RU2136757C1 - Конструкция днк, конструкция рекомбинантной днк и способ получения растений - Google Patents
Конструкция днк, конструкция рекомбинантной днк и способ получения растений Download PDFInfo
- Publication number
- RU2136757C1 RU2136757C1 RU96100552A RU96100552A RU2136757C1 RU 2136757 C1 RU2136757 C1 RU 2136757C1 RU 96100552 A RU96100552 A RU 96100552A RU 96100552 A RU96100552 A RU 96100552A RU 2136757 C1 RU2136757 C1 RU 2136757C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plant
- rna
- dna
- virus
- protein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 79
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 18
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 8
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 claims description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 141
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 94
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 55
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000005712 elicitor Substances 0.000 description 28
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 15
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 11
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 3
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 3
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 241000709757 Luteovirus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000712894 Orthotospovirus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 2
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 2
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 2
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000723848 Tobamovirus Species 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000218993 Begonia Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 241000724268 Bromovirus Species 0.000 description 1
- 229910000906 Bronze Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100000858 Caenorhabditis elegans act-3 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000612153 Cyclamen Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000208136 Nicotiana sylvestris Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000028344 Primula vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000016311 Primula vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 1
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 1
- 108020005543 Satellite RNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 235000012308 Tagetes Nutrition 0.000 description 1
- 241000736851 Tagetes Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- 241000723613 Tomato mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000007212 Verbena X moechina Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 240000001519 Verbena officinalis Species 0.000 description 1
- 235000001594 Verbena polystachya Kunth Nutrition 0.000 description 1
- 235000007200 Verbena x perriana Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 235000002270 Verbena x stuprosa Moldenke Nutrition 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 244000172533 Viola sororia Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010974 bronze Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N copper tin Chemical compound [Cu].[Sn] KUNSUQLRTQLHQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229930186364 cyclamen Natural products 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012135 ice-cold extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006491 negative regulation of transport Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Конструкции ДНК предназначены для придания растениям устойчивости к патогенам и могут быть использованы в селекции растений. Введение конструкций ДНК, кодирующих молекулы минус- или плюс-смысловых РНК, способных взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой вирусом при его внедрении в растение, приводит к продуцированию в этом растении молекулы плюс-смысловой РНК или элиситорного элемента. Продуцирование элиситорного элемента в виде пептида, полипептида или протеина включает естественный механизм защиты растения против проникающих в него патогенов. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил.
Description
Предметом настоящего изобретения являются устойчивые к патогенам растения и, в частности, устойчивые к патогенам растения, у которых устойчивость к патогенам возникает в ответ на поражение патогенами, например вирусами, а также конструкции ДНК для применения в таких растениях и способы введения индуцируемой вирусами устойчивости в растения.
Вирусные инфекции растений часто являются причиной неблагоприятных изменений в росте, нежелательных морфологических изменений, снижения урожая и тому подобного. Такие инфекции часто обуславливают повышенную чувствительность инфицированных растений к другим растительным патогенам и вредителям.
Вирусные частицы обычно содержат относительно небольшое количество генетического материала (однонитевая или двунитевая РНК или ДНК), защищенного белком или белками, которые у некоторых типов вирусов могут также быть окружены липидными мембранами, построенными из материала хозяина, образующими инфекционные частицы. Размножение вирусов зависит от клеток-хозяев, поэтому их можно рассматривать как внутриклеточных паразитов.
Растения обладают рядом защитных механизмов, позволяющих ограничивать воздействия вирусной инфекции. К их числу относятся так называемые горизонтальные или частичные устойчивости, являющиеся полигенными по своей природе, и так называемые вертикальные устойчивости, моногенные по природе.
Горизонтальную устойчивость сложно успешно вводить в растения в процессе реализации селекционных программ, однако вертикальная устойчивость может быть относительно легко введена в растения в рамках селекционных программ. Гены, кодирующие устойчивость к вирусам, могут работать конституитивно пассивным образом, то есть без обязательной индукции генной экспрессии. Конституитивно экспрессируемая устойчивость к вирусам включает в качестве механизмов действия неспецифическую устойчивость, выносливость, то есть ингибирование развития болезни, иммунность, то есть ингибирование транспорта, либо наличие антивирусных агентов и тому подобное. С другой стороны, гены, кодирующие устойчивость к вирусам в растениях, могут быть активно задействованы посредством индукции экспрессии гена или генов, кодирующих устойчивость к вирусам. Примером такой системы является реакция сверхчувствительности.
Выявленные у растений так называемые реакции сверхчувствительности (СЧР) в общем характеризуются гибелью растительных клеток в области проникновения патогена сразу же после инфицирования. Продвижение патогена через инфицированные или зараженные клетки ограничивается или блокируется благодаря некрозу зараженных клеток и/или клеток, окружающих зараженную клетку. Кроме того, СЧР включает серию дополнительных или вторичных защитных реакций и накопление определенных белков и вторичных метаболитов, приводящих к общему увеличению уровня устойчивости к поражению патогенами. В целом полагают, что СЧР реакции, развивающиеся в организмах, включают продукт гена устойчивости в растительной клетке, который распознает и взаимодействует с элиситорным элементом, то есть продуктом гена авирулентности патогена. Распознавание элиситорного элемента в клетках устойчивого растения вызывает СЧР реакцию, которая в свою очередь ограничивает проникновение патогена в отдельную клетку или клетки, либо самое большее, в небольшое количество растительных клеток в их ближайшем окружении.
Примером СЧР-опосредованной устойчивости к вирусной инфекции является устойчивость растений табака, несущих N' ген устойчивости к тобамовирусам, таким как BTM (TMV) и BToM (ToMV), которые содержат авирулентный ген белка оболочки. К настоящему времени было идентифицировано свыше двадцати отдельных доминантных генов устойчивости СЧР-типа, которые присутствуют у многих агрономически значимых культур, включая табак, томат, картофель, перец, латук и тому подобное.
Несмотря на кажущееся изобилие источников устойчивости к определенным вирусам, у многих культур до сих пор отсутствуют эффективные гены устойчивости к основным вирусным патогенам [1]. В результате поиска наборов зародышевой плазмы дикого типа были идентифицированы только несколько приемлемых источников устойчивости к вирусам, которые могут быть успешно введены в агрономически значимые культуры. Примером является отсутствие генов вертикальной устойчивости к вирусу огуречной мозаики (ВОМ) у многих типов агрономически значимых культур, включая томат, перец, огурец, дыню, латук и тому подобное, но не ограничиваясь ими.
Селекционеры растений непрерывно пытаются создавать сорта культурных видов растений, выносливых или устойчивых к специфическим вирусным штаммам. Раньше гены, ответственные за устойчивость к вирусам, переносили из диких типов, родственных культурным растениям, в промышленные сорта посредством скрещиваний. Пренос имеющейся в природе устойчивости из генного пула дикого типа в сорт является утомительной процедурой, в ходе которой ген(ы), ответственный за устойчивость, сначала должен быть идентифицирован в растительных видах, являющихся источником (донором), а затем введен в генный пул промышленного сорта. Устойчивость или выносливость, приобретаемая таким путем, как правило активна только против одного или в лучшем случае, нескольких штаммов интересующих вирусов. Кроме того, недостатком является также и то, что реализация селекционной программы для получения агрономически значимых растений занимает длительное время, измеряемое годами.
В качестве альтернативы была разработана система, именуемая как "перекрестная защита". Перекрестная защита - это явление, при котором инфицирование растения одним штаммом вируса защищает это растение против гиперинфицирования вторым родственным вирусным штаммом. Способ перекрестной защиты предпочтительно включает применение для инфицирования растений авирулентных вирусных штаммов, которые ингибируют вторичное инфицирование вирулентным штаммом этого же вируса. Однако применение естественной системы перекрестной защиты может иметь ряд недостатков. Способ очень трудоемок, поскольку требует инокуляции каждой отдельной растительной культуры, и существует опасность того, что авирулентный штамм может мутировать в вирулентный штамм, превращаясь тем самым в возбудителя болезни растения. Другой потенциальной опасностью является то, что авирулентный в одном растительном виде вирусный штамм может действовать как вирулентный штамм в других растительных видах.
