JP3281512B2 - ウイルス耐性の植物の生産方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術的背景】本発明は、ウイルス病に耐性であ
る植物を生産する方法と、そのようなウイルス耐性の付
与に用いる遺伝物質と、その方法の産物とに関する。従
って、本発明は、植物分子生物学、植物ウイルス学およ
び植物遺伝子工学の分野の応用を含んでいる。 【０００２】植物においてウイルス感染は、成長阻害、
形態変化および収穫減少などの種々の不利な効果の原因
となる。更に、ウイルス感染はしばしば植物を他の害虫
や病原菌による損傷に対してより影響され易くする。植
物ウイルスについての一般的な知見は、文献（例えば、
Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９８１）、Ｌａｕｆｆｅｒ（１９
８１）およびＫａｄｏ ＆ Ａｇｒａｗａｌ（１９７
２））に記述されている。 【０００３】植物は、動物のように抗体が関与する免疫
系を持たない。しかし、植物は病原菌による感染に抵抗
するために、幾つかの方法を発達させてきた。例えば、
ある型の植物は、侵入する真菌の表面の糖部分に結合し
て真菌を不動化するレクチンを産生する。更に、ある型
の植物は、明らかに、細菌、昆虫、それに多分ウイルス
による攻撃に応答して植物中を循環する種々の分子を産
生する。 【０００４】ある型の植物では、幼若な植物に「減衰さ
せた（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」ウイルス株、つまり、
重大な症状を起こさないウイルス株を感染させることに
よって、ある程度のウイルス耐性を誘導することができ
る（例えば、Ｒａｓｔ（１９７２）およびＣｏｓｔａ
（１９８０）を参照）。この方法には次のような幾つか
の限界がある。つまり、（１）一定の型の農作物（ｃｒ
ｏｐ）中でのみ都合良く行うことができる。（２）一定
の型のウイルスに対してのみ行うことができる。（３）
感染ウイルスの適切な減衰株が同定されているかまたは
単離されている場合にのみ、行うことができる。（４）
この方法によって与えられる保護は、限られた数の種々
のウイルスに対してのみ効果があり得る。（５）減衰感
染は第２の関連の無いウイルスによる感染を、相乗効果
によって更に深刻に悪化する可能性がある。 【０００５】それで、上述した問題が解決されていて、
しかも、減衰ウイルスの同定、単離および使用を必要と
しないようなウイルス感染から植物を保護する方法が必
要とされている。また、天然の遺伝的耐性または交叉免
疫（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）耐性が利用で
きないときにウイルス耐性を与える必要がある。 【０００６】 【発明の概要】従って、本発明の目的は、減衰ウイルス
の使用、耐性を与える遺伝的決定基の存在、または、交
叉免疫の利用可能性のいずれにも依存しないウイルス耐
性植物を生産する方法を提供することである。 【０００７】また、本発明の目的は、工学的に処理した
植物が植物ウイルスに対して耐性を示すように、植物の
ゲノムに、植物ウイルスのゲノムの小部分を他のものと
共に含むＤＮＡ構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を挿入す
ることにより、植物を遺伝子工学的に処理する方法を提
供することである。 【０００８】また、本発明の他の目的は、遺伝的に形質
転換されたウイルス耐性植物の生産に使用できる組換体
ＤＮＡ分子を提供することである。 【０００９】更に、本発明の他の目的は、植物ウイルス
のＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ配列の存在をそれぞ
れ特徴とする、遺伝的に形質転換された細胞および分化
植物を提供することである。 【００１０】上述の目的を達成する中で、本発明の一つ
の観点として、植物ウイルスによる感染に耐性である遺
伝的に形質転換された植物を生産する方法が提供され
た。この方法は次の工程を包含する。 【００１１】（ａ）植物細胞のゲノムに、（ｉ）植物細
胞中で機能して、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起
こすプロモーターと、（ii）植物ウイルスから誘導した
ＤＮＡ配列であって、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産
を起こすＤＮＡ配列と、（iii)植物細胞中で機能して、
ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチド
の付加を起こす３′非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔ
ｅｄ）ＤＮＡ配列とを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子
を、挿入する工程。 【００１２】（ｂ）形質転換された植物細胞を得る工
程。 【００１３】（ｃ）形質転換された植物細胞から、植物
ウイルスによる感染に対する耐性が増した遺伝的に形質
転換した植物を再生する工程。 【００１４】一つの好ましい具体例では、植物ウイルス
のＲＮＡ配列はそのウイルスのコートたんぱく質をコー
ドする。 【００１５】本発明の他の観点として、配列中に次のも
のを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子が提供された。 【００１６】（ａ）植物細胞中で機能して、植物ウイル
スのＲＮＡ配列の生産を起こすプロモーター、（ｂ）植
物ウイルスから誘導されたＤＮＡ配列であって、植物ウ
イルスのコートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生
産を起こすＤＮＡ配列、および、（ｃ）植物細胞中で機
能して、ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌク
レオチドの付加を起こす３′非翻訳領域。 【００１７】また、本発明の他の観点として、上述の
（ａ），（ｂ）および（ｃ）の要素を包含するＤＮＡ
を、それぞれ含む細菌細胞および形質転換された植物細
胞が提供された。 【００１８】更に、本発明の他の観点として、上述のよ
うに形質転換された植物細胞を包含し、植物ウイルスに
対して耐性を示す分化した植物が提供された。また、本
発明の他の観点として、そのような植物を栽培するこ
と、外植片（ｅｘｐｌａｎｔｓ）、挿木およびサッド
（ｓｕｄｓ）などの胎芽（むかご、ｐｒｏｐａｇｕｌｅ
ｓ）を用いてそのような植物を繁殖させること、また
は、この植物を他の植物と交雑（ｃｒｏｓｓ）させて同
じくこの植物ウイルスに対して耐性を示す後代（ｐｒｏ
ｇｅｎｙ）を生産することを伴う方法を提供する。 【００１９】本発明の他の目的、特質および利点は、本
明細書の以下の説明から明らかとなるだろう。しかし、
本明細書中の詳しい説明および特定の具体例は、本発明
の好ましい具体例を示してはいるが、説明のためだけの
ものであり、本発明の技術的範囲を定めるものではな
い。本発明の技術的範囲内で成される種々の変形および
修正は、この詳細な説明から当業者には明らかであろ
う。 【００２０】図面には次の通りの内容を示している。 【００２１】図１はトランスジェニック植物におけるウ
イルス病耐性の生物試験の概略を示す。 【００２２】図２はダイズ モザイク ウイルス コー
トたんぱく質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列を示
す。 【００２３】図３は、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／
ＮＯＳ 構成物を含む植物形質転換ベクター、ｐＭＯＮ
３１９を示す。このベクターは植物細胞に構成物を挿入
するために使用した。 【００２４】図４は、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII
とＥｃｏＲＩに対する唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）開裂部位
を有する合成マルチリンカーに隣接してＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を
示す。このマルチリンカーの後には、ノパリン シンタ
ーゼ遺伝子アデニル化シグナルをコードする２６０塩基
対の断片が続いている。 【００２５】図５は、図４に示したＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーター、マルチリンカーおよびノパリン シンター
ゼ断片の完全配列を示している。 【００２６】図６および図７は、本発明によってそれぞ
れ生産したトランスジェニックなタバコ植物とトマト植
物に対する異なる水準のウイルス接触（ｅｘｐｏｓｕｒ
ｅ）の効果を含む例３（Ａ）と３（Ｂ）に記述した実験
からのデータを、それぞれ示している。 【００２７】図８は、遺伝的に耐性な系のトマト植物
と、本発明によって生産したトランスジェニック植物の
間のウイルス耐性の比較を含む例３（Ｃ）に記述した実
験からのデータを示している。 【００２８】図９は、タバコ モザイク ウイルスの種
々の株に対して効果的である、本発明に従ったトマト植
物中への交叉免疫の導入を含む例４に記述した実験から
のデータを示す。 【００２９】図１０は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の単離と中
間体ベクターへの導入を示している。 【００３０】図１１は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌクレオチ
ド配列を示している。 【００３１】図１２は、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター
をペチュニアのｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーターに置換
したＤＮＡ構成物の生産の概略を示す。 【００３２】図１３は、アルファルファ モザイク ウ
イルスのコートたんぱく質（ＡＭＶＣＰ）をコードする
ｃＤＮＡを製造するために使用した方法を示す。 【００３３】図１４は、ポテト ウイルス Ｘ のコー
トたんぱく質遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクタ
ーを製造するために使用した方法を示す。 【００３４】図１５は、ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオ
チド配列を示す。 【００３５】図１６は、トマト ゴールデン モザイク
ウイルス コートたんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）をコ
ードするヌクレオチド断片を単離するための工程を示
す。 【００３６】図１７は、ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチ
センス相補体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターを
生産するために例９で使用した工程の概略を示す。 【００３７】 【好ましい具体例の説明】本発明は、植物細胞中で機能
し、ウイルス耐性を生じるＤＮＡ構成物の製造を含む。
以下に詳細に説明するように、「ウイルス耐性」という
語は、ここでは、一つまたはそれ以上の型の植物ウイル
スに抵抗する植物の能力を意味している。 【００３８】多数の植物ウイルスが世界的に重大な農作
物の損失を引起こしている。本発明は、植物ウイルスに
感染され易い植物を保護する方法を提供する。そのよう
なウイルスには、例えば、ダイズ モザイク ウイル
ス、ビーン ポッド モトル（ｂｅａｎ ｐｏｄ ｍｏ
ｔｔｌｅ） ウイルス、タバコ リング スポットウイ
ルス、バーレイ イエロー ドゥワーフ（ｂａｒｌｅｙ
ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ） ウイルス、コムギ ス
ピンドル ストリーク（ｓｐｉｎｄｌｅ ｓｔｒｅａ
ｋ） ウイルス、ソイル ボーン（ｓｏｉｌ ｂｏｒ
ｎ） モザイクウイルス、コムギ ストリーク ウイル
ス イン メイズ（ｉｎ ｍａｉｚｅ）、メイズ ドゥ
ワーフ モザイク ウイルス、メイズ クロロティック
（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ） ドゥワーフ ウイルス、キュ
ーリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ） モザイク ウイルス、タバ
コ モザイク ウイルス、アルファルフア モザイク
ウイルス、ポテト ウイルス Ｘ、ポテト ウイルス
Ｙ、ポテト リーフロール（ｌｅａｆｒｏｌｌ） ウイ
ルス、トマト ゴールデン モザイク ウイルスがあ
る。これらの中で、メイズ ドゥワーフ モザイク ウ
イルス、バーレイ イエロー ドゥワーフ ウイルス、
コムギ ストリーク モザイク ウイルス、ソイル ボ
ーン モザイク ウイルス、ポテト リーフロール ウ
イルス およびキューリ モザイク ウイルス に対す
る保護が特に重要である。 【００３９】本発明の実施によりウイルス耐性となる植
物には、ジャガイモ、トマト、コショウ、タバコ、ダイ
ズ、コムギ、コーン、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、スカ
ッシュ（ｓｑｕａｓｈ）、キューリおよびビート（ｂｅ
ｅｔ）などがある。しかし、これらに限られるわけでは
ない。 【００４０】２本鎖ＤＮＡ中に存在する植物遺伝子の発
現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ＲＮＡポリメラーゼ酵
素によるＤＮＡの一つの鎖からのメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の転写と、核の中でのｍＲＮＡ一次転写体
のその後のプロセッシングを含んでいる。このプロセッ
シングは、ウイルスＲＮＡの３′末端にポリアデニル化
ヌクレオチドを付加する３′非翻訳領域を含んでい
る。 【００４１】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、普通「プロ
モーター」と称されるＤＮＡ領域によって制御されてい
る。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼに対してＤ
