CZ291203B6 - DNA-konstrukty propůjčující rezistenci vůči virům, rostliny které je obsahují a způsob jejich přípravy - Google Patents

DNA-konstrukty propůjčující rezistenci vůči virům, rostliny které je obsahují a způsob jejich přípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ291203B6
CZ291203B6 CZ19953199A CZ319995A CZ291203B6 CZ 291203 B6 CZ291203 B6 CZ 291203B6 CZ 19953199 A CZ19953199 A CZ 19953199A CZ 319995 A CZ319995 A CZ 319995A CZ 291203 B6 CZ291203 B6 CZ 291203B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ser
wall
leu
rna
plant
Prior art date
Application number
CZ19953199A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ319995A3 (en
Inventor
Haan Petrus Theodorus De
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ319995A3 publication Critical patent/CZ319995A3/cs
Publication of CZ291203B6 publication Critical patent/CZ291203B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Popisuj se rekombinantn DNA-konstrukty k duj c negativn nebo pozitivn molekulu RNA interaguj c s RNA-dependentn RNA-polymer zou k dovanou virem napadaj c m rostlinu a replikuj c v d sledku t to interakce pozitivn molekulu RNA k duj c alespo jeden protein, polypeptid nebo peptid odli n² od virov ho obalov ho proteinu, elicituj c p°irozenou hypersenzitivn odpov proti napadaj c m patogen m, p°i em tento konstrukt je pod expresn kontrolou promotoru a polyadenyla n ho sign lu pro konec transkripce, funk n ch v rostlin ch. D le se popisuj rostliny obsahuj c takov konstrukty a zp soby z sk n takov²ch rostlin.\

Description

Oblast techniky'
Vynález se týká rostlin rezistentních vůči patogenům a zejména rostlin rezistentních vůči patogenům, kde je rezistence vůči patogenům způsobena jako odpověď na napadení patogeny, jako jsou viry, DNA-konstruktů pro použití v takových rostlinách a způsobů zavedení rezistence indukované virem do rostlin.
Dosavadní stav techniky
Virové infekce rostlin často mají škodlivé účinky na růst, způsobují nežádoucí morfologické změny, snižují výnos a podobně. Takové infekce často mají za následek vyšší citlivost infikovaných rostlin vůči infekci jinými patogeny rostlin a škůdci rostlin.
Virové částice obecně obsahují relativně malé množství genetického materiálu (jednořetězcové nebo dvouřetězcové RNA nebo DNA), chráněného proteinem nebo proteiny, které u některých typů virů mohou být rovněž obaleny- lipidovými membránami získanými z hostitele, za vzniku infekčních částic. Rozmnožování virů je závislé na hostitelských buňkách a viry lze tudíž považovat za intracelulámí parazity.
Rostliny vyvinuly řadu obranných mechanismů pro omezení účinků virové infekce. Jde například o takzvané horizontální nebo částečné rezistence, které jsou polygenní povahy a takzvané vertikální rezistence, které jsou monogenní povahy.
Horizontální rezistenci lze v programech šlechtění těžko úspěšně zavést do rostliny, ale vertikální rezistenci lze v rámci programů šlechtěni rostlin zavést do rostlin relativně snadno. Geny kódující rezistenci vůči viru mohou působit konstitutivně v pasivním smyslu, tj. bez nutnosti indukovat expresi genu. Mezi konstitutivně exprimované rezistence vůči virům patří, jako způsoby působení, nehostitelské rezistence, tolerance, tj. inhibice založení choroby, imunita, tj. inhibice transportu nebo přítomnost antivirových činidel a podobně. Alternativně mohou být geny kódující rezistenci vůči virům v rostlinách aktivně zapínány pomocí indukce exprese genu nebo genů kódujících rezistenci vůči virům. Mezi příklady takových systémů patří hypersenzitivní odpověď.
Takzvané hypersenzitivní odpovědi (HSR, hypersensitive responses) byly u rostlin popsány a obecně jsou charakterizovány smrtí rostlinných buněk v blízkosti penetrujícího patogena krátce po infekci. Pohyb patogenu přes infikované nebo napadené buňky je omezen nebo blokován díky nekróze napadených buněk nebo/a buněk v blízkosti napadené buňky (nebo napadených buněk). Kromě toho hypersenzitivní odpověď zahrnuje kaskádu dalších nebo sekundárních obranných odpovědí a akumulaci určitých proteinů a sekundárních metabolitů, což vede k obecně zvýšené úrovni rezistence vůči napadení patogeny. Obecně se má za to, že na reakcích hypersenzitivní odpovědi proti napadajícím organismům se podílí produkt genu rezistence v rostlinné buňce, který rozpoznává a interaguje s elicitorovým elementem, tj. produktem genu avirulence patogenu. Rozpoznání elicitorového elementu v buňkách rezistentní rostliny vyvolá hypersenzitivní reakci, která zase omezuje infekci patogenem na jedinou buňku nebo buňky, nebo nejvýše několik rostlinných buněk v jejich bezprostřední blízkosti.
Jako příklad hypersenzitivní odpovědí zprostředkované rezistence vůči virové infekci lze uvést rostliny tabáku obsahující gen rezistence N' vůči tobamovirům, jako je TMV a ToMV, které obsahují gen avirulence obalového proteinu. Dosud bylo identifikováno více než dvacet jednotlivých dominantních genů rezistence typu hypersenzitivní odpovědi, které jsou přítomné v mnoha agronomicky důležitých plodinách včetně tabáku, rajčete, brambor, papriky, salátu a podobně.
-1 CZ 291203 B6
Přes zřejmou hojnost zdrojů rezistence vůči určitým virům mnohé plodiny stále postrádají účinné geny rezistence vůči důležitým virovým patogenům (Fraser, R. S. S. (1992), Euphytica 63: 175). Prohledáváním sbírek zárodečné plazmy divokých typů bylo identifikováno pouze několik vhodných zdrojů rezistence vůči virům, které lze úspěšně zavést do agronomicky důležitých plodin. Jako příklad lze uvést absenci genů vertikální rezistence vůči viru mozaiky okurky (CMV, cucumber mosaic virus) u mnoha typů zemědělsky důležitých plodin včetně, ale nejen, rajčete, papriky, okurky, melounu, salátu a podobně.
Šlechtitelé rostlin se neustále snaží vyvinout odrůdy užitkových druhů rostlin, které by byly tolerantní nebo rezistentní vůči specifickým kmenům virů. V minulosti byly přenášeny geny propůjčující rezistenci vůči virům z divokých typů příbuzných komerčně užívaným rostlinám do komerčních odrůd pomocí křížení. Přenos rezistence existující v přírodě z genového fondu divokého typu do kultivaru je unavující proces, při kterém je nutné nejprve identifikovat gen nebo geny propůjčující rezistenci v zdrojovém druhu rostlin (donor) a poté je zakombinovat do genového fondu komerční odrůdy. Rezistence nebo tolerance vytvořená tímto způsobem je typicky účinná pouze proti jednomu nebo v nejlepším případě několika kmenům daného viru. Další nevýhodou je, že program šlechtění obecně trvá dlouhou dobu, měřenou na roky, než se získají agronomicky vhodné rostliny.
Jako alternativa byl používán systém označování „cross-protection“ („ochrana křížem“). Ochrana křížem je jev, kdy infekce rostliny jedním kmenem viru chrání tuto rostlinu proti nové infekci druhým příbuzným kmenem viru. Způsob využívající ochranu křížem přednostně zahrnuje použití avirulentního virového kmene pro infekci rostlin, což působí tak, že se inhibuje sekundární infekce virulentním kmenem stejného viru. Použití přírodního systému ochrany křížem však může přinášet několik nevýhod. Tento způsob je velice pracovně náročný, jelikož je nutná inokulace každé jednotlivé užitkové rostliny a nese s sebou riziko, že avirulentní kmen může zmutovat na virulentní kmen a tak se sám stát agens způsobujícím chorobu plodiny. Dalším možným rizikem je to, že kmen viru avirulentní u jednoho druhu rostliny může působit jako virulentní kmen u jiného druhu rostliny.
Genetickým inženýrstvím dodávaná ochrana křížem je formou rezistence vůči virům, která je fenotypicky podobná přírodní ochraně křížem, ale dosáhne se jí pomocí exprese genetické informace virového obalového proteinu z genomu geneticky manipulované rostliny. Je známé, že exprese genu pro obalový protein kmenu U1 viru mozaiky tabáku (TMV U-l) z genomu transgenické rostliny může mít za následek zpoždění vývoje symptomů po infekci jakýmkoli kmenem viru mozaiky tabáku (TMV). Podobně bylo ochrany zprostředkované obalovým proteinem dosaženo v případě viru mozaiky vojtěšky (AMV), viru X brambor (PVX) a viru mozaiky okurky (CMV). U některých rostlinných vírů, například luteovirů, je složité v transgenických rostlinách získat detekovatelná množství odpovídajícího obalového proteinu a rezistence vůči virům je v důsledku toho obecně snížená. Dále je pro jakýkoli údajný stupeň ochrany potřebné, aby rostlina produkovala obalový protein soustavně, což pro rostlinu představuje energetickou zátěž. V důsledku těchto omezení zůstává komerční význam této technologie nejasný.
Mezi další příklady genetickým inženýrstvím dodávané rezistence vůči virům patří zavedení rostlinné virové satelitní RNA, kdy exprese začleněného genetického materiálu modifikuje rostlinný virus nebo jeho účinky.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je alternativní spolehlivější strategie pro genetickým inženýrstvím dodávanou rezistenci vůči virům u rostlin ve srovnání s rezistencemi dodávanými genetickým inženýrstvím známými v oboru, založená na přímé patogenem indukované expresi molekul v cílových pletivech rostliny před tím, než se může napadající patogen etablovat v hostitelské rostlině.
-2CZ 291203 B6
Dalším předmětem vynálezu je kombinování technologie transformace rostlin pomocí genového inženýrství s přirozeně existujícími obrannými mechanismy rostlin vůči virům v pletivu rostlin.
Podrobný popis
Podle vynálezu je popisován rekombinantní DNA-konstrukt kódující negativní (minus sense) nebo pozitivní (plus sense) molekulu RNA interagující s RNA-dependentní RNA-polymerázou kódovanou virem napadajícím rostlinu a replikující v důsledku této interakce pozitivní molekulu RNA kódující alespoň jeden protein, polypeptid nebo peptid odlišný od virového obalového proteinu, elicitující přirozenou hypersenzitivní odpověď proti napadajícím patogenům, přičemž tento konstrukt je pod expresní kontrolou promotoru a polyadenylačního signálu pro konec transkripce, funkčních v rostlinách.
Protein, polypeptid nebo peptid elicitující přirozenou hypersenzitivní odpověď proti napadajícím patogenům je zde dále nazýván též „elicitující element“.
Rostlinný virový DNA-konstrukt lze získat z libovolného virového zdroje schopného napadnout rostliny, je však výhodné získat rostlinnou virovou DNA z libovolného virového zdroje o kterém je známo, že napadá, je u něj nebezpečí napadání neboje schopen napadat zemědělsky zajímavý typ rostliny. Může jít o přírodní rostlinnou virovou DNA vhodně modifikovanou pro expresi nebojí lze získat synteticky. Rostlinná virová DNA by měla být schopná kódovat transkripci na sekvenci RNA komplementární (tj. negativní) s virovou RNA (tj. pozitivní) v rostlinných buňkách. Kromě toho by měla rostlinná virová DNA v sobě obsahovat část nebo segment, který po transkripci za vzniku negativní RNA a další transkripci za vzniku pozitivní RNA, po translaci pozitivní RNA, je schopen dát vznik alespoň jednomu elicitujícímu elementu nebo jeho části dostatečné pro vyvolání přirozených obranných mechanismů rostliny proti napadajícímu viru. Vhodnými zdroji rostlinných virových DNA nebo RNA jsou zdroje získané z rostlinných virů schopných napadat typy rostlin jako jsou rajče, paprika, pepřovník, meloun, salát, květák, brokolice, brukev, růžičková kapusta, cukrová řepa, kukuřice, kukuřice cukrová, cibule, mrkev, pór, okurka, tabák a podobně. Mezi zdroje rostlinných virových DNA nebo RNA patří rovněž zdroje získané z rostlinných virů schopných napadat typy rostlin patřící mezi okrasné rostliny, jako je netýkavka, begónie, petúnie, pelargónie, violka, brambořík, sporýš, brčál, aksamitník, prvosenka, saintpaulia a podobně.