Генетически модифицированная перекрестная защита является формой устойчивости к вирусам, которая фенотипически сходна с естественной перекрестной защитой, но реализуется посредством экспрессии генетической информации белка вирусной оболочки из генома генетически модифицированного растения. Известно, что экспрессия гена белка оболочки вируса табачной мозаики штамма U1 (BTM-U1) из генома трансгенного растения может привести к замедлению развития симптомов после инфицирования любым штаммом ВТМ. Аналогичным образом опосредованная белком оболочки защита была реализована также для вируса мозаики люцерны (ВЛМ), Х-вируса картофеля (КВХ) и вируса огуречной мозаики (ВОМ). Для некоторых растительных вирусов, например лютеовирусов, в трансгенном растении трудно получить существенные количества соответствующего белка оболочки и, следовательно, устойчивость к вирусам обычно понижена. Кроме того, любая указанная степень защиты требует того, чтобы растение продуцировало белок оболочки непрерывно и таким образом создает энергетическую нагрузку на растение. В силу этих ограничений коммерческая значимость этого способа остается неопределенной.
Следующим примером генетически модифицированной устойчивости к вирусам является введение сателлитной РНК растительных вирусов, при котором экспрессия введенного генетического материала модифицирует растительный вирус или его воздействие.
Целью настоящего изобретения является создание возможно наиболее надежно разработанной системы устойчивости растений к вирусам по сравнению с уже разработанными устойчивостями, известными из уровня техники, базирующейся на непосредственно индуцируемой патогеном экспрессии молекул в целевых тканях растения, происходящей до того, как внедряющийся патоген сможет сам развиться в растении - хозяине.
Другой целью изобретения является комбинирование технологии генно-инженерной трансформации растений с естественно существующими в растительной ткани защитными механизмами против растительных вирусов.
Согласно настоящему изобретению предлагают конструкцию ДНК растительного вируса, способную кодировать прямо или опосредованно молекулу минус-смысловой РНК, способной взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой внедряющимся вирусом таким образом, что по меньшей мере один элиситорный элемент продуцируется как следствие взаимодействия с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой указанным внедряющимся вирусом.
В другой реализации изобретения предлагают конструкцию рекомбинантной ДНК растительного вируса, способную кодировать молекулу плюс-смысловой РНК, способной взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой внедряющимся вирусом, продуцирующей в результате этого взаимодействия молекулу плюс-смысловой РНК, которая способна кодировать по меньшей мере один элиситорный элемент, способный элисировать естественную защитную растительную реакцию в растении при инвазии в растение указанного внедряющегося вируса.
Конструкция ДНК растительного вируса может быть получена из любого вирусного источника, способного поражать растение, однако предпочтительно, чтобы ДНК растительного вируса получали из такого вирусного источника, о котором известно, что он поражает, предполагается, что он поражает или который способен поражать агрономически перспективный растительный тип. Это может быть либо ДНК природного растительного вируса, модифицированная соответствующим образом для экспрессии, либо ДНК, полученная синтетическим путем. ДНК растительного вируса должна быть способна кодировать в растительных клетках транскрипцию в последовательность РНК, комплементарную (например минус-смысловую) к вирусной РНК (например плюс-смысловой). Кроме того, ДНК растительного вируса должна содержать участок или его сегмент, который при транскрипции с образованием минус-смысловой РНК и дальнейшей транскрипции в плюс-смысловую РНК при трансляции плюс- смысловой РНК способен обеспечивать образование по меньшей мере одного элиситорного элемента или его части, достаточной для элисирования естественного защитного механизма растений против внедряющегося вируса. Приемлемыми источниками ДНК или РНК растительных вирусов являются источники, происходящие из растительных вирусов, способных поражать такие растительные типы, как томаты, перцы, дыни, латук, цветная капуста, брокколи, капуста, брюссельская капуста, сахарная свекла, кукуруза, сахарная кукуруза, лук, морковь, лук-порей, огурцы, табак и тому подобное. Также в качестве источников ДНК или РНК растительных вирусов приемлемы источники, получаемые из растительных вирусов, способных поражать растительные типы, относящиеся к декоративным культурам, такие как недотрога, бегония, петуния, пеларгонии (герани, фиалка, цикламен, вербена, барвинок, тагетес, примула, сенполия и тому подобное).
Молекула минус-смысловой РНК является молекулой, которая содержит по меньшей мере один цистрон или его часть, соответствующую по меньшей мере части указанной ДНК растительного вируса и способна обеспечивать образование молекулы плюс-смысловой РНК, транскрибируемой с указанной молекулы минус-смысловой РНК, которая способна кодировать и обеспечивать образование по меньшей мере одного элиситорного элемента или его части в растительных клетках. Минус-смысловая РНК может транскрибироваться прямо с указанной ДНК растительного вируса либо может транскрибироваться с плюс-смысловой РНК, синтезированной с указанной ДНК. Как таковая минус-смысловая РНК, транскрибируемая с плюс-смысловой РНК, именуется, для целей настоящего изобретения, как опосредованно транскрибируемая с указанной ДНК. Ориентация или полярность цистрона или цистронов либо их частей, локализованных на молекуле минус-смысловой РНК, может быть таковой, что элиситорный элемент может не кодироваться непосредственно после транскрипции с конструкции ДНК растительного вируса. Генетический код цистрона или цистронов либо их частей локализован на нити, комплементарной к молекуле минус-смысловой РНК, а именно плюс-смысловой РНК. Цистрон, кодирующий элиситорный элемент, становится доступным для трансляции тогда, когда последовательность минус-смысловой вирусной РНК реплицируется РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой внедряющимся вирусом, с образованием молекулы плюс-смысловой РНК.
К минус-смысловым РНК по тексту относятся также те молекулы РНК, которые могут быть охарактеризованы как имеющие двусмысловые характеристики, такие как молекулы РНК тосповирусов и тому подобное. В таких случаях минус-смысловая РНК содержит по меньшей мере один цистрон, соответствующий части ДНК указанного растительного вируса и способна обеспечивать образование плюс-смысловой РНК, транскрибируемой с указанной минус-смысловой РНК, которая способна кодировать и обеспечивать образование по меньшей мере одного элиситорного элемента или его части в растительных клетках.
Молекула плюс-смысловой вирусной РНК представляет собой молекулу, которая способна прямо или опосредованно кодировать по меньшей мере один элиситорный элемент или его часть, способную экспрессироваться и обладать способностью элисировать естественную или сконструированную растительную защиту в клетках растений. Молекула плюс-смысловой РНК является также молекулой, которая комплементарна вирусной минус-смысловой РНК и при трансляции в растительных клетках способна обеспечивать образование прямо или опосредованно по меньшей мере одного элиситорного элемента. Таким образом, молекула вирусной смысловой РНК может рассматриваться как молекула РНК, комплементарная молекуле минус-смысловой РНК.
К плюс-смысловым РНК по тексту относятся также те молекулы РНК, которые могут быть охарактеризованы как имеющие двусмысловые характеристики. В таких случаях плюс-смысловая РНК содержит по меньшей мере один цистрон, соответствующий части указанной ДНК растительного вируса и способна прямо кодировать и обеспечивать образование по меньшей мере одного элиситорного элемента или его части в растительных клетках.
Количество элиситорного элемента, который экспрессируется в растительной клетке, должно быть достаточным для того, чтобы элисировать по меньшей мере клеточную растительную защитную реакцию против внедряющегося вируса, приводя к возникновению естественной или сконструированной защитной реакции растений, эффективно блокирующей или ограничивающей дальнейшее воздействие вируса. Тем самым, молекулы плюс-смысловой РНК, если они являются комплементом минус-смысловой РНК или двусмысловой РНК, должны быть способны обеспечивать образование элиситорных элементов, которые способны запускать или элисировать естественную или сконструированную защитную реакцию растений, причем происходит это посредством прямой трансляции либо посредством взаимодействия с вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой (например, с помощью генерированной субгеномной РНК). В зависимости от типа элисируемых защитных реакций растений должен быть один или более элиситорных элементов, в конечном счете кодируемых плюс-смысловой РНК. Последовательность вирусной плюс-смысловой РНК предпочтительно является последовательностью, в которой по меньшей мере один вирусный цистрон замещен по меньшей мере одним цистроном, кодирующим элиситорный элемент, способный экспрессироваться в растительных клетках и обладающим способностью элисировать в растительной ткани естественную или сконструированную растительную защитную реакцию.
