導入工程を含む場合、予めオートファジー系が抑制された植物に対して、核酸断片を導入してもよいし、植物への核酸断片の導入の後、当該植物のオートファジー系が抑制されてもよいし、核酸断片の導入とオートファジー系の抑制は同時であってもよい。
（目的タンパク質）
　目的タンパク質としては、所望の種類や性質等を有するタンパク質を適宜選定可能である。目的タンパク質は、ペプチドであってもよい。
　目的タンパク質は、オートファジー系が抑制された植物が、本来は有していない外来タンパク質であってよい。
　目的タンパク質は、例えば、医療用タンパク質を含んでよい。医療用タンパク質としては、薬理作用を有する医薬として使用されるタンパク質の他、任意の疾患の治療、予防又は診断に使用されるタンパク質又はペプチドであってよい。医療用タンパク質として、例えば、ワクチンとして使用される抗原タンパク質なども例示できる。
　医療用タンパク質としては、例えば、酵素、抗体、増殖因子等の各種因子、ホルモン、インターロイキン類、アゴニスト、アンタゴニストなどに分類されるタンパク質であってよい。
　また、目的タンパク質は、医療用タンパク質以外にも、例えば、食品、化粧品、殺虫剤等として使用される任意の種類のタンパク質を好適に例示できる。
＜回収工程＞
　実施形態のタンパク質の製造方法は、前記製造工程の後に、前記植物から前記目的タンパク質を回収する回収工程を更に含むことができる。
　回収方法としては、例えば、生産された目的タンパク質を含む植物の破砕液、抽出液などから、目的タンパク質を取得することが挙げられ、必要に応じて、目的タンパク質精製又は単離することができる。精製又は単離法は、公知の方法を採用でき、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種クロマトグラフィー、限外ろ過などの方法が挙げられる。
　実施形態のタンパク質の製造方法によれば、オートファジー系が抑制された植物を使用することにより、オートファジー系が抑制されていない対照の植物を使用する場合に比べ、目的タンパク質の生産量を向上可能である。特に、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された前記植物における、目的タンパク質の生産に好適である。
≪植物≫
　実施形態の植物は、実施形態のタンパク質の製造方法に使用される、オートファジー系が抑制された植物である。
　実施形態のタンパク質の製造方法、及び該オートファジー系が抑制された植物としては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　実施形態の植物は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であってよく、前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、ことが好ましい。前記オートファジー関連遺伝子は、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含んでもよい。
　実施形態の植物における、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝としては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　実施形態の植物は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片、又は前記核酸断片から発現した前記目的タンパク質を含むことが好ましい。
　実施形態の植物における、目的タンパク質、及び前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片としては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　実施形態の植物は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を有する植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ領域を含むことが好ましい。
　実施形態の植物における、植物ウイルスベクターとしては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　前記目的タンパク質は、医療用タンパク質を含むことが好ましい。
　実施形態の植物は、タバコ属植物であることが好ましい。
　実施形態の植物は、実施形態の製造方法に使用されるプラットフォーム植物として好適であり、実施形態の植物の使用により高効率に目的タンパク質を生産可能である。
　また、実施形態のオートファジー系が抑制された植物は、後述の実施形態の植物ウイルスベクターの生産方法に使用される植物としても、好適に使用可能である。
≪植物ウイルスベクターの生産方法≫
　実施形態の植物ウイルスベクターの生産方法は、目的タンパク質をコードする核酸断片を有する植物ウイルスベクターを含む植物に、前記植物ウイルスベクターを複製させる製造工程を含み、前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である。
　実施形態の生産方法における前記植物、及び植物ウイルスベクターとしては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　実施形態の生産方法における植物は、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であってよく、前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、ことが好ましい。前記オートファジー関連遺伝子は、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含んでもよい。