Negativní molekulou RNA je taková molekula, která obsahuje alespoň cistron nebo jeho část odpovídající alespoň části uvedené rostlinné virové DNA a je schopná dát vznik pozitivní molekule RNA transkribovatelné z uvedené negativní molekuly RNA, která je schopná kódovat a dát vznik alespoň jednomu elicitujícímu elementu nebo jeho části v rostlinných buňkách. Negativní RNA může být přímo transkribovatelná z uvedené rostlinné virové DNA nebo může být transkribovatelné z pozitivní RNA získané z uvedené DNA. Negativní RNA transkribovatelná z pozitivní RNA je pro účely vynálezu označována jako nepřímo transkribovatelná z uvedené DNA. Orientace nebo polarita cistronu nebo cistronů nebo jejich částí nacházejících se v negativní molekule RNA může být taková, že elicitující element nemusí být přímo kódován po transkripci z rostlinného virového DNA-konstruktu. Genetický kód cistronu nebo cistronů nebo jejich částí se nachází na řetězci komplementárním k negativní molekule RNA, tj. pozitivní RNA. Cistron kódující elicitující element se stává dostupným pro translaci když je negativní virová sekvence RNA replikována RNA-dependentní RNA-polymerázou kódovanou napadajícím virem za vzniku pozitivní molekuly RNA.
Mezi negativní RNA zde rovněž patří molekuly RNA, o kterých lze říci, že mají negativní i pozitivní (ambisense) vlastnosti, jako jsou molekuly RNA z tospovirů a podobně. V takových případech negativní RNA obsahuje alespoň cistron odpovídající části uvedené rostlinné virové DNA a je schopná dát vznik pozitivní RNA transkribovatelné z uvedené negativní RNA, která je
-3CZ 291203 B6 schopná kódovat a dát vznik alespoň jednomu elicitujícímu elementu nebo jeho části v rostlinných buňkách.
Pozitivní virovou molekulou RNA je molekula, která je schopná přímo nebo nepřímo kódovat alespoň jeden elicitující element nebo jeho část schopnou exprese v rostlinných buňkách a vykazující účinnost při vyvolávání přirozené nebo genetickým inženýrstvím dodávané rostlinné obrany v rostlinných buňkách. Pozitivní molekulou RNA je rovněž molekula, která je komplementární k virové negativní RNA a je schopná po translaci v rostlinných buňkách dát vznik přímo nebo nepřímo alespoň jednomu elicitorovému elementu. Za virovou pozitivní molekulu RNA lze tedy považovat molekulu RNA komplementární k negativní molekule RNA.
Mezi pozitivní RNA zde rovněž patří ty molekuly RNA, o kterých lze říci, že mají negativní i pozitivní (ambisense) vlastnosti. V takových případech pozitivní molekula RNA obsahuje alespoň cistron odpovídající části uvedené rostlinné virové DNA a je schopná přímo kódovat a dát vznik alespoň jednomu elicitujícímu elementu nebo jeho části v rostlinných buňkách.
Množství elicitujícího elementu, který je exprimován v rostlinné buňce, musí být dostatečné pro vyvolání alespoň buněčné rostlinné obranné odpovědi proti napadajícímu viru, která má za následek přirozenou nebo genetickým inženýrstvím dodávanou reakci rostliny účinnou při blokování nebo omezení dalšího působení viru. Pozitivní molekuly RNA, ať jsou komplementární k negativní RNA nebo jde o ambisense RNA, musí tedy být schopné dát vznik elicitorovým elementům, které jsou schopné podnítit nebo vyvolat přirozenou nebo genetickým inženýrstvím dodávanou obrannou odpověď rostliny, ať již je to pomocí přímé translace nebo pomocí interakce s virovou RNA-dependentní RNA-polymerázou (například přes vytvořenou subgenomovou RNA). Pozitivní RNA může být podstatně kódován jeden nebo několik elicitujících elementů, v závislosti na typu obranné odpovědi rostliny nebo obranných odpovědí rostliny, které jsou vyvolávané. Virovou pozitivní sekvencí RNA je výhodně sekvence, ve které byl alespoň virový cistron nahrazen alespoň cistronem kódujícím elicitující element schopný exprese v rostlinných buňkách, . který vykazuje účinnost při vyvolávání přirozené nebo genetickým inženýrstvím dodávané rostlinné obrany v rostlinném pletivu.
Elicitujícím elementem může být libovolný element, který může vzniknout translací z cistronu pozitivní RNA získatelného z rostlinné virové DNA jak je popsáno výše a může jít o protein, polypeptid nebo peptid nebo jeho fragmenty. Mezi příklady výhodných elicitujících elementů patří takzvané elicitorové proteiny nebo/a buněčné inhibiční proteiny.
Elicitorovým proteinem je protein, který, pokud je přítomen v rostlinném pletivu, schopen vyvolávat, podněcovat nebo indukovat hypersenzitivní odpověď (HSR), což je přirozený obranný mechanismus rostliny proti napadajícím patogenům jako jsou viry. Elicitorové proteiny mohou být původem z rostlinných virů, jako jsou obalové proteiny, proteiny podílející se na pohybu z buňky do buňky, helikasy, RNA-dependentní RNA-polymerázy a podobně. Kromě toho mohou elicitorové proteiny pocházet neboje lze získat z jiných rostlinných patogenů, jako jsou bakterie, houby, háďátka a podobně.
Buněčným inhibičním proteinem je protein, který, pokud je přítomen v rostlinném pletivu, má škodlivé účinky na rostlinnou buňku, které vedou k inhibici růstu buňky, například dělení buňky nebo/a ke smrti buňky. Mezi buněčná inhibiční činidla patří, aniž by však šlo o vyčerpávající výčet, ribonukleasy, proteinasy, ribozomální inhibiční proteiny, proteiny degradující buněčné stěny a podobně.
Negativní a pozitivní molekuly RNA lze považovat za rostlinné virové RNA, jelikož jsou získány z rostlinného DNA-konstruktu jak je popsán výše a obsahují genom nebo segment genomu rostlinného viru. V takových rostlinných virových RNA mohou být vybrané nukleotidové zbytky nahrazeny jinými nebo mohou být deletovány. Nahrazení nebo/a delece nukleotidů nebo segmentů tvořených nukleotidy by měla být taková, aby nebyla narušena schopnost molekuly
-4CZ 291203 B6
RNA množit se nebo replikovat se ve virem infikovaných rostlinných buňkách. Rovněž by nahrazení nebo/a delece nukleotidů, kodónů nebo segmentů tvořených nukleotidy mělo být takové, aby nebyla narušována schopnost RNA-dependentní RNA-polymerázy napadajícího viru rozpoznávat a působit na molekulu RNA (v pozitivní nebo negativní orientaci) a tím vyvolávat sled událostí, jak je zde popsán, vedoucí k produkci účinného množství elicitujícího elementu schopného vyvolat přirozenou nebo genetickým inženýrstvím dodávanou obrannou odpověď rostliny. Mezi příklady vhodných rostlinných virových molekul RNA patří, aniž by šlo o omezující výčet, genomové molekuly RNA nebo jejich segmenty vybrané ze skupiny zahrnující potyviry, potexviry, tobamoviry, luteoviry a genomové RNA nebo jejich segmenty z cucumovirů, bromovirů, tospovirů a podobně.
Rostlinná virová DNA je při expresi řízena promotorem schopným fungování v rostlinách a zahrnuje terminátor schopný fungování v rostlinách.
Promotorem je nukleotidová sekvence upstream od místa iniciace transkripce, která obsahuje všechny regulační oblasti nutné pro transkripci. Mezi příklady promotorů vhodných pro použití v DNA-konstruktech podle vynálezu patří promotory získané z virů, hub, baktérií, živočichů a rostlin, které jsou schopné fungovat v rostlinných buňkách. Výhodný promotor exprimuje DNA konstitutivně, to znamená ve všech živých pletivech rostliny. Je třeba vzít v úvahu, že použitý promotor by měl způsobovat expresi virové rostlinné DNA v rychlosti dostatečné pro vytvoření množství RNA schopného kódovat alespoň elicitorový element schopný vyvolat přirozenou obranu rostliny v transformované rostlině při napadení rostliny virem. Požadované množství RNA, které má být transkribováno, se může lišit v závislosti na typu rostliny. Mezi příklady vhodných promotorů patří promotory viru mozaiky květáku 35S (CaMV 35S) a 19S (CaMV 19S), promotory nopalin-syntázy a oktopin-syntázy, promotor tepelného šoku 80(hsp80) a podobně.
Za terminátor je považována (A) sekvence DNA downstream od virové DNA, kódující transkripci na sekvenci RNA, která je schopná autokatalýzy, štěpení sebe samotné, pro uvolnění terminátorových sekvencí z rekombinantní virové sekvence RNA, následovaná (B) sekvencí DNA na konci transkripční jednotky, která signalizuje konec transkripce. Těmito elementy jsou 3'-nepřekládané sekvence obsahující polyadenylační signály, které jsou činné tak, že způsobují přidání polyadenylátových sekvencí na 3'-konec primárních transkriptů. Mezi příklady sekvencí uvedených pod bodem (A) patří sebe sama štěpící molekuly RNA nebo ribozymy, jako je ribonukleasa P, intervenující sekvence Tetrahymena L-19, „kladivové“ ribozymy (hammerhead ribozymes), RNA delta viru Hepatitis, mitochondriální VS RNA Neurospora a podobně (Symons, R. H. (1992), Ann. Rev. Biochem. 61: 641). Sekvence uvedené pod bodem (B) lze izolovat z hub, bakterií, živočichů nebo/a rostlin. Mezi příklady zejména vhodné pro použití v DNA-konstruktech podle vynálezu patří polyadenylační signál nopalin-syntázy z Agrobacterium tumefaciens, polyadenylační signál 35S z viru mozaiky květáku a polyadenylační signál zeinu z kukuřice (Zea mays).
Sekvence DNA nebo RNA je komplementární k jiné sekvenci DNA nebo RNA, pokud je za vhodných hybridizačních podmínek schopná tvořit s ní komplex spojený vodíkovými vazbami, podle pravidel párování bází. Pro účely vynálezu mezi vhodné hybridizační podmínky může patřit, aniž by však šlo o omezování na tyto podmínky, například inkubace po dobu přibližně 16 hodin při teplotě 42 °C, vpufrovacím systému obsahujícím 5x standardní citrátový pufr s chloridem sodným (standard šalině citráte, SSC), 0,5 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 5 x Denhardtův roztok, 50 % formamidu a 100 pg/ml nosné DNA nebo RNA (dále označován pufrovací systém), s následujícím promýváním třikrát v pufru obsahujícím 1 x SSC a 0,1 % SDS při teplotě 65 °C, vždy po dobu přibližně 1 hodiny. Hybridizační signál získaný pro molekulu RNA nebo DNA, například autoradiogram, by měl tedy být pro odborníka dostatečně jasný, aby naznačil, že získanou molekulu RNA nebo DNA lze užitečně použít při konstruování rostlinných virových DNA-konstruktů vhodných pro použití podle vynálezu. Přirozeně má tato molekula RNA nebo DNA vykazovat požadovanou aktivitu, jak je zde popsána. Nahrazení nebo/a delece
-5CZ 291203 B6 nukleotidů, kodónů nebo segmentů složených z nukleotidů by tedy měla být taková, aby nebyla narušována schopnost DNA-konstruktu podle vynálezu kódovat negativní molekulu RNA, jak je zde popsána, která je schopná být rozpoznávána RNA-dependentní RNA-polymerázou napadajícího viru a je schopná interakce s ní, což vede k produkci účinného množství elicitujícího elementu schopného vyvolat přirozenou nebo genetickým inženýrstvím dodávanou obrannou odpověď rostliny.
Mezi vhodné hybridizační podmínky používané ve vynálezu může patřit inkubace v pufrovacím systému po dobu přibližně 16 hodin při teplotě 49 °C a promývání třikrát v pufru obsahujícím 0,1 x SSC a 0,1 % SDS při teplotě 55 °C vždy po dobu přibližně 1 hodiny. Výhodněji, mohou hybridizační podmínky zahrnovat inkubaci v pufrovacím systému po dobu přibližně 16 hodin při teplotě 55 °C a promývání třikrát v pufru obsahujícím 0,1 x SSC a 0,1 % SDS při teplotě 65 °C vždy po dobu přibližně 1 hodiny. Přirozeně má každá molekula RNA nebo DNA podrobená takovým hybridizačním podmínkám vykazovat požadovanou aktivitu, jak je zde popsána.