Элиситорным элементом может быть любой элемент, транслируемый с цистрона плюс-смысловой РНК, получаемого из ДНК растительного вируса, как это было описано ранее, и это могут быть белок, полипептид или пептид либо их фрагменты. Примерами предпочтительных элиситорных элементов являются так называемые элиситорные белки и/или клеточные ингибиторные белки.
Элиситорный белок - это белок, который при наличии его в растительной ткани способен элисировать, запускать или индуцировать реакцию сверхчувствительности (СЧР), которая является естественным защитным механизмом растений против внедряющихся патогенов, таких как вирусы. Элиситорные белки могут быть производными растительных вирусов, например белки оболочки, белки, участвующие в движении от клетки к клетке, геликазы, РНК-зависимые РНК-полимеразы и тому подобное. Кроме того, элиситорные белки могут происходить или быть получены из других растительных патогенов, таких как бактерии, грибы, нематоды и тому подобное.
Клеточный ингибиторный белок - это белок, который в случае наличия в растительной ткани оказывает вредное воздействие на растительную клетку, приводя к ингибированию клеточного роста, например клеточного деления, и/или гибели клетки. Клеточные ингибиторные агенты включают рибонуклеазы, протеиназы, рибосомальные ингибиторные белки, белки, разрушающие клеточные оболочки и т. д., но не ограничиваются ими.
Молекулы минус- и плюс-смысловой РНК можно рассматривать как РНК растительного вируса, поскольку они являются продуктами конструкции растительной ДНК, как описано ранее, и включают геном или сегмент генома растительного вируса. В таких РНК растительных вирусов определенные нуклеотидные фрагменты могут быть либо замещены другими фрагментами, либо удалены. Замена и/или делеция нуклеотидов или сегментов, содержащих нуклеотиды, должна иметь такой характер, чтобы не влиять на способность молекулы РНК воспроизводиться или копироваться в инфицированных вирусом растительных клетках. Кроме того, замещение и/или делеция нуклеотидов, кодонов или сегментов, содержащих нуклеотиды, должно иметь такой характер, чтобы не нарушать способность РНК-зависимой РНК-полимеразы внедряющегося вируса узнавать и воздействовать на молекулу РНК (в плюс- или минус-смысловой ориентации), и тем самым инициировать последовательность описанных событий, приводящих к продуцированию эффективного количества элиситорного элемента, способного элисировать естественную или сконструированную защитную реакцию растений. Примерами соответствующих молекул РНК растительных вирусов являются молекулы геномной РНК или их сегменты, выбранные из группы, включающей потивирусы, потексивирусы, тобамовирусы, лютеовирусы либо геномную РНК нуклеовирусов, бромовирусов, тосповирусов и тому подобное или их сегменты, но не ограничиваются ими.
ДНК растительных вирусов находится под контролем экспрессии промотора, способного функционировать в растениях, и содержит терминатор, способный функционировать в растениях.
Промотор - это нуклеотидная последовательность, расположенная выше сайта инициации транскрипции и содержащая все регуляторные области, необходимые для транскрипции. Примерами промоторов, пригодных для применения в конструкциях ДНК по настоящему изобретению, являются промоторы вирусного, грибного, бактериального, животного и растительного происхождения, способные функционировать в растительных клетках. Предпочтительный промотор должен экспрессировать ДНК конституитивно, как это имеет место во всех живых тканях растения. Следует учитывать, что используемый промотор должен обеспечивать усиление экспрессии ДНК растительного вируса в степени, достаточной для продуцирования количества РНК, способного кодировать по меньшей мере один элиситорный элемент, способный элисировать естественную растительную защиту в трансформированном растении при заражении растения вирусом. Количество РНК, которое должно быть транскрибировано, может варьировать в зависимости от типа растения. Примерами соответствующих промоторов являются промоторы 35S (CaMV 35S) и 19S (CaMV 19S) вируса мозаики цветной капусты, промоторы нопа-линсинтетазы и октопинсинтетазы, промотор теплового шока 80 (hsp 80) и тому подобное.
Терминатор рассматривают как (A) последовательность ДНК, расположенную после вирусной ДНК, кодирующей транскрипцию в последовательность РНК, которая способна к автокаталитическому саморасщеплению с высвобождением терминаторной последовательности из последовательности рекомбинантной вирусной РНК, с последующей (Б) последовательностью ДНК на конце транскрипционной единицы, которая сигнализирует терминацию транскрипции. Этими элементами являются 3'-нетранслируемые последовательности, содержащие сигналы полиаденилирования, которые вызывают присоединение полиаденилатных последовательностей к 3' концу первичных транскриптов. Примерами последовательностей, обозначенных как (А), являются саморасщепляющиеся молекулы РНК или рибозимы, такие как рибонуклеаза Р, Tetrahymena L-19 промежуточная последовательность, рибозимы головки, РНК Hepatitis дельта вируса, митохондриальная VS РНК Neurospora и тому подобное [2]. Последовательности, упоминаемые как (Б), могут быть выделены из грибов, бактерий, животных и/или растений. Примерами особенно перспективных для применения в конструкциях ДНК по изобретению последовательностей являются сигнал полиаденилирования нопалин-синтетазы Agrobacterium tumefaciens, сигнал 35S полиаденилирования CaMV и сигнал зеинового полиаденилирования из Zea mays.
Последовательность ДНК или РНК комплементарна другой последовательности ДНК или РНК, если она способна образовывать с ней связанный посредством водородных связей комплекс в соответствии с правилами спаривания оснований в соответствующих условиях гибридизации. Для целей настоящего изобретения соответствующие условия гибридизации могут включать (но не ограничиваются этим), например, инкубацию в течение приблизительно 16 часов при 42oC в буферной системе, содержащей 5 x стандартный раствор цитрата (СРЦ), 0,5%-ный додецилсульфат натрия (ДДС), 5 x Denhardt's раствор, 50%-ный формамид и 100 мкг/мл носителя ДНК или РНК (в дальнейшем буферная система), с последующей промывкой 3х в буфере, содержащем 1 x СРЦ и 0,1%-ный ДДС, при 65oC каждый раз в течение приблизительно одного часа. Таким образом, сигнал гибридизации, полученный для молекулы РНК или ДНК, например показание авторадиограммы, должен быть достаточно ясным для специалиста с целью подтверждения того, что полученная молекула ДНК или РНК может быть успешно применена при создании конструкций ДНК растительных вирусов, пригодных для использования по изобретению. Естественно, такая молекула РНК или ДНК должна быть способна проявлять требуемую активность, как описано в тексте. Таким образом, замещение и/или делеция нуклеотидов, кодонов или сегментов, содержащих нуклеотиды, должно иметь такой характер, чтобы не нарушать способность конструкции ДНК по изобретению кодировать молекулу минус-смысловой РНК, описанную в тексте, которая способна быть узнанной и взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой внедряющегося вируса и инициировать тем самым описанную здесь последовательности событий, приводящую к продуцированию эффективного количества элиситорного элемента, способного элисировать естественную или сконструированную защитную реакцию растений.
Соответствующие условия гибридизации, применяемые в настоящем изобретении, могут включать инкубацию в буферной системе в течение приблизительно 16 часов при 49oC и промывку 3x в буфере, содержащем 0,1 х СРЦ и 0,1%-ный ДДС при 55oC каждый раз в течение приблизительно часа. Более предпочтительно, чтобы условия гибридизации могли включать инкубацию в буферной системе в течение приблизительно 16 часов при 55oC и промывки 3x в буфере, содержащем 0,1 x СРЦ и 0,1%-ный ДДС при 65oC каждый раз в течение приблизительно часа. Естественно, любая молекула РНК или ДНК, помещенная в такие условия гибридизации, должна быть способной проявлять необходимую активность, как описано в тексте.
В изобретении предлагают также вектор, способный вводить конструкцию ДНК по изобретению в растения, и способы получения таких векторов. Термин вектор, применяемый в тексте, обозначает переносчик, посредством которого молекулы ДНК или их фрагменты могут быть введены в организм хозяина. Приемлемыми переносчиками являются плазмиды, чистая ДНК, вводимая путем микроинъекции, пушки для частиц и тому подобное [3].