ＮＡと会合し、更に、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型（ｔｅｍｐ
ｌｅｔｅ）として使用してｍＲＮＡの転写を始め、対応
するＲＮＡ鎖をつくるように合図する配列を含む。 【００４２】植物細胞中で活性な多数のプロモーターが
文献に記載されてきた。これらには、例えば、ノパリン
シンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）
（ＮＯＳ）とオクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ） シンタ
ーゼ（ＯＣＳ） プロモーター（これらは、アグロバク
テリウム タメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導プラスミド
に保有されている）、カリフラワー モザイク ウイル
ス （ＣａＭＶ） １９Ｓ および ３５Ｓ プロモー
ター、リブロース２リン酸 カルボキシル化酵素の小サ
ブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富な植物ポ
リペプチド）からの光誘導プロモーター、および、ヒド
ロキシプロリンに富む糖たんぱく質をコードする遺伝子
のプロモーターなどがある。これらのプロモーターの全
てが、植物中で発現される種々の型のＤＮＡ構成物をつ
くるために使用された（ＰＣＴ公報 ＷＯ ８４／０２
９１３（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｓａｎｔ
ｏ）を参照）。 【００４３】植物細胞中でウイルスＲＮＡの転写を起こ
すことが知られているあるいは見出されているプロモー
ターを、本発明で使用することができる。そのようなプ
ロモーターは植物またはウイルスから得ることができ、
例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子などの植物遺伝子から単離されたプロモータ
ーがある。しかし、これらに限定されるわけではない。
後述するように、好ましくは、選んだ特定のプロモータ
ーは、植物を実質的にウイルス感染に対して耐性にする
有効量のコートたんぱく質の生産をもたらすための十分
な発現を引起こすことができなければならない。耐性を
誘導するために必要なコートたんぱく質の量は、植物お
よび／または 保護の目標となるウイルスの型に応じて
変化する。従って、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターが好
ましい。しかし、このプロモーターが本発明の全ての具
体例で最適なプロモーターであるとは限らない。 【００４４】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるプロ
モーターは、必要ならば、修飾してその制御特性を変化
させることができる。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモ
ーターを、光のないところでｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現
を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の一部分に連結さ
せ、葉では活性であるが根では活性でないプロモーター
をつくることができる。生成のキメラ プロモーターを
ここに示すように使用することができる。ここでの説明
では、「ＣａＭＶ３５Ｓ」の語は、例えば、オペレータ
ー領域との連結、無作為のまたは制御を伴った突然変異
生成（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって誘導されたプ
ロモーターなどの、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの変
形も含む。 【００４５】本発明のＤＮＡ構成物は、２本鎖ＤＮＡ形
の中にウイルスのコートたんぱく質をコードするウイル
ス ゲノムの一部分を含むことが好ましい。多くの型の
植物ウイルスはＤＮＡではなくＲＮＡを含んでいるが、
１本鎖または２本鎖のＤＮＡを含むものもある。ＲＮＡ
を含むウイルスは、標準の転写プロモーター および／
または ３′制御配列を含まない。この場合には、ポリ
ペプチドまたはたんぱく質は、ウイルスに保有されるＲ
ＮＡ鎖またはその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から
直接翻訳される。コートたんぱく質をコードしているウ
イルス ゲノムの部分は、当業者によく知られている幾
つかの方法のいずれかによって決定できる（後述の例１
を参照）。 【００４６】例えば、ある場合には、コートたんぱく質
をシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、ウイ
ルスのコートたんぱく質をコードするＤＮＡ配列の合成
を選択することができる。その代わりに、コートたんぱ
く質をコードするウイルスからのＲＮＡを同定し、生成
することもできる。ＲＮＡを含む植物ウイルスの大部分
では、コートたんぱく質遺伝子はウイルスＲＮＡの３′
末端に位置している。ある場合には、コートたんぱく質
遺伝子は、その配列がウイルスのコートたんぱく質のア
ミノ酸配列を反映しているオリゴヌクレオチド プロー
ブを用いて位置を定めることができる。ウイルスがＲＮ
Ａを保有している場合には、ＤＮＡコード配列は逆転写
酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成すること
によって得られる。上述したように、多くの型の植物ウ
イルスはＲＮＡを含んでいる。これらには、例えば、タ
バコ モザイク ウイルス、トマト スポッティド（ｓ
ｐｏｔｔｅｄ） ウィルト（ｗｉｌｔ） ウイルス、キ
ューリ モザイク ウイルス、アルファルファ モザイ
ク ウイルス、ポテト ウイルス Ｘ などのポテック
スウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓ）、ポテト ウ
イルス Ｙ などのポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕ
ｓｅｓ）、ポテト リーフロール ウイルスなどがあ
る。 【００４７】ポティウイルスなどの一定のウイルスの場
合には、コートたんぱく質は、プロセッシングを受けて
コートたんぱく質を放出するポリプロテインの一部であ
る。当業者は、次の例１に詳述するように、コートたん
ぱく質をコードするウイルスゲノムの領域を単離し、翻
訳開始シグナルを導入するためには、これらのことを考
慮しなければならない。 【００４８】それほど好ましくはないが、ウイルスＲＮ
Ａ配列の生産を起こす本発明のＤＮＡ構成物で用いられ
る配列はアンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）の配置
をとることができる。例えば、ＤＮＡの転写によって生
産されるＲＮＡは、最終的には、天然のウイルス コー
トたんぱく質ｍＲＮＡの相補的配列を持つＲＮＡ分子を
生産することができる。（アンチセンス配置が使用され
る場合は、ＤＮＡ配列は、コートたんぱく質ｍＲＮＡの
５′領域に相補的なアンチセンスＲＮＡをつくるために
短くなると、信じられている。）その代わりに、アンチ
センスＤＮＡはウイルス ゲノムの他の断片から誘導で
きる。好ましい領域には、試験管中でウイルスＲＮＡの
翻訳を阻害することが示されている（Ｂｅａｃｈｙ ｅ
ｔ ａｌ．（１９８５））ウイルスＲＮＡの５′末端な
どがある。いずれの場合も、アンチセンス転写体は安定
性が低く、あるいは、宿主植物中でのより高い水準での
発現を必要とすると信じられているので、この配置はあ
まり好ましくない。 【００４９】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるコー
ド配列は、必要ならば、当業者に既知の方法を使用し
て、無作為のまたは制御を伴った突然変異生成のいずれ
かにより修飾して突然変異体をつくることができる。そ
れで、そのような突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）と変異
体（ｖａｒｉｅｎｔｓ）は本発明の範囲に含まれる。従
って、「コートたんぱく質」の語は、ここでは、トラン
ケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）たんぱく質、融合
（ｆｕｓｉｏｎ）たんぱく質、並びに、無修飾のコート
たんぱく質を含んでいる。 【００５０】３′非翻訳領域は、植物中で機能してウイ
ルスＲＮＡの３′末端へのポリアデニル化 ヌクレオチ
ドの付加を起こすポリアデニル化シグナルを含む。適切
な３′領域は、例えば、（１）アグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のノパリン シンターゼ
（ＮＯＳ）遺伝子などの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺
伝子の、ポリアデニル化シグナルを含む３′転写非翻訳
領域、および、（２）ダイズ貯蔵たんぱく質遺伝子およ
びＲｕＢＰカルボキシル化酵素遺伝子の小サブユニット
などの植物遺伝子である。好ましい３′領域は、例え
ば、ＮＯＳ遺伝子のものである。これについては後述の
例に詳しく述べる。 【００５１】本発明のＤＮＡ構成物によって生産される
ＲＮＡは、また、５′非翻訳のリーダー（ｌｅａｄｅ
ｒ）配列を含む。この配列は、遺伝子を発現するために
選んだプロモーターから誘導できるし、また、ｍＲＮＡ
の翻訳を増加させるために特別に修飾することができ
る。また、５′非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡから、適
当な真核細胞の遺伝子から、または、合成遺伝子配列か
ら得ることができる。本発明は、後述の例に示すよう
に、非翻訳領域が、プロモーター配列に伴う５′非翻訳
配列、および、ウイルス コートたんぱく質遺伝子の
５′非翻訳領域の部分の両者から誘導される構成物には
限定されない。そうではなくて、非翻訳リーダー配列
は、ウイルス コートたんぱく質に対するコード配列の
非翻訳領域の５′末端の部分、または、プロモーター配
列の部分であってよく、あるいは、関連のないプロモー
ター配列または上述のようなコード配列から誘導でき
る。 【００５２】本発明のＤＮＡ構成物は任意の適当な方法
によって植物のゲノムに挿入できる。適当な植物形質転
換ベクターには、例えば、アグロバクテリウム タメフ
ァシエンスのＴｉプラスミドから誘導したもの、並び
に、文献に開示されたものがある（例えばＨｅｒｒｅｒ
ａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂｅｖａｎ（１９
８３）、Ｋｌｅｅ（１９８５）およびＥＰＯ公報第１２
０５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．））。アグロバクテリウムのＴｉまたは根誘導（Ｒ
ｉ）プラスミドから誘導した植物形質転換ベクターに加
えて、本発明のＤＮＡ構成物を植物細胞へ挿入する他の
方法を用いることができる。そのような方法には、例え
ば、リポゾームの使用、エレクトロポーレーション（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遊離ＤＮＡ取込みを
増加させる化学物質、および、ウイルスまたは花粉を使
用する形質転換などがある。 【００５３】本発明の一つの具体例では、２本鎖ｃＤＮ
Ａは、タバコ モザイク ウイルス（ＴＭＶ）のコート
たんぱく質をコードするＲＮＡ断片（ＣＰ−ｍＲＮＡ）
から製造される。このコード配列をＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーター および ＮＯＳ３′非翻訳領域に連結し
て、本発明のＤＮＡ構成物を形成することができる。Ｄ
ＮＡ構成物を、部分的にアグロバクテリウム タメファ
シエンスのＴｉプラスミドから誘導した中間体プラスミ
ドに挿入して、プラスミド ｐＭＯＮ３１９をつくる。
それから、ベクターを、弱めた（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ
ｉプラスミドを含む培養Ａ．タメファシエンスに挿入す
る。二つのプラスミドは、交叉（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ
ｅｖｅｎｔ）によりコインテグレート（ｃｏｉｎｔｅｇ
ｒａｔｅ） プラスミドを形成する。 【００５４】コインテグレート プラスミドを含む細菌
細胞を、タバコ植物から誘導した細胞と共に培養し、形
質転換した植物細胞をカナマイシンを含む栄養培地を用
いて選抜する。それから、その細胞をカルス組織に培養
し、分化した植物に再生する。生成した本発明の植物
は、ウイルス耐性を与えるＤＮＡ構成物を含む。 【００５５】本発明の実施においては、特定のウイルス
に由来するＣＰコード配列を含むＤＮＡ構成物が持つ耐
性付与能力を、第１の例としてそのウイルスに対する全
身性の（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）宿主を用いて利用すること
が好ましい。「全身性の」宿主植物中では、ウイルス
は、複製し、依然として非特定的な方法で接種部位（典
型的には、葉上）から植物中を移動して、局部的でない
全身的な感染の症状を起こすことができる。（逆に、
「非全身的な」宿主は、壊疽性斑点の発達のような、接
種部位の周辺領域に制限された症状を示す。）特定のウ
イルスとそれに対して全身性である宿主とのペアリング
は、植物病理学ではよく認められている。例えば、多く
のトマトおよびタバコの変種並びにアルファルファは、
アルファルファ モザイク ウイルス （ＡＭＶ）に対
して全身性である。また、キューリモザイク ウイルス
（ＣｕＭＶ）は、トマト、タバコ、キューリおよび他の
メロン作物に全身性の感染を起こし、、タバコ、トマト
および多数のランの変種は、ＴＭＶに対する全身性の宿
主である。一般的には文献を参照（ＩＮＤＥＸ ＯＦＰ
ＬＡＮＴ ＶＩＲＵＳ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．３０７（ＡＲ
Ｓ−ＵＳＤＡ １９６６）。 【００５６】特に、本発明によって製造されたＤＮＡ構
成物は、ＲＮＡ配列の生産を起こす構成物中のＤＮＡ配
