CN112877302A - 一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列；所插入的烟草花叶病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明的双价弱毒疫苗是将CMV_Fny分离物的突变型RNA2与含有CMV_Fny分离物RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的危害。本发明的双价弱毒疫苗对CMV和TMV具有交叉保护效果；为田间防治CMV和TMV引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

Description

一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗及其在防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒中的应用。

背景技术

病毒病是仅次于真菌病的第二大类植物病害，对绝大部分作物均造成不同程度的危害，植物病毒病的防治是研究热点及难点问题。黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(Mochizuki etal.,2012)。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是危害烟草、番茄和马铃薯的主要病毒，侵染烟草可引起花叶及疱斑等症状，严重影响烟叶产量及品质(姜翰林等，2018)。

在自然界中，不同病毒侵染同一寄主植物后有时会加重病毒病的症状，这种现象叫做协生作用。植物病毒协生现象在自然界广泛存在，黄瓜花叶病毒与烟草花叶病毒复合侵染造成的危害更大，因此，设计能够兼抗两种病毒的策略尤为重要。

对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

一种弱毒突变体只能用来防治对应的强病毒，如果想同时防治不同的病毒，就需要几种不同类型的弱毒突变体。但可以通过在一个骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应的病毒的效果，这种突变型病毒就是多价弱毒疫苗。以黄瓜花叶病毒为基础病毒载体，能够兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种兼抗CMV和TMV的双价弱毒疫苗，为田间防治CMV和TMV引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列；所插入的烟草花叶病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

(1)以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ；所述中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ是2661位之后插入TAATAG，然后再依次引入BamH I、SpeI和Sma I酶切位点；

(2)利用酶切和连接方法将SEQ ID NO.1所示的烟草花叶病毒的保守序列插入到中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ中，即构建得到兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双联弱毒疫苗pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉。

(3)将构建得到兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉与含有CMV_Fny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种。

本发明的第三方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗在防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒中的应用。

本发明的第四方面，提供一种防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的方法，包括以下步骤：

兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的CMV_Fny分离物的突变型RNA2与含有CMV_Fny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种。

本发明的有益效果：

(1)对于获得的黄瓜花叶病毒RNA2的2b蛋白提前终止型突变体pCC_FR2-2bPTⅡ，本发明进一步在新的终止密码子后插入TMV保守片段，得到含有TMV片段的黄瓜花叶病毒RNA2的2b蛋白提前终止型突变体，该质粒与含有CMV_Fny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防CMV和TMV强毒株系的侵染，可作为兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗。

(2)本发明提供的突变型质粒中插入的TMV基因片段，是长度为200bp的TMV基因组保守序列，对多种TMV分离物均具有防治的潜力。

附图说明

图1：基础载体pCB301-CMV_Fny-R2、中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ、含TMV的弱毒突变体pCC_FR2-2bPTII-TM₂₀₇₉示意图；图中，LB，T-DNA left border(LB)；RB，T-DNA right border(RB)；35S，promoter(from gene 2x35S)；RZ，ribozyme(HDV-RZ)；NOS，terminator(NOSterminator)。

图2：中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000分子量标准，酶切后片段约为7.6kb。

图3：质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的酶切鉴定结果电泳示意图；其中M为Tiangen公司的D15000+2000，酶切后得到中间载体和200bp插入的TMV片段。

图4：质粒pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉中含有的TMV序列与TMV(NCBI登录号MH595921)序列的比对。

图5：pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉在本生烟上弱致病症状；mock，空的农杆菌菌液；R1，CMV_Fny RNA1；R2，CMV_Fny RNA2；R3，CMV_Fny RNA3；pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉,含有CMV_Fny RNA2全序列，并在2b蛋白提前终止密码子后插入TMV的200bp保守序列。

图6：pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的TMV插入片段在植物体内的稳定性检测；其中M为Tiangen公司的D2000分子量标准；mock，空的农杆菌菌液；R2，CMV_Fny RNA2；R2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉，含有CMV_Fny RNA2全序列，并在2b蛋白提前终止密码子后插入TMV的200bp保守片段。

图7：pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉对TMV和CMV的交叉保护效果；mock，空的农杆菌菌液。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，能够兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。与单价弱毒疫苗相比，在构建双价弱毒疫苗时需要插入异源病毒的片段，既要保证插入一定长度的片段以有效引发对异源病毒的基因沉默效果，同时还要保证弱毒突变体中插入片段的稳定性，因此，双价弱毒疫苗的构建难度更大。