Применяемый в тексте термин растения используют в широком смысле, он обозначает дифференцированные растения, а также недифференцированный растительный материал, например протопласты, растительные клетки, семена, проростки и тому подобное, который при соответствующих условиях может развиваться в зрелые растения, их потомство и их части, такие как черенки и плоды таких растений.
Далее в изобретении рассматривают растения, содержащие в своем геноме конструкцию ДНК по изобретению, и способы получения таких растений.
Растения согласно изобретению имеют пониженную чувствительность к болезням, вызываемым соответствующими вирусами, и не обладают недостатками и ограничениями растений, полученных классическими способами и методами генетической инженерии, обсуждавшимися в тексте.
Изобретение иллюстрируют следующие отдельные примеры с сопровождающими рисунками.
Фиг. 1: Схематическое изображение взаимодействия белков, кодируемых в патогене и растении, приводящего к индукции реакции СЧР.
Фиг. 2: Схематическое изображение ВОМ устойчивых растений табака или томата, полученных путем экспрессии молекулы минус-смысловой ВОМ РНК 3, в которой БД ген замещен геном, кодирующим элиситор (BToM БО или БЗО) или клеточный ингибиторный белок (РНК-аза Т1).
Фиг. 3: Схематическое изображение ВОМ устойчивых растений табака или томатов, полученных путем экспрессии молекулы плюс-смысловой ВОМ РНК 3, в которой БО ген замещен геном, кодирующим элиситор (ВТоМ БО или БЗО) или клеточный ингибиторный белок (РНК-аза Т1).
Последовательность 1: РНК 3 химерного вируса огуречной мозаики (SEQ ID N 1).
Последовательность 2: Белок оболочки ВТоМ (соответствующий нуклеотидам 123-600 Послед. N. 1) (SEQ ID N 2).
Последовательность 3: Белок оболочки вируса огуречной мозаики, соответствующий нуклеотидам 897-1550 Послед. N 1 (SEQ ID N 3).
Последовательность 4: РНК 3 химерного вируса огуречной мозаики (SEQ ID N 4).
Последовательность 5: РНК-аза Т1, соответствующая положениям 123-437 Послед. N. 4 (SEQ ID N 5).
Последовательность 6: РНК 3 химерного вируса огуречной мозаики, кодирующая БЗО BToM (SEQ ID N 6).
Последовательность 7: БЗО ВТоМ, соответствующий нуклеотидам 123- 914 Послед. N. 7 (SEQ ID N 7).
Последовательность 8: РНК химерного S вируса бронзовости томата, кодирующая белок оболочки ВТоМ и неструктурный белок, НС (NSs) в противоположной полярности (SEQ ID N 8).
Последовательность 9: Неструктурный белок, НС (в противоположной полярности), соответствующий нуклеотидам 1141-2543 Послед. N. 8 (SEQ ID N 9).
Примеры. Все ВОМ, BБT (TSWV) и ВТоМ РНК-овые последовательности, представленные в тексте, описаны как последовательности ДНК единственно с целью единообразия. Следует иметь ввиду, что это сделано только для удобства.
Сорта Nicotiana tabacum и Lycopersicon esculentum, применяемые в исследованиях по трансформации растений, выращивают в стандартных тепличных условиях. Стерильный материал эксплантатов выращивают на стандартной МС среде [4], содержащей соответствующие концентрации фитогормонов и сахарозы.
Бактерию Е. coli выращивают на роторных качалках при 37oC в стандартной LB-среде. Штаммы Agrobacterium tumefaciens выращивают при 28oC в Мин А среде с добавкой 0,1%-ной глюкозы [5].
Во всех методиках клонирования Е. coli штамм JM83, (F-, Δ(lac-pro), ara rpsL, ⌀80, dlacZM15) применяют в качестве предпочтительного реципиента рекомбинантных плазмид.
Бинарные вектора конъюгируют с Agrobacterium tumefaciens штамм LBA 4404, штаммом, содержащим vir-область Ti-плазмиды [6], в трехродительском скрещивании с применением Е. coli НВ101, содержащего плазмиду pRK2013 в качестве хелперного штамма [7]. Соответствующие Agrobacterium tumefaciens реципиенты селектируют на среде, содержащей рифампицин (50 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл).
Клонирование фрагментов в вектора pUC19 [8], pBluescript (Stratagene), pBIN19 [9] или их производные, рестрикционно-ферментный анализ ДНК, трансформацию Е. coli реципиентных штаммов, выделение плазмидной ДНК как маленького, так и большого размера, ник-трансляцию, in vitro транскрипцию, сиквенс ДНК, блоттинг по Саузерну и гель-электрофорез ДНК проводят согласно стандартным методикам [10, 5].
Амплификацию ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили согласно рекомендациям изготовителя Taq полимеразы (Perkin Elmer Cetus). Амплификацию РНК путем обратной транскрипции и последующую стандартную амплификацию ДНК проводили с применением Gene Амп РНК ПЦР согласно рекомендациям изготовителя (Perkin Elmer Cetus).
Пример 1: Выделение ВОМ частиц и их генетического материала.
ВОМ серотипа I выделяют из растений тыквы и поддерживают на тыкве посредством механического переноса. Вирус выделяют из листьев системно инфицированного растения тыквы в основном согласно способу [11]. Приблизительно 100 мкг вируса в объеме 250 мкл экстрагируют фенолом, затем смесью фенола и хлороформа и наконец хлороформом. РНК осаждают этанолом и собирают центрифугированием. Осадок растворяют в 20 мкл воды.
Пример 2: Выделение ВТоМ частиц и их генетического материала.
ВТоМ, выделенный из растений томата, поддерживают на табаке посредством механического переноса. Вирус выделяют из листьев системно инфицированного растения табака в основном согласно способу [12]. Приблизительно 200 мкг вируса в объеме 300 мкл экстрагируют фенолом, затем смесью фенола и хлороформа и наконец хлороформом. РНК осаждают этанолом и собирают центрифугированием. Осадок растворяют в 50 мкл воды.
Пример 3: Молекулярное клонирование ВОМ РНК 3.
Последовательность РНК 3 ВОМ получают, применяя ПЦР на основе РНК, на очищенной ВОМ РНК (Perkin Elmer Cetus supra). Конструируют два праймера, ZUP 069:
(5' TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG 3'), (посл. 10),
который комплементарен первым 16-ти нуклеотидам на 3' конце РНК 3 ВОМ (Поcл. N. 1), и ZUP 068:
(5' TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 3'), (посл. 11),
который идентичен первым 14-ти нуклеотидам на 5' конце РНК 3 ВОМ (Посл. N. 1). Оба праймера содержат BamH1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Выделенную ВОМ РНК подвергают Gene Амп РНК ПЦР, а полученный ПЦР фрагмент элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированнуго pUC19, получая в результате рекомбинантную плазмиду pZU181.
(5' TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG 3'), (посл. 10),
который комплементарен первым 16-ти нуклеотидам на 3' конце РНК 3 ВОМ (Поcл. N. 1), и ZUP 068:
(5' TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 3'), (посл. 11),
который идентичен первым 14-ти нуклеотидам на 5' конце РНК 3 ВОМ (Посл. N. 1). Оба праймера содержат BamH1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Выделенную ВОМ РНК подвергают Gene Амп РНК ПЦР, а полученный ПЦР фрагмент элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированнуго pUC19, получая в результате рекомбинантную плазмиду pZU181.
Пример 4: Молекулярное клонирование ВБТ S РНК.
Путем встраивания кДНК клонов 520 и 614 в уникальный EcoRI сайт с образованием pTSWV-S1 был сконструирован кДНК клон, содержащий почти полную ВБТ S РНК-специфическую последовательность [13]. Полную последовательность ВБТ S РНК получают, применяя ПЦР на основе РНК на очищенной pTSWV-S1 ДНК (Perkin Elmer Cetus supra). Конструируют два праймера, ZUP250:
5' (TTTGGATCCA GAGCAATCGT GTCAATTTTG TGTTCATACC TTAAC) 3', (посл. 12),
который содержит 36 нуклеотидов, идентичных первым 36-ти нуклеотидам на 5' конце ВБТ S РНК (Посл. N. 8), и ZUP251:
5' (TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTTTTGTTCATAAT CAAACCTCACTT) 3', (посл. 13),
который содержит 43 нуклеотида, комплементарных первым 43-м нуклеотидам на 3' конце ВБТ S РНК (Посл. N. 8). Оба праймера содержат BamH1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Полученный ПЦР фрагмент элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированную pUC19, получая в результате рекомбинантную плазмиду pTSWV-S2.