列を与える源として使用するウイルスに対して、全身性
であるような植物から誘導した植物細胞またはプロトプ
ラストに、上に述べた適当なベクターを介して導入され
る。ＤＮＡ配列がウイルスのコートたんぱく質をコード
している場合には、このように修飾された植物物質は、
例えば、ノーザン ブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりＣＰ−ｍＲＮＡの存在を試
験される。ＣＰ−ｍＲＮＡが検出されない（または力価
が低すぎる）場合には、ＣＰをコードする断片を制御す
るために構成物中で使用されているプロモーターを、よ
り強力な可能性のある他のプロモーターと置換えて、こ
の変化した構成物を再び試験することができる。 【００５７】その代わりに、この監視を全体（ｗｈｏｌ
ｅ）の再生した植物に行うことができる。いずれの場合
も、ウイルスｍＲＮＡしの適切な生産が行われたときに
は、形質転換細胞（またはプロトプラスト）は全植物に
再生され、後者（植物）をウイルスに対する耐性に関し
てスクリーニングする。再生工程のための方法論の選択
は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、ク
ローバーなど）、セリ科（ニンジン、セロリー、アメリ
カボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、ハツカダイコ
ン、ナタネなど）、ウリ科（メロンとキューリ）、イネ
科（コムギ、イネ、コーンなど）、ナス科（ジャガイ
モ、タバコ、トマト、コショウ）および種々の植物作物
の宿主に対する適当なプロトコルが利用できる。文献
（例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８
４））を参照。上記の科のそれぞれの植物に、本発明に
よってウイルス耐性を与えることができる。 【００５８】ウイルス耐性を試験される再生植物は、病
気の発達の速度が接種物中のウイルス濃度と線形に相関
する範囲の濃度で、ウイルスに接させることが好まし
い。この線形の範囲は、一定のウイルスと宿主種のペア
リングに関して、形質転換していない植物を用いて試験
的に決定することができる。 【００５９】ウイルス接種の方法は当業者にはよく知ら
れており、文献（Ｋａｄｏ ＆ Ａｇｒａｗａｌ（１９
７２））にまとめられている。一つの方法は、カルボラ
ンダム（ｃａｒｂｏｒｕｎｄｕｍ）またはケイソウ土な
どの研磨剤とウイルスとを含む水性懸濁液（典型的には
ｐＨ７〜８に緩衝化する）を用いて、葉表面を研磨する
工程を含む。この方法での接種はその簡便さのために一
般に好まれているが、一定の植物ウイルスに対しては他
の方法が好ましい可能性があることは当業者には認めら
れるだろう。例えば、アフィドボーン（ａｐｈｉｄ−ｂ
ｏｒｎ） ポテト リーフロール ウイルスは機械的な
研磨によっては容易に接種されないことが知られてい
る。これは適当な昆虫ベクターを用いて移入される。一
般的には文献（Ｔｈｏｍａｓ（１９８３））を参照。 【００６０】再生物の後代に接種を行い、形質転換され
ていない植物、および／または、ウイルスＲＮＡ配列の
生産を起こすＤＮＡ配列を欠いている構成物を用いて形
質転換された植物である、同様に処理した対照と共に観
測し、例えば、症状の発生の時期について群の間の相違
に反映される比較耐性を測定する（図１参照）。例え
ば、本発明によるウイルス コートたんぱく質をコード
する配列を含む植物は、ウイルス感染の症状を示すとし
ても、対照の植物に比較して相当に長い期間の後にの
み、症状を示すことが見出された。トランスジェニック
（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物の間で観測された耐性
は、ウイルスｍＲＮＡまたはコートたんぱく質の測定さ
れた水準と相関している。このように、ウイルス ゲノ
ムの小部分の発現は、ウイルス感染に対する耐性を与え
ることができることが見出された。 【００６１】ある場合には、ウイルスｍＲＮＡまたはコ
ートたんぱく質の発現は検出することができない。これ
は多分ｍＲＮＡまたはたんぱく質の不安定性のためと思
われる。しかし、ｍＲＮＡまたはたんぱく質を安定化す
る方法が当業者には知られている。例えば、安定なｍＲ
ＮＡの形成には、イントロンのスプライシングが重要な
役割を果たすことが知られている（Ｈａｍｅｒ ＆ Ｌ
ｅｄｅｒ（１９７９））。ウイルス コートたんぱく質
遺伝子の発現は、イントロンをコード配列または非コー
ド配列に挿入することにより十分に高められる。更に、
ｍＲＮＡの３′非翻訳配列が、対応するｍＲＮＡの安定
性を決定することが知られている（Ｓｈａｗ ＆ Ｋａ
ｍｅｎ（１９８６））。工学的に処理したコートたんぱ
く質ｍＲＮＡの安定性は、その３′非翻訳領域の交替に
よって十分に増加させることができる。最後に、幾つか
のたんぱく質はたんぱく質分解の際にその機能活性を保
持することが知られている（Ｍｏｏｒｅ（１９８１）、
Ｓａｎｄｍｅｉｅｒ（１９８０）、Ｚｕｒｉｎｉ（１９
８４））。 【００６２】本発明によって生産されたトランケートさ
れたコートたんぱく質は、トランスジェニック植物中に
高水準で発現されたときに、その生物活性を保持しウイ
ルス耐性を与えることができた。 【００６３】 【実施例】例１ 交叉免疫で使用するためのウイルス コートたん
ぱく質の典型的な単離 ポティウイルスは、最も広範で経済的に重要な既知の植
物ウイルスの群を包含する。それで、一つのポティウイ
ルス、ダイズ モザイク ウイルス（ＳＭＶ）を選び、
本発明に従ってウイルス病耐性（「交叉免疫」）を与え
るために使用することができるウイルス ゲノムの小部
分、コートたんぱく質をコードする配列を単離する一般
的な方法を説明した（図１参照）。 【００６４】ＳＭＶを、ＳＭＶのＮ鎖を用いて感染され
たダイズ葉から精製した。文献（Ｖａｎｃｅ ＆ Ｂｅ
ａｃｈｙ（１９８４））に開示されている方法に従っ
て、ウイルスを単離し、ウイルスＲＮＡを調製した。Ｓ
ＭＶに対する抗体は定法によりウサギ中で産生させた。
これは、１ｍｇの精製ＳＭＶをウサギに注射し、４週後
に５０μｇのＳＭＶの第２の注射を行い、更に２週後に
ＳＭＶ（５０μｇ）を注射する工程を含んでいた。最後
の追加抗原注射の後、２週間隔でこの例で使用するため
に血清を集めた。 【００６５】ウイルス コートたんぱく質遺伝子のｃＤ
ＮＡクローニングは、当業者によく知られている方法を
用いて行った。ｃＤＮＡは、まず、オリゴｄＴを用いて
ポリアデニル化されたＳＭＶ ＲＮＡをプライミング
し、それから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生産する
ことにより、ウイルスＲＮＡから生産した。２本鎖ｃＤ
ＮＡを生産するために、第１の鎖ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッド分子をＲＮｓａｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて処理した。それから、この分子をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて処理し、その後、ＥｃｏＲＩメチラ
ーゼにより処理した。この分子を、ＥｃｏＲＩ部位を含
む合成オリゴヌクレオチド リンカーの存在下でＴ４
ＤＮＡ リガーゼと反応させた。その後、この分子をＥ
ｃｏＲＩを用いて消化し、プラスミドｐＥＭＢＬ１８に
連結した。このプラスミドは、ヨーロッパ分子生物学研
究所（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １０−２２０９，６９００ Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ． Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌ
ｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ）で構築された広く利用さ
れているクローニングベクターのクラスの一つである。
ｐＥＭＢＬ１８ ＤＮＡに予め酵素ＥｃｏＲＩを用いて
制限を行い、プラスミドの再アニーリングを防ぐために
リン酸アルカリを用いて処理した。露出したＥｃｏＲＩ
部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを開いたプラスミドに連結し
た。これらの連結されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）ＤＨ５α株を形質転換するために使用した。 【００６６】形質転換した細菌のコロニーを32Ｐ標識し
たｃＤＮＡを用いてスクリーニングし、32Ｐ標識分子と
反応したコロニーを選んだ。抗原産生に対するスクリー
ニングのために、ＩＰＴＧを使用してポジティプな形質
転換体を誘導し、予め産生させたウサギ 抗コートたん
ぱく質 抗体を用い、抗体ブロット法を介して成長する
コロニーをスクリーニングした。（一定の適当な抗ＣＰ
抗体は市販もされている。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉ
ｎ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ。）抗体と
反応したそれらのコロニーを更にスクリーニングして選
抜し、それらが実際にコートたんぱく質：ｌａｃＺ融合
たんぱく質を生産することを確めた。融合たんぱく質を
生産するコロニーから単離したプラスミドＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、ｃＤＮＡを含む他のコロニーを同定
した。この方法は標準的なハイブリダイゼーション法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２））と一
部重複している。 【００６７】クローンしたｃＤＮＡのＤＮＡ配列は標準
法によって決定した（図２参照）。ウイルス コートた
んぱく質のアミノ酸シークエンシングを完成して、ＮＨ
2 末端アミノ酸配列を決定することができる。ある場合
にはアミノ末端断片がブロックされている可能性がある
ので、ウイルス コートたんぱく質は、当業者に既知の
方法を応用し、ファースト アトム ボンバードメント
（ｆａｓｔ ａｔｏｍｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡ
Ｂ）と質量分析計によりシークエンシングすることがで
きる。それから、たんぱく質のアミノ酸配列をクローン
化ｃＤＮＡのシークエンシングにより誘導した配列と比
較できる。これによってウイルス コートたんぱく質を
コードすると同定されたｃＤＮＡ断片を、新たな制限部
位とＡＴＧ翻訳開始コドンを成熟コートたんぱく質のＮ
Ｈ2 末端アミノ酸のコドンの、５′末端に関して、すぐ
隣に導入することにより得ることができる。これはゾラ
ーとスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１
９８２））によって行うことができる。コートたんぱく
質コード配列を切取るための制限酵素消化の後、単離し
たＣＰコード配列を上に述べたように、適当なプロモー
ターに連結し、本発明によってウイルス耐性を与えるた
めに植物中に置いた。 【００６８】例２ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（タバコ モザイク ウイルス）を含むトランスジェニ
ック植物におけるウイルス病耐性 この例では、ウイルス コートたんぱく質のヌクレオチ
ド配列が利用できる場合に本発明を実施する方法を説明
する。 【００６９】Ａ．プラスミド ｐＭＯＮ３１９の製造 文献（Ｂｒｕｅｎｉｎｇ（１９８２））に記述されるよ
うに、フェノール抽出によってタバコ モザイク ウイ
ルス（ＴＭＶ、普通のＵ１ バルガー（ｖｕｌｇａｒ
ｅ）株、配列は公表されている（Ｇｏｅｌｅｔ ｅｔ
ａｌ．（１９８２）））からＲＮＡを除いた。ウイルス
ＲＮＡの３′末端に相補的であり、しかも、ＮｄｅＩと
ＢａｍＨＩ開裂部位を有する３５−ｍｅｒ オリゴヌク
レオチドプライマーを合成した。オリゴヌクレオチドを
ウイルスＲＮＡに対してアニーリングし、マニアチスの
方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２））に従って、ｃＤ
ＮＡの合成（逆転写酵素を用いる）のためのプライマー
として用いた。１本鎖ＤＮＡをマニアチスの方法（Ｍａ
ｎｉａｔｅｓ（１９８２））により２本鎖（ｄｓ）ＤＮ
Ａに変換した。 【００７０】ｄｓ−ｃＤＮＡを、プライマー上の部位で
開裂するＢａｍＨＩ、および、ＴＭＶ配列の５０８０の
塩基で開裂するＨｉｎｄ IIIにより開裂した。生成した
１．３ｋｂの断片を、同じくＨｉｎｄ IIIとＢａｍＨＩ
を用いて開裂したプラスミドｐＵＣ９ ＤＮＡと混合し
た。生成のアンピシリン耐性プラスミド ｐＴＭ３７を
その後の操作に使用するコートたんぱく質コード配列Ｄ
ＮＡの源とした。これはＢａｍＨＩ部位に隣接してＥｃ
ｏＲＩ部位を有している。 【００７１】コートたんぱく質コード配列を有するより
小さいＤＮＡ断片を得るために、プラスミド ｐＴＭ３
７を、ＴＭＶ配列の５７０７の塩基（コートたんぱく質
ｍＲＮＡに対するＡＴＧ翻訳開始コドンから５塩基対）
で開裂するＡｈａIII 、および、ｐＴＭ３７中のＴＭＶ
配列の末端をちょうど越えて開裂するＥｃｏＲＩを用い
て消化した。それから、生成した長さ約７００塩基対
（ｂｐ）の断片を、コートたんぱく質コード断片の５′
および３′末端に対する制限部位を付加するために、他
の二つのプラスミドに移してクローンした。これらの制
限部位の付加はその後のプラスミドの構築を容易にし
た。その代わりに、制限部位を付加するために、サイト
ダイレクティッド（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突
然変異生成、または、合成ＤＮＡリンカーの連結などの
他の方法を選択することもできる。これらの技術は全て
従来技術の範囲内にある。 【００７２】ＢｇｌII部位で５′末端に接し、ＥｃｏＲ
Ｉ部位で３′末端に接する７００ｂｐのコートたんぱく
質コード配列断片を、ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用いる消
化によって中間体プラスミドから切取った。この７００
ｂｐの断片を精製し、同じくＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用
いて消化した プラスミド ｐＭＯＮ３１６のＤＮＡと