　実施形態の生産方法における、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝としては、上記の≪タンパク質の製造方法≫で説明したものが挙げられる。
　実施形態の生産方法は、前記核酸断片を、前記植物ウイルスベクターを介して前記植物に導入する導入工程を含むことが好ましい。
　前記目的タンパク質は、医療用タンパク質を含むことが好ましい。
　実施形態の生産方法における植物は、タバコ属植物であることが好ましい。
　実施形態の植物ウイルスベクターの生産方法によれば、オートファジー系が抑制された植物を使用することにより、オートファジー系が抑制されていない対照の植物を使用する場合に比べ、高効率に前記ウイルスベクターを生産可能である。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　下記表１に、各実験の概要を記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施例において、遺伝子の機能欠損（ノックアウト）をＫＯと表記することがあり、機能抑制（ノックダウン）をＫＤと表記することがある。
・実験１　ＡＴＧ ＫＤ植物体（１）　ウイルス誘導型ＲＮＡサイレンシング ＶＩＧＳ
　ＡＴＧ５～８のいずれかをＫＤすることで、効果的にオートファジーを抑制できることを期待して、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ベクターにＡＴＧ遺伝子の部分的な塩基配列を組み込んだ。この組換えウイルス感染部位では一過的にＡＴＧ遺伝子のＲＮＡｉを誘導できる（ウイルス誘導型ＲＮＡｉ、ＶＩＧＳ）。
　各ＡＴＧ遺伝子のターゲットとなる配列を以下に示す。
　ＡＴＧ８（５’－ＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＣＴＧＡＴＡＧＡＡＴＡＣＣＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＡＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＧＴ－３’：配列番号９）
　ＡＴＧ７（５’－ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＴＴＧＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＴＡＡＧ－３’：配列番号１０）
　ＡＴＧ６（５’－ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＡＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＣ－３’：配列番号１１）
　ＡＴＧ５（５’－ＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＴＧＴＧＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＡＴＡ－３’：配列番号１２）
　前記ターゲット配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、クローニング用に５’末端及び３’末端にそれぞれＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトを付加したオリゴＤＮＡを合成し、ＰＣＲによって２本鎖にした。これをＣＭＶ－Ａ１ベクター（Otagaki et al., Plant Biotech 23, 259-265, 2006）の感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ。
（ベクターの接種）
　上記で得た各ＡＴＧ遺伝子のターゲット配列をもつＣＭＶ－Ａ１ベクター（ＲＮＡ２）をＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写した。これをＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ１感染性クローンｐＣＹ１及びＲＮＡ３感染性クローンｐＣＹ３よりｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ１及びＲＮＡ３と混合し、ベンサミアナタバコに機械接種した。接種７日後に感染葉からＲＮＡを抽出し、該ＣＭＶ－Ａ１ベクターの発現を確認したのち、これを接種源とした。
　各ＡＴＧ遺伝子をターゲットにしたＣＭＶベクターを感染させ、ＡＴＧ５ ＫＤ植物体、ＡＴＧ６ ＫＤ植物体、ＡＴＧ７ ＫＤ植物体、及びＡＴＧ８ ＫＤ植物体を得た。
（ウイルスベクター量の測定）
　上記の各ＫＤ植物体のベンサミアナタバコの葉より、ＴＲＩｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製)を使用し、マニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ(Ｔａｋａｒａ製)を使用したのち、ＡＭＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ (Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ製)によって、マニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡを鋳型に、Ｐｏｗｅｒ　Ｕｐ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ
　Ｍｉｘ(Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、ＣＭＶベクター量を測定した。ＣＭＶを増幅するプライマーとしてＣＭＶ－ＤＥＴ－５－３４０（５’－ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣ－３’：配列番号１３）、及びＣＭＶ－ＤＥＴ－３－３４０（５’－ＧＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣ－３’：配列番号１４）を使用し、マニュアルに従ってＰＣＲを行った。また、内部標準遺伝子としてＮｂ－Ｌ２３－５－１１０（５’－ＡＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴ－３’：配列番号１５）、及びＮｂ－Ｌ２３－３－１１０（５’－ＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＡＣＣ－３’：配列番号１６）のプライマーを使用した。
　結果を図２に示す。ＶＩＧＳにより各ＡＴＧ５～８のそれぞれ１つをノックダウンした結果、４つ全てのＡＴＧ遺伝子について、ＶＩＧＳ誘導によるＣＭＶベクターの蓄積レベルは、ＶＩＧＳ誘導をしない対照（ＣＭＶ－Ａ１）に比べて２～６０倍に増大した。特に、ＡＴＧ８で最も増大効果が高いとの結果が得られた。
　このことから、ＡＴＧ５～８について発現を抑制することで、ＣＭＶウイルスベクター量を向上可能であることが示された。
・実験２　ＡＴＧ ＫＤ植物体（２）
　上記の実験１において、上記４種のＡＴＧ遺伝子のいずれのＶＩＧＳによるＫＤであっても、ＣＭＶベクターの蓄積量が向上したことから、ＡＴＧ６及びＡＴＧ８について、新たなＫＤ植物体の作出に着手した。ＡＴＧ遺伝子の部分断片を逆向き且つ隣り合わせに繋いだ（インバーテッドリピート）配列を３５Ｓプロモーター下に組み込んだバイナリーベクター（３５Ｓ：ＡＴＧ６－ＩＲ、及び３５Ｓ：ＡＴＧ８－ＩＲ）を構築した（図３）。
　これらのバイナリーベクターによりベンサミアナタバコを形質転換すると、インバーテッドリピート配列を持つＲＮＡが細胞内で恒常的に発現し、分子内で２本鎖ＲＮＡを形成してＡＴＧ遺伝子に対するＲＮＡｉが誘導され、オートファジー抑制植物を作出することが出来る。恒常的なオートファジー抑制による植物の成長や稔性の阻害の可能性を回避するために、３５ＳプロモーターとＤＥＸやＨＳＰなど誘導型プロモーターとを入れ換えたバイナリーベクターも構築可能である。
・実験２－１　ＡＴＧ６ ＫＤ植物体の作製と、ＣＭＶベクターによるＩＬＲａの製造（ＡＴＧ６ ＫＤ植物体の作製と発現低下の確認）
　ＡＴＧ６遺伝子のクローニングのため、ａｔｔＢ配列をもつＡＴＧ６-ａｔｔＢ１（５’－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴｇａｇｃａａｃｃｇｔｔｇｔｇｔｃｔｔｇａａｔｇｃ－３’：配列番号１７）及びＡＴＧ６－ａｔｔＢ２（５’－ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴｇｇｃａａｇｃｔｔｇｇｃｃｃｃａｔｇｃｔｇｃ－３’：配列番号１８）のオリゴＤＮＡを合成し、これらをプライマーとして、ベンサミアナタバコｃＤＮＡを鋳型に、ＰＣＲによって２本鎖ＤＮＡを得た。増幅したＤＮＡ断片をマニュアルに従い、ｐＢＩ－ｓｅｎｓｅ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＧＷ－ＧＦＰ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｐｌａｎｔａ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）に組み込み、ＡＴＧ６－ＫＤコンストラクトとした。
　これを常法に従ってアグロバクテリウムに組み込み、ベンサミアナタバコを形質転換し、ＡＴＧ６ ＫＤ植物体を得た。
　ＡＴＧ６の発現低下の確認のため、形質転換ベンサミアナタバコの葉より、ＴＲＩｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用し、マニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。
　抽出したＲＮＡから、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ製）を使用したのち、ＡＭＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ製）によって、マニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。
　合成したｃＤＮＡを鋳型に、Ｐｏｗｅｒ　Ｕｐ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、ＡＴＧ６　ｍＲＮＡ量を測定し、ＡＴＧ６の発現レベルを解析した。ＡＴＧ６のｃＤＮＡ断片を増幅するプライマーとしてＡＴＧ６－５－Ｆ（５’－ＣＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＧ－３’：配列番号１９）、及びＡＴＧ６－３－Ｒ（５’－ＴＧＣＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＣＧＡＣＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＣＡ－３’：配列番号２０）を使用し、マニュアルに従ってＰＣＲを行った。また、内部標準遺伝子としてＮｂ－Ｌ２３－５－１１０（５’－ＡＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴ－３’：配列番号１５）、及びＮｂ－Ｌ２３－３－１１０（５’－ＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＡＣＣ－３’：配列番号１６）のプライマーを使用した。
（ＩＬＲａ発現ＣＭＶベクターの構築）
　目的タンパク質としては、ヒトインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬＲａ）を選定した。ＩＬＲａは、炎症性サイトカインを阻害する作用を有し、抗リュウマチ薬としても使用されている有用タンパク質である。