Vynález rovněž popisuje vektor schopný introdukovat DNA-konstrukt podle vynálezu do rostliny a způsoby výroby takových vektorů. Zde používaný termín vektor označuje prostředek, jehož pomocí mohou být molekuly DNA nebo jejich fragmenty inkorporovány do hostitelského organismu. Mezi vhodné prostředky patří plazmidy, obnažené DNA zaváděné pomocí mikroinjekcí, ostřelování částicemi (particle guns) a podobně (Offringa (1992), PhD thesis, Statě University Leiden, Nizozemí, Chl: strany 7 - 28).
Termín rostliny, jak je zde používán, se používá v širokém smyslu slova a označuje diferenciované rostliny jakož i nediferenciovaný rostlinný materiál, jako jsou protoplasty, rostlinné buňky, semena, klíční rostliny a podobně, ze kterého se za vhodných podmínek mohou vyvinout celé rostliny, jejich potomstvo a jejich části, jako jsou řízky a plody takových rostlin.
Vynález dále popisuje rostliny obsahující vjejich genomu DNA-konstrukt podle vynálezu a způsoby přípravy takových rostlin.
Rostliny podle vynálezu vykazují sníženou citlivost vůči chorobám způsobeným příslušnými viry a nevykazují nevýhody a omezení rostlin získaných klasickými metodami a metodami genetického inženýrství, jak jsou rozebrány výše.
Vynález ilustrují následující příklady, kterými se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje, a přiložené obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: Schématické zobrazení interakce patogeném a rostlinou kódovaných proteinů vedoucí k indukci hypersenzitivní odpovědi.
Obrázek 2: Schématické zobrazení rostlin tabáku nebo rajčete, rezistentních vůči CMV (virus mozaiky okurky), čehož bylo dosaženo pomocí exprese negativní molekuly CMV RNA 3, ve které je gen MP nahrazen genem kódujícím elicitor (ToMV CP nebo P30) nebo buněčným inhibičním proteinem (RNAsa TI).
Obrázek 3: Schématické zobrazení rostlin tabáku nebo rajčete, rezistentních vůči CMV (virus mozaiky okurky), čehož bylo dosaženo pomocí exprese pozitivní molekuly CMV RNA 3, ve které je gen CP nahrazen genem kódujícím elicitor (ToMV CP nebo P30) nebo buněčným inhibičním proteinem (RNAsa TI).
-6CZ 291203 B6
Popis sekvencí
Sekvence SEQ ID č. 1: Chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky.
Sekvence SEQ ID č. 2: Obalový protein ToMV (odpovídající nukleotidům z poloh 123 - 600 ze SEQIDč. 1).
Sekvence SEQ ID č. 3: Obalový protein viru mozaiky okurky (odpovídající nukleotidům z poloh 897- 1550 ze SEQ IDč. 1).
Sekvence SEQ ID č. 4: Chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky.
Sekvence SEQ ID č. 5: RNAsa TI odpovídající polohám 123 - 437 ze SEQ ID č. 4.
Sekvence SEQ ID č. 6: Chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky, kódující P30 z ToMV.
Sekvence SEQ ID č. 7: P30 z ToMV odpovídající nukleotidům z poloh 123 - 914 ze SEQ ID č. 7.
Sekvence SEQ ID č. 8: Chimérická s RNA viru skvrnitého vadnutí rajčete (tomato spotted wilt virus), kódující obalový protein ToMV a nestrukturální protein, NSs v opačné polaritě.
Sekvence SEQ ID č. 9: Nestrukturální protein, NSs (v opačné polaritě) odpovídající nukleotidům z poloh 1141 - 2543 ze SEQ ID č. 8.
Příklady provedení vynálezu
Všechny sekvence odvozené od RNA virů CMV, TSWV a ToMV, které jsou zde prezentovány, jsou uváděny jako sekvence DNA z důvodů jednotnosti. Je třeba vzít v úvahu, že je tomu takto pouze pro jednoduchost.
Kultivary Nicotiana tabacum a Lycopersicon esculentum, používané při studiu transformace rostlin, se pěstují ve standardních skleníkových podmínkách. Sterilní explantátový materiál se pěstuje na standardním médiu MS (Murashige a Skoog (1962), Physiol. Plant 15:473) obsahujícím vhodné koncentrace fytohormonů a sacharózy.
Bakterie Escherichia coli se pěstují na rotačních třepačkách při teplotě 37 °C ve standardním LB-médiu. Kmeny Agrobacterium tumefaciens se pěstují při teplotě 28 °C v médiu MinA doplněném 0,1 % glukózy (Ausubel a kol., (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Inter-sciences, New York, Chichiester, Brisbane, Toronto a Singapur).
Ve všech klonovacích postupech se jako výhodný recipient rekombinantních plazmidů používá kmen Escherichia coli JM83 (F~, k(lac-pró), ara, rpsL, 080, d/acZM15).
Binární vektory se konjugují s kmenem Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, kmenem obsahujícím oblast vir Ti-plazmidu (Hoekema a kol. (1983), Nátuře 303: 179) v standardních triparentálních spojováních, za použití Escherichia coli HB101, obsahujícího plazmid pRK2013, jako pomocného kmene. (Figurski a Helinski, 1979), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1648). Vhodný recipienti Agrobacterium tumefaciens se selektují na médiu obsahujícím rifampicin v množství 50 pg/ml a kanamycin v množství 50 pg/ml.
Klonování fragmentů ve vektorech pUC19 (Yanish-Perron a kol. (1985), Gene 33: 103), pBluescript (Stratagene), pBIN19 (Bevan a kol. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 8711) nebo jejich derivá
-7CZ 291203 B6 těch, analýza DNA pomocí restrikčních enzymů, transformace do recipientních kmenů Escherichia coli, izolace plazmidové DNA v malém jakož i ve velkém měřítku, nick-translace (posun jednořetězcového zlomu), transkripce in vitro, sekvenování DNA, Southem blotting a gelová elektroforéza DNA se provádějí podle standardních postupů (Maniatis a kol. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel a kol., viz výše (1987)).
Amplifikace DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se provádí podle doporučení dodavatele Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus). Amplifikace RNA pomocí reverzní transkripce a následné standardní amplifikace DNA se provádí za použití polymerázové řetězové reakce Gene Amp RNA PCR podle doporučení dodavatele (Perkin Elmer Cetus).
Příklad 1
Izolace částic CMV a genetického materiálu v nich
Virus mozaiky okurky (CMV) sérové skupiny I se izoluje z tykve a uchovává se na tykvi pomocí mechanického pasážování. Virus se purifikuje ze systémově infikovaných listů tykve v podstatě podle postupu, který popsali Francki a kol. ((1979 CMI/AAB Descr. of Plant Viruses 213). Přibližně 100 pg viru v objemu 250 μΐ se extrahuje fenolem, poté směsí fenolu a chloroformu a nakonec chloroformem. RNA se vysráží ethanolem a izoluje se centrifugací. Peleta se rozpustí ve 20 μΐ vody.
Příklad 2
Izolace částic ToMV a genetického materiálu v nich
Izolát ToMV z rajčete se uchovává na tabáku pomocí mechanického pasážování. Virus se purifikuje ze systémově infikovaných listů tabáku v podstatě podle postupu, který popsali Hollings a Huttinga ((1976) CMI/AAB Descr. of Plant Viruses 156). Přibližně 200 pg viru v objemu 300 pl se extrahuje fenolem, poté směsi fenolu a chloroformu a nakonec chloroformem. RNA se vysráží ethanolem a izoluje se centrifugací. Peleta se rozpustí v 50 pl vody.
Příklad 3
Molekulové klonování RNA 3 z CMV
Sekvence RNA 3 z CMV se izoluje z purifikované RNA CMV za použití polymerázové řetězové reakce na bázi RNA (RNA-based PCR, Perkin Elmer Cetus, viz výše). Připraví se dva primery, ZUP069:
(5' TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG 3') který je komplementární k prvním 16 nukleotidům na 3'-konci RNA 3 z CMV (SEQ ID č. 1), aZUP068:
(5' TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 3') který je identický s prvními 14 nukleotidy na 5'-konci RNA 3 z CMV (SEQ ID č. 1). Oba přiměly obsahují restrikční místa pro BamHl pro umožnění dalšího klonování amplifikovaných molekul DNA. Purifikovaná RNA z CMV se podrobí polymerázové řetězové reakci Gene Amp RNA
-8CZ 291203 Β6
PCR, a výsledný PCR-fragment se izoluje z agarosového gelu a klonuje se do pUC19 linearizovaného pomocí Smál, čímž se získá rekombinantní plazmid pZU181.
Příklad 4
Molekulové klonování TSWV S RNA cDNA-klon obsahující téměř úplnou TSWV S RNA-specifickou sekvenci se zkonstruuje fúzí cDNA-klonů 520 a 614 do jedinečného místa EcoRl, čímž se získá pTSWV-Sl (De Haan a kol. (1990), J. Gen. Virol. 71: 1001). Úplná sekvence TSWV SRNA se izoluje zpurifikované pTSWV-Sl DNA za použití polymerázové řetězové reakce na bázi RNA (RNA-based PCR, Perkin Elmer Cetus, viz výše). Připraví se dva primery, ZUP250:
5' (TTTGGATCCA GAGCAATCGT GTCAATTTTG TGTTCATACC TTAAC) 3' který obsahuje 36 nukleotidů identických s prvními 36 nukleotidy na 5'-konci TSWV S RNA (SEQ IDč. 8), aZUP251:
5' (TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTT TGTTCATAAT CAAACCTCACTT) 3' který obsahuje 43 nukleotidů komplementárních k prvním 43 nukleotidům na 3'-konci TSWV S RNA (SEQ ID č. 8). Oba primery obsahují restrikční místa pro BamHl pro umožnění dalšího klonování amplifíkovaných molekul DNA. Výsledný PCR-fragment se izoluje z agarosového gelu a klonuje se do pUC19 linearizovaného pomocí Smál, čímž se získá rekombinantní plazmid pTSWV-S2.
Příklad 5
Molekulové klonování genů CP a P30 z ToMV
Sekvence genů odpovídající obalovému proteinu (coat protein, CP) a P30 z ToMV se izoluje za použití polymerázové řetězové reakce na bázi RNA. Primer ZUP112 překlenuje obě strany kodónu počátku translace genu CP z ToMV RNA:
5' GTATTAACCA TGGCTTACTC 3' (obsahuje 13 nukleotidů identických s nukleotidy 121 133 sekvence SEQ ID č. 1), a primer ZUP113 překlenuje obě strany kodónu terminace translace genu CP z ToMV RNA:
5' GCACCCATGG ATTTAAGATG 3' (obsahuje 16 nukleotidů komplementárních k nukleotidům 595 - 610 sekvence SEQ ID č. 1), a primer ZUP117 překlenuje obě strany kodónu počátku translace genu P30 z ToMV RNA:
5' TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 3' (obsahuje 13 nukleotidů identických s nukleotidy 121 133 sekvence SEQ ID č. 6), a primer ZUP118 překlenuje obě strany kodónu terminace translace genu P30 z ToMV RNA:
5' GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 3' (obsahuje 13 nukleotidů komplementárních k nukleotidům 911 - 923 sekvence SEQ ID č. 6).
-9CZ 291203 B6
Primery obsahují restrikční místa pro Ncol pro umožnění dalšího klonování amplifikovaných molekul DNA. Purifikovaná RNA z ToMV se podrobí polymerázové řetězové reakci Gene Amp RNA PCR. Výsledné PCR-fragmenty se izolují zagarosového gelu a klonují se do pUC19 linearizovaného pomocí Smál, čímž se získají rekombinantní plazmidy pZU183 (obsahující gen CP) a pZU206 (obsahující gen P30).
Příklad 6
Syntéza genu ribonukleasy TI
Sekvence genu odpovídajícího ribonuklease TI se syntetizuje na komerčně dodávaném zařízení pro syntézu DNA (Pharmacia LKB, Gene Assembler plus) jako primer ZUP110 (obsahující nukleotidy identické s nukleotidy 121 - 293 sekvence SEQ ID č. 4):
5' TTTCCATGGC ATGCGACTAC ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCA
GACGTTTCTA CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCAČG AAGACGGTGA
AACTGTTGGA TCTAATTCTT ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTT
TTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC 3’ a primer ZUP111 (obsahující nukleotidy komplementární k nukleotidům 278 -446 sekvence SEQ ID č. 4):
5' GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT GTTACCAGAA GCACCAGTGT GAGTGATAAC ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC GACACGGTCA GCACCTGGAG AAGGACCAGA GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCA TTCGTAGTAG GGAGAGCTCA C 3'
Oba primery obsahují restrikční místa pro Ncol pro umožnění dalšího klonování amplifikovaných molekul DNA. Primery se teplotně hybridizují a podrobí ze standardní polymerázové řetězové reakci DNA. Amplifikovaný fragment DNA se izoluje z agarosového gelu a klonuje se do pUC19 linearizovaného pomocí Smál, čímž se získá rekombinantní plazmid pZU230.