混合した。プラスミド ｐＭＯＮ３１６は、３５Ｓ転写
体の生産を指示するカリフラワー モザイク ウイルス
（ＣａＭＶ）の３３０ｂｐ断片を保有するｐＭＯＮ２
００（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｒｏｇ
ｅｒｓ ｅｔａｌ（１９８５））の誘導体である。 【００７３】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター断片を、Ｓ
ａｌＩ挿入物としてＣａＭＶ ＣＭ４−１８４株（Ｈｏ
ｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８１））の完全なゲノム
を保有するｐＢＲ３２２誘導体であるプラスミド ｐＯ
Ｓ−１から単離した。ＣＭ４−１８４株はＣＭ１８４１
株の天然に存在する欠失突然変異体である。ＣａＭＶの
ＣＭ１８４１株（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８
１））とＣａｂｂ−Ｓ株（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ
（１９８０））のヌクレオチド配列は公表されており、
異なるＣＭ４−１８４ クローン（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ
ａｌ（１９８２））に対するある部分的な配列を有し
ている。これらの全ての株の３５Ｓ プロモーターのヌ
クレオチド配列は非常に類似している。以下の説明中に
参照するヌクレオチド番号（「ｎ・・・」）は、ガード
ナーら（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８１））に
より開示されているＣＭ１８４１の配列に対するもので
ある。 【００７４】まずＢａｍＨＩを用いて開裂された ｐＢ
Ｒ３２２に挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて処理し、最後にＥｃ
ｏＲＩを用いて開裂したＡｌｕＩ（ｎ ７１４３）−Ｅ
ｃｏＲＩ* （ｎ ７５１７）断片として、３５Ｓ プロ
モーターをＣＭ４−１８４のｐＯＳ−１クローンから単
離した。それから、プロモーター断片をＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＩを用いてｐＢＲ３２２から切取り、クレノー
ポリメラーゼを用いて処理し、ｍｐ８マルチリンカーの
ＥｃｏＲＩ部位がプロモーター断片の５′末端にくるよ
うにＭ１３ ｍｐ８ （Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｉ
ｒａ（１９８２））のＳｍａＩ部位に挿入した。その
後、サイト ダイレクティッド 突然変異生成（Ｚｏｌ
ｌｅｒ ＆Ｓｍｉｔｈ（１９８２））を使用して、ヌク
レオチド ７４６４にグアニジン残基を導入し、Ｂｇｌ
II部位を形成した。 【００７５】それから、３５Ｓ プロモーター断片を、
Ｍ１３から、３３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII断片と
して切取った。これは、３５Ｓ プロモーター、転写開
始部位、および、５′非翻訳リーダーの３０個のヌクレ
オチドを含むが、ＣａＭＶ翻訳イニシエーター、また、
転写の開始点から１８０ヌクレオチド下に位置する３５
Ｓ転写ポリアデニル化シグナル （Ｃｏｖｅｙ ｅｔ
ａｌ（１９８１）、Ｇｕｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９
８２））は含まない。３５Ｓ プロモーター断片を、合
成マルチリンカーと、ＮＯＳ ３′非翻訳領域からのｐ
ＴｉＴ３７ ノパリン シンターゼ遺伝子（Ｂｅｖａｎ
ｅｔ ａｌ（１９８３））の２６０ｂｐ Ｓａｕ３Ａ
断片（ヌクレオチド ６６５〜４１７）とに結合させ
た。このようにして製造した断片をｐＭＯＮ２００に挿
入し、ｐＭＯＮ３１６を得た（図３）。３５Ｓ プロモ
ーター、マルチリンカーおよびＮＯＳ ３′断片の完全
な配列を図４に示す。この配列は、３５Ｓ プロモータ
ー断片の５′末端に位置するＥｃｏＲＩ部位を除くため
のクレノー ポリメラーゼ処理によって形成されたＸｍ
ｎＩ部位で始まっている。 【００７６】プラスミド ｐＭＯＮ３１６は、５′リー
ダーとＮＯＳポリアデニル化シグナルの間に、制限エン
ドヌクレアーゼ ＢｇｌII、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、Ｘｈ
ｏＩおよびＥｃｏＲＩに対する唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）
開裂部位を有するコインテグレート型の中間体ベクター
である。この開裂部位のために、３５Ｓ転写リーダー配
列のすぐ隣に、それ自身の翻訳開始シグナルを保有する
コード配列を挿入することができる。ｐＭＯＮ３１６
プラスミドは、大腸菌およびＡ．タメファシエンスにお
ける選抜のためのスペクチノマイシン耐性を含むｐＭＯ
Ｎ２００の全ての性質、並びに、形質転換された植物組
織の選抜のためのキメラ カナマイシン遺伝子（ＮＯＳ
−ＮＰＴＩＩ′−ＮＯＳ）、および、後代中での形質転
換体と遺伝形質の容易なスコアリングのためのノパリン
シンターゼ遺伝子を保持している。ｐＭＯＮ３１６
プラスミドは上述のＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ カセット
を含む。これはｐＭＯＮ２００には欠けていたものであ
る。しかし、実質的にはｐＭＯＮ２００と同様に使用す
ることができる（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８
５）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）を参
照）。 【００７７】７００ｂｐのＴＭＶコートたんぱく質コー
ド断片を挿入することにより、形質転換植物細胞中での
このたんぱく質の合成の適切なシグナルが提供される。
生成のプラスミドを図５に示す。このプラスミドを「ｐ
ＭＯＮ３１９」と称する。 【００７８】Ｂ．ＣＰ遺伝子を含むＤＮＡ構成物の植物
細胞への挿入 プラスミド ｐＭＯＮ３１９を、フレーリーら（Ｆｒａ
ｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８５））に従い、「ｐＴｉＢ
６Ｓ３−ＳＥ」と称する弱めたＴｉ プラスミドを含む
Ａ．タメファシエンス細胞に挿入した。このプラスミド
は、完全に機能的なＴ−ＤＮＡ領域を含まず、左のＴ−
ＤＮＡ境界を含む。 【００７９】ｐＭＯＮ３１９ プラスミドは、細菌中の
スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）とストレプトマイシン
（Ｓｔｒ）に対する選択可能な耐性を伝達する標識遺伝
子を保有している。更に、ｐＭＯＮ３１９をｐＴｉＢ６
Ｓ３−ＳＥと組合わせて、それにより、ＣａＭＶ３５Ｓ
／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含む再構成されたＴ
−ＤＮＡ領域を有するコインテグレート Ｔｉ プラス
ミドをつくる交叉を起こすことができる相同性の領域を
保有している。しかし、ｐＭＯＮ３１９はＡ．タメファ
シエンス細胞中で独立して複製することができない。そ
れで、ＳｐｃおよびＳｔｒ存在下では、コインテグレー
ト プラスミドを有するＡ．タメファシエンス細胞のみ
が生存できる。 【００８０】コインテグレート Ｔｉ プラスミドを含
むＡ．タメファシエンスの培養を、ホーシュら（Ｈｏｒ
ｓｃｈ ｅｔ ａｌ（１９８５））に記述されるよう
に、タバコ植物（Ｎｉｃｉｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｕｍ
ｃｖ．“Ｓａｍｓｕｎ”）から採取した葉のディスク
と接触させた。アグロバクテリウム細胞は、ＤＮＡ構成
物を植物細胞の染色体に挿入した。カナマイシンに耐性
の植物細胞を選抜し、ホーシュら（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ
ａｌ（１９８５））が記述する方法により分化植物に
再生した。 【００８１】実験で対照とした植物は、（１）外来性の
遺伝子を全く含んでいないか、または、（２）ｐＭＯＮ
２００ プラスミドのみを含むかのどちらかであった。 【００８２】ｐＭＯＮ３１９：：ｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ
コインテグレート プラスミドを含むＡ．タメファシ
エンス細胞の培養を、ＡＴＣＣにブダベスト条約に基づ
く国際寄託をした。受託番号は第５３２９４号であっ
た。 【００８３】Ｃ．植物細胞中でのウイルスＲＮＡの発現 文献（Ｌａｎｅ ＆ Ｔｒｅｍｉａｔｅｓ−Ｋｅｎｎｅ
ｄｙ（１９８１））に記載される方法により、再生した
植物の葉からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、マニアチス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ（１９８２）））が
記述するように、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲ
ル中での電気泳動により大きさに従って分離し、ニトロ
セルロースに対してブロッティングした。ウイルスＲＮ
Ａは、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
（１９８２）））の方法を使用して、32Ｐ標識ＤＮＡク
ローンに対してハイブリダイゼーションさせることによ
って、ニトロセルロース上に検出した。 【００８４】このＲＮＡハイブリダイゼーション分析に
基づいて、形質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を保有す
る植物）はウイルスＲＮＡを保有するが、ｐＭＯＮ２０
０のみを含む植物はウイルスＲＮＡを含まないことが決
定された。ＴＭＶ コートたんぱく質の存在は、ｐＭＯ
Ｎ３１９を含むが、ｐＭＯＮ２００は含まない植物中に
検出された。リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０））
に従い、試料緩衝液中で粉砕することにより葉からたん
ぱく質を抽出した。リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７
０））が開示するように、たんぱく質の５０μｇの部分
に、ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲル中での
電気泳動を行った。たんぱく質は、トービンら（Ｔｏｗ
ｂｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８１））の開示するように、
電気泳動的にニトロセルロースへ移された。 【００８５】ブロッティングしたたんぱく質を、シミン
グトンら（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８
１））の開示に従い、精製したＴＭＶに対してウサギ中
で産生させた抗血清と反応させた。ニトロセルロース上
でＴＭＶと結合したウサギ抗体は、 125Ｉ標識したロバ
抗ウサギ 抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．，Ｃｈ
ｉｃａｇｏ）との結合により検出した。 【００８６】イムノブロット分析の結果に基づいて、形
質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を含む）はＴＭＶ コ
ートたんぱく質を生産するが、ｐＭＯＮ２００のみを含
む植物はＴＭＶ コートたんぱく質を生産しないことが
決定された。これらの葉中で生産されるコートたんぱく
質の量は、葉の全たんぱく質の５０μｇ中にコートたん
ぱく質が約５０ナノグラム、つまり０．１％であった。 【００８７】Ｄ．タバコ植物のＴＭＶに対する耐性 形質転換した植物と対照の植物とを約２フィートの高さ
に成長させ、それから、幹部を腋芽を伴った挿木に分割
し、これを根付かせ個々の植物に再生させた。これらの
植物にＴＭＶを接種した。これは、研磨粒子をウイルス
粒子の水性懸濁液に加え、研磨溶液を葉上でこすること
によって行った。特に、ＴＭＶは０．０５Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁した。約５０μｌ
の溶液を、カルボランダム（３２０グリット、Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．製造）を撒いたタ
バコ葉に、こすることによって適用した。葉の表面が乾
燥した後、葉を水ですすぎ、植物を温室または生育室に
置いた。 【００８８】対照植物は接種後約３〜５日以内に感染の
症状を示した。それに対して、本発明のＤＮＡ構成物を
含む植物は、接種後８〜１０日まで症状を生じなかっ
た。この結果は独立した３組の実験で確められた。 【００８９】他の実験では、ｐＭＯＮ３１９を含む二つ
の異なる形質転換植物により生産された種子を発芽さ
せ、実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）を土壌で成長させた。そ
れぞれの実生に、上述のイムノブロッティング法によっ
てＴＭＶ コートたんぱく質が存在するか否かを試験し
た。全部で３９の実生に、上に述べたＴＭＶを含む懸濁
液（０．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、実生がＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含むか否かを前もって知らない盲検法
で接種を行った。実験の結果、１１／３９の植物がコー
トたんぱく質を含んでいた。残りはコートたんぱく質を
含んでいず、この実験の対照とした。 【００９０】接種後５日に、３／１１（２７％）の対照
植物がＴＭＶ感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含む植物はいずれもそのような症状を
示さなかった。 【００９１】接種後６日に、４５％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。一方、ＴＭＶ コートた
んぱく質を含む植物では１８％のみがそのような症状を