　ＩＬＲａタンパク質をコードする読み枠ＯＲＦ配列（ＮＣＢＩ　ＮＭ＿１７３８４１）をクローニングするため、５’末端及び３’末端にそれぞれＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトをＰＣＲにより付加した。これをＣＭＶ－Ｈ１ベクター(Matsuo et al. Planta 225, 277-286, 2007)の感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ。
（ウイルスベクターの接種方法）
　上記の実験１の場合と同様、ＩＬＲａの遺伝子配列を持つＣＭＶ－Ｈ１ベクター（ＲＮＡ２）をＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写した。これをＣＭＶ－Ｙ　ＲＮＡ１感染性クローンｐＣＹ１及びＲＮＡ３感染性クローンｐＣＹ３よりｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡ１及びＲＮＡ３と混合し、ベンサミアナタバコに機械接種した。接種７日後に感染葉からＲＮＡを抽出し、ＣＭＶ－Ｈ１ベクターの発現を確認したのち、これを接種源とした。
　ＡＴＧ６ ＫＤ植物体に、ＩＬＲａをコードするポリヌクレオチドを搭載したＣＭＶベクターを接種し、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物を得た。
（ＩＬＲａの検出）
　ＩＬＲａ発現ＣＭＶの感染組織におけるＩＬＲａを検出した。検出は、常法に従いウェスタンブロッティングで行った。ＩＬＲａの検出用に抗ＩＬＲａモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．製）を用いた。また、ウイルスタンパク質の検出には、抗ＣＭＶ　ＣＰポリクローナル抗体（植物防疫協会製）を用いた。
　結果を図４に示す。接種５日後の感染上葉におけるＩＬＲａの蓄積量を、ウェスタンブロッティングにより比較解析した（図４：Ａ）。ＣＰは、ＣＭＶの外被タンパク質を示し、ＲｂｃＬはルビスコラージサブユニットを示す。解析の結果、ＡＴＧ６ノックダウン植物体では、非形質転換植物体に比べて、ＩＬＲａの蓄積量が平均して７．２倍向上していた（図４：Ｂ）。ＡＴＧ６ ＫＤ植物体で、ＡＴＧ６遺伝子の発現レベルが低下していることを定量ＰＣＲで確認した（図４：Ｃ）。
　このことから、ＡＴＧ６の発現を抑制することで、目的タンパク質であるＩＬＲａの生産量を向上可能であることが示された。
・実験２－２　ＡＴＧ８ ＫＤ植物体の作製と、ＣＭＶベクターによるαＦＧＦの製造
　ＡＴＧ８遺伝子のクローニングのため、ａｔｔＢ配列をもつＡＴＧ８－ａｔｔＢ１（５’－ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＧ－３’：配列番号２１）及びＡＴＧ８－ａｔｔＢ２（５’－ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＡＡＡＴＴＧＣＣＣＣＡＣＡＧ－３’：配列番号２２）のオリゴＤＮＡを合成し、これらをＰＣＲによって２本鎖にした。
　増幅したＤＮＡ断片をマニュアルに従い、ｐＤＯＮＲ２２１　ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）さらにｐＢＩ－ｓｅｎｓｅ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＧＷ－ＧＦＰ　Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｐｌａｎｔａ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ製）に組み込み、ＡＴＧ８－ＫＤコンストラクトとした。
　得られたベクターを常法に従ってアグロバクテリウムに組み込み、ベンサミアナタバコに形質転換を行い、ＡＴＧ８ ＫＤ植物体を得た。
　形質転換ベンサミアナタバコの葉より、ＴＲＩｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用し、マニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｔａｋａｒａ製）を使用したのち、ＡＭＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ製）によってマニュアルに従いｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型にＰｏｗｅｒ　Ｕｐ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、ＡＴＧ８　ｍＲＮＡ量を測定し、ＡＴＧ８の発現レベルを解析した。ＡＴＧ８を増幅するプライマーとしてＡＴＧ８－５－１３４（５’－ＡＣＧＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＣＧＴＡＡＧＡＧＡＡ－３’：配列番号２３）、及びＡＴＧ８－３－１３４（５’－ＡＧＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＴＣＣＴ－３’：配列番号２４）を使用し、マニュアルに従ってＰＣＲを行った。また、内部標準遺伝子としてＮｂ－Ｌ２３－５－１１０（５’－ＡＡＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴ－３’：配列番号１５）、Ｎｂ－Ｌ２３－３－１１０（５’－ＧＣＡＴＣＧＴＡＧＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＡＣＣ－３’：配列番号１６）のプライマーを使用した。
　結果を図５に示す。ＡＴＧ８のＫＤラインを３ライン作出することができた。