Příklad 7
Konstrukce expresívního vektoru pZU-A
Promotorový fragment 35S viru mozaiky květáku (CaMV) se izoluje z rekombinantního plazmidu pZO27, derivátu pUC19 nesoucího jako fragment HindlII-Pstl o velikosti 444 bp oblast HincII-Hphl promotoru 35S z viru mozaiky květáku kmene Cabb-S (Franck a kol. (1980)), Cell 21: 285 - 294). Nukleotidové sekvence kmenů CaMV jsou u různých kmenů velmi podobné. Promotorový fragment 35S se vyštěpí z pZO27 jako fragment EcoRI-Pstl o velikosti 472 bp a obsahuje: část oblasti polylinkeru, 437 bp netranskribovanou oblast a místo iniciace translace a 7 bp nepřekládanou vedoucí oblast, ale neobsahuje žádné iniciátory translace 35S. Promotorový fragment 35S se liguje za použití T4 ligasy do pZ0008 linearizovaného pomocí EcoRI-PSTI. Plazmid pZ0008 nese polyadenylační signál nopalin-syntázy (NOS) ve formě fragmentu PstlHindlII o velikosti 270 bp. Výsledný rekombinantní plazmid pZU-A nese promotor 35S, jedinečné místo Pstl a terminátor NOS (Gielen a kol. (1991) Bio/Technology 10: 1363).
-10CZ 291203 B6
Příklad 8
Konstrukce vektoru pro transformaci rostlin, který poskytuje transkript replikující se po infekci CMV
5'-konec negativní RNA 3 z CMV se fúzuje přímo k místu iniciace transkripce promotoru 35S CaMV za použití dvou primerů ZUP 148:
5' CCACGTCTTC AAAGCAAG 3' (komplementární k nukleotidům promotoru 35S CaMV), a primeru ZUP 146:
5' CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCT CCAAATGAAA 3' (obsahuje nukleotidy komplementární k nukleotidům 1860 - 1827 sekvence SEQ ID č. 1) s pZU-A jako matricí ve standardní polymerázové řetězové reakci pro DNA. Amplifikovaný fragment DNA se rozštěpí EcoRV a klonuje se do pZU-A linearizovaného pomocí EcoRV. Výsledný plazmid se rozštěpí BstXl a Pstl a purifikuje se na agarosovém gelu. pZU181 se rozštěpí Pstl a BstXl, inzert DNA o velikosti 2,1 kb se purifikuje na agarosovém gelu a následně se klonuje do derivátu pZU-A purifikovaného na gelu, čímž se získá pCMV3AS-l.
Doména pCMV3AS-l kódující pohybový protein (movement protein, MP) se nahradí jedinečným klonovacím místem Ncol a „sekyrová“ (axehead) struktura virové RNA Hepatitis delta se klonuje downstream od 3'-konce negativní RNA 3 CMV, pomocí amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí dvou fragmentů DNA za použití pCMV3AS-l jako matrice. První fragment DNA se amplifikuje za použití primerů ZUP050:
5' AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 3' (obsahuje nukleotidy komplementární k nukleotidům 1020 - 1039 sekvence SEQ ID č. 1) a ZUP329:
5' GTCTTTAGCA CCATGGTG 3' (obsahuje nukleotidy identické s nukleotidy 604 -612 sekvence SEQ ID č. 1)
Fragment DNA se rozštěpí Nrul a Ncol a na agarosovém gelu se izoluje fragment DNA dlouhý 411 bp (polohy 607 -1016 sekvence SEQ ID č. 1). Druhý fragment DNA se amplifikuje za použití primerů ZUP327:
5' GGAGAGCCAT GGCTCGGG 3' (obsahuje nukleotidy komplementární k nukleotidům 115-126 sekvence SEQ ID č. 1) a ZUP350, primeru syntetizovaného s nukleotidy obsahujícími nukleotidy komplementární k antigenomové RNA viru Hepatitis delta, jak popsali Perrotta AT a Been MD (1991) Nátuře, svazek 350(4), strany 434-436, ligovanými knukleotidům identickým snukleotidy 1 - 14 (3konec primeru) sekvence SEQ ID č. 1:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGA CGTGCGTCCT CCTTCGGATG CCCAGGTCGG ACCGCGAGGA GGTGGAGATG CCATGCCGAC CCGTAATCTT ACCACT 3'
Fragment DNA se rozštěpí Pstl a Ncol a na agarosovém gelu se izoluje fragment DNA dlouhý 208 bp. Oba izolované fragmenty DNA se klonují do pCMV3AS-l, linearizovaného pomocí Pstl a Nrul, čímž se získá pCMV3AS-2. Geny kódující elicitory (příklad 5) nebo buněční inhibiční
-11CZ 291203 B6 proteiny (příklad 6) lze klonovat jako fragmenty DNA získané Ncol do jedinečného místa Ncol v pCMV3AS-2. Výsledné plazmidy odvozené od pCMV3AS-2 se rozštěpí HindlII a fragmenty
DNA obsahující chimérické geny se izolují na agarosovém gelu a ligují do pBIN19 linearizovaného pomocí HindlII. čímž se získají binární vektory pro transformaci rostlin pBINCMV3-CP, pBINCMV3-P30 respektive pBINCMV3-T 1.
Příklad 9
Konstrukce vektoru pro transformaci rostlin, který poskytuje transkript replikující se po infekci TSWV
5'-konec negativní TSWV S RNA se fúzuje přímo k místu iniciace transkripce promotoru 35S CaMV za použití dvou primerů ZUP148 (příklad 8), a primeru ZUP255:
5' ACACAATTGC TCTCCTCTCCC AAATGAAA 3' (obsahuje nukleotidy identické s nukleotidy 2608 - 2621 sekvence SEQ ID č. 8) s pZU-A jako matricí ve standardní polymerázové řetězové reakci pro DNA. Amplifikovaný 20 fragment DNA se rozštěpí EcoRV a klonuje se do pZU-A linearizovaného pomocí EcoR5.
Výsledný plazmid se rozštěpí Munl a Pstl a purifikuje se na agarosovém gelu. pTSWV-S2 se rozštěpí Pstl a Munl, inzert DNA o velikosti 2,9 kb se purifikuje na agarosovém gelu a následně se klonuje do derivátu pZU-A purifíkovaného na gelu, čímž se získá pTSWVSAS-1.
N-kódující doména pTSWVSAS-1 se nahradí jedinečným klonovacím místem Ncol a „sekyrová“ (axehead) struktura virové RNA Hepatitis delta se klonuje downstream od 3'-konce negativní TSWV S RNA, pomocí amplifíkace polymerázovou řetězovou reakcí dvou fragmentů DNA za použití pTSWVSAS-1 jako matrice. První fragment DNA se amplifíkuje za použití primerů ZUP252:
5' GACCCGAAAG GGACCAATTT C 3' (obsahuje nukleotidy komplementární k nukleotidům 911 - 930 sekvence SEQ ID č. 8) aZUP253:
5' TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 3' (obsahuje nukleotidy identické s nukleotidy 636 - 655 sekvence SEQ ID č. 8)
Fragment DNA se rozštěpí Balí a Ncol a na agarosovém gelu se izoluje fragment DNA dlouhý 40 2 69 bp (polohy 639 - 911 sekvence SEQ ID č. 8). Druhý fragment DNA se amplifíkuje za použití primerů ZUP254:
5' TTTCCATGGT GATCGTAAAA G 3' (obsahuje nukleotidy komplementární k nukleotidům 140-157 sekvence SEQ ID č. 8) a ZUP255, primeru syntetizovaného s nukleotidy obsahujícími nukleotidy komplementární k antigenomové RNA viru Hepatitis delta, jak popsali Perrotta AT a Been MD (1991) Nátuře, svazek 350(4), strany 434 - 436, ligovanými k nukleotidům identickým s nukleotidy 1-14 (3konec primeru) sekvence SEQ ID č. 8:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTC CTTCGGATGC
CCAGGTCGGA CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACC CAGAGCAATC
GTGTC 3'
-12CZ 291203 B6
Fragment DNA se rozštěpí Pstl a Ncol a na agarosovém gelu se izoluje fragment DNA dlouhý 245 bp. Oba izolované fragmenty DNA se klonují do pTSWVSAS-1, linearizovaného pomocí Pstl a Balí, čímž se získá pTSWVSAS-2. Geny kódující elicitory (příklad 5) nebo buněčné inhibiční proteiny (příklad 6) se klonují jako fragmenty DNA získané Ncol do jedinečného místa Ncol v pTSWVSAS-2. Výsledné plazmidy odvozené od pTWSVSAS-2 se rozštěpí Xbal a fragmenty DNA obsahující chimérické geny se izolují na agarosovém gelu a ligují do pBIN19 linearizovaného pomocí Xbal, čímž se získají binární vektory pro transformaci rostlin pBINTSWVS-CP (SEQ ID č. 8), pBINTSWVS-p30, respektive pBINTSWVS-Tl.
Příklad 10
Selekce vhodných hostitelských rostlin
1) Tabák: Nicotiana tabacum var. Samsun EN je kultivar tabáku obsahující Ν'-gen N. sylvestris vykazující po infekci ToMV hypersenzitivní odpověď. CP zToMV vyvolává v tomto hostiteli silnou hypersenzitivní obrannou reakci.
2) Rajče: Lycopersicon esculentum var. ATV847 je rodičovská linie pro komerční hybridy Yaiza a Gamma. Tato linie rajčete obsahuje gen rezistence vůči ToMV, Tm-22. Bylo zjištěno, že P30 zToMV vyvolává v tomto genotypu resistag30 nt hypersenzitivní odpověď (Fraset (1986) CRC Crit. Rev. Plant. Sci. 3: 257; Keen (1990) Ann. Rev. Genet. 24: 447).
Příklad 11
Transformace binárních vektorů do rostlinného materiálu (tabáku a rajčete)
Způsoby transferu binárních vektorů do rostlinného materiálu jsou odborníkovi dobře známé. Odchylky v postupech se provádějí například z důvodů rozdílů v použitých kmenech Agrobacteria, rozdílných zdrojů explantátového materiálu, rozdílů v regeneračních systémech v závislosti jak na kultivaru, tak druhu použité rostliny.
Binární vektory pro transformaci rostlin, jak jsou popsány výše, se použijí v experimentální transformaci rostlin podle následujícího postupu. Konstrukty binárních vektorů se přenesou pomocí triparentálního spojování (tri-parental mating) do akceptorového kmene Agrobacterium tumefaciens, následně se provede Southemova analýza bývalých konjugátů pro ověření správného přenosu konstruktu do akceptorového kmene, inokulace a kokultivace sterilního explantátového materiálu s vybraným kmenem Agrobacterium tumefaciens, selektivní usmrcení použitého kmene Agrobacterium tumefaciens vhodnými antibiotiky, selekce transformovaných buněk pomocí pěstování na selekčním médiu obsahujícím kanamycin, přenos pletiva na médium indukující tvorbu prýtů, přenos vybraných prýtů na médium indukující tvorbu kořenů, přenos rostlinek do půdy, testování neporušenosti konstruktu pomocí Southemovy analýzy izolované celkové DNA z transgenické rostliny, a testování správného fungování inzertovaného chimérického genu analýzou pomocí Northem blottingu nebo/a pomocí enzymových testů a westemblottingu proteinů (Ausubel a kol., viz výše, (1987)).