示した。 【００９２】接種後７日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では５７％がそのような症状を示した。 【００９３】接種後８日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では６４％がそのような症状を示した。 【００９４】ウイルスによる重大な攻撃（ｍａｓｓｉｖ
ｅ ａｓｓａｕｌｔ）にもかかわらず症状の発生が相当
に遅れたという結果は、形質転換された植物が、形質転
換されない植物よりもウイルスに対して相当に耐性が大
きいことの証明である。この実験で観測された耐性の増
加の程度は、形質転換された植物が、開放田畑または温
室で起こる可能性がある感染接触の型に耐えることがで
きることを示している。 【００９５】例３．トランスジニック植物におけるウイ
ルス病耐性の確認（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ） Ａ．タバコにおける適用量応答（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ） 例２に説明した形質転換したタバコ植物の実生をこの実
験に使用した。上に述べたイムノブロッティング法によ
り、ＣＰコード配列を発現するか、または、ＣＰコード
配列を発現しないかを決定された植物を、３群に分け、
上記のＴＭＶ（Ｕ１バルガー株）を含む懸濁液を用いて
接種した。この３群はそれぞれ、０．４μｇ／ｍｌ、
０．８μｇ／ｍｌおよび２．０μｇ／ｍｌの濃度でＴＭ
Ｖを含む懸濁液を用いて接種を行った。接種した植物を
温室に入れ、ウイルス感染の症状を観察した。図６の棒
グラフはこの実験の結果を示している。データは、明ら
かに、コートたんぱく質を発現する植物が、〜０．４μ
ｇ／ｍｌまたはそれ以下でウイルスに対して全く耐性で
あったことを示している。 【００９６】Ｂ．トマトにおける適用量応答 コインテグレート プラスミド ｐＭＯＮ３１９：：ｐ
ＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥを含むＡ．タメファシエンス細胞の
培養を、再び例２に説明した方法を使用して、トマト植
物から採取した葉のディスクと接触させた。ＣａＭＶ３
５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含むカナマイシ
ン耐性組織を選抜し、植物に再生した。自家受精したト
ランスジェニックなトマト植物の実生後代を、試験植物
とした。この実験に対する対照植物は、形質転換されて
いない親植物および非発現の実生後代であった。 【００９７】試験植物と対照植物とに例２の接種方法に
従い、０．５μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間の濃度で
ＴＭＶを含む懸濁液を用いて接種を行った。この実験の
結果を図７に示す。図７に示すように、全ての対照植物
が３０日以内にウイルス感染の症状を示した。更に、対
照植物はウイルス接種物の増加に伴ってより速やかに症
状を示した。これと対照的に、ＴＭＶコートたんぱく質
を発現する実生はＴＭＶ感染に対して実質的に耐性であ
り、感染の症状を示す場合でも接種後３０日までは症状
を発達させなかった。 【００９８】Ｃ．遺伝的耐性との比較 本発明によって上記の実生後代に付与された耐性を更に
確認するために、ＴｏＭＶ耐性のための遺伝的決定基を
含むことが知られているトマト植物のＴｏＭＶ接種に対
する応答を、例２の方法を用いて調製したトランスジェ
ニック植物の対応する応答と比較した。特に、通常の育
種方法によってそれぞれ耐性決定基Ｔｍ−２またはＴｍ
−２ａを導入された「クライゲラ（Ｃｒａｉｇｅｌｌ
ａ）」変種植物に、「ＴｏＭＶ２」または「ＴｏＭＶ２
ａ」と称するＴｏＭＶ株を用いて接種を行った。（種々
の株によるＴｏＭＶ感染に対する異なる耐性決定基を保
有する植物の相対感受性のデータを、次の表に示す。）
形質転換されＴＭＶ コートたんぱく質を発現したほか
はＴｏＭＶ２感受性である変種のトランスジェニック植
物を含む試験群（「ＶＦ３６」）に、形質転換されない
ＶＦ３６植物の対照群と同様に、同じウイルス株を用い
て接種を行った。 【００９９】ＴｏＭＶ株 植物群 ＴＭＶ* ２ ２ａ ＶＦ３６ ５／５ ５／５ ５／５ Ｔｍ−１ ０／５ ０／５ ０／５ Ｔｍ−２ ０／５ ５／５ ０／５ Ｔｍ−２ａ ０／５ ０／５ ３／５ トランス− ジェニック １／５ ３／５ １／５ ＊ ＝ ＴＭＶ株 ＰＶ２３０ ＋ ＝ 感染性 − ＝ 耐性 それぞれの群の５つの植物が、接種後１４日に病気の症
状を記録された。接種後１４日以内に対照植物およびＴ
ｍ−２決定基を含む植物の両方が全てＴｏＭＶ感染の症
状を発達させた。５つのトランスジェニック植物のうち
３つが同じ期間にわたって症状を示した（図８参照）。
前記の表中のデータは、トランスジェニックな植物が、
形質転換されていない対照よりも相当に良く、しかも、
ＴｏＭＶの多くの株に対して非選択性の耐性の水準を示
すことを証明している（図８参照）。これと対照的に、
遺伝的耐性はかなり範囲が狭い。試験植物中、最終的に
は６０％が感染の徴候を示したが、症状はＴｍ−２植物
のものよりも重大でなかった。この結果は、試験植物中
でのＣＰ発現により付与されたＴｏＭＶ２に対する耐性
は、Ｔｍ−２によりコードされる遺伝的耐性より、優れ
てはいないとしてもそれと比較できるものであったこと
を示している。 【０１００】例４ タバコ モザイク ウイルスの種々
の株に対する交叉免疫 ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有
する形質転換したトマト植物を例３に記述した方法で製
造した。自家受精トランスジェニック トマト植物の実
生後代をこの実験の試験植物とした。対照植物は、ＴＭ
Ｖ コートたんぱく質を発現しない実生後代、および、
親型の正常の形質転換していない植物であった。 【０１０１】試験植物と対照植物に次の二つの異なるＴ
ＭＶ株を用いて接種を行った。 【０１０２】ＰＶ−２３０ − ＡＴＣＣから得たＴＭ
Ｖのヴィルレント株（受託番号ＰＶ−２３０） Ｌ−ＴＭＶ − トマト植物に感染することが知られて
いる株 試験植物と対照植物に、例２に記述した方法に従い、そ
れぞれ２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの濃度で前記のそ
れぞれのＴＭＶ株を接種した。この実験の結果を図９に
示す。このデータは、「ＭＶ コートたんぱく質を発現
するトランスジェニックなトマト植物がＴＭＶ感染に耐
性であったことを明らかに示している。試験したＴＭＶ
の両方の株に対して耐性が示された。更に、２０μｇ／
ｍｌもの高濃度でヴィルレント株ＰＶ−２３０を使用し
たにもかかわらず、高い割合のトマト植物（４０％から
１００％）が接種後２９日内に症状を発達させなかっ
た。 【０１０３】例５ 種々のプロモーターによるウイルス
コートたんぱく質の制御 本発明の他のプロモーターの使用を示すため、および、
コートたんぱく質の発現の水準とウイルス耐性の間の相
関を示すために、一つの実験を行った。 【０１０４】第１群の植物は、例２に記述したように形
質転換されてＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ
構成物を保有するトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であった。 【０１０５】第２群と第３群の植物は、第１群の植物と
同様に、ＴＭＶ コートたんぱく質遺伝子を発現するよ
うに形質転換されたトランスジェニックなタバコ植物の
実生後代であるが、ただ、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモータ
ーを次の方法によって、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）
由来のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（Ｔｕｎｅｒ
ｅｔ ａｌ （１９８６））に置換した。 【０１０６】ペチュニア １１Ａ 小サブユニット（ｓ
ｓ）プロモーター断片を、バクテリオファージ λに保
有されるゲノム クローン（Ｔｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ
（１９８６））から、ＥｃｏＲＩを用いる開裂を経て単
離した。このプロモーターを保有する生成した１．３ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片を更にＰｓｔＩを用いて消化し、フ
ァージ Ｍ１３ｍｐ８のＰｓｔＩ部位とＥｃｏＲＩ部位
との間に挿入して、サイト ダイレクティド 突然変異
生成のために、小サブユニット転写体の５′非翻訳配列
にＢｇｌIIを導入した（図１０）。ペチュニア １１Ａ
ｓｓ プロモーターと突然変異生成プライマーの部分
配列を図１１に示す。ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIを用いて開
裂した後、生成の８００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩとＢｇ
ｌIIを用いて開裂したｐＭＯＮ２００に挿入した。生成
のプラスミド ｐＭＯＮ８０４６をＥｃｏＲＩを用いて
消化し、ＤＮＡポリメラーゼの大クレノー断片およびＤ
ＮＡリガーゼを用いて処理した。ＥｃｏＲＩ部位を失っ
たプラスミドを単離し、ｐＭＯＮ８０４８と命名した
（図１０）。 【０１０７】ペチュニア ｓｓ−ＮＯＳ ３′カセッ
ト、プラスミド ｐＭＯＮ３１１を構築するために、Ｓ
ｍａＩ部位をＢａｍＨＩリンカーで置換え、その後クレ
ノーポリメラーゼとリガーゼを用いて処理することによ
りＢａｍＨＩ部位を除いたｐＭＯＮ２００誘導体を、Ｓ
ｔｕＩとＨｉｎｄ IIIを用いて消化した。生成の８ｋｂ
断片を、ｐＭＯＮ３１６から精製した３００ｂｐのＢｇ
ｌII−ｔｏ−ＨｉｎｄIII断片、および、ｐＭＯＮ８０
４８の２．６ｋｂのＳｔｕＩ−ｔｏ−ＢｇｌII断片と混
合した。生成のプラスミド ｐＭＯＮ８０４９は、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターがペチュニア ｓｓ プロモー
ターと置換えられている以外はｐＭＯＮ３１６と同様で
ある（図１２）。５′末端にＢｇｌII部位を３′末端に
ＥｃｏＲＩ部位を含む上記の７００ｂｐのＴＭＶ−ＣＰ
コード断片を、ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用いて開裂した
ｐＭＯＮ８０４９に挿入し、ペチュニア ｓｓ プロモ
ーター／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有するｐＭ
ＯＮ８０５９を得た（図１２）。 【０１０８】第４群の植物はプラスミド ｐＭＯＮ２０
０のみを含むように形質転換し、対照植物とした。 【０１０９】それぞれの群は、例２（Ｄ）に概説した方
法に従ってＴＭＶを接種した３０の植物を含んでいた。
接種後、これらの植物を温室に置き、ウイルス感染の症
状を観察した。 【０１１０】ＴＭＶ コートたんぱく質の相対的な水準
は、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析により
評価した。第１群の植物におけるコートたんぱく質遺伝
子発現の程度に対する平均値を１００％とし、次のよう
に決定した。 【０１１１】ＣＰ発現の平均値 第１群 − １００ 第２群 − １４ 第３群 − ３ 第４群 − ０ 症状を示す植物の割合（％）群 （接種後の日数） ３ ４ ５ ６ ７ ８ １０ １ ０ ３ ７ ２３ ４０ ４７ ５０ ２ ０ ３ １３ ６３ ８３ ９７ ９７ ３ ０ ０ １５ ８８ １００ ４ ０ １３ ７０ １００ 上に示したデータは次の結論を支持している。 【０１１２】（１）リブロース２リン酸 カルボキシル
化酵素 小サブユニット プロモーターは、本発明での
使用に対して有用なプロモーターである。しかし、一定
の植物ではＣａＭＶ２５Ｓ プロモーターのように強力
なプロモーターではない可能性がある。 【０１１３】（２）コートたんぱく質の発現の水準とウ
イルス耐性との間には正の相関がある。 【０１１４】例６ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（アルファルファ モザイク ウイルス）を含むトラン
スジェニックな植物におけるウイルス病耐性 アルファルファ モザイク ウイルスのコートたんぱく
質コード配列（ＡＭＶＣＰ）を含むＤＮＡ構成物を、Ｔ
ＭＶ耐性を工学的に処理するために用いた戦略と同様の
戦略を使用して製造した。ＡＭＶのコートたんぱく質を
コードする全長さの（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｃＤＮ
Ａクローンを次に記述し、図１３に概略的に示すように
して得た。ＡＭＶ コートたんぱく質ｃＤＮＡを、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓ プロモーターとＮＯＳ ３′末端に、既に
述べたようにして融合させた。それから、この構成物を
アグロバクテリウム介在形質転換系を用いて植物に移入
することができる。 【０１１５】ＡＭＶの３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔ
ｅ）ＲＮＡゲノムの完全なヌクレオチド配列は既に知ら
れている。このデータは、ＡＭＶゲノムが４つの主要な
遺伝子生成物をコードしていることを示している。これ
らは、ＲＮＡ １によってコードされている１２６キロ
ダルトン（ｋｄ）のたんぱく質、ＲＮＡ ２によってコ
ードされている９０ｋｄのたんぱく質、および、ＲＮＡ
３によってコードされている３２ｋｄのたんぱく質で
ある。コートたんぱく質は、ＲＮＡ ３の３′末端 ８
８１ヌクレオチドと相同する「ＲＮＡ ４」と称される
サブゲノム メッセンジャー（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ（１９８３ｂ））から翻訳される。 【０１１６】ＡＭＶのコートたんぱく質をコードする全
長さのｃＤＮＡを合成するために、第１鎖および第２鎖
の両方のＤＮＡ合成に対する合成オリゴヌクレオチド
プライマーを使用した。図１３に参照されるように、使
用したプライマーは、ＡＭＶコートたんぱく質コード配
列のそれぞれの末端に唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）ＥｃｏＲ
Ｉ部位を含んでいた。第１鎖のｃＤＮＡは、１００ｍｌ