本发明的兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗是以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为基础载体，在基础载体中CMV_Fny RNA2的全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列。

对于本发明的兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗构建而言，其难度主要在于对基础载体的改造以及插入序列的选择。其中：对于基础载体的改造，发明人在前期研究(CN108486148A)中以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板，利用反向PCR扩增方法，获得2b蛋白提前终止的中间载体pCB301-CMV_Fny2-del2b，即在紧邻2a蛋白终止密码子后的2661位和2662位间插入含BamH I、SpeI和Sma I的多克隆位点及TAATA序列。在后续进一步的研究中发现，采用这种改造策略，中间载体中新插入的序列则会在核苷酸和氨基酸水平同时起作用，其中氨基酸水平的作用则可能涉及到2b延长蛋白型蛋白质序列和三级结构的变化，导致疫苗效果的可控性低。

基于此，本发明对黄瓜花叶病毒2b蛋白编码基因的改造策略进行了改进，本发明的中间载体是2661位先插入TAATAG，然后依次引入BamH I、SpeI和Sma I酶切位点，采用本发明的这种设计，可保证所插入序列只在核苷酸水平起作用，所制备的疫苗效果的可控性更强。所引入的克隆位点BamH I、Spe I和Sma I，主要是为不同类型片段插入到载体中准备的。可以使用任意的两个酶切位点的组合导入外源插入片段，所以有必要设计3个酶切位点，方便不同外源序列的插入。

对于插入序列的选择，烟草花叶病毒的基因组序列本身是比较长的，由于病毒对自身尺寸存在包装限制，在构建多价弱毒疫苗时，对插入的外源病毒片段具有长度限制。因此，不可能将烟草花叶病毒的全长序列导入，这就需要从烟草花叶病毒基因组中筛选合适的序列作为外源基因片段导入，所导入的外源基因片段需要保证有效性和稳定性。因此，选择何种序列作为烟草花叶病毒的插入序列十分关键。经反复优化筛选，本发明最终选取了长度为200bp的烟草花叶病毒基因序列作为插入序列，如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

GAGGAGATAGAGTCTTTAGAGCAGTTTCATATGGCAACGGCAGATTCGTTAATTCGTAAGCAGATGAGCTCGATTGTGTACACGGGTCCGATTAAAGTTCAGCAAATGAAAAACTTTATCGATAGCCTGGTAGCATCACTATCTGCTGCGGTGTCGAATCTCGTCAAGATCCTCAAAGATACAGCTGCTATTGACCTTGA。

采用SEQ ID NO.1所示序列作为插入序列，其一方面能够有效保持烟草花叶病毒的侵染性能；另一方面，接种后能够在植物体内稳定存在。

在本发明的一个优选实施方案中，给出了黄瓜花叶病毒(CMV_Fny)RNA2突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的构建方法，具体如下：

(1)TMV部分片段的克隆：根据GenBank中公布的4种不同株系TMV全序列(登录号：MH595921，NC001367，AF395128，MK087763)，利用DNAMAN软件进行序列比对，发现其序列保守的区域并设计引物TMV-BamHI-2079-F和TMV-SmaI-2278-R(详细信息见表1)。提取受TMV侵染烟草的植物总RNA，利用RT-PCR扩增对应于TMV基因组2079-2278位的200bp片段。

表1：本发明中用到的引物

注：保护碱基用粗体表示，酶切位点用下划线表示，非病毒序列用斜体表示。

(2)pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的构建：分别利用BamH I和Sma I双酶切pCC_FR2-2bPTⅡ以及TMV200bp片段，然后经胶回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉。

所述质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉中含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

注：小写字母为CMV_FnyRNA2序列；大写字母为引入的外源片段，加粗表示终止密码子，斜体表示酶切位点，下划线表示插入的TMV(NCBI登录号MH595921)的2079-2278位片段。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

实施例1.pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉构建：

(1)TMV部分片段的克隆：利用TransZol(TransGen)提取受TMV侵染的本氏烟植物总RNA，在Reverse Transcriptase M-MLV(Takara)作用下，进行反转录反应，反向引物为TMV-SmaI-2278-R，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h。再以反转录产物cDNA为模版，在2×Taq MasterMix(Vazyme)作用下，进行PCR反应，引物对为TMV-BamHI-2079-F和TMV-SmaI-2278-R；PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，52℃退火15s，72℃延伸12s，30个循环；72℃延伸5min；12℃保存；PCR产物为TMV中200bp保守序列片段。对PCR产物经DNA回收试剂盒回收后备用。