Příklad 12
Exprese chimérických sekvencí v rostlinných buňkách tabáku a rajčete
Z listů regenerovaných rostlin se extrahuje RNA za použití následujícího postupu. 200 mg listového materiálu se rozetře nájemný prášek v kapalném dusíku. Přidá se 800 μΐ pufru pro extrakci RNA (lOOmM Tris-HCl (pH 8,0), 500mM chlorid sodný, 2mM kyselina ethylendiamintetra
-13CZ 291203 B6 octová, 200mM β-merkaptoethanol, 0,4% SDS), homogenát se extrahuje fenolem a nukleové kyseliny se izolují alkoholovou precipitací. Nukleové kyseliny se resuspendují v 0,5 ml lOmM Tris-HCl (pH 8,0), lmM kyseliny ethylendiamintetraoctové, přidá se chlorid lithný na celkovou koncentraci 2 M, směs se nechá stát na ledu po dobu maximálně 4 hodin a RNA se izoluje centrifugách RNA se resuspenduje ve 400 μΐ lOmM Tris-HCl (pH 8,0), lmM kyseliny ethylendiamintetraoctové, precipituje se alkoholem, a nakonec se resuspenduje v 50 μΐ lOmM Tris-HCl (pH 8,0), lmM kyseliny ethylendiamintetraoctové. RNA se separují na glyoxal/agarosových gelech a přenesou se na Genescreen, jak popsali van Grinsven a kol. ((1986), Theor. Appl. Gen. 73: 94-101). Rekombinantní sekvence virové RNA se detekují za použití DNA- nebo RNAsond značených [32P], [35S] nebo pomocí neradioaktivních způsobů značení. Analýzou pomocí northem blottingu se stanoví, vjakém rozsahu regenerované rostliny exprimují chimérické rekombinantní virové geny.
Rostliny transformované rekombinantními sekvencemi virové DNA se rovněž podrobí western blottingu po inokulaci příslušným virem. Proteiny se extrahují z listů transformovaných rostlin třením v pufru podle postupu, který popsal Laemmli ((1970), Nátuře 244: 29). Část proteinů o hmotnosti 50 pg se podrobí elektroforéze v 12,5% SDS-polyakrylamidovém gelu v podstatě tak, jak popsal Laemmli, viz výše (1970). Separované proteiny se přenesou elektroforeticky na nitrocelulosu, jak popsali Towbin a kol. ((1979), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350). Přenesené proteiny se podrobí reakci s antisérem vytvořeným proti purifikovaným částicím ToMV nebo proti purifíkovanému proteinu P30, jak popsali Towbin a kol., viz výše (1979). Na základě výsledků analýzy pomocí western blottingu se zjistí, že transformované rostliny exprimují po inokulaci příslušným virem elicitorové proteiny.
Příklad 13
Rezistence rostlin tabáku a rajčete vůči infekci CMV nebo TSWV
Transformované rostliny se pěstují ve skleníku za standardních karanténních podmínek za účelem zabránění infekci patogeny. Transformované rostliny se samoopylí a semena se sklidí. U rostlin potomstva se analyzuje segregace inzertovaného genu a následně se infikují CMV (virus mozaiky okurky nebo TSWV (virus skvrnitého vadnutí rajčete) pomocí mechanické inokulace. Pletivo z rostlin systémově infikovaných CMV nebo TSWV se rozmělní v pětinásobném objemu ledově chladného inokulačního pufru (lOmM fosfátový pufr) a touto směsí se za přítomnosti karborundového prášku potřou první dva plně rozevřené listy přibližně 5 týdnů starých semenáčků. U inokulovaných rostlin se zkoumá vývoj symptomů během 3 týdnů po inokulaci.
Rostliny obsahující sekvence DNA příbuzné CMV nebo sekvence DNA příbuzné TSWV vykazují sníženou citlivost vůči infekci CMV nebo TSWV ve srovnání s netransformovanými kontrolními rostliny, které vykazují těžké systémové symptomy CMV nebo TSWV během 7 dnů po inokulaci.
Zobrazení sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1860 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá
-14CZ 291203 B6 (vi) původní zdroj:
(A) organismus: chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 123..599 to (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 897..1550 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:
GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT
120
GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG
167
1 5 10 15
TCT GTA TGG GCT GAC CCT ATA GAA TTG TTA AAC GTT TGT ACA AAT TCG
Ser Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn Ser
20 25 30
TTA GGT AAC CAG TTT CAA ACA CAG CAA GCA AGA ACT ACT GTT CAA CAG
Leu Gly Asn Gin Phe Gin Thr Gin Gin Ala Arg Thr Thr Val Gin Gin
35 40 45
CAG TTC AGC GAG GTG TGG AAA CCT TTC CCT CAG AGC ACC GTC AGA TTT
Gin Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gin Ser Thr Val Arg Phe
50 5S 60
CCT GGC GAT GTT TAT AAG GTG TAC AGG TAC AAT GCA GTT TTA GAT CCT
Pro Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Val Leu Asp Pro
65 70 75
215
263
311
359
-15CZ 291203 B6
CTA Leu 80 ATT ACT GCG TTG Ile Thr Ala Leu CTG GGG TCT TTC GAT ACT AGG AAT AGA ATA ATC 407
Leu Gly 85 Ser Phe Asp Thr 90 Arg Asn Arg Ile Ile 95
GAA GTA GAA AAC CAG CAG AAT CCG ACA ACA GCT GAA ACG TTA GAT GCT 455
Glu Val Glu Asn Gin 100 Gin Asn Pro Thr Thr 105 Ala Glu Thr Leu Asp 110 Ala
ACC CGC AGG GTA GAC GAC GCT ACG GTT GCA ATT CGG TCT GCT ATA AAT 503
Thr Arg Arg Val 115 Asp Asp Ala Thr Val 120 Ala Ile Arg Ser Ala 125 Ile Asn
AAT TTA GTT AAT GAA CTA GTA AGA GGT ACT GGA CTG TAC AAT CAA AAT 551
Asn Leu Val 130 Asn Glu Leu Val Arg 135 Gly Thr Gly Leu Tyr 140 Asn Gin Asn
ACT TTT GAA AGT ATG TCT GGG TTG GTC TGG ACC TCT GCA CCT GCA TCT 599
Thr Phe 145 Glu Ser Met Ser Gly 150 Leu Val Trp Thr Ser 155 Ala Pro Ala Ser
TAAATCCATG GTGTATTAGT ATATAAGTAT GTGTCCTGTG TGAGTTGATA CAGTAGACAT CACATCTGGT TTTAGTAAGC CTACATCACA TTGAGTCCCT TACTTTCTCA TGGATGCTTC ATATAGAGAG TGTGTGTGCT GTGTTTTCTC
TGTGAGTCTG TACATAATAC TATATCTATA659
CTGTGACGCG ATGCCGTGTT GAGAAGGGAA719
GTTTTGAGGT TCAATTCCTC ATACTCCCTG779
TCCGCGAGAT TGCGTTATTG TCTACTGACT839
TTTTGTGTCG TAGAATTGAG TCGAGTC896
ATG Met 1 GAC AAA TCT Ser GAA TCA Glu Ser 5 ACC AGT GCT GGT CGT AAC CGT CGA CGT CGT 944
Asp Lys Thr Ser Ala Gly 10 Arg Asn Arg Arg Arg Arg 15
CCG CGT CGT GGT TCC CGC TCC GCC CCC TCC TCC GCG GAT GCT AAC TTT 992
Pro Arg Arg Gly 20 Ser Arg Ser Ala Pro 25 Ser Ser Ala Asp Ala 30 Asn Phe
AGA GTC TTG TCG CAG CAG CTT TCG CGA CTT AAT AAG ACG TTA GCA GCT 1040
Arg Val Leu 35 Ser Gin Gin Leu Ser 40 Arg Leu Asn Lys Thr 45 Leu Ala Ala
GGT CGT CCA ACT ATT AAC CAC CCA ACC TTT GTA GGG AGT GAA CGC TGT 1088
Gly Arg 50 Pro Thr Ile Asn His 55 Pro Thr Phe Val Gly 60 Ser Glu Arg Cys
AAA CCT GGG TAC ACG TTC ACA TCT ATT ACC CTA AAG CCA CCA AAA ATA 1136
Lys 65 Pro Gly Tyr Thr Phe 70 Thr Ser Ile Thr Leu 75 Lys Pro Pro Lys Ile 80
GAC CGT GGG TCT TAT TAC GGT AAA AGG TTG TTA TTA CCT GAT TCA GTC 1184
Asp Arg Gly Ser Tyr 85 Tyr Gly Lys Arg Leu 90 Leu Leu Pro Asp Ser 95 Val
ACG GAA TAT GAT AAG AAA CTT GTT TCG CGC ATT CAA ATT CGA GTT AAT 1232
Thr Glu Tyr Asp 100 Lys Lys Leu Val Ser 105 Arg Ile Gin Ile Arg 110 Val Asn
CCT TTG CCG AAA TTC GAT TCT ACC GTG TGG GTG ACA GTC CGT AAA GTT 1280
Pro Leu Pro 115 Lys Phe Asp Ser Thr 120 Val Trp Val Thr Val 125 Arg Lys Val
CCT GCC TCC TCG GAC TTA TCC GTT GCC GCC ATC TCT GCT ATG TTT GCG 1328
Pro Ala 130 Ser Ser Asp Leu Ser 135 Val Ala Ala Ile Ser 140 Ala Met Phe Ala
- 16CZ 291203 B6
GAC Asp 145 GCC GCA TTT GGA Ala Ala Phe Gly GTC CAA GCT AAC AAC AAA TTG TTG TAT GAT CTT 1376
Val Gin 150 Ala Asn Asn Lys 155 Leu Leu Tyr Asp Leu 160
TCG GCG GGA GCC TCA CCG GTA CTG GTT TAT CAG TAC ATG CGC GCT GAT 1424
Ser Ala Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gin Tyr Met Arg Ala Asp
165 170 175
ATA GGT GAC ATG AGA AAG TAC GCC GTC CTC GTG TAT TCA AAA GAC GAT 1472
Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp
180 185 190
GCG CTC GAG ACG GAC GAG CTA GTA CTT CAT GTT GAC ATC GAG CAC CAA 1520
Ala Leu Glu Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gin
195 200 205
CGC ATT CCC ACA TCT AGA GTA CTC CCA GTC TGATTCCGTG TTCCCAGAAC 1570
Arg Ile Pro Thr Ser Arg Val Leu Pro val
210 215
CCTCCCTCCG ATTTCTGTGG CGGGAGCTGA GTTGGCAGTT CTGCTATAAA CTGTCTGAAG 1630
TCACTAAACG TTTTACGGTG AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA ATGGTCAGTC 1690
GTGGAGAAAT CCACGCCAGC AGATTTACAA ATCTCTGAGG CGCCTTTGAA ACCATCTCCT 1750
AGGTTTTTTC GGAAGGACTT CGGTCCGTGT ACCTCTAGCA CAACGTGCTA GTCTTAGGGT 1810
ACGGGTGCCC CTTGTCTTCG CACCTTCGTG GGGGCTCCAA AAGGAGACCA 1860
Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 159 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová io (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:
Met 1 Ala Tyr Ser Ile 5 Thr Ser Pro Ser Gin Phe Val Phe Leu Ser Ser
10 15
Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn Ser Leu
20 25 30
Gly Asn Gin Phe Gin Thr Gin Gin Ala Arg Thr Thr Val Gin Gin Gin
35 40 45
Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gin Ser Thr Val Arg Phe Pro
15 50 55 60
-17CZ 291203 B6
Gly 65 Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Val Leu Asp Pro Leu 80
70 75
Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ser Phe Asp Thr Arg Asn Arg Ile Ile Glu
85 90 95
Val Glu Asn Gin Gin Asn Pro Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr
100 105 110
Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn Asn
115 120 125
Leu Val Asn Glu Leu Val Arg Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gin Asn Thr
130 135 140
Phe Glu Ser Met Ser Gly Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser
145 150 155
Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 218 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová ío (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:
Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro Arg Arg Gly 20 Ser Arg Ser Ala Pro 25 Ser Ser Ala Asp Ala 30 Asn Phe
Arg Val Leu 35 Ser Gin Gin Leu Ser 40 Arg Leu Asn Lys Thr 45 Leu Ala Ala
Gly Arg 50 Pro Thr Ile Asn His 55 Pro Thr Phe Val Gly 60 Ser Glu Arg Cys
Lys 65 Pro Gly Tyr Thr Phe 70 Thr Ser Ile Thr Leu 75 Lys Pro Pro Lys Ile 80
Asp Arg Gly Ser Tyr 85 Tyr Gly Lys Arg Leu 90 Leu Leu Pro Asp Ser 95 Val
Thr Glu Tyr Asp 100 Lys Lys Leu Val Ser 105 Arg Ile Gin Ile Arg no- Val Asn
18CZ 291203 B6
Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Val Trp 120 Val Thr Val 125 Arg Lys Val
115
Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Ala Ala Ile Ser Ala Met Phe Ala
130 135 140
Asp Ala Ala Phe Gly Val Gin Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu
145 150 155 160
Ser Ala Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gin Tyr Met Arg Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp
180 185 190
Ala Leu Glu Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gin
195 200 205