5' (TTTGGATCCA GAGCAATCGT GTCAATTTTG TGTTCATACC TTAAC) 3', (посл. 12),
который содержит 36 нуклеотидов, идентичных первым 36-ти нуклеотидам на 5' конце ВБТ S РНК (Посл. N. 8), и ZUP251:
5' (TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTTTTGTTCATAAT CAAACCTCACTT) 3', (посл. 13),
который содержит 43 нуклеотида, комплементарных первым 43-м нуклеотидам на 3' конце ВБТ S РНК (Посл. N. 8). Оба праймера содержат BamH1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Полученный ПЦР фрагмент элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированную pUC19, получая в результате рекомбинантную плазмиду pTSWV-S2.
Пример 5: Молекулярное клонирование БО и БЗО генов ВТоМ.
Последовательность генов, соответствующих белку оболочки (БО) и БЗО ВТоМ получают, используя ПЦР на основе РНК. Праймер ZUP112 может располагаться с любой стороны стартового кодона трансляции БО гена ВТоМ РНК:
5' GTATTAACCA TGGCTTACTC 3' (содержащий 13 нуклеотидов, идентичных нуклеотидам 121-133 Посл. N. 1), (посл. 14.),
праймер ZUP113 может располагаться с любой стороны стоп-кодона трансляции БО гена ВТоМ РНК:
5' GCACCCATGG ATTTAAGATG 3' (содержащий 16 нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам 595-610 Поcл. N. 1), (посл. 15),
праймер ZUP117 может располагаться с любой стороны стартового кодона трансляции БЗО гена ВТоМ РНК:
5' TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 3' (содержащий 13 нуклеотидов, идентичных нуклеотидам 121-133 Поcл. N. 6), (посл. 16),
праймер ZUP118 может располагаться с любой стороны стоп-кодона трансляции БЗО гена ВТоМ РНК:
5' GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 3' (содержащий 13 нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам 911-923 Посл. N. 6), (посл. 17).
5' GTATTAACCA TGGCTTACTC 3' (содержащий 13 нуклеотидов, идентичных нуклеотидам 121-133 Посл. N. 1), (посл. 14.),
праймер ZUP113 может располагаться с любой стороны стоп-кодона трансляции БО гена ВТоМ РНК:
5' GCACCCATGG ATTTAAGATG 3' (содержащий 16 нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам 595-610 Поcл. N. 1), (посл. 15),
праймер ZUP117 может располагаться с любой стороны стартового кодона трансляции БЗО гена ВТоМ РНК:
5' TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 3' (содержащий 13 нуклеотидов, идентичных нуклеотидам 121-133 Поcл. N. 6), (посл. 16),
праймер ZUP118 может располагаться с любой стороны стоп-кодона трансляции БЗО гена ВТоМ РНК:
5' GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 3' (содержащий 13 нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам 911-923 Посл. N. 6), (посл. 17).
Праймеры содержат Nco1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Выделенную ВТоМ РНК подвергают Gene Амп РНК ПЦР. Полученные ПЦР фрагменты элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированную pUC19, получая в результате рекомбинантные плазмиды pZU183 (содержащую БО ген) и pZU206 (содержащую БЗО ген).
Пример 6: Синтез гена рибонуклеазы Т1.
Последовательность гена, соответствующего рибонуклеазе Т1, синтезируют на коммерческом ДНК-синтезаторе (Pharmacia LKB, Gene assembler plus) как праймер ZUP110 (содержащий нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 121-293 Поcл. N. 4):
5' TTTCCATGGC ATGCGACTAC ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCA GACGTTTCTA CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCACG AAGACGGTGA AACTGTTGGA TCTAATTCTT ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTT TTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC 3', (посл. 18),
и праймер ZUP111 (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 278-446 Посл. N. 4):
5' GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT GTTACCAGAA GCACCAGTGT GAGTGATAAC ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC GACACGGTCA GCACCTGGAG AAGGACCAGA GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCA TTCGTAGTAG GGAGAGCTCA С 3', (посл. 19).
5' TTTCCATGGC ATGCGACTAC ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCA GACGTTTCTA CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCACG AAGACGGTGA AACTGTTGGA TCTAATTCTT ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTT TTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC 3', (посл. 18),
и праймер ZUP111 (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 278-446 Посл. N. 4):
5' GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT GTTACCAGAA GCACCAGTGT GAGTGATAAC ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC GACACGGTCA GCACCTGGAG AAGGACCAGA GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCA TTCGTAGTAG GGAGAGCTCA С 3', (посл. 19).
Оба праймера содержат Nco1 сайты рестрикции, позволяющие осуществлять последующее клонирование молекул амплифицированной ДНК. Праймеры отжигают и подвергают стандартной ДНК ПЦР. Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля и клонируют в Sma1-линеаризированную pUC19, получая рекомбинантную плазмиду pZU230.
Пример 7: Конструирование и экспрессия вектора pZU-A.
Промоторный фрагмент 35S вируса мозаики цветной капусты (ВЦкМ) выделяют из рекомбинантной плазмиды pZ027, производной pUC19, несущей в виде Hindlll-PstI фрагмента длиной 444 т.п.н. Hincll-HphI область 35S промотора ВЦкМ штамма Cabb-S [14]. Нуклеотидные последовательности ВЦкМ штаммов очень схожи у различных штаммов. 35S промоторный фрагмент вырезают из pZ027 в виде EcoRI-PstI фрагмента длиной 472 т.п.н., который содержит: часть полилинкерной области, 437 т. п. н. нетранскрибируемой области и сайта инициации транскрипции и 7 т.п.н. нетранслируемой лидерной области, не содержащей никаких 35S инициаторов трансляции. 35S промоторный фрагмент лигируют с помощью Т4 лигазы в ЕсоRI-PstI линеаризированную pZO008. Плазмида pZO008 несет сигнал полиаденилирования нопалинсинтетазы (НОС) в виде Pstl-Hindlll фрагмента длиной 270 т.п.н. Полученная рекомбинантная плазмида pZU-A несет 35S промотор, уникальный PstI сайт и НОС терминатор [15].
Пример 8: Конструирование вектора для трансформации растений, который продуцирует транскрипт, реплицируемый при инфицировании ВОМ (CMV)
5' конец минус-смысловой РНК 3 ВОМ встраивают непосредственно в сайт инициации транскрипции CaMV 35S промотора с помощью двух праймеров, ZUP 148 (посл. 20):
5' CCACGTCTTC AAAGCAAG 3' (комплементарного нуклеотидам CaMV 35S промотора), и праймера ZUP 146 (посл. 21):
5' CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCT CCAAATGAAA 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1860-1827 Посл. N. 1)
с pZU-A в качестве матрицы в стандартной ДНК ПЦР реакции. Амплифицированный фрагмент ДНК подвергают рестрикции по EcoRV и клонируют в EcoRV линеаризированную pZU-A. Полученную плазмиду подвергают рестрикции по BstXI и PstI и концентрируют в агарозном геле. pZU181 подвергают рестрикции по PstI и BstXI, вставку ДНК размером 2,1 т.п.н. концентрируют в агарозном геле, а затем клонируют в сконцентрированную в геле производную pZU-A, получая в результате pCMV3AS-1.
5' конец минус-смысловой РНК 3 ВОМ встраивают непосредственно в сайт инициации транскрипции CaMV 35S промотора с помощью двух праймеров, ZUP 148 (посл. 20):
5' CCACGTCTTC AAAGCAAG 3' (комплементарного нуклеотидам CaMV 35S промотора), и праймера ZUP 146 (посл. 21):
5' CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCT CCAAATGAAA 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1860-1827 Посл. N. 1)
с pZU-A в качестве матрицы в стандартной ДНК ПЦР реакции. Амплифицированный фрагмент ДНК подвергают рестрикции по EcoRV и клонируют в EcoRV линеаризированную pZU-A. Полученную плазмиду подвергают рестрикции по BstXI и PstI и концентрируют в агарозном геле. pZU181 подвергают рестрикции по PstI и BstXI, вставку ДНК размером 2,1 т.п.н. концентрируют в агарозном геле, а затем клонируют в сконцентрированную в геле производную pZU-A, получая в результате pCMV3AS-1.