　各ラインの無菌培養から鉢上げして外の培養棚で馴化した形質転換体初代（Ｔ０）植物体の新葉３枚からＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲによりＡＴＧ８遺伝子の発現レベルを対照の野生型ベンサミアナタバコと比較した。馴化後１週間後および５週間後の、植物体間で比較したところ、野生型でＡＴＧ８遺伝子の発現レベルが上がる５週間後であっても、ＡＴＧ８ノックダウンラインでＡＴＧ８遺伝子の発現レベルが低く抑えられていた。
（αＦＧＦ発現ＣＭＶベクターの構築）
　目的タンパク質として、酸性線維芽細胞増殖因子（αＦＧＦ）を選定した。αＦＧＦは、炎症性サイトカインを阻害する作用を有し、抗リュウマチ薬としても使用されている有用タンパク質である。
　αＦＧＦタンパク質をコードする読み枠ＯＲＦ配列（ＮＣＢＩ　Ｘ６５７７８）をクローニングするため、５’末端及び３’末端にそれぞれＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトをＰＣＲにより付加した。これをＣＭＶ－Ｈ１ベクター(Matsuo et al. Planta 225, 277-286, 2007)の感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ。
　ＡＴＧ８　ＫＤ植物体に、αＦＧＦを搭載したＣＭＶベクターを接種し、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物を得た。
（αＦＧＦの検出）
　αＦＧＦ発現ＣＭＶの感染組織におけるαＦＧＦを検出した。検出は、常法に従いウェスタンブロッティングで行った。αＦＧＦの検出用に抗αＦＧＦモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
　結果を図６に示す。接種５日後の感染上葉におけるαＦＧＦの蓄積量を、ウェスタンブロッティングにより比較解析した（図６：Ａ）。ＣＢＢ染色はＲｂｃＬ（ルビスコラージサブユニット）を示す。解析の結果、ＡＴＧ８ノックダウン植物体で、非形質転換植物体に比べてαＦＧＦの蓄積量が、平均して８．２５倍向上していた（図６：Ｂ）。
　このことから、ＡＴＧ８の発現を抑制することで、目的タンパク質のαＦＧＦの生産量を向上可能であることが示された。
・実験２－３　ＡＴＧ８ ＫＤ植物体における、アグロインフィルトレーションによるαＦＧＦ発現
　αＦＧＦタンパク質をコードする読み枠ＯＲＦ配列（ＮＣＢＩ　Ｘ６５７７８）を、バイナリーベクターｐＢＥ２１１３の制限酵素サイトに常法で組込んだ。構築したｐＢＥ２１１３－αＦＧＦでアグロバクテリウムＬＢ４４０４株を形質転換した。
　形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、３つのＡＴＧ８ ＫＤ植物体の全体にインフィルトレーションし、αＦＧＦを一過発現させた。インフィルトレーションの５日後に葉を採取し、生理食塩水（ＰＢＳ）中で破砕し、可溶性タンパク質を含む破砕液を得た。破砕液を遠心分離することにより、不溶性タンパク質を沈殿させて除去した可溶性タンパク質水溶液を試料として、常法によりウェスタンブロッティングを行い、可溶性のαＦＧＦ（すなわち、活性を有するαＦＧＦ）の蓄積量を評価した。
　αＦＧＦの検出には、抗αＦＧＦモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
　ウェスタンブロッティングの結果を図１３に示す。図１３の右端のレーンは、ＦＧＦ１を３００ｎｇ含む標準試料を示す。ＡＴＧ８ ＫＤ植物体では、非形質転換植物体（ＷＴ）に比べて可溶性のαＦＧＦの蓄積レベルが、平均して２．９２倍向上しており、有用タンパク質の生産が充分に行えた。
　標準試料のバンドの濃度と比較して算出した、ＡＴＧ８　ＫＤ植物体の葉から回収した試料に含まれる可溶性αＦＧＦの量は、約１６２.４ｎｇであった。非形質転換植物体（ＷＴ）の葉から回収した試料に含まれる可溶性αＦＧＦの量は、約５０．４９ｎｇであった。
・実験３　ＡＴＧ ＫＯ植物体
・実験３－１　ＡＴＧ７ ＫＯ植物体の作製と、ＣＭＶベクターによるＩＬＲａの製造
　ＡＴＧ７遺伝子について、ゲノム編集（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を利用してＫＯ植物を作出した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では、２本鎖ＤＮＡを切断するＣａｓ９タンパク質とＣａｓ９をターゲット遺伝子に導くガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同時に細胞内で発現することで、Ｃａｓ９で切断後の修復時の変異によりターゲットタンパク質をノックアウトすることが出来る。
　ベンサミアナタバコは、ＡＴＧ７遺伝子を２つ持っており（ＡＴＧ７ａとＡＴＧ７ｂ）、これら両方の遺伝子をゲノム編集ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりノックアウトした。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のバイナリーベクターの作製は、基本的に常法（Osmani et al., Methods Mol Biol 2028, 153-165, 2019）に従った。
　ただし、ゲノム編集の効率を上げるために、Ｘｉｅらの方法（PNAS 112, 3570-3575, 2015）に従い、ガイドＲＮＡと骨格ＲＮＡ、ｔＲＮＡの配列をタンデムに繋ぎ、同じ細胞内でＡＴＧ７に対して３種類のガイドＲＮＡ（ＡＴＧ７－ｇＲＮＡ１：５’－ＡＵＣＵＡＵＵＣＡＡＧＧＵＧＧＧＧＣＣＵＵＧＧ－３’：配列番号２５，ＡＴＧ７－ｇＲＮＡ２：５’－ＧＡＧＡＣＵＵＵＣＡＡＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＧＧ－３’：配列番号２６，ＡＴＧ７－ｇＲＮＡ３：５’－ＵＧＡＵＧＡＧＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＡＧＡＧＧ－３’：配列番号２７）が同時に発現するようにｐＺＫ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ＿ＦＦＣａｓ９＿ＮＰＴＩＩを改変してバイナリーベクターを構築した。このようにして、ＡＴＧ７遺伝子に対して３つのガイドＲＮＡを設計し、それらをＣａｓ９と共に１細胞内で同時に発現するバイナリーベクターを構築して、確実にＡＴＧ遺伝子のノックアウトが出来るように工夫した。