Arg Ile Pro Thr Ser Arg Val Leu Pro Val
210 215
Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1696 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (vi) původní zdroj:
(A) organismus: chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 123..437 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:
GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT 60
GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG 120
CC ATG GCA TGC GAC TAC ACT TGC GGT TCT AAC TGC TAC TCT TCT TCA 167
Met Ala Cys Asp Tyr Thr Cys Gly Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Ser
1 5 10 15
GAC GTT TCT ACT GCT CAA GCT GCC GGA TAT AAA CTT CAC GAA GAC GGT
Asp Val Ser Thr Ala Gin Ala Ala Gly Tyr Lys Leu His Glu Asp Gly
20 25 30
GAA ACT GTT GGA TCT AAT TCT TAC CCA CAC AAA TAC AAC AAC TAC GAA
Glu Thr Val Gly Ser Asn Ser Tyr Pro His Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu
- 19CZ 291203 B6
40 45
GGT Gly TTT GAT TTC TCT GTG AGC TCT CCC TAC TAC GAA TGG CCT ATC CTC 311
Phe Asp 50 Phe Ser Val Ser Ser 55 Pro Tyr Tyr Glu Trp 60 Pro Ile Leu
TCT AGC GGT GAT GTT TAC TCT GGT GGT TCT CCA GGT GCT GAC CGT GTC 359
Ser Ser Gly Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Pro Gly Ala Asp Arg Val
65 70 75
GTC TTC AAC GAA AAC AAC CAA CTA GCT GGT GTT ATC ACT CAC ACT GGT 407
Val Phe Asn Glu Asn Asn Gin Leu Ala Gly Val 11· Thr His Thr Gly
80 85 90 95
GCT TCT GGT AAC AAC TTC GTT GAA TGT ACA TAACCATGGT GTATTAGTAT 457
Ala Ser Gly Asn Asn Phe Val Glu Cys Thr
100 105
ATAAGTATTG TGAGTCTGTA CATAATACTA TATCTATAGT GTCCTGTGTG AGTTGATACA 517
GTAGACATCT GTGACGCGAT GCCGTGTTGA GAAGGGAACA CATCTGGTTT TAGTAAGCCT 577
ACATCACAGT TTTGAGGTTC AATTCCTCAT ACTCCCTGTT GAGTCCCTTA CTTTCTCATG 637
GATGCTTCTC CGCGAGATTG CGTTATTGTC TACTGACTAT ATAGAGAGTG TGTGTGCTGT 697
GTTTTCTCTT TTGTGTCGTA GAATTGAGTC GAGTCATGGA CAAATCTGAA TCAACCAGTG 757
CTGGTCGTAA CCGTCGACGT CGTCCGCGTC GTGGTTCCCG CTCCGCCCCC TCCTCCGCGG 817
ATGCTAACTT TAGAGTCTTG TCGCAGCAGC TTTCGCGACT TAATAAGACG TTAGCAGCTG 877
GTCGTCCAAC TATTAACCAC CCAACCTTTG TAGGGAGTGA ACGCTGTAAA CCTGGGTACA 937
CGTTCACATC TATTACCCTA AAGCCACCAA AAATAGACCG TGGGTCTTAT TACGGTAAAA 997
GGTTGTTATT ACCTGATTCA GTCACGGAAT ATGATAAGAA ACTTGTTTCG CGCATTCAAA 1057
TTCGAGTTAA TCCTTTGCCG AAATTCGATT CTACCGTGTG GGTGACAGTC CGTAAAGTTC 1117
CTGCCTCCTC GGACTTATCC GTTGCCGCCA TCTCTGCTAT GTTTGCGGAC GGAGCCTCAC 1177
CGGTACTGGT TTATCAGTAC GCCGCATTTG GAGTCCAAGC TAACAACAAA TTGTTGTATG 1237
ATCTTTCGGC GATGCGCGCT GATATAGGTG ACATGAGAAA GTACGCCGTC CTCGTGTATT 1297
CAAAAGACGA TGCGCTCGAG ACGGACGAGC TAGTACTTCA TGTTGACATC GAGCACCAAC 1357
GCATTCCCAC ATCTAGAGTA CTCCCAGTCT GATTCCGTGT TCCCAGAACC CTCCCTCCGA 1417
TTTCTGTGGC GGGAGCTGAG TTGGCAGTTC TGCTATAAAC TGTCTGAAGT CACTAAACGT 1477
TTTACGGTGA ACGGGTTGTC CATCCAGCTT ACGGCTAAAA TGGTCAGTCG TGGAGAAATC 1537
CACGCCAGCA GATTTACAAA TCTCTGAGGC GCCTTTGAAA CCATCTCCTA GGTTTTTTCG 1597
GAAGGACTTC GGTCCGTGTA CCTCTAGCAC AACGTGCTAG TCTTAGGGTA CGGGTGCCCC 1657
TTGTCTTCGC ACCTTCGTGG GGGCTCCAAA AGGAGACCA 1696
-20CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 105 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:
Met Ala Cys Asp Tyr Thr Cys Gly Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Ser Asp
1 5 10 15
Val Ser Thr Ala Gin Ala Ala Gly Tyr Lys Leu His Glu Asp Gly Glu
20 25 30
Thr Val Gly Ser Asn Ser Tyr Pro His Lys Tyr Asn Asn Tyr Glu Gly
35 40 45
Phe Asp Phe Ser Val Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Trp Pro Ile Leu Ser
50 55 60
Ser Gly Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Pro Gly Ala Asp Arg Val Val
65 70 75 80
Phe Asn Glu Asn Asn Gin Leu Ala Gly Val Ile Thr His Thr Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Asn Asn Phe Val Glu Cys Thr
100 105
Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2173 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (vi) původní zdroj:
(A) organismus: chimérická RNA 3 viru mozaiky okurky (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 123..914
-21 CZ 291203 B6 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:
GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG
CC ATG GCT CTA GTT GTT AAA GGT AAG GTA AAT ATT AAT GAG TTT ATC Met Ala Leu Val Val Lys Gly Lys Val Asn Ile Asn Glu Phe Ile 15 10 15
GAT Asp CTG TCA Leu Ser AAG TCT GAG AAA CTT CTC CCG TCG ATG TTC ACG CCT GTA Val
Lys Ser Glu 20 Lys Leu Leu Pro 25 Ser Met Phe Thr Pro 30
AAG AGT GTT ATG GTT TCA AAG GTT GAT AAG ATT ATG GTC CAT GAA AAT
Lys Ser Val Met Val Ser Lys Val Asp Lys Ile Met Val His Glu Asn
35 40 45
GAA TCA TTG TCT GAA GTA AAT CTC TTA AAA GGT GTA AAA CTT ATA GAA
Glu Ser Leu Ser Glu Val Asn Leu Leu Lys Gly Val Lys Leu Ile Glu
50 55 60
GGT GCG TAT GTT TGC TTA GTT GGT CTT GTT GTG TCC GGT GAG TGG AAT
Gly Gly Tyr Val Cys Leu Val Gly Leu Val Val Ser Gly Glu Trp Asn
65 70 75
TTC CCA GAT AAT CGC CGT GGT GGT GTG AGT GTC TGC ATG GTT GAC AAG
Phe Pro Asp Asn Arg Arg Gly Gly Val Ser Val cys Met Val Asp Lys
ao 85 90 95
AGA ATG GAA AGA GCG GAC GAA GCC ACA CTG GGG TCA TAT TAC ACT GCT
Arg Met Glu Arg Ala Asp Glu Ala Thr Leu Gly Ser Tyr Tyr Thr Ala
100 105 110
GCT GCT AAA AAG CGG TTT CAG TTT AAA GTG GTC CCA AAT TAC GGT ATT
Ala Ala Lys Lys Arg Phe Gin Phe Lys Val Val Pro Asn Tyr Gly Ile
115 120 125
ACA ACA AAG GAT GCA GAA AAG AAC ATA TGG CAG GTC TTA GTA AAT ATT
Thr Thr Lys Asp Ala Glu Lys Asn Ile Trp Gin Val Leu Val Asn Ile
130 135 140
AAA AAT GTA AAA ATG AGT GCG GGC TAC TGC CCT TTG TCA TTA GAA TTT
Lys Asn Val Lys Met Ser Ala Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Leu Glu Phe
145 150 155
GTG TCT GTG TGT ATT GTT TAT AAA AAT AAT ATA AAA TTG GGT TTG AGG
Val Ser Val Cys Ile Val Tyr Lys Asn Asn Ile Lys Leu Gly Leu Arg
160 165 170 175
120
167
215
263
311
359
407
455
503
551
599
647
-22CZ 291203 B6
GAG Glu AAA GTA ACG AGT GTG AAC GAT GGA GGA CCC ATG GAA CTT TCG GAA Ser Glu 190 695
Lys Val Thr Ser Val 1S0 Asn Asp Gly Gly 185 Pro Met Glu Leu
GAA GTT GTT GAT GAG TTC ATG GAG AAT GTT CCA ATG TCG GTT AGA CTC 743
Glu Val Val Asp Glu Phe Met Glu Asn Val Pro Met Ser Val Arg Leu
195 200 205
GCA AAG TTT CGA ACC AAA TCC TCA AAA AGA GGT CCG AAA AAT AAT AAT 791
Ala Lys Phe Arg Thr Lys Ser Ser Lys Arg Gly Pro Lys Asn Asn Asn
210 215 220
AAT TTA GGT AAG GGG CGT TCA GGC GGA AGG CCT AAA CCA AAA AGT TTT 839
Asn Leu Gly Lys Gly Arg Ser Gly Gly Arg Pro Lys Pro Lys Ser Phe
225 230 235
GAT GAA GTT GAA AAA GAG TTT GAT AAT TTG ATT GAA GAT GAA GCC GAG 837
Asp Glu Val Glu Lys Glu Phe Asp Asn Leu Ile Glu Asp Glu Ala Glu
240 245 250 255
ACG TCG GTC GCG GAT TCT GAT TCG TAT TAACCATGGT GTATTAGTAT 934
Thr Ser Val Ala Asp Ser Asp Ser Tyr
260
ATAAGTATTG TGAGTCTGTA CATAATACTA TATCTATAGT GTCCTGTGTG AGTTGATACA 994
GTAGACATCT GTGACGCGAT GCCGTGTTGA GAAGGGAACA CATCTGGTTT TAGTAAGCCT 1054
ACATCACAGT TTTGAGGTTC AATTCCTCAT ACTCCCTGTT GAGTCCCTTA CTTTCTCATG 1114
GATGCTTCTC CGCGAGATTG CGTTATTGTC TACTGACTAT ATAGAGAGTG TGTGTGCTGT 1174
GTTTTCTCTT TTGTGTCGTA GAATTGAGTC GAGTCATGGA CAAATCTGAA TCAACCAGTG 1234
CTGGTCGTAA CCGTCGACGT CGTCCGCGTC GTGGTTCCCG CTCCGCCCCC TCCTCCGCGG 1294
ATGCTAACTT TAGAGTCTTG TCGCAGCAGC TTTCGCGACT TAATAAGACG TTAGCAGCTG 1354
GTCGTCCAAC TATTAACCAC CCAACCTTTG TAGGGAGTGA ACGCTGTAAA CCTGGGTACA 1414
CGTTCACATC TATTACCCTA AAGCCACCAA AAATAGACCG TGGGTCTTAT TACGGTAAAA 1474
GGTTGTTATT ACCTGATTCA GTCACGGAAT ATGATAAGAA ACTTGTTTCG CGCATTCAAA 1534
TTCGAGTTAA TCCTTTGCCG AAATTCGATT CTACCGTGTG GGTGACAGTC CGTAAAGTTC 1594
CTGCCTCCTC GGACTTATCC G7TGCCGCCA TCTCTGCTAT GTTTGCGGAC GCCGCATTTG 1654
GAGTCCAAGC TAACAACAAA TTGTTGTATG ATCTTTCGGC GGGAGCCTCA CCGGTACTGG 1714
TTTATCAGTA CATGCGCGCT GATATAGGTG ACATGAGAAA GTACGCCGTC CTCGTGTATT 1774
CAAAAGACGA TGCGCTCGAG ACGGACGAGC TAGTACTTCA TGTTGACATC GAGCACCAAC 1834
GCATTCCCAC ATCTAGAGTA CTCCCAGTCT GATTCCGTGT TCCCAGAACC CTCCCTCCGA 1894
TTTCTGTGGC GGGAGCTGAG TTGGCAGTTC TGCTATAAAC TGTCTGAAGT CACTAAACGT 1954
TTTACGGTGA ACGGGTTGTC CATCCAGCTT ACGGCTAAAA TGGTCAGTCG TGGAGAAATC 2014
CACGCCAGCA GATTTACAAA TCTCTGAGGC GCCTTTGAAA CCATCTCCTA GGTTTTTTCG 2074
GAAGGACTTC GGTCCGTGTA CCTCTAGCAC AACGTGCTAG TCTTAGGGTA CGGGTGCCCC 2134
TTGTCTTCGC ACCTTCGTGG GGGCTCCAAA AGGAGACCA 2173
-23CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 264 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární io (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:
Met 1 Ala Leu Val Val 5 Lys Gly Lys
Leu Ser Lys Ser 20 Glu Lys Leu Leu
Ser Val Met 35 Val Ser Lys Val Asp 40
Ser Leu 50 Ser Glu Val Asn Leu 55 Leu
Gly 65 Tyr Val Cys Leu Val 70 Gly Leu
Pro Asp Asn Arg Arg 85 Gly Gly Val
Met Glu Arg Ala 100 Asp Glu Ala Thr
Ala Lys Lys 115 Arg Phe Gin Phe Lys 120
Thr Lys 130 Asp Ala Glu Lys Asn 135 Ile
Asn. 145 Val Lys Met Ser Ala 150 Gly Tyr
Ser Val Cys Ile Val 165 Tyr Lys Asn
Lys Val Thr Ser 180 Val Asn Asp Gly
Val Val Asp 195 Glu Phe Met Glu Asn 200
Lys Phe 210 Arg Thr Lys Ser Ser 215 Lys
Leu 225 Gly Lys Gly Arg Ser 230 Gly Gly
Glu Val Glu Lys Glu 245 Phe Asp Asn
Ser Val Ala Asp 260 Ser Asp Ser Tyr
Val Asn 10 Ile Asn Glu Phe Ile 15 Asp
Pro 25 Ser Met Phe Thr Pro 30 Val Lys
Lys Ile Met Val His 45 Glu Asn Glu
Lys Gly Val Lys 60 Leu Ile Glu Gly
Val Val Ser 75 Gly Glu Trp Asn Phe 80
Ser Val 90 Cys Met Val Asp Lys 95 Arg
Leu 105 Gly Ser Tyr Tyr Thr 110 Ala Ala
Val Val Pro Asn Tyr 125 Gly Ile Thr
Trp Gin Val Leu 140 Val Asn Ile Lys
Cys Pro Leu 155 Ser Leu Glu Phe Val 160
Asn Ile 170 Lys Leu Gly Leu Arg 175 Glu
Gly 185 Pro Met Glu Leu Ser 190 Glu Glu
Val Pro Met Ser Val 205 Arg Leu Ala
Arg Gly Pro Lys 220 Asn Asn Asn Asn
Arg Pro Lys 235 Pro Lys Ser Phe Asp 240
Leu Ile 250 Glu Asp Glu Ala Glu 255 Thr
-24CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2621 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (vi) původní zdroj:
(A) organismus: chimérická S RNA viru skvrnitého vadnutí rajčete (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:
AGAGCAATCG TGTCAATTTT GTGTTCATAC CTTAACACTC AGTCTTACAA ATCATCACAT 60
TAAGAACC7A AGAAACGACT GCGGGATACA GAGTTGCACT TTCGCACCTT GAGTTACATA 120
CGGTCAAAGC ATATAACAAC 7TTTACGATC ACCATGGCTT ACTCAATCAC TTCTCCATCG 180
CAATTTGTGT TTTTGTCATC TGTATGGGCT GACCCTATAG AATTGTTAAA CGTTTGTACA 240
AATTCGTTAG GTAACCAGTT TCAAACACAG CAAGCAAGAA CTACTGTTCA ACAGCAGTTC 300
AGCGAGGTGT GGAAACCTTT CCCTCAGAGC ACCGTCAGAT TTCCTGGCGA TGTTTATAAG 360
GTGTACAGG7 ACAATGCAGT TTTAGATCCT CTAATTACTG CGTTGCTGGG GTCTTTCGAT 420
ACTAGGAATA GAATAATCGA AGTAGAAAAC CAGCAGAATC CGACAACAGC TGAAACGTTA 480