Кодирующий белок движения (БД) домен pCMV3AS-1 замещают уникальным Ncol сайтом клонирования и вниз от 3' конца минус--смысловой РНК 3 ВОМ клонируют головную структуру Hepatitis дельта вирусной РНК посредством ПЦР амплификации двух фрагментов ДНК, используя pCMV3AS-1 в качестве матрицы. Первый фрагмент ДНК амплифицируют, применяя праймеры ZUP050:
5' AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 3' (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1020-1039 Посл. N. 1) (посл. 22),
и ZUP329:
5' GTCTTTAGCA CCATGGTG 3' ( содержащий нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 604-612 Посл. N. 1) (посл. 23).
5' AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 3' (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 1020-1039 Посл. N. 1) (посл. 22),
и ZUP329:
5' GTCTTTAGCA CCATGGTG 3' ( содержащий нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 604-612 Посл. N. 1) (посл. 23).
Фрагмент ДНК подвергают рестрикции по Nru1 и Nco1 и из агарозного геля элюируют фрагмент ДНК длиной 411 т.п.н. (положения 607-1016 Посл. N. 1). Второй фрагмент ДНК амплифицируют, применяя праймеры ZUP327:
5' GGAGAGCCAT GGCTCGGG 3' (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 115-126 Посл. N. 1) (посл. 24)
и ZUP350, праймер, синтезированный из нуклеотидов, включающих нуклеотиды, комплементарные антигеномной РНК hepatitis дельта вируса, как описано [16] , лигированных с нуклеотидами, идентичными нуклеотидам 1-14 (3' конец праймера) Посл. N. 1:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGA CGTGCGTCCT CCTTCGGATG CCCAGGTCGG ACCGCGAGGA GGTGGAGATG CCATGCCGAC CCGTAATCTT ACCACT) 3' (посл. 25).
5' GGAGAGCCAT GGCTCGGG 3' (содержащий нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 115-126 Посл. N. 1) (посл. 24)
и ZUP350, праймер, синтезированный из нуклеотидов, включающих нуклеотиды, комплементарные антигеномной РНК hepatitis дельта вируса, как описано [16] , лигированных с нуклеотидами, идентичными нуклеотидам 1-14 (3' конец праймера) Посл. N. 1:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGA CGTGCGTCCT CCTTCGGATG CCCAGGTCGG ACCGCGAGGA GGTGGAGATG CCATGCCGAC CCGTAATCTT ACCACT) 3' (посл. 25).
Фрагмент ДНК подвергают рестрикции по Pst1 и Nco1 и из агарозного геля элюируют фрагмент ДНК длиной 208 т.п.н. Оба выделенных фрагмента ДНК клонируют в pCMV3AS-1, линеаризированную по Pst1 и Nru1, получая в результате pCMV3AS-2. Гены, кодирующие элиситоры (пример 5) или клеточные ингибиторные белки (пример 6) могут быть клонированы в виде Ncol фрагментов ДНК в уникальный Nco1 сайт pCMV3AS-2. Полученные производные pCMV3AS-2 плазмиды подвергают рестрикции по HindIII, а из агарозного геля элюируют фрагменты ДНК, содержащие химерные гены, которые затем лигируют в линеаризированную по Hindlll pBIN19, получая бинарные вектора для трансформации растений pBINCMV3-CP, pBINCMV3-РЗО и pBINCMV3-TI, соответственно.
Пример 9: Конструирование вектора для трансформации растений, который продуцирует транскрипт, реплицируемый при инфицировании ВБТ (TSWV).
5' конец минус-смысловой ВБТ S РНК встраивают непосредственно в сайт инициации транскрипции, CaMV 35S промотора с применением двух праймеров ZUP148 (Пример 8), и праймера ZUP255:
5' ACACAATTGC TCTCCTCTCC AAATGAAA 3' (содержащего нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 2608-2621 Посл. N. 8) (посл. 26)
с pZU-A в качестве матрицы в стандартной ДНК ПЦР реакции. Амплифицированный фрагмент ДНК подвергают рестрикции по EcoRV и клонируют в EcoR5 линеаризированную pZU-A. Полученную плазмиду подвергают рестрикции по Mun1 и Pst1 и концентрируют в агарозном геле. pTSWV-S2 подвергают рестрикции по Pst1 и Mun1, фрагмент ДНК длиной 2,9 т.п.н. концентрируют в агарозном геле, а затем клонируют в элюированную из геля производную pZU-A, получая pTSWVSAS-1.
5' ACACAATTGC TCTCCTCTCC AAATGAAA 3' (содержащего нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 2608-2621 Посл. N. 8) (посл. 26)
с pZU-A в качестве матрицы в стандартной ДНК ПЦР реакции. Амплифицированный фрагмент ДНК подвергают рестрикции по EcoRV и клонируют в EcoR5 линеаризированную pZU-A. Полученную плазмиду подвергают рестрикции по Mun1 и Pst1 и концентрируют в агарозном геле. pTSWV-S2 подвергают рестрикции по Pst1 и Mun1, фрагмент ДНК длиной 2,9 т.п.н. концентрируют в агарозном геле, а затем клонируют в элюированную из геля производную pZU-A, получая pTSWVSAS-1.
N-кодирующий домен pTSWVSAS-1 замещают уникальным Nco1 сайтом клонирования, а вниз от 3' конца минус-смысловой ВБТ S РНК клонируют головную структуру Hepatitis delta вирусной РНК, путем ПЦР амплификации двух фрагментов ДНК с применением pTSWVSAS-1 в качестве матрицы. Первый фрагмент ДНК амплифицируют с применением праймера ZUP252 (noсл. 27):
5' GACCCGAAAG GGACCAATTT С 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 911-930 Посл. N. 8)
и ZUP253 (посл. 28):
5' TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 3' (содержащего нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 636-655 Поcл. N. 8).
5' GACCCGAAAG GGACCAATTT С 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 911-930 Посл. N. 8)
и ZUP253 (посл. 28):
5' TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 3' (содержащего нуклеотиды, идентичные нуклеотидам 636-655 Поcл. N. 8).
Фрагмент ДНК подвергают рестрикции по Bal1 и Nco1, и из агарозного геля элюируют фрагмент ДНК (положения 636-911 Последовательности N. 8) длиной 269 т. п. н. Второй фрагмент ДНК амплифицируют с применением праймеров ZUP254 (посл. 29):
5' TTTCCATGGT GATCGTAAAA G 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 140-157 Посл. N. 8)
и ZUP255, праймера, синтезированного из нуклеотидов, включающих нуклеотиды, комплементарные антигеномной РНК hepatitis delta вируса, как описано [16] , лигируют с нуклеотидами, идентичными нуклеотидам 1-14 (3' конец праймера) Посл. N. 8:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTC CTTCGGATGC CCAGGTCGGA CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACC CAGAGCAATC GTGTC 3' (посл. 30).
5' TTTCCATGGT GATCGTAAAA G 3' (содержащего нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам 140-157 Посл. N. 8)
и ZUP255, праймера, синтезированного из нуклеотидов, включающих нуклеотиды, комплементарные антигеномной РНК hepatitis delta вируса, как описано [16] , лигируют с нуклеотидами, идентичными нуклеотидам 1-14 (3' конец праймера) Посл. N. 8:
5' TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTC CTTCGGATGC CCAGGTCGGA CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACC CAGAGCAATC GTGTC 3' (посл. 30).
Скорректированный перечень последовательностей I - 30 см. далее.
Фрагмент ДНК подвергают рестрикции по Pst1 и Nco1, и из агарозного геля элюируют фрагмент ДНК длиной 245 т.п.н. Оба выделенных фрагмента ДНК клонируют в pTSWVSAS-1, линеаризированную по Pst1 и Bal1, с образованием pTSWVSAS-2. Гены, кодирующие элиситоры (пример 5) или клеточные ингибиторные белки (пример 6) клонируют в виде Ncol фрагментов ДНК в уникальный Nco1 сайт pTSWVSAS-2. Полученные pTSWVSAS-2 производные плазмиды подвергают рестрикции по Xba1, а фрагменты ДНК, содержащие химерные гены, выделяют из агарозного геля и лигируют с Xba1 линеаризированной pBIN19, с образованием бинарных векторов для трансформации растений pBINTSWVS-CP (Посл. N. 8), pBINTSWVS-РЗО и pBINTSWVS-T1, соответственно.