　アグロバクテリウムＬＢ４４０４系統に構築したバイナリーベクターを導入し、上記のＡＴＧ ＫＤ植物体の作出と同様の方法で、ベンサミアナタバコの形質転換体を作出した。
　解析の結果、ＡＴＧ７ａ及びＡＴＧ７ｂ遺伝子のガイドＲＮＡ、ＡＴＧ７－ｇＲＮＡ２とＡＴＧ－ｇＲＮＡ３のターゲット領域で１塩基挿入や１塩基欠損等の変異導入が確認された。いずれも、ＡＴＧ７タンパク質の翻訳において、フレームシフトを伴う変異であることから、タンパク質機能が著しく損なわれるノックアウト変異であると考えられ、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体を得ることができた。
　ＡＴＧ７の遺伝子座（ＡＴＧ７ａおよびＡＴＧ７ｂ）の配列にもゲノム編集による変異が認められ、それらをホモに持つＡＴＧ７ ＫＯ植物体が得られた。
　ＡＴＧ７ ＫＯ植物体のＡＴＧ７の変異箇所は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第４７７番目以降のフレームシフトが生じる変異であった。
　上記の実験２－１と同様にして、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体にＩＬＲａをコードするポリヌクレオチドを搭載したＣＭＶベクターを接種し、ＩＬＲａの蓄積量をウェスタンブロッティングにより比較した。
　結果を図７に示す。ＡＴＧ７ ＫＯ植物（Ｔ１世代）で、接種５日後の感染上葉におけるＩＬＲａの蓄積量を、ウェスタンブロッティングにより比較解析した（図７：Ａ）。ＣＰは、ＣＭＶの外被タンパク質を示し、ＲｂｃＬはルビスコラージサブユニットを示す。
　Ｈは、ウイルスを接種していない非形質転換ベンサミアナタバコ陰性対照サンプルを示す。解析の結果、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体で、非形質転換植物体に比べてＩＬＲａの蓄積量が平均して５．２倍向上していた（図７：Ｂ）。
　図８に、Ｔ１世代から選抜したＴ２世代での結果を示す。ＡＴＧ７ａおよびＡＴＧ７ｂの両方のノックアウト植物体で、ＩＬＲａの蓄積量の増大が確認できた。また、地上部生重量はやや減少の傾向がみられたものの、統計的な有意差は無く、生育状態も良好であった。
　以上のことから、ＡＴＧ７遺伝子を破壊することで、目的タンパク質のＩＬＲａの生産量を向上可能であることが示された。
　ＣＭＶ ＣＰ蓄積量は、統計的に有意に増加しており、ＩＬＲａの蓄積量の増大には、ＩＬＲａのタンパク質の安定化と、ＣＭＶベクターの量の向上との両方が貢献していると考えられた。
・実験３－２　ＡＴＧ５ ＫＯ植物体の作製と、ＣＭＶベクターによるＩＬＲａの製造
　ＡＴＧ５遺伝子について、上記のＡＴＧ７遺伝子の場合と同様の方法でゲノム編集により変異を導入した。
　ベンサミアナタバコは、ＡＴＧ５遺伝子を２つ持っており（ＡＴＧ５ａとＡＴＧ５ｂ）、これら両方の遺伝子をゲノム編集ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法によりノックアウトした。
　ただし、ゲノム編集の効率を上げるために、Ｘｉｅらの方法（PNAS 112, 3570-3575, 2015）に従い、ガイドＲＮＡと骨格ＲＮＡ、ｔＲＮＡの配列をタンデムに繋ぎ、同じ細胞内でＡＴＧ５に対して３種類のガイドＲＮＡ（ＡＴＧ５－ｇＲＮＡ１：５’－ＣＣＵＧＵＵＧＡＧＡＵＵＣＡＵＧＧＡＧＡＵＧＧ－３’：配列番号２８，ＡＴＧ５－ｇＲＮＡ２：５’－ＧＣＵＵＣＵＧＣＣＧＧＡＧＣＵＧＵＵＵＧＧＧＧ－３’：配列番号２９，ＡＴＧ５－ｇＲＮＡ３：５’－ＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧ－３’：配列番号３０）が同時に発現するようにｐＺＫ＿ＡｔＵ６ｇＲＮＡ＿ＦＦＣａｓ９＿ＮＰＴＩＩを改変してバイナリーベクターを構築した。このようにして、ＡＴＧ５遺伝子に対して３つのガイドＲＮＡを設計し、それらをＣａｓ９と共に１細胞内で同時に発現するバイナリーベクターを構築して、確実にＡＴＧ遺伝子のノックアウトが出来るように工夫した。
　アグロバクテリウムＬＢ４４０４系統に構築したバイナリーベクターを導入し、上記のＡＴＧ ＫＤ植物体の作出と同様の方法で、ベンサミアナタバコの形質転換体を作出した。
　解析の結果、ＡＴＧ５ａ及びＡＴＧ５ｂ遺伝子のガイドＲＮＡ、ＡＴＧ５－ｇＲＮＡ１からＡＴＧ－ｇＲＮＡ３のターゲット領域で変異導入が確認された。いずれも、ＡＴＧ５タンパク質の翻訳において、フレームシフトを伴う変異であることから、タンパク質機能が著しく損なわれるノックアウト変異であると考えられ、ＡＴＧ５ ＫＯ植物体を得ることができた。
　ＡＴＧ５の遺伝子座（ＡＴＧ５ａおよびＡＴＧ５ｂ）の配列にもゲノム編集による変異が認められ、それらをホモに持つＡＴＧ５ ＫＯ植物体が得られた。
　ＡＴＧ５ ＫＯ植物体のＡＴＧ５の変異箇所は、配列番号３で表されるアミノ酸配列の第２５５番目以降のフレームシフトが生じる変異であった。
　上記の実験２－１と同様にして、ＡＴＧ５ ＫＯ植物体にＩＬＲａをコードするポリヌクレオチドを搭載したＣＭＶベクターを接種し、ＩＬＲａの蓄積量をウェスタンブロッティングにより比較した。
　結果を図９に示す。ＡＴＧ５ ＫＯ植物（Ｔ１世代）で、接種５日後の感染上葉におけるＩＬＲａの蓄積量を、ウェスタンブロッティングにより比較解析した（図９：Ａ）。ＣＭＶ　ＣＰは、ＣＭＶの外被タンパク質を示し、ＣＢＢ染色はＲｂｃＬ（ルビスコラージサブユニット）を示す。解析の結果、ＡＴＧ５ ＫＯ植物体で、非形質転換植物体に比べてＩＬＲａの蓄積量が平均して２４．４倍向上していた（図９：Ｂ）。