(2)中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ的构建：以CMV_Fny侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板(CMV_Fny侵染性克隆质粒pCB301-Fny2的构建参照“农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体的构建”，姚敏等，中国农业科学，2011,44(14)：3060-3068)，在PrimeSTAR HS DNAPolymerase(Takara)作用下，进行反向PCR扩增，引物对为Fny2-2bPT 3'-BSS-2662-F和Fny2-2bPT 3'-BT-2661-R；PCR条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min，7个循环；98℃变性10s，68℃延伸8min，25个循环；4℃保存；扩增得到的PCR产物即为线性化中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ。

利用Dpn I(NEB)降解PCR反应中的质粒模板pCB301-CMV_Fny-R2，反应条件为：37℃，1h；80℃，20min；产物利用无水乙醇沉淀法进行回收：将产物加入ddH₂O至450μl，加入50ulpH5.2 3.0mM醋酸钠，1ml无水乙醇，-80℃沉淀2h，常温12000rpm，离心10min，将液体倒掉，加入600μl 70％乙醇，常温12000rpm，离心5min，将液体倒掉，常温12000rpm，离心1min后将离心管内液体吸净，加入ddH₂O 30μl回溶。

然后利用BamH I(Takara)酶切回收产物，酶切产物经DNA回收试剂盒回收后，在T₄DNA连接酶(Takara)作用下16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，确认得到中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ。

(3)pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的构建：将中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ经BamH I和Sma I双酶切，酶切产物经DNA回收试剂盒回收；TMV中200bp保守序列片段经BamH I和Sma I双酶切，酶切产物经DNA回收试剂盒回收。将同样双酶切的中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ和TMV片段在T₄DNA连接酶作用下16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂带有100μg/mL卡那霉素的LB平板，经菌落PCR筛选、酶切鉴定和DNA测序确认得到阳性克隆pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉。

结果分析：连接产物转化后，产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，选用BamH I和Sma I双酶切鉴定，酶切结果显示有约200bp的酶切条带，并且剩余的酶切片段大小约为7.6kb(图2)，基本确认该质粒中含有TMV 200bp的基因序列；并通过质粒的DNA测序进行最终鉴定(图3)。

实施例2.质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的生物学效应

农杆菌浸润侵染本生烟：首先将野生型CMV_FnyRNA1、pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉、野生型CMV_Fny RNA3的质粒分别转化农杆菌GV3101的感受态细胞，涂带有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml利福平的LB平板，28℃，培养48h后挑取单斑进行菌落PCR验证后，挑取单斑于2ml LB培养液(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，28℃，200rpm培养24h。

诱导：分别取含CMV_FnyRNA1、pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉、CMV_FnyRNA3，100μL菌液加至5mlLB培养液(含50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，于28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0。

重悬：将经诱导的菌液于10ml离心管，在室温条件下，6000rpm离心10min；收集菌体并重新悬浮于1ml农杆菌菌体重悬溶液(10mM MgCl₂，10mM MES，0.1mM AS)中吸打混匀，取50ul菌液到1ml重悬液，测其OD₆₀₀値，调整浓度使其OD₆₀₀为1.2，根据菌液和重悬液的比例调整剩余菌液OD₆₀₀为0.9-1.5，并使得3种菌液OD₆₀₀一致。

将三种调节好OD₆₀₀值的菌液(分别含有CMV_FnyRNA1、pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉、CMV_FnyRNA3)等比例混匀，28℃静置3h。

接种：取1ml一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，选取3-4叶期的本生烟，利用压力将注射器中的菌液从叶片背面的叶脉之间注入，每株共注射两个叶片，每片叶片注射量至少覆盖叶片的1/3。

接种完的植株放置25℃培养，16h光照/8h黑暗交替。

结果分析：接种14d后，接种野生型CMV_FnyRNA1/RNA2/RNA3的本生烟叶片皱缩，植株矮化；接种CMV_FnyRNA1/RNA2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉/RNA3与健康对照基本一致，无明显的病毒病症状。表明pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉为CMV RNA2的弱毒突变体(图5)。

为检测突变体接种烟草后的遗传稳定性，在接种后14天在未接种系统叶片上取样，利用RT-PCR检测异源病毒插入片段是否稳定存在。为检测异源病毒插入片段是否稳定存在，在CMV_FnyRNA2的异源片段插入序列的上下游设计引物CM-Fny2-2510-F(SEQ ID NO.7)和CM-Fny2-2760-R(SEQ ID NO.8)，进行RT-PCR检测。