Пример 10: Выбор соответствующих растений-хозяев.
1) Табак, Nicotiana tabacum var. Samsun EN. Сорт табака, несущий N' ген N. sylvestris, дающий реакцию сверхчувствительности при инфицировании ВТоМ. БО ВТоМ элисирует сильную СЧР защитную реакцию в этом хозяине.
2) Томат, Lycopersicon esculentum var. ATV847, родительская линия для коммерческих гибридов Yaiza и Gemma. Линия томата, несущая Tm-22 ген устойчивости к ВТоМ. Было показано, что БЗО ВТоМ элисирует реакцию СЧР у этого устойчивого генотипа [17, 18].
Пример 11: Трансформация бинарных векторов в растительный материал табака и томата.
Способы переноса бинарных векторов в растительный материал хорошо разработаны и известны специалистам. Существующие отличия в методиках имеют место благодаря отдельным различиям в применяемых штаммах Agrobacterium, различным источникам материала эксплантата, различиям в регенерационных системах в зависимости как от сорта, так видов используемых растений.
Бинарные вектора для трансформации растений, описанные выше, применяют в экспериментах по трансформации растений согласно следующим способам. Бинарные векторные конструкции переносят посредством трехродительского скрещивания в акцепторный штамм Agrobacterium tumefaciens с последующим анализом по Саузерну экс-конъюгатов для подтверждения соответствующего переноса конструкции в акцепторный штамм, инокуляции и сокультивирования стерильного материала эксплантанта с выбранным штаммом Agrobacterium tumefaciens, селективного подавления штамма Agrobacterium tumefaciens с помощью соответствующих антибиотиков, селекции трансформированных клеток при росте на селективной среде, содержащей канамицин, переноса ткани на среду, индуцирующую корнеобразование, переноса проростков в почву, анализ сохранности конструкции путем анализов по Саузерну выделенной из трансгенного растения тотальной ДНК, анализа на соответствующую функцию встроенного химерного гена путем анализа по Норзерну и/или ферментных анализов и Вестерн-блоттинга белков [5] .
Пример 12: Экспрессия химерных последовательностей в клетках растений табака и томата.
РНК экстрагируют из листьев регенерированных растений следующим способом. В жидком азоте растирают в тонкоизмельченный порошок 200 мг листового материала. Добавляют 800 мкл буфера для экстракции РНК (100 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 500 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 200 мМ β- Меркаптоэтанола, 0,4% ДДС), экстрагируют гомогенат фенолом и собирают нуклеиновые кислоты путем осаждения спиртом. Ресуспендируют нуклеиновые кислоты в 0,5 мл 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1мМ ЭДТА, добавляют LiCl до конечной концентрации 2 М, оставляют на льду максимально в течение 4 часов и собирают РНК центрифугированием. Ресуспендируют в 400 мкл 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА и осаждают спиртом, окончательно ресуспендируют в 50 мкл 10 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 1мМ ЭДТА. РНК разделяют на гелях глиоксоль/агароза и блоттируют с Genescreen, как описано [19] . Последовательности рекомбинантной вирусной РНК определяют с помощью ДНК или РНК зондов, меченных [32P], [35S] или путем применения способов с введением нерадиоактивных меток. Основываясь на анализах по Норзерну, определяют, в какой степени регенерированные растения экспрессируют химерные рекомбинантные вирусные гены.
Растения, трансформированные последовательностями рекомбинантной вирусной ДНК, подвергают также блоттингу по Вестерну после инокуляции соответствующим вирусом. Из листьев трансформированных растений посредством их измельчения в буфере для приготовления образцов согласно [20] экстрагируют белки. Навеску 50 мкг белка подвергают электрофорезу в 12,5%-ном ДДС-полиакриламидном геле согласно [20]. Разделенные белки переносят электрофоретически на нитроцеллюлозу согласно [21]. Перенесенные белки взаимодействуют с антисывороткой, полученной против очищенных частиц ВТоМ или против очищенного БЗО белка согласно [21]. Основываясь на результатах анализов по Вестерну определяют, что трансформированные растения действительно экспрессируют элиситорные белки после инокуляции соответствующим вирусом.
Пример 13: Устойчивость растений табака и томата к ВОМ и ВБТ инфекции.
Трансформированные растения выращивают в теплице в стандартных карантинных условиях для того, чтобы предотвратить любую возможность инфицирования патогенами. Трансформанты самоопыляются, а образовавшиеся семена собирают. Растения следующего поколения анализируют на наличие сегрегации встроенного гена, а затем инфицируют ВОМ или ВБТ посредством механической инокуляции. Ткань растений, системно инфицированных ВОМ или ВБТ, измельчают в 5 объемах охлажденного на льду буфера для экстракции (10 мМ фосфатный буфер) и втирают в присутствии порошка карборунда в первые два полностью развернутые листа проростков приблизительно 5-недельного возраста. В течение 3-х недель после инокуляции следят за развитием симптомов у инокулированных растений.
Растения, содержащие последовательности ДНК ВОМ или последовательности ДНК ВБТ, обладают пониженной чувствительностью к ВОМ или ВБТ инфекциям по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями, у которых тяжелые системные ВОМ или ВБТ симптомы развиваются в течение 7 дней после инокуляции.
Claims (12)
1. Конструкция ДНК, способная кодировать прямо или опосредованно молекулу минус-смысловой РНК, способную взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой вирусом при внедрении его в растение таким образом, что по меньшей мере один протеин, полипептид или пептид, вызывающий естественный механизм защиты растений против проникающих патогенов, продуцируется как следствие взаимодействия с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой указанным внедряющимся вирусом, причем указанная конструкция находится под контролем экспресии промотора и терминатора, способных функционировать в растении.
2. Конструкция рекомбинантной ДНК, способная кодировать молекулу плюс-смысловой РНК, способную взаимодействовать с РНК-зависимой РНК-полимеразой, кодируемой вирусом при внедрении его в растение, и реплицирующая как результат такого взаимодействия молекулу плюс-смысловой РНК, которая способна кодировать по меньшей мере один протеин, полипептид или пептид, вызывающий естественный механизм защиты растений против проникающих патогенов, причем указанная конструкция находится под контролем экспресии промотора и терминатора, способных функционировать в растении.
3. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что включает SEQ ID N 1.
4. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что включает SEQ ID N 4.
5. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что включает SEQ ID N 6.
6. Конструкция по п.1, отличающаяся тем, что включает SEQ ID N 8.
7. Конструкция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный протеин, полипептид или пептид способен вызывать реакцию сверхчувствительности или выделение в растении белка - клеточного ингибитора.
8. Конструкция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что механизм защиты вызывается белком растительного вируса, бактерии, гриба или нематоды.
9. Конструкция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный белок - клеточный ингибитор выбирают из группы, включающей рибонуклеазы, протеиназы, белки - ингибиторы рибосом и белки, разрушающие клеточные стенки.
10. Конструкция по пп.1 - 9, отличающаяся тем, что указанная конструкция содержит конструктивный промотор, при этом указанный промотор выбирают из группы, включающей промоторы вирусного, грибного, бактериального и растительного происхождения.
11. Конструкция по п.10, отличающаяся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промоторов CaMV 19S, нопалинсинтетазы, октопинсинтетазы, теплового шока 80.