　以上のことから、ＡＴＧ５遺伝子を破壊することで、目的タンパク質のＩＬＲａの生産量を向上可能であることが示された。
・実験３－３　ＡＴＧ７ ＫＯ植物体における、ＣＭＶベクターによるＧＦＰ発現
　上記で得たＡＴＧ７－ＫＯ植物体にＧＦＰを発現させるＣＭＶベクターを接種した。結果を図１０に示す。対照の非形質転換体にも死細胞に由来する蛍光がみられたが、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体では頂葉部でＣＭＶがより広く移行していることが確認された。
・実験３－４　ＡＴＧ７ ＫＯ植物体における、ＣＩＹＶＶベクターによるＧＦＰ発現
　ＣＭＶに代えてクローバ葉脈黄化ウイルス（ＣｌＹＶＶ）ベクターを接種した。ＧＦＰ発現クローバ葉脈黄化ウイルスベクター（ＣｌＹＶＶ－ＧＦＰ）は、既報（Masuta et al., Plant J 23, 539-546, 2000）で作製されたものを用い、接種方法も既報に従った。
　結果を図１１に示す。接種１４日後の感染上葉におけるＧＦＰ蛍光を検出し（図１１：Ａ）、ＧＦＰ蓄積量をウェスタンブロッティングにより比較解析した（図１１：Ｂ）。ＨＣ－Ｐｒｏは、ＣｌＹＶＶのヘルパーコンポーネントプロテアーゼを示し、ＣＰは、ＣｌＹＶＶの外被タンパク質を示し、ＲｂｃＬはルビスコラージサブユニットを示す。上記ウイルスタンパク質の検出には、抗ＣｌＹＶＶ　ＣＰポリクローナル抗体、抗ＣｌＹＶＶ　ＨＣ－Ｐｒｏモノクローナル抗体を用いた。Ｈは、ウイルスを接種していない非形質転換ベンサミアナタバコ陰性対照サンプルを示す。解析の結果、ＡＴＧ７ ＫＯ植物体では、非形質転換植物体に比べて、矢印で示した上葉での著しく強いＧＦＰ蛍光が観察され、ＧＦＰの蓄積量が平均して７２．８倍向上していた。ウイルスタンパク質である、ＨＣ－Ｐｒｏおよび外被タンパク質（ＣＰ）についてもＡＴＧ７ ＫＯ植物体で蓄積量が著しく増大していたことから、ＣｌＹＶＶベクター量の向上が、ＧＦＰタンパク質の蓄積量増大に貢献したと考えられる。
・実験３－５　ＡＴＧ５ ＫＯ植物体における、アグロインフィルトレーションによるαガラクトシダーゼ（αＧａｌ）発現
　αガラクトシダーゼ（αＧａｌ）を発現する読み枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）の３’末端にＦｌａｇタグを付加し、バイナリーベクターｐＢＥ２１１３の制限酵素サイトＢａｍＨＩとＳａｃＩの間に組込んだ。構築したｐＢＥ２１１３－αＧａｌ－ＦｌａｇでアグロバクテリウムＬＢ４４０４株を形質転換して、アグロインフィルトレーションによるαＧａｌの一過発現に用いた。構築したαＧａｌ－Ｆｌａｇの配列を配列番号３１に示す。
　αＧａｌとＧＦＰの共発現は、上記の形質転換アグロバクテリウム培養液とＧＦＰ遺伝子を組込んだｐＩＧ１２１－ＧＦＰ(Yambao et al., Archives of Virology 153. 105-115, 2008)で形質転換したアグロバクテリウムの培養液を混合して、葉にインフィルトレーションすることで行った。
　αＧａｌとＧＦＰの蓄積量の比較はウェスタンブロッティングで検出して行った。両タンパク質の検出には、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（１Ｅ６クローン、富士フイルム和光純薬製）と抗ＧＦＰポリクローナル抗体（ＭＢＬライフサイエンス製）とを用いた。
　このように、ウイルスベクターではなくアグロバクテリウム菌体液をインフィルトレーションにより葉に注入してαＧａｌとＧＦＰを共発現させた。
　結果を図１２に示す。ＡＴＧ５ ＫＯ植物体では、非形質転換植物体に比べてαＧａｌの蓄積レベルが１０倍以上向上していた。
　αＧａｌは分解されやすく、植物で発現させることが難しいことが知られているが、ＡＴＧ５　ＫＯによりオートファジーを抑制することで、蓄積量を向上させることが可能であった。このように、オートファジー系が抑制された植物では、従来では生産の難しかった有用タンパク質の生産を可能に出来る場合があることが示された。
・実験３－６　ＡＴＧ７ ＫＯ植物体における、アグロインフィルトレーションによるαＦＧＦ発現
　上記の実験２－３と同様にして、αＦＧＦをコードするバイナリーベクターｐＢＥ２１１３－αＦＧＦを用い、アグロバクテリウムＬＢ４４０４株を形質転換した。その培養液を３つのＡＴＧ７ ＫＯ植物体の全体にインフィルトレーションし、αＦＧＦを一過発現させた。
　各植物体の葉における可溶性のαＦＧＦの蓄積量をウェスタンブロッティングで検出した結果を図１３に示す。ＡＴＧ７ ＫＯ植物体では、非形質転換植物体に比べて可溶性のαＦＧＦの蓄積レベルが、平均して１．９５倍向上しており、有用タンパク質の生産が充分に行えた。
　標準試料のバンドの濃度と比較して算出した、ＡＴＧ７　ＫＯ植物体の葉から回収した試料に含まれる可溶性αＦＧＦの量は、約１１３．２ｎｇであった。非形質転換植物体（ＷＴ）葉から回収した試料に含まれる可溶性αＦＧＦの量は、約５０．４９ｎｇであった。
　各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

Claims (20)

  1. 　目的タンパク質をコードする核酸断片が導入された植物に、目的タンパク質を製造させる製造工程を含み、
    　前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である、タンパク質の製造方法。
  2. 　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
    　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項２に記載の製造方法。
    　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