の反応中５μｇのＡＭＶ全ＲＮＡと５５ｎｇのプライマ
ーから、４ｍＭのピロリン酸ナトリウムと逆転写酵素を
用いて合成した。この方法によって、分子量が１．０４
×１０6 ダルトン（ＲＮＡ １）、０．７３×１０6 ダ
ルトン（ＲＮＡ ２）および０．６８×１０6 ダルトン
（ＲＮＡ ３）のｃＤＮＡが合成された。ＲＮＡ鋳型を
加水分解した後、ｃＤＮＡ生成物をＰ−６０カラムで分
別した。１本鎖ｃＤＮＡをアニーリングして２本鎖プラ
イマーとして、逆転写酵素と共にインキュベーションし
た。ＡＭＶ コートたんぱく質配列を含む生成した２本
鎖ｃＤＮＡは、それぞれの末端でＥｃｏＲＩ部位に接し
ていた。ＥｃｏＲＩを用いて消化した後、ｃＤＮＡをｐ
ＵＣ９のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０１細
胞を形質転換し、それから、アンピシリン、ＩＰＴＧお
よびＸ−Ｇａｌを含む培地上で選抜した。約１０００の
形質転換体を得た。２５％の形質転換体に５′および
３′特異プライマーの両方に対してハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ＤＮＡを３つのポジティブから調製し
た。ＥｃｏＲＩ消化物は予期した大きさ（８８１ｂｐ）
の挿入物の存在を明らかにした。ヌクレオチド シーク
エンシング（それぞれの末端に〜１００ｂｐ）により、
これらのクローンが実際に全長さのＡＭＶ コートたん
ぱく質挿入物を含むことが確認された。 【０１１７】ＡＭＶ コートたんぱく質をコードする８
８１ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、意味を持つ配向および意
味を持たない配向（ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）とで（それぞれ、ｐ
ＭＯＮ９８００とｐＭＯＮ９８０１）、植物発現ベクタ
ーｐＭＯＮ３１６に結合させた。ｐＭＯＮ９８００の構
造を図１３に示す。それから、これらのベクターを例２
に記述したアグロバクテリウム介在形質転換系を使用し
て、タバコ、トマトおよびペチュニアに移入した。 【０１１８】ＡＭＶ コートたんぱく質ｍＲＮＡの発現
を更に調べるために、ＡＭＶ コートたんぱく質遺伝子
を意味のある配向（ｐＭＯＮ９８００）で含むトランス
ジェニックなタバコ植物（ｃｖ．“Ｓａｍｓｕｎ”）由
来のカルス組織に、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロ
ット分析を行った。ｐＭＯＮ９８００からと、ＡＭＶＣ
Ｐコード配列を欠くｐＭＯＮ２００から誘導した対照ベ
クターであるｐＭＯＮ２７３からの全ＲＮＡ（４０μ
ｇ）をアガロースゲル上に仕込み、膜（Ｇｅｎｅ Ｓｃ
ｒｅｅｎR 、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
製造）に移し、それから、ＡＭＶ コートたんぱく質を
コードする８８１ｂｐのｃＤＮＡ挿入物をプローブとし
て調べた。予期した大きさの転写体（１．２ｋｂ）に対
応するバンドの群は非常に強いハイブリダイゼーション
を示した。プローブとハイブリダイゼーションする、よ
り小さい大きさの転写体も存在した。ｐＭＯＮ２７３を
用いて形質転換した対照カルスに対してはハイブリダイ
ゼーションは検出されなかった。 【０１１９】同じく、ＡＭＶ コートたんぱく質検出の
ためのウエスタン ブロット プロトコルを、トランス
ジェニックな植物と感染植物とに発達させた。市販の抗
ＡＭＶ ＩｇＧ分画（Ａｇｄｉａ Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｈ
ａｗａｋａ，ＩＮ）を、トランスジェニックなタバコ
カルスおよび葉中、および、トランスジェニックなトマ
ト葉中でのコートたんぱく質の検出にうまく使用するこ
とができた。特に、対照およびトランスジェニックなタ
バコ カルスからの３０μｇのたんぱく質、および、対
照およびトランスジェニックなトマト材料からの４０μ
ｇのたんぱく質をウエスタン ブロットに適用し、精製
ＡＭＶ コートたんぱく質標品と共に移動する分子量２
８〜２９ｋｄ付近の免疫反応性のバンドが得られた。 【０１２０】ＡＭＶ コートたんぱく質を発現すると同
定されたトランスジェニックなタバコ植物に、ＡＭＶの
接種を行った。また、形質転換されていないか、また
は、ベクター ｐＭＯＮ３１６を用いて形質転換された
かのいずれかの対照植物に、接種を行った。症状の発達
を生育室内で毎日監視した。用いた対照植物とトランス
ジェニック植物とは、大きさ、外観および発達段階（全
て開花を始めていた）が類似していた。対照植物とトラ
ンスジェニック植物からの３枚の葉に、それぞれ、ＡＭ
Ｖ感染植物の抽出物を接種した。その後の滴定分析か
ら、この接種に用いたＡＭＶの濃度は約５０μｇ／ｍｌ
であったことが示された。 【０１２１】対照のトランスジェニックなタバコ植物お
よび形質転換されていないタバコ植物の接種を施された
葉は、ＡＭＶの感染後１週以内に症状を示した。これと
対照的に、ＣＰを発現するトランスジェニック植物はい
ずれも感染後１週以内に症状を示さなかった。１０日
後、後者の植物の一つは、３枚の接種した葉の１枚に１
または２の病害を示した。感染後２週には、対照植物の
接種を施され葉の多数の病害は同様のままだったが、接
種しなかった上側の葉は葉の表面に均一に広がった症状
（緑退環）を示した。ＡＭＶ コートたんぱく質を生産
するトランスジェニック試験植物は、接種した葉または
全体の（接種していない）葉のいずれにも症状を示さな
かった（または、追加の症状を示さなかった）。 【０１２２】トランスジェニック植物および対照植物中
のＡＭＶの複製は、ウエスタンおよびドット（ｄｏｔ）
ブロット分析を介してコートたんぱく質の水準を監視
することによって測定した。感染後１週に、トランスジ
ェニック植物ではウエスタンブロッティングによって背
景の水準の発現のみが検出された。つまり、検出された
発現の水準は、導入されたコートたんぱく質コード配列
の固有の水準と比較できるものであった。一方、対照植
物は相当に高い水準のＡＭＶ コートたんぱく質を含ん
でいた。デンシトメーター スキャンニングによるハイ
ブリダイゼーションのシグナルの量化から、トランスジ
ェニックと形質転換されていない対照のタバコ植物との
間には２１１倍の差が示された。トランスジェニックな
タバコ対照植物は、ＡＭＶ形質転換体の水準より１１０
ないし８１５倍高いＡＭＶ コートたんぱく質の水準に
よって確認された。この結果は、上記のたんぱく質をつ
くるトランスジェニックな植物ではＡＭＶ複製は相当に
低いことを示している。 【０１２３】例７ ポテト ウイルス Ｘ コートたん
ぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成物 ポテト ウイルス Ｘのコートたんぱく質コード配列
（ＰＶＸ ＣＰ）を包含する構成物を、ＴＭＶおよびＡ
ＭＶ構成物の工学的処理に用いた同様の方法を使用して
製造した。ポテックスウイルス群に属するポテト ウイ
ルス Ｘ（ＰＶＸ）は、２×１０6 ダルトンの１本の感
染性のゲノムＲＮＡを含んでいる。ＰＶＸＲＮＡの３′
末端領域をクローニングし、シークエンシングを行っ
た。この領域は、長さが２３７アミノ酸残基のたんぱく
質をコードするコートたんぱく質遺伝子を含む（Ｚａｋ
ｈａｒｙｅｖ ｅｔ ａｌ（１９８４））。 【０１２４】５′末端から最初の１０個のコドンを除い
て、ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を含むｃＤＮＡ複
製物を、ポリアデニル化したＰＶＸ ウイルス ＲＮＡ
から合成した。「クローン ｐ３ａ」と称するｃＤＮＡ
複製物を、文献（Ｚａｋｈａｒｙｅｖ ｅｔ ａｌ（１
９８４））記載のｄＧ．ｄＣ テイリング（ｔａｉｌｉ
ｎｇ）法を介してｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位へクロー
ニングした。遺伝子の５′末端を修復するために、開始
コドン ＡＴＧの直前、および２２コドン後に１８塩基
の真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）５′非コード配列を含む
合成のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ 断片を用いて、ｄＧ．ｄ
Ｃ テイル（ｔａｉｌ）および１１番目から２１番目ま
でのコドンを含むより小さいＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を
置換えた。この遺伝子のｄＧ．ｇＣ テイルと３′末端
のｄＡ．ｄＴ 伸長の部分を、ｐＵＣ１８中でサブクロ
ーニングしたより大きいＨｐａII−ＰｓｔＩ断片のＢａ
ｌ３１消化によって除去し、それから、ＣｌａＩ部位を
リンカー付加によって形成した。ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断
片（約 １７０ｂｐ）を使用して、それぞれ、ｐ３ａ由
来の本来の３′末端配列、および、ｐＢＲ３２２由来の
ＰｓｔＩ−ＣｌａＩ配列を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断
片を置換えた。 【０１２５】最終構成物は、１８ｂｐの５′非コード領
域のｃＤＮＡ、６５７ｂｐのコートたんぱく質配列コー
ド領域（翻訳終結コドンであるＴＡＡを含む）、７２ｂ
ｐの３′非コード領域、および、４０ｂｐのｐＥＭＢＬ
１２（＋）中のｄＡ．ｄＴ伸長を含んでいた（図１４参
照）。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子の配列を図１５
に示す。水平の矢印はｐ３ａ中のＰＶＸ配列の５′境界
を示す。合成ＤＮＡから誘導した領域は配列上部の波線
で示した。構築に用いた制限部位には下線を施した。こ
のシークエンシングデータと文献（Ｚａｋｈａｒｙｅｖ
ｅｔ ａｌ（１９８４））に発表されているデータと
の相違を、配列の下に示す。コードされている新たなア
ミノ酸を本来のものの上に示す。 【０１２６】ＰＶＸ コートたんぱく質の全長さのｃＤ
ＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター（ｐＭＯＮ９８
１８）またはｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（ｐＭ
ＯＮ９８１８）のいずれかとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端
（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８５））を用いて、両
方の配向で、ｐＭＯＮ５０５から誘導した発現ベクター
に挿入した。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を発現さ
せるために次に示すベクターを作成し、例２に記述した
アグロバクテリウム介在の形質転換系を使用して、タバ
コ植物へ移入した。 【０１２７】（ａ）ｐＭＯＮ９８０９ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１８のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−
Ｅ９３′末端の間に挿入した。 【０１２８】（ｂ）ｐＭＯＮ９８１０ − ＰＶＸコー
トたんぱく質ｃＤＮＡを、意味のない（アンチセンス）
配向で、ｐＭＯＮ９８１８のＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端の間に挿入した。 【０１２９】（ｃ）ｐＭＯＮ９８１１ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列の５′断片を、意味のある配向
で、ｐＭＯＮ９８１８に挿入した。 【０１３０】（ｄ）ｐＭＯＮ９８１２ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列の５′断片を、意味のない配向
で、ｐＭＯＮ９８１８に挿入した。 【０１３１】（ｅ）ｐＭＯＮ９８１３ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１９のｒｂｃＳ８ＢプロモーターとＥ９ ３′末
端の間に挿入した。 【０１３２】上記に従い、植物にＰＶＸを用いて接種を
行い、ウイルス耐性の水準を測定した。 【０１３３】ＡＭＶのｍＲＮＡと異なり、ポックスウイ
ルスのＲＮＡはポリアデニル化されており、このため
に、オリゴｄＴを第１鎖合成のプライマーとして使用
し、ＤＮＡポリメラーゼまたは鳥骨髄芽球症ウイルス逆
転写酵素を第２鎖合成に使用することが可能になる。こ
の例の始めに詳細に記述したように、２本鎖ＤＮＡの単
離と、植物中でコートたんぱく質配列の発現との操作を
行うことができる。 【０１３４】例８ トマト ゴールデン モザイク ウ
イルス コートたんぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成
物 トマト ゴールデン モザイク ウイルス（ＴＧＭＶ）
コートたんぱく質に対するｍＲＮＡの生産を起こすこ
とができるコード配列を含むＤＮＡ構成物を包含するプ
ラスミドを、以下のようにして構築した。プラスミド
ｐＢＨ４０４（Ｂｉｓａｒｏ ｅｔ ａｌ（１９８
２））をＸｈｏIIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コートた
んぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）のコード配列を保有するヌ
クレオチド３１２から１２８５におよぶ約１ｋｂの断片
（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４））を単離
した（図１６参照）。この断片を、ｐＭＯＮ２００をＮ
ｄｅＩを用いて開裂し９００ｂｐのＮｄｅＩ断片を除く
ことにより構築したプラスミドであるｐＭＯＮ５３０に
挿入した。このようにしてｐＭＯＮ５０３を得た。これ
をＨｉｎｄ IIIとＳｍａＩを用いて開裂し、同じくＨｉ
ｎｄ IIIとＳｍａＩを用いて開裂したｐＴＪＳ７５（Ｓ
ｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ（１９
８５））と混合した。ｐＴＪＳ７５の３．８ｋｂのＨｉ
ｎｄ III−ＳｍａＩ断片を含む生成したプラスミドを、
８ｋｂのｐＭＯＮ５０３断片と結合させ、これをとり、
ｐＭＯＮ５０５と命名した。ｐＭＯＮ３１６由来のＣａ
ＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ 発現カセット（図３参照）を、
２．４ｋｂのＳｔｕＩ−ＨｉｎｄIII断片上に単離し、
ＳｔｕＩ−Ｈｉｎｄ IIIを用いて開裂したｐＭＯＮ５０
５ＤＮＡと混合した。 【０１３５】生成のプラスミド ｐＭＯＮ５３０（図１
６参照）をＢｇｌIIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コート
たんぱく質コード配列を保有する１ｋｂのＸｈｏII断片
を挿入した。プラスミドは１ｋｂ断片を意味のある配向
で含んでいることを同定された。「ｐＭＯＮ４０１」と
称するこのプラスミドは、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＧＭＶ−
ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有していた（図１６参照）。
例２に記述される方法と実質的に同じ方法により、タバ
コ植物をｐＭＯＮ４０１を用いて形質転換した。カナマ
イシンに耐性であるこれらの植物の自家受精により、上
に詳述した方法に従ってウイルス耐性を試験できる実生
後代を得た。 【０１３６】例９ ＴＭＶ ＲＮＡに相補的なアンチセ
ンスＲＮＡの発現ベクター コートたんぱく質に関するｍＲＮＡに対して相対的にア
ンチセンスの極性を有するＲＮＡを生産するように、Ｔ
ＭＶ−ＣＰ 遺伝子を中間体プラスミド（ｐＭＯＮ３１
６）に挿入する実験を行った。 【０１３７】図１７に参照されるように、ＴＭＶ コー
トたんぱく質遺伝子を、酵素ＡｈａIII およびＢａｍＨ
Ｉを用いて中間体プラスミド（ｐＴＭ３７）から切取っ
た。この配向においては、ｍＲＮＡをコードする遺伝子
の５′末端はＡｈａIII 部位の近くに位置する。Ａｈａ
III ：ＢａｍＨＩ 断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａＩを用
いて既に消化したプラスミド ｐＵＣ１３に導入した。 【０１３８】コートたんぱく質遺伝子を、ＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩを用いる消化によってｐＵＣ１３から切取っ
た。このＤＮＡ断片を、酵素ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用
いて制限したｐＭＯＮ３１６（図３参照）に連結した。 【０１３９】この配置においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターは、ＴＭＶ コートたんぱく質 ｍＲＮＡに相
補的なＲＮＡを生産する。このＲＮＡは次のものを包含
する（転写体の５′末端から）。 【０１４０】（１）ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターから
誘導した約３０のヌクレオチド （２）ｃＤＮＡの第１鎖の調製に使用したヌクレオチド
プライマーから誘導した約８のヌクレオチド （３）ＴＭＶ ＲＮＡのヌクレオチド （−） ６３９
５ （−） ５７０７ （４）ＮＯＳ ３′末端によって付与された約１５０の
ヌクレオチド この構成物を植物に導入し、それらの植物に例２の記述
に従ってウイルス耐性の試験を行うことができる。 【０１４１】例１０ キューリ モザイク ウイルス
（ＣｕＭＶ） コートたんぱく質遺伝子のクローニング ＲＮＡ ４が豊富であるＣｕＭＶ−Ｄ株（Ｊ．Ｍ．Ｋａ
ｐｅｒ，ＵＳＤＡ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ より入手可能）の大きさに従って分
別したゲノムＲＮＡを、ＣｕＭＶ ＲＮＡ分子当りのＡ
ＭＰ残基の概算値（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｎｕｍｂｅ
ｒ）が約３０になるようにポリアデニル化した。２本鎖
ｃＤＮＡを合成するために、ウイッケンズら（Ｗｉｃｋ
ｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９７８））の方法論を第１鎖ｃ
ＤＮＡの製造に適用した。更に詳しくは、３μｇのポリ
アデニル化ＣｕＭＶ−ＲＮＡ４、１００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１９ｍＭ β−メルカプトエタノール、
１．５μｇ（ｄＴ）15 、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ、
２０μＣｉ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ （３０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）、および、４８単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．）を含む８０μｌの反応混
合物を、４２℃で９０分間インキュベートした。それか
ら、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを反応混合物に加え、
続いてこれをフェノール／クロロホルムで抽出し、その
後、２０μｌの０．５トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
逆抽出した。１／３容の８Ｍ酢酸アンモニウムおよび２
容のエタノールを用いて連続して２回沈澱させることに
より、生成物を遊離のヌクレオチドとして回収した。 【０１４２】上記の反応から得たｃＤＮＡを乾燥させ、
４０μｌの水に再懸濁した。第２鎖合成にはガブラーと
ホフマンの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ
（１９８３））を適用した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ、３０単位のＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）、２０μＣｉ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ、および、２単
位のＲＮＡｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）を、０．１ｍｌの容積中
に含む反応混合物に、４０μｌの水中のｃＤＮＡを加え
た。まず、この反応混合物を１１℃で１時間インキュベ
ートし、その後２２℃で１時間インキュベートした。第
１鎖ｃＤＮＡの合成について記述した同じ方法で、生成
物を回収した。 【０１４３】文献（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ（１９８
５））に開示された方法に従って、２本鎖ｃＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ メチラーゼを用いてメチル化し、リン酸化し
たＥｃｏＲＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）に連結し、ＥｃｏＲＩ酵素で消化し、それ
から、過剰のリンカーから分離した。その後、ｃＤＮＡ
を、試料レーンと接したレーン中に適用した標識ＤＮＡ
と共に、１％アガロースゲル上で電気泳動した。標識を
エチジウム プロミド染色によって可視化し、約９００
〜１３００ｂｐの大きさのｃＤＮＡを含むゲル薄片を切
取った。ｃＤＮＡを電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔ
ｉｏｎ）し、５μｇのグリコーゲン坦体（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）の存在下で沈澱させ、１０μｌの連結反応容積と相
溶性である容積の水中に再懸濁した。それから、ｃＤＮ
Ａを室温で４時間、２０ｎｇのＥｃｏＲＩ消化リン酸化
ｐＥＭＢＬ１２（＋） ＤＮＡに連結させた。その後、
生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ１０１株中に形質転換さ
せた。コロニーを、アンピシリン耐性、並びに、０．６
ｍｇＸ−ＧａｌとＩＰＴＧを用いて広げたプレート上の
白色により選抜した。挿入物の大きさを、ミニプレップ
（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ（１９８２））のＥｃｏＲＩ消化によって決定し
た。 【０１４４】６００ｂｐから１３００ｂｐの範囲にわた
る挿入物を有する１６のコロニーに、ジデオキシシーク
エンシングによって更にスクリーニングを行い、文献
（Ｇｏｕｌｄ ＆ Ｓｙｍｏｎｓ（１９８２））に報告
されているように、Ｘ株のＣＭＶ コートたんぱく質に
対する配列相同性の存在を決定した。最長のクローンを
完全にシークエンシングし、ＣｕＭＶ ＣＰに対する全
長さのｃＤＮＡを得たことを確認した。ＣｕＭＶ コー
トたんぱく質コード配列を、発現ベクター ｐＭＯＮ９
８１８とｐＭＯＮ９８１９（前記の例７を参照）中にク
ローニングすることができる。その後、これらのベクタ
ーを使用して、ＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列
からの意味のある配列と意味のない（アンチセンス）配
列を生産することができる。 【０１４５】次のベクターを構築し、植物に移入させ
た。 【０１４６】ｐＭＯＮ９８１６ − ｐＭＯＮ９８１８
中の意味のある配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コー
ド配列 ｐＭＯＮ９８１７ − ｐＭＯＮ９８１８中の意味のな
い配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 これらのベクターを例２に従って、アグロバクテリウム
細胞に導入し、生産したトマトおよびタバコ植物に形質
転換させた。上記に従って、これらの植物にＣｕＭＶを
接種し、ウイルス耐性の水準を決定することができる。 【０１４７】例１１ ポテト リーフロール ウイルス
由来のＲＮＡの操作 精製したポテト リーフロール ウイルス（ＰＬＲＶ）
（Ｄｒ．Ｐｅｔａ Ｔｈｏｍａｓ，ＵＳＤＡ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏ
ｎ，Ｐｒｏｓｓｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ から入
手）から、大きさが約６ｋｂの完全なウイルスＲＮＡを
単離した。このＲＮＡを、大腸菌 ポリ（Ａ） ポリメ
ラーゼを用いてポリアデニル化することができる。更
に、上記に従って、ｃＤＮＡの第１鎖をオリゴ ｄＴ
プライミングにより合成できる。その後、ガブラーとホ
フマン（Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８
３））に従い、ＲＮＡｓｅ Ｈの存在下でＤＮＡ ポリ
メラーゼＩを使用することによって、第２のｃＤＮＡ鎖
を合成できる。 【０１４８】上記の例１０に従って、このようにして生
産した２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル
化し、ＥｃｏＲＩ リンカーに連結し、それから、Ｅｃ
ｏＲＩで消化したｐＥＭＢＬ１２（＋）に連結すること
ができる。生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ １０１（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｉｒａ（１９８２））に形質
転換させ、それによって得た組換体クローンを、トーマ
ス（Ｔｈｏｍａｓ（１９８３））の記述に従い、ＰＬＲ
Ｖにたいする抗体を使用してスクリーニングすることが
できる。ウイルス コートたんぱく質をコードしている
ことが同定されたｃＤＮＡ断片は、成熟コートたんぱく
質のＮＨ2 末端アミノ酸に対するコドンのすぐ隣（ｖｉ
ｓ−ａ−ｖｉｓ ５′末端）に、新たな制限部位および
ＡＴＧ翻訳開始コドンを導入することによって得られ
る。これはゾラーとスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ ＆
Ｓｍｉｔｈ（１９８２））によって行うことができる。 【０１４９】例１２ カリフラワー モザイク ウイル
ス由来ＤＮＡの操作 カリフラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ）のコー
トたんぱく質コード配列は、プラスミド ｐＯＳ１（Ｈ
ｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８１））をＡｃｃＩを
用いて開裂し、ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノー断片で
処理し、ＢａｍＨＩで開裂することによって、１．６ｋ
ｂの断片上に単離することができる。プラスミドそのも
のはＤｒ．ロバート シェファード（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒ
ｔ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）から入手でき
る。１．６ｋｂの断片にゲル上で電気泳動による分離を
行った後、ＮＡ−４５膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｅｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いてそれを精
製し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ３１６ ＤＮＡと
混合し、クレノー断片を用いて処理し、ＢｇｌIIを用い
て消化することができる。 【０１５０】リガーゼで処理することによりＣａＭＶ
コートたんぱく質コード配列を含む組換体プラスミドを
得る。このプラスミドを上記に従って使用し、細胞を形
質転換させることができる。意味のある配向のコード配
列を有するプラスミドを保有するそれらの細胞は、Ｈｉ
ｎｄIII を用いるプラスミドＤＮＡの消化により、同定
することができる。つまり、そのようなＤＮＡは、１．
１ｋｂおよび０．７ｋｂのＨｉｎｄIII 断片、並びに、
プラスミドの残りに由来するより大きな断片を示す。そ
れから、正しく配向したＣａＭＶコートたんぱく質コー
ド配列を含むプラスミドＤＮＡをクローニングし、植物