GATGCTACCC GCAGGGTAGA CGACGCTACG GTTGCAATTC GGTCTGCTAT AAATAATTTA 540
GTTAATGAAC TAGTAAGAGG TACTGGACTG TACAATCAAA ATACTTTTGA AAGTATGTCT 600
GGGTTGGTCT GGACCTCTGC ACCTGCATCT TAAATCCATG GCTGTAAGTT AAATTATAAA 660
AAAC-CCTATA AATATATAAA gctttcttta TCTTTATTGC TTGTGCTTGC TTAGTGTGTT 720
AAATTTTAAA TAAGTGTGTT TAATTAAAGT TTGCTTTCTG TGTGTTGTGC TTAATAAATA 780
ATAAAATAAC AAAAAGAACG AAAACAAAAA ATAAATAAAA TAAAAATAAA ATAAAAATAA 840
AATAAAATAA ΆΆΑΤΑΑΑΑΤΑ AAAAATAAAA AACAAAAAAC AAAAAACAAA AACAAAACCC 900
-25CZ 291203 B6
AAATTTGGCC AAATTGGTCC CTTTCGGGTC TTTTTGGTTT TTCGTTTTTT aattttttgt 960
TGTTTTTATT TCATTTTTTG ATTTTATTTT ATTTTAATTT TATTTTCATT TTTATTTTTT 1020
GTTTTTATGG TTTCTACTAG ACAGGAGGAA TTTGAAAGAG ATGACAAACA GAGAAATAAT 1080
TATAAGTAAA GAAAGAAAAT AAACATAACA TAATTAGAAA AAGCTGGACA AAGCAAGATT 1140
ATTTTGATCC TGAAGCATAC gcttccttaa CCTTAGATTC TTTCTTTTTG ATCCCGCTTA 1200
AATCAAGCTT TAACAAAGAT TTTGCAACTG AAATAGATTG TGGAGAAATT TTAATTTCTC 1260
CTCTGGCAAA GTCTATCTTC CATGAAGGGA TTTGGATGCT GTCTAAGTAA GACATAGTTT 1320
GTGTGTTAGA TGGAAGACAT TCAAGTGTTT TTGAAAGGAA ATATTTCCTT TTGTAGGCAT 1380
CTTCACTGTA ATTCAAGGTT CTTTCACCTA AATCTAACTT TCCAGGAGTT AGCTCAAGGT 1440
TGTTCAAAGT GTAGATGATT ACATCTTCTT GCAAGTTAGT TGCAAAGAAC TTGTGCAAAG 1500
ATGTGTGAGT TTCGAGCCAG AGCATTGGAA CCGATCCTTT GGGGTATGAA GGGTCATGAA 1560
CAATGTTGTA AGGCTCCTTT AAATCAGAAA ACATCATTGA TAATTCAAAA GGAGCTTTGC 1620
ATTTGCGAAT TGGGAGCTGA TGCTTGCAAA TAACAGTAAT GTTTAAAGCT GTCTCAACAC 1680
TGTTATGGTT TGGAATGCAG GCAATAGATA AATAAAATGT TTTGTTTGTT TCATCTCCTG 1740
CAACCTTGAA CAATTTCTGA ATGGAAACCT GCTTCAAAAC CTTTGGAACC CTTAGCCAGA 1800
GGCTCAGCTT GAAATGAGAA TCAGTGGAAG CTTGAGAGTT AGGCATGATG TTGTTTTCTG 1860
CTGACATGAG CAGAGATTTC ACTGCAAGAG AATTTACAGT TCTGTTGTTG CTTTCAACTT 1920
GATTGAAATT TGGCTTGAAA CTGTACAGCC ATTCATGGAC ATTTCTGTTA GGAGATAGAA 1980
CATTCACTTT GCCTAAAGCC TGATTATAGC ACATCTCGAT CTTATAGGTA TGCTCTTTGA 2040
CACAAGACAA AGAGCCTTTG TTTGCAGCTT CAATGTATTT GTCATTGGGA ATTATGTCTT 2100
TTTCTTGGAG CTGGAATCGG TCTGTAATAT CAGATCTGTT CATGATAGAT TCAATAGAGT 2160
GGAGCTGGGC AGGAGACAAA ACCTTCAAAT GACCTTGATG TTTCACTCCG TTAGCATTGA 2220
CTGTATTTGA GCAAACAGAT AGTGCCAGAA CAGAGTTATC AATATTGATG CTAAAATCAA 2280
TATCATCAAA AATAGGGATA TACACATGCT GAGAAAGAAA TCTCTTCTTC TTCACAGGGA 2340
AGATCCCTAC TTTGCAGTAT AGCCAAAGGA CTACTTTGCT TCTTGAATCA GAATACAGCT 2400
GGGTCTGAAC TAGTTGAGAA CCAGTACCAA GTTCATGAAT CCAGTAAGAA TCTACAACAG 2460
CTTTACCAGA TGCAGTTGAT CCCCAGACTG AAGCTCTTGT CTGAATGATC GACTCATAAA 2520
CACTTGAAGA CATTATGGTT ATTGGTACTG TGTTCTTATT ACAGTATTGT GATTTTCTAA 2580
GTGAGGTTTG ATTATGAACA AAATTCTGAC ACAATTGCTC T 2621
-26CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 464 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární io (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:
Met Ser Ser Ser Val Tyr Glu Ser Ile Ile Gin Thr Arg Ala Ser Val
1 5 10 15
Trp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Lys Ala Val Val Asp Ser Tyr Trp Ile
20 25 30
His Glu Leu Gly Thr Gly Ser Gin Leu Val Gin Thr Gin Leu Tyr Ser
35 40 45
Asp Ser Arg Ser Lys Val Val Leu Trp Leu Tyr cys Lys Val Gly ile
50 55 60
Phe Pro Val Lys Lys Lys Arg Phe Leu Ser Gin His Val Tyr Ile Pro
65 70 75 80
Ile Phe Asp Asp Ile Asp Phe Ser Ile Asn Ile Asp Asn Ser Val Leu
85 90 95
Ala Leu Ser Val Cys Ser Asn Thr Val Asn Ala Asn Gly Val Lys His
100 105 110
Gin Gly His Leu Lys Val Leu Ser Pro Ala Gin Leu His Ser Ile Glu
115 120 125
Ser Ile Met Asn Arg Ser Asp Ile Thr Asp Arg Phe Gin Leu Gin Glu
130 135 140
Lys Asp Ile Ile Pro Asn Asp Lys Tyr Ile Glu Ala Ala Asn Lys Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Cys Val Lys Glu His Thr Tyr Lys Ile Glu Met Cys Tyr
165 170 175
Asn Gin Ala Leu Gly Lys Val Asn Val Leu Ser Pro Asn Arg Asn Val
180 185 190
His Glu Trp Leu Tyr Ser Phe Lys Pro Asn Phe Asn Gin Val Glu Ser
195 200 205
Asn Asn Arg Thr Val Asn Ser Leu Ala Val Lys Ser Leu Leu Met Ser
210 215 220
Ala Glu Asn Asn Ile Met Pro Asn Ser Gin Ala Ser Thr Asp Ser His
225 230 235 240
-27CZ 291203 B6
Phe Lys Leu Ser Leu Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Leu Lys Gin Val
245 250 255
Ser Ile Gin Lys Leu Phe Lys Val Ala Gly Asp Glu Thr Asn Lys Thr
260 265 270
Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys Ile Pro Asn His Asn Ser Val Glu Thr
275 280 285
Ala Leu Asn Ile Thr Val Ile Cys Lys His Gin Leu Pro Ile Arg Lys
290 295 300
Cys Lys Ala Pro Phe Glu Leu Ser Met Met Phe Ser Asp Leu Lys Glu
305 310 315 320
Pro Tyr Asn Ile Val His Asp Pro Ser Tyr Pro Lys Gly Ser Val Pro
325 330 335
Met Leu Trp Leu Glu Thr His Thr Ser Leu His Lys Phe Phe Ala Thr
340 345 350
Asn Leu Gin Glu Asp Val Ile Ile Tyr Thr Leu Asn Asn Leu Glu Leu
355 360 365
Thr Pro Gly Lys Leu Asp Leu Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu
370 375 380
Asp Ala Tyr Lys Arg Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys Leu
385 390 395 400
Pro Ser Asn Thr Gin Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gin Ile Pro
405 410 415
Ser Trp Lys Ile Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Lys Ile Ser Pro Gin
420 425 430
Ser Ile Ser Val Ala Lys Ser Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Gly Ile
435 440 445
Lys Lys Lys Glu Ser Lys Val Lys Glu Ala Tyr Ala Ser Gly Ser Lys
450 455 460
Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:
TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG
-28CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 11 :
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:
TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 23
Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 45 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:
TTTGGATCCA GAGCAATCGT GTCAATTTTG TGTTCATACC TTAAC 45
-29CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 52 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:
TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTT TGTTCATAAT CAAACCTCAC TT 52
Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:
GTATTAACCA TGGCTTACTC 20
-30CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:
GCACCCATGG ATTTAAGATG 20
Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:
TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 20
-31 CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 17:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:
GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 20
Informace o sekvenci SEQ ID č. 18:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 176 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:
TTTCCATGGC ATGCGACTAC
ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCA GACGTTTCTA
CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCACG
AAGACGGTGA AACTGTTGGA TCTAATTCTT
120
ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTT TTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC
176
-32CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 19:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 170 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19:
GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT
ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC
GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCA
GTTACCAGAA GCACCAGTGT GAGTGATAAC60
GACACGGTCA GCACCTGGAG AAGGACCAGA120
TTCGTAGTAG GGAGAGCTCA170
Informace o sekvenci SEQ ID č. 20:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 20:
CCACGTCTTC AAAGCAAG 18
-33CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 21:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 50 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 21:
CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCT CCAAATGAAA 50
Informace o sekvenci SEQ ID č. 22:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 22:
AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 21
-34CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 23:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 23:
GTCTTTAGCA CCATGGTG 18
Informace o sekvenci SEQ ID č. 24:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 24:
GGAGAGCCAT GGCTCGGG 18
-35CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 25:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 105 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 25:
TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTC CTTCGGATGC CCAGGTCGGA 60
CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACC CGTAATCTTA CCACT 105
Informace o sekvenci SEQ ID č. 26:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 26:
ACACAATTGC TCTCCTCTCC AAATGAAA 28
-36CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID Č. 27:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 27:
GACCCGAAAG GGACCAATTT 20
Informace o sekvenci SEQ ID č. 28:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 28:
TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 23
-37CZ 291203 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 29:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 29:
TTTCC ATGGT GATCGTAAAA G 21
Informace o sekvenci SEQ ID č. 30:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 105 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (iii) není hypotetická (vi) původní zdroj:
(A) organismus: oligonukleotid (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 30:
TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTC CTTCGGATGC CCAGGTCGGA 60
CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACC CAGAGCAATC GTGTC 105
-38CZ 291203 B6
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rekombinantní DNA-konstrukt kódující buď negativní, nebo pozitivní molekulu RNA interagující s RNA-dependentní RNA-polymerázou kódovanou virem napadajícím rostlinu a replikující v důsledku této interakce pozitivní molekulu RNA kódující alespoň jeden protein, polypeptid nebo peptid odlišný od virového obalového proteinu, elicitující přirozenou hypersenzitivní odpověď proti napadajícím patogenům, přičemž tento konstrukt je pod expresní kontrolou promotoru a polyadenylačního signálu pro konec transkripce, funkčních v rostlinách, přičemž tento konstrukt hybridizuje s DNA definovanou SEQ ID č. 8 po inkubaci po dobu 16 hodin při teplotě 49 °C a trojím promytí při teplotě 55 °C v pufru obsahujícím 0,1 x standardní citrátový pufr s chloridem sodným a 0,1 % dodecylsulfátu sodného.