  4. 　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を、植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムを介して前記植物に導入する導入工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記製造工程の後に、前記植物から前記目的タンパク質を回収する回収工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記植物がタバコ属植物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　請求項１に記載の製造方法に使用される、オートファジー系が抑制された植物。
  9. 　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
    　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、請求項８に記載の植物。
  10. 　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項９に記載の植物。
    　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
  11. 　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片、又は前記核酸断片から発現した前記目的タンパク質を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の植物。
  12. 　前記目的タンパク質をコードする前記核酸断片を有する植物ウイルスベクター及び／又はアグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ領域を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の植物。
  13. 　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の植物。
  14. 　タバコ属植物である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の植物。
  15. 　目的タンパク質をコードする核酸断片を有する植物ウイルスベクターを含む植物に、前記植物ウイルスベクターを複製させる製造工程を含み、
    　前記植物が、オートファジー系が抑制された植物である、植物ウイルスベクターの生産方法。
  16. 　前記植物が、オートファジー関連遺伝子の機能が抑制若しくは欠損されている植物、又はオートファジー関連遺伝子の発現が抑制若しくは喪失されている植物であり、
    　前記オートファジー関連遺伝子が、ＡＴＧ６遺伝子、ＡＴＧ７遺伝子、ＡＴＧ５遺伝子、及びＡＴＧ８遺伝子からなる群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子を含む、請求項１５に記載の生産方法。
  17. 　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ６遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ６遺伝子が、下記（ａ１）～（ｃ１）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ７遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ７遺伝子が、下記（ａ２）～（ｃ２）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ５遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ５遺伝子が、下記（ａ３）～（ｃ３）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、
    　（ａ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ３）配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　前記オートファジー関連遺伝子が前記ＡＴＧ８遺伝子を含む場合、前記ＡＴＧ８遺伝子が、下記（ａ４）～（ｃ４）のいずれか一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項１６に記載の生産方法。
    　（ａ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
    　（ｂ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
    　（ｃ４）配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を有し、オートファジー系における活性を有するタンパク質
  18. 　前記核酸断片を、前記植物ウイルスベクターを介して前記植物に導入する導入工程を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の生産方法。
  19. 　前記目的タンパク質が、医療用タンパク質を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の生産方法。
  20. 　前記植物がタバコ属植物である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の生産方法。
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