12. Способ получения растений, содержащих конструкцию по любому из пп.1 - 11 в их геноме, отличающийся тем, что: а) встраивают в геном растительной клетки конструкцию ДНК по п.1-11, б) получают трансформированные клетки, в) регенерируют из трансформированных клеток генетически трансформированные растения.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9311593.9 | 1993-06-04 | ||
| GB939311593A GB9311593D0 (en) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | Improvements in or relating to organic compounds |
| PCT/EP1994/001817 WO1994029464A1 (en) | 1993-06-04 | 1994-06-03 | Virus resistant plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96100552A RU96100552A (ru) | 1998-05-27 |
| RU2136757C1 true RU2136757C1 (ru) | 1999-09-10 |
Family
ID=10736665
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96100552A RU2136757C1 (ru) | 1993-06-04 | 1994-06-03 | Конструкция днк, конструкция рекомбинантной днк и способ получения растений |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5919705A (ru) |
| EP (1) | EP0701620A1 (ru) |
| JP (1) | JPH08510915A (ru) |
| CN (1) | CN1119422C (ru) |
| AU (1) | AU683071B2 (ru) |
| BR (1) | BR9406711A (ru) |
| CA (1) | CA2163523A1 (ru) |
| CZ (1) | CZ291203B6 (ru) |
| GB (1) | GB9311593D0 (ru) |
| HU (1) | HUT74227A (ru) |
| IL (1) | IL109891A0 (ru) |
| PL (1) | PL185856B1 (ru) |
| RU (1) | RU2136757C1 (ru) |
| SK (1) | SK152495A3 (ru) |
| WO (1) | WO1994029464A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA943917B (ru) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1283631B1 (it) * | 1996-05-09 | 1998-04-23 | Metapontum Agrobios Srl | Metodo per la preparazione di piante transgeniche resistenti ad in- fezioni virali e piante cosi' ottenute |
| GB9615349D0 (en) * | 1996-07-22 | 1996-09-04 | Zeneca Ltd | Virus resistance in plants |
| US6235974B1 (en) * | 1996-12-05 | 2001-05-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Hypersensitive response induced resistance in plants by seed treatment with a hypersensitive response elicitor |
| US6664447B2 (en) | 2000-03-10 | 2003-12-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Tomato gene.Sw-5 conferring resistance to Tospoviruses |
| CA2379445C (en) | 2000-06-01 | 2007-08-21 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Lactams substituted by cyclic succinates as inhibitors of a.beta. protein production |
| AUPR155800A0 (en) * | 2000-11-17 | 2000-12-14 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Method of enhancing virus-resistance in plants and producing virus-immune plants |
| WO2005049839A2 (en) | 2003-11-10 | 2005-06-02 | Icon Genetics Ag | Rna virus-derived plant expression system |
| US9267143B2 (en) | 2003-11-10 | 2016-02-23 | Icon Genetics Gmbh | RNA virus-derived plant expression system |
| US20080052791A1 (en) * | 2006-01-30 | 2008-02-28 | Samuel Roberts Noble Foundation | drought tolerance in plants |
| US8669413B2 (en) * | 2009-11-25 | 2014-03-11 | Hm.Clause, Inc. | Breeding and selection for resistance to melon severe mosaic virus (MeSMV) |
| CN115176014B (zh) * | 2020-02-26 | 2024-03-26 | 瑞克斯旺种苗集团公司 | Cmv抗性赋予基因 |
| CN111549054A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-18 | 中国农业科学院植物保护研究所 | CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用 |
| CN111667887A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-09-15 | 海南大学 | 基于功能性状筛选模型的外来入侵植物的生物防治方法 |
| CN112195288B (zh) * | 2020-11-19 | 2024-04-26 | 广西壮族自治区农业科学院 | 同时检测辣椒四种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991013994A1 (en) * | 1990-03-13 | 1991-09-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Gene expression |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0298918B1 (de) * | 1987-07-10 | 2001-09-05 | Syngenta Participations AG | Induzierbare Virusresistenz bei Pflanzen |
| US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
| CN1033645A (zh) * | 1988-10-22 | 1989-07-05 | 中国科学院上海植物生理研究所 | 控制植物病毒病的基因工程方法 |
| NL9001711A (nl) * | 1989-10-03 | 1991-05-01 | Clovis Matton N V | Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat. |
| EP0479180A3 (en) * | 1990-10-05 | 1992-08-26 | Hoechst Aktiengesellschaft | Virus resistant plants, method for their production |
| DE69328994T2 (de) * | 1992-04-28 | 2001-03-01 | Nihon Nohyaku Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung eines fremden Gens oder dessen Produkt in Pflanzenzellen |
-
1993
- 1993-06-04 GB GB939311593A patent/GB9311593D0/en active Pending
-
1994
- 1994-06-03 AU AU70707/94A patent/AU683071B2/en not_active Ceased
- 1994-06-03 IL IL10989194A patent/IL109891A0/xx unknown
- 1994-06-03 BR BR9406711A patent/BR9406711A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-06-03 EP EP94919606A patent/EP0701620A1/en not_active Withdrawn
- 1994-06-03 CA CA002163523A patent/CA2163523A1/en not_active Abandoned
- 1994-06-03 US US08/553,619 patent/US5919705A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-03 JP JP7501291A patent/JPH08510915A/ja not_active Ceased
- 1994-06-03 SK SK1524-95A patent/SK152495A3/sk unknown
- 1994-06-03 HU HU9503284V patent/HUT74227A/hu unknown
- 1994-06-03 ZA ZA943917A patent/ZA943917B/xx unknown
- 1994-06-03 CN CN94192894A patent/CN1119422C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-06-03 WO PCT/EP1994/001817 patent/WO1994029464A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-06-03 RU RU96100552A patent/RU2136757C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-06-03 CZ CZ19953199A patent/CZ291203B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-06-03 PL PL94311815A patent/PL185856B1/pl unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991013994A1 (en) * | 1990-03-13 | 1991-09-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Gene expression |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ319995A3 (en) | 1996-04-17 |
| AU683071B2 (en) | 1997-10-30 |
| HUT74227A (en) | 1996-11-28 |
| SK152495A3 (en) | 1996-05-08 |
| CN1119422C (zh) | 2003-08-27 |
| CZ291203B6 (cs) | 2003-01-15 |
| CA2163523A1 (en) | 1994-12-22 |
| JPH08510915A (ja) | 1996-11-19 |
| GB9311593D0 (en) | 1993-07-21 |
| CN1128048A (zh) | 1996-07-31 |
| US5919705A (en) | 1999-07-06 |
| IL109891A0 (en) | 1994-10-07 |
| PL311815A1 (en) | 1996-03-18 |
| AU7070794A (en) | 1995-01-03 |
| BR9406711A (pt) | 1996-03-19 |
| HUP9503284D0 (en) | 1996-02-28 |
| EP0701620A1 (en) | 1996-03-20 |
| PL185856B1 (pl) | 2003-08-29 |
| WO1994029464A1 (en) | 1994-12-22 |
| ZA943917B (en) | 1995-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3281512B2 (ja) | ウイルス耐性の植物の生産方法 | |
| US5773700A (en) | Constructs containing impatiens necrotic spot tospovirus RNA and methods of use thereof | |
| EP0426195B1 (en) | Improvements in or relating to organic compounds | |
| CA2026703C (en) | Genetic manipulations with recombinant dna comprising sequences derived from rna virus | |
| JP6675332B2 (ja) | ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物 | |
| RU2136757C1 (ru) | Конструкция днк, конструкция рекомбинантной днк и способ получения растений | |
| Chowrira et al. | Coat protein-mediated resistance to pea enation mosaic virus in transgenic Pisum sativum L. | |
| WO2017044773A1 (en) | Citrus plants resistant to huanglongbing | |
| EP0938574B1 (en) | Method for inducing viral resistance into a plant | |
| US20230392159A1 (en) | Engineering increased suberin levels by altering gene expression patterns in a cell-type specific manner | |
| EP1358341B1 (en) | Methods for generating resistance against cgmmv in plants | |
| NZ235789A (en) | Rna having endonuclease and antisense activity, genes encoding it and use | |
| JPH11504521A (ja) | 植物病原体耐性遺伝子およびそれの使用 | |
| WO2013062069A1 (ja) | ジェミニウイルス複製阻害剤 | |
| WO2002039808A1 (en) | Method of enhancing virus-resistance in plants and producing virus-immune plants | |
| US8901372B2 (en) | Plant resistance to banana bunchy top virus | |
| Yeh et al. | Production and evaluation of transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of passionfruit woodiness virus | |
| US20040139494A1 (en) | Infection resistant plants and methods for their generation | |
| Prins | Characterisation of tospovirus resistance in transgenic plants | |
| JP2003521218A (ja) | ポチイウィルス感染に対する耐性を付与できるリボザイム、及び前記リボザイムを発現する植物 | |
| AU2002220347A1 (en) | Method of enhancing virus-resistance in plants and producing virus-immune plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040604 |