结果分析：pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉接种本生烟后第14天，在系统叶片中可以利用RT-PCR检测到病毒的复制信号，根据扩增片段的大小判断插入的TMV片段仍然存在(图6)。

实施例3.质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉的交叉保护效果测试

利用实施例2中的方法，接种CMV_FnyRNA1/RNA2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉/RNA3进行交叉保护测试。接种弱毒突变体的5d后，分别用靶标强毒CMV和TMV侵染预先接种弱毒突变体的植株和未预先接种弱毒突变体的植株，测试其交叉保护效果。

结果分析：CMV和TMV强毒直接接种前期未接种突变体的本生烟出现萎蔫致死症状；预接种CMV_FnyRNA1/RNA2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉/RNA3的本生烟再进行靶标强毒(CMV和TMV)的接种，叶片出现卷叶，整株不萎蔫致死，减轻了TMV对本生烟的影响，说明预接种CMV_FnyRNA1/RNA2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉/RNA3的本生烟对CMV和TMV有交叉保护防治效果，为兼抗CMV和TMV的双价弱毒疫苗(图7)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 烟草花叶病毒

<400> 1

gaggagatag agtctttaga gcagtttcat atggcaacgg cagattcgtt aattcgtaag 60

cagatgagct cgattgtgta cacgggtccg attaaagttc agcaaatgaa aaactttatc 120

gatagcctgg tagcatcact atctgctgcg gtgtcgaatc tcgtcaagat cctcaaagat 180

acagctgcta ttgaccttga 200

<210> 2

<211> 3268

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtttatttac aagagcgtac ggttcaaccc ctgcctcccc tgtaaaactc cctagactta 60

aatcttttct ttctagtatc ttttctatgg ctttccctgc ccccgcattc tcactagcca 120

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agcaacgcga agaggctgct gcggcctgtc gtaattacag gcccctaccc gctgtggatg 240

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ccgtgaagtg tcaatatgaa aaatgtccaa cgccaaccat cgcgattcct ccggatttaa 900

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tccagagacg aactggcgat gcactcactt attttggcaa taccatcgtc accatggctg 1860

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gaacaaagaa aattccctat tctgacaatg atgaattctt gtttgctcac ttcatgagct 2160

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ttaagaagta taccgctaat ttccagtcct acaaagaact ctattattca gatcgtcgtc 2340

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ccgattaaag ttcagcaaat gaaaaacttt atcgatagcc tggtagcatc actatctgct 2820

gcggtgtcga atctcgtcaa gatcctcaaa gatacagctg ctattgacct tgacccgggg 2880

cctctcgttt agagttatcg gcggaagacc atgattttga cgatacagat tggttcgccg 2940

gtaacgaatg ggcggaaggt gctttctgaa acctcccctt ccgcatctcc ctccggtttt 3000

ctgtggcggg agctgagttg gcagtattgc tataaactgt ctgaagtcac taaacacatt 3060

gtggtgaacg ggttgtccat ccagcttacg gctaaaatgg tcagtcgtag aggaatctac 3120

gccagcagac ttacaagtct ctgaggcacc tttgaaacca tctcctaggt ttcttcggaa 3180

ggacttcggt ccgtgtactt ctagcacaac gtgctagttt cagggtacgg gtgcccccca 3240

cttttgtggg gcctccaaaa ggagacca 3268

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggatccga ggagatagag tctttagagc agttt 35

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcccgggtc aaggtcaata gcagctgtat ct 32

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcggatccac tagtcccggg gcctctcgtt tagagttatc ggcg 44

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggatccct attactcaga ctcgggtaac tccgcc 36

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaatcgacg ggaacgaggt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggaggttt cagaaagcac c 21

Claims (4)

1.一种兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗，其特征在于，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列；所插入的烟草花叶病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以CMV_Fny RNA2侵染性克隆质粒pCB301-CMV_Fny-R2为模板，利用反向PCR扩增技术获得中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ；所述中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ是2661位之后插入TAATAG，然后再依次引入BamH I、SpeI和Sma I酶切位点；

(2)利用酶切和连接方法将SEQ ID NO.1所示的烟草花叶病毒的保守序列插入到中间载体pCC_FR2-2bPTⅡ中，即构建得到兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉。

(3)将构建得到兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价突变型质粒载体pCC_FR2-2bPTⅡ-TM₂₀₇₉与含有CMV_Fny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种。

3.权利要求1所述的兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗在防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒中的应用。

4.一种防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述的兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的CMV_Fny分离物的突变型RNA2与含有CMV_Fny分离物的RNA1和RNA3的质粒混合接种。

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