  2. 2. Rekombinantní DNA-konstrukt kódující buď negativní, nebo pozitivní molekulu RNA interagující s RNA-dependentní RNA-polymerázou kódovanou virem napadajícím rostlinu a replikující v důsledku této interakce pozitivní molekulu RNA kódující alespoň jeden protein, polypeptid nebo peptid elicitující obranný mechanismus rostliny proti napadajícím patogenům, přičemž tento konstrukt je pod expresní kontrolou promotoru a terminátoru, funkčních v rostlinách, přičemž tento konstrukt hybridizuje s DNA definovanou SEQ ID č. 1 nebo SEQ ID č. 8 po inkubaci po dobu 16 hodin při teplotě 49 °C a trojím promytí při teplotě 55 °C v pufru obsahujícím 0,1 x standardní citrátový pufr s chloridem sodným a 0,1 % dodecylsulfátu sodného, a přičemž uvedený terminátor obsahuje sekvenci DNA odštěpující terminátorovou sekvenci od transkribované RNA, následovanou polyadenylačním signálem pro konec transkripce.
  3. 3. Konstrukt podle nároku 2, který obsahuje sekvenci SEQ ID č. 1.
  4. 4. Konstrukt podle nároku 2, který obsahuje sekvenci SEQ ID č. 4.
  5. 5. Konstrukt podle nároků 1 a 2, který obsahuje sekvenci SEQ ID č. 6.
  6. 6. Konstrukt podle nároků 1 a 2, který obsahuje sekvenci SEQ ID č. 8.
  7. 7. Konstrukt podle nároku 1 nebo 2, kde elicitorový protein je původem z rostlinného viru, baktérie, houby nebo háďátka.
  8. 8. Konstrukt podle nároku 2, kde buněčný inhibiční protein je vybrán ze skupiny zahrnující ribonukleasy, proteinasy, ribozomální inhibiční proteiny a proteiny degradující buněčné stěny.
  9. 9. Konstrukt podle libovolného z nároků 1 až 8, který obsahuje konstitutivní promotor vybraný ze skupiny zahrnující promotory získané z virů, hub, baktérií a rostlin.
  10. 10. Konstrukt podle nároku 9, kde promotor je vybrán ze souboru zahrnujícího promotory CaMV 19S, nopalin-syntázy, oktopin-syntázy a tepelného šoku 80.
    -39CZ 291203 B6
  11. 11. Rostliny, které obsahují ve svém genomu konstrukt podle libovolného z nároků 1 až 10.
  12. 12. Způsob přípravy rostlin podle nároku 11,vyznačující se tím, že se
    A) inzertuje do genomu rostlinné buňky DNA-konstrukt podle nároku 1 nebo nároku 2,
    B) získají se transformované buňky, a
    10 C) z transformovaných buněk se regenerují geneticky transformované rostliny.
    15 3 výkresy
CZ19953199A 1993-06-04 1994-06-03 DNA-konstrukty propůjčující rezistenci vůči virům, rostliny které je obsahují a způsob jejich přípravy CZ291203B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB939311593A GB9311593D0 (en) 1993-06-04 1993-06-04 Improvements in or relating to organic compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ319995A3 CZ319995A3 (en) 1996-04-17
CZ291203B6 true CZ291203B6 (cs) 2003-01-15

Family

ID=10736665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19953199A CZ291203B6 (cs) 1993-06-04 1994-06-03 DNA-konstrukty propůjčující rezistenci vůči virům, rostliny které je obsahují a způsob jejich přípravy

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5919705A (cs)
EP (1) EP0701620A1 (cs)
JP (1) JPH08510915A (cs)
CN (1) CN1119422C (cs)
AU (1) AU683071B2 (cs)
BR (1) BR9406711A (cs)
CA (1) CA2163523A1 (cs)
CZ (1) CZ291203B6 (cs)
GB (1) GB9311593D0 (cs)
HU (1) HUT74227A (cs)
IL (1) IL109891A0 (cs)
PL (1) PL185856B1 (cs)
RU (1) RU2136757C1 (cs)
SK (1) SK152495A3 (cs)
WO (1) WO1994029464A1 (cs)
ZA (1) ZA943917B (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1283631B1 (it) * 1996-05-09 1998-04-23 Metapontum Agrobios Srl Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute
GB9615349D0 (en) * 1996-07-22 1996-09-04 Zeneca Ltd Virus resistance in plants
US6235974B1 (en) * 1996-12-05 2001-05-22 Cornell Research Foundation, Inc. Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor
US6664447B2 (en) 2000-03-10 2003-12-16 Cornell Research Foundation, Inc. Tomato gene.Sw-5 conferring resistance to Tospoviruses
WO2001092235A1 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Bristol-Myers Squibb Pharma Company LACTAMS SUBSTITUTED BY CYCLIC SUCCINATES AS INHIBITORS OF Aβ PROTEIN PRODUCTION
AUPR155800A0 (en) * 2000-11-17 2000-12-14 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Method of enhancing virus-resistance in plants and producing virus-immune plants
DK1682667T3 (da) 2003-11-10 2010-08-23 Icon Genetics Gmbh RNA-virus afledt plantekspressionssystem
MXPA06003715A (es) 2003-11-10 2006-06-23 Icon Genetics Ag Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn.
US20080052791A1 (en) * 2006-01-30 2008-02-28 Samuel Roberts Noble Foundation drought tolerance in plants
US8669413B2 (en) * 2009-11-25 2014-03-11 Hm.Clause, Inc. Breeding and selection for resistance to melon severe mosaic virus (MeSMV)
EP4110044A1 (en) * 2020-02-26 2023-01-04 Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. Cmv resistance conferring genes
CN111549054A (zh) * 2020-05-22 2020-08-18 中国农业科学院植物保护研究所 CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用
CN111667887A (zh) * 2020-05-26 2020-09-15 海南大学 基于功能性状筛选模型的外来入侵植物的生物防治方法
CN112195288B (zh) * 2020-11-19 2024-04-26 广西壮族自治区农业科学院 同时检测辣椒四种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0298918B1 (de) * 1987-07-10 2001-09-05 Syngenta Participations AG Induzierbare Virusresistenz bei Pflanzen
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
CN1033645A (zh) * 1988-10-22 1989-07-05 中国科学院上海植物生理研究所 控制植物病毒病的基因工程方法
NL9001711A (nl) * 1989-10-03 1991-05-01 Clovis Matton N V Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.
WO1991013994A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene expression
EP0479180A3 (en) * 1990-10-05 1992-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft Virus resistant plants, method for their production
AU668387B2 (en) * 1992-04-28 1996-05-02 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Process for production of exogenous gene or its product in plant cells

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08510915A (ja) 1996-11-19
PL311815A1 (en) 1996-03-18
US5919705A (en) 1999-07-06
HUP9503284D0 (en) 1996-02-28
CZ319995A3 (en) 1996-04-17
WO1994029464A1 (en) 1994-12-22
BR9406711A (pt) 1996-03-19
GB9311593D0 (en) 1993-07-21
PL185856B1 (pl) 2003-08-29
CA2163523A1 (en) 1994-12-22
SK152495A3 (en) 1996-05-08
EP0701620A1 (en) 1996-03-20
AU683071B2 (en) 1997-10-30
IL109891A0 (en) 1994-10-07
RU2136757C1 (ru) 1999-09-10
AU7070794A (en) 1995-01-03
CN1119422C (zh) 2003-08-27
ZA943917B (en) 1995-12-04
CN1128048A (zh) 1996-07-31
HUT74227A (en) 1996-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5773700A (en) Constructs containing impatiens necrotic spot tospovirus RNA and methods of use thereof
Leiser et al. Agroinfection as an alternative to insects for infecting plants with beet western yellows luteovirus.
US6608241B1 (en) Protection of plants against viral infection
EP0426195B1 (en) Improvements in or relating to organic compounds
KR940007772B1 (ko) 작물 바이러스 또는 이들의 작용을 변형시키는 방법
EP0558944A2 (en) RNA and DNA molecules for producing virus resistance
CZ291203B6 (cs) DNA-konstrukty propůjčující rezistenci vůči virům, rostliny které je obsahují a způsob jejich přípravy
US5939600A (en) Nucleic acids encoding tospovirus genome and expression thereof
Jacquet et al. High resistance to plum pox virus (PPV) in transgenic plants containing modified and truncated forms of PPV coat protein gene
Kollar et al. Efficient pathogen-derived resistance induced by integrated potato virus Y coat protein gene in tobacco
Rubino et al. Biologically active cymbidium ringspot virus satellite RNA in transgenic plants suppresses accumulation of DI RNA
Racman et al. Strong resistance to potato tuber necrotic ringspot disease in potato induced by transformation with coat protein gene sequences from an NTN isolate of Potato virus Y
JPH08509599A (ja) 植物体にウイルスに対する耐性を付与し得るポリリゾザイムおよびこのポリリゾザイムを産生する耐性植物体
US20040139494A1 (en) Infection resistant plants and methods for their generation
US5428144A (en) Maize dwarf mosaic virus cDNA
Yang Towards genetic engineering cucumber mosaic virus (CMV) resistance in lupins
Getu Tobacco (Nicotiana benthamiana Domin) Plant Transformation With and Without Selectable Marker Gene for Multiple Virus Resistance
Sheng-Niao et al. Creation of trivalent transgenic watermelon resistant to virus infection
CA2431875A1 (en) Infection resistant plants and methods for their generation
WO2002083886A2 (en) Means and method for the preparation of transgenic plants resistant to viral infections

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20040603