細胞に導入し、それを今度は全植物へ再生することがで
きる。これらの形質転換植物のウイルス耐性は、その
後、既に記述した基本的な方法に従って決定することが
できる。例えば、形質転換したタバコ植物の耐性は、タ
バコに感染するＣａＭＶ Ｗ２６０株、Ｗ２６２株およ
びＷ２８３株（Ｇｒａｃｉａ ＆ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ
（１９８５））を用いる接種によって試験することがで
きる。 【０１５１】例１３ ＭＡＳ（２′）プロモーターによ
って制御されたＴＭＶコートたんぱく質コード配列を有
するＤＮＡ構成物 ＥｃｏＲＩ（２１，６３１）とＣｌａＩ（２０，１３
８）によるオクトピン型ｐＴｉＡ６プラスミド Ｂａｍ
ＨＩ２断片を保有するプラスミド ｐＮＷ３４Ｃ−２−
１（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ（１９８１））か
ら、ＭＡＳ プロモーターを保有するＤＮＡ断片を切取
った。（括弧内の数値は、オクトピン型Ｔｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡ配列のベーカーら（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ
ａｌ（１９８３ａ））の発表配列から取った開裂部位の
座標である。）生成した１５０３ｂｐの断片を精製し、
ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ開裂ｐＭＯＮ５０５（Ｈｏｒ
ｓｃｈ ＆ Ｋｌｅｅ（１９８６））に挿入して、ｐＭ
ＯＮ７０６を生産した。ＮＯＳ３′末端を、ＢｇｌIIお
よびＢａｍＨＩを用いてｐＭＯ５３０から切取った。２
９８ｂｐのＮＯＳ３′断片を、ｐＭＯＮ７０６のＭＡＳ
プロモーターの３′末端に隣接するＢｇｌII部位に導
入し、ｐＭＯＮ７０７を得た。 【０１５２】生成したｐＭＯＮ７０７中のＭＡＳ プロ
モーター − ＮＯＳ３′ カセットを、ＳｔｕＩとＨ
ｉｎｄIII を用いてｐＭＯＮ７０７を開裂し、それか
ら、ＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ′−ＮＯＳ キメラ カナマイ
シン耐性遺伝子およびＭＡＳプロモーター − ＮＯＳ
３′ カセットを保有する３．２ｋｂの断片を単離する
ことにより、コインテグレート型ベクターに移入した。
この断片を、ｐＭＯＮ２００の７．７ｋｂのＳｔｕＩ−
ｔｏ−ＨｉｎｄIII 断片に付加した。生成のプラスミ
ド、ｐＭＯＮ９７４１はｐＭＯＮ３１６の類似物である
が、ＭＡＳ プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓ プロモー
ターと置換わった発現カセットを含んでいる。 【０１５３】ＴＭＶ−ＣＰコード配列は、例２の記述に
従って、または、アベルら（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ（１
９８６））が開示するようにＢｇｌIIとＢａｍＨＩを用
いてｐＴＭ３１９ ＤＮＡを消化することによって、得
ることができる。それから、７００ｂｐのＣＰコード断
片をＢｇｌIIを用いて開裂したｐＭＯＮ９７４１に挿入
できる。プロモーターおよびＮＯＳ３′に関して意味の
ある配向でＣＰ挿入物を有するプラスミドは、ＢｇｌII
とＥｃｏＲＩを用いてプラスミド ＤＮＡを消化し、Ｍ
ＡＳプロモーターを１．５ｋｂの断片上に、更に、ＣＰ
コード配列を７００ｂｐの断片上に放出させることによ
り、同定できる。生成のプラスミドをＡ．タメファシエ
ンスに交配させ、ＭＡＳ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ３′構
成物を保有するＡ．タメファシエンス細胞を、上記に従
って、形質転換したタバコ植物およびトマト植物を得る
ために使用できる。既に記述した方法で、形質転換した
植物のウイルス耐性を試験することができる。 【０１５４】例１４ エレクトロポーレーション技術を
使用する遊離ＤＮＡベクターによる植物細胞の形質転換 以下の説明により、ウイルス病耐性を得るために、プラ
スミドＤＮＡを外膜を除去した種々の植物細胞（プロト
プラスト）に効果的に導入するアグロバクテリウムに基
づかない遊離のＤＮＡ受渡し（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）法を
概説する。 【０１５５】Ａ．双子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 ダイズ［Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＧＭ）］、ペチュニ
ア［Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ
（ＭＰ４）］およびニンジン［Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔ
ａ（ＴＣ）］由来の細胞培養をウィドホルム（Ｗｉｄｈ
ｏｌｍ（１９７７））に従い、ＴＣおよびＧＭに対して
は０．４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、あるいは、ＭＰ４に対
しては０．２ｍｇ／ｌのρ−クロロフェノキシ酢酸を含
む５０ｍｌのＭＳ培養基（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓ
ｋｏｏｇ（１９６２））中で、旋回振とう器上の２５０
ｍｌエルレンマイヤー フラスコ（１３５ｒｐｍ、２７
°〜２８℃）中に成長させた。 【０１５６】１０ｍｌパック（ｐａｃｋｅｄ）細胞容積
の対数成長している懸濁培養細胞を、１０％マンニトー
ルと０．１％ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（ｐＨ５．７）とに
溶解した酵素４０ｍｌ中で１２時間インキュベートする
ことにより、ＧＭおよびＴＣ由来のプロトプラストを、
それぞれ生産した。酵素混合物は、２％セルラーゼＲ−
１０（Ｋｉｎｋｉ Ｙａｋｕｌｔ，Ｎｉｓｈｉｎｏｍｉ
ｙａ，Ｊａｐａｎ）、０．１％マセロザイム（Ｍａｃｅ
ｒｏｚｙｍｅ）Ｒ−１０（Ｋｉｎｋｉ Ｙａｋｕｌ
ｔ）、および、０．５％ペクトラヤーゼ（Ｐｅｃｔｏｌ
ａｙａｚｅ） Ｙ−２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｎｏｄａ，
Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を含んでいた。生成のプロト
プラストは、ハウプトマンとウィンドホルム（Ｈａｕｐ
ｔｍａｎ ＆ Ｗｉｎｄｈｏｌｍ（１９８４））の開示
に従って、単離、精製および培養した。 【０１５７】ＭＰ４由来のメゾフィル（ｍｅｓｏｐｈｙ
ｌｌ） プロトプラストを、使用した酵素混合物が懸濁
培養に用いたものと同一だった以外はフレーリーら（Ｆ
ｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８４））の開示に従っ
て、単離し培養した。 【０１５８】Ｂ．単子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 コムギ［Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔ
Ｍ）およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｔｉｕｕｍ（Ｔ
Ａ）、Ｍａｄｄｏｃｋら（１９８３）およびＯｚｉａｓ
−ＡｋｉｎｓとＶａｓｉｌ（１９８３）により開示］、
エレファント グラス［Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒ
ｐｕｒｅｕｍ（ＰＰ）、Ｖａｓｉｌら（１９８３）およ
びＫａｒｌｓｓｏｎとＶａｓｉｌ（１９８６）により開
示］、ギニアグラス ［Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｘｉｍｕ
ｍ（ＰＭ）、ＬｕとＶａｓｉｌ（１９８１）およびＫａ
ｒｌｓｓｏｎとＶａｓｉｌ（１９８６）により開示］、
イネ［Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＯＳ）、Ｈｅｙｓｅ
ｒら（１９８３）およびＹａｍａｄａら（１９８６）に
より開示］、コーン［Ｚｅａ ｍａｙｓ（ＺＭ）、Ｍｅ
ａｄｏｗｓ（１９８２）により開示］、サトウキビ［Ｓ
ａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ（ＳＣ）、
ＨｏとＶａｓｉｌ（１９８３）およびＳｒｉｎｉｖａｓ
ｉｎとＶａｓｉｌ（１９８５）により開示］、および、
ペニセタム アメリカナム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ａ
ｍｅｒｉｃａｎｕｍ）とＰ．プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒ
ｐｕｒｅｕｍ）およびＰ．スクアマラタム（Ｐ．ｓｑｕ
ａｍｕｌａｔｕｍ）の間の複交雑（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒ
ｏｓｓ）トリスペシフィック（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ）ハイブリッド（ＰＡＰＳ）［ＤｕｊａｒｄｉｎとＨ
ａｎｎａ（１９８４）により開示］から単子葉類の細胞
を採取した。ＰＭおよびＰＡＰＳの懸濁培養を、５％コ
コナット ミルクおよび２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含む
変形ＭＳ培地（Ｖａｓｉｌ ＆ Ｖａｓｉｌ（１９８
１））中で成長させた。一方、ＳＣ培養に対して使用し
たＭＳ培地は、更に５００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解
物を含んでいた。ＴＭ懸濁培養は、ダディッツら（Ｄｕ
ｄｉｔｓ ｅｔａｌ（１９７７））に従って、脂質培地
中で成長させた。他の単子葉類の細胞培養は、それぞれ
上に引用した文献に従って成長させた。週に２度継代培
養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）したＴＭとＰＡＰＳを除
き、全ての懸濁培養は、３５ｍｌの培地中に２〜８ｍｌ
の接種物を用いて、７日の継代培養で成長させた。プロ
トプラスト単離に先だって、４〜５日目に、懸濁を２５
〜３５ｍｌの培地中に５〜８ｍｌの接種物を用いて継代
培養した。 【０１５９】それぞれの単子葉類細胞型に関するプロト
プラストを、バジルら（Ｖａｓｉｌｅｔ ａｌ（１９８
３））の開示に従い、３ｍＭ ＭＥＳ、０．４５Ｍマン
ニトール、７ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、および、
０．７ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4ＯＨ（ｐＨ５．６）に溶解
した種々の酵素混合物を使用して、単離した。酵素混合
物は、ＴＭおよびＰＭに対しては、１．０％セルラーゼ
ＲＳ（ＫｉｎｋｉＹａｋｕｌｔ）と０．８％ペクチナ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ）を；ＳＣに対しては、２％セルラー
ゼ ＲＳと０．７％ペクチナーゼを；ＰＰに対しては、
３％セルラーゼ Ｒ−１０と０．７％ペクチナーゼを；
ＰＡＰＳに対しては、２．５％セルラーゼ Ｒ−１０と
０．７５％ペクチナーゼを含んでいた。 【０１６０】それから、単離した単子葉類プロトプラス
トを、カオとミカイルク（Ｋａｏ＆ Ｍｉｃｈａｙｌｕ
ｋ（１９７５））により変形された８ｐ培地（Ｖａｓｉ
ｌ＆ Ｖａｓｉｌ（１９８０））中で培養した。この培
養基は、０．４〜０．５Ｍグルコース、０．５〜１．０
ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄおよび０．２ｍｇ／ｌゼアチンを
含んでいた。これを１週間後にプロトプラスト培養基を
用いて１：２．３に希釈した。ＰＡＰＳおよびＴＭのコ
ロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ）を測定するために、２〜３週間後に、２ｍｌの元の
プロトプラスト培養と等価な量を、０．４％のシープラ
ーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ） アガロース（ＦＭＣ）を
用いて３６ｍｌに希釈した。それから、希釈した培養の
３ｍｌを、１０ｃｍペトリ皿の０．６％アガロースを含
む同じ培地の層上にプレートした。 【０１６１】Ｃ．エレクトロポーレーションによる遊離
ＤＮＡ受渡し カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの存在
下で、ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）細胞融合系
（ＧＣＡ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、または、キャパシタ
− ディスチャージ バンク（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ
（１９８５））を用いて、プロトプラストにエレクトロ
ポーレーションを行った。ジンマーマン細胞融合系を用
いるエレクトロポーレーションは、ジンマーマン ヘリ
カルフュージョン チャンバー中で、または、ポッター
ら（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８４））の方法に
従ってキュベットと白金またはアルミニウム箔から構成
されたエレクトロポーレーション室中で行った。パルス
（直流２４０Ｖ）を、それぞれ９のパルスからなるパ
ルス列として９９９．９μｓｅｃで与えた。それぞれの
パルス列を、プロトプラスト洗浄溶液中、５０μｇの子
ウシ胸線ＤＮＡを伴ってまたはそれを伴わずに１４μｇ
のプラスミド ＤＮＡの存在下で、１回、１０回、５０
回および１００回与えた。 【０１６２】キャパシター バンクは、１個の１００μ
Ｆキャパシターと１個の２４００μＦキャパシター（Ｍ
ａｌｌｏｒｙ）と共に、それぞれ４０、１１０、２４
０、３４０μＦのキャパシターの４個を含むように構成
した。キャパシターは個々にまたは平行に充電と放電を
行うことができた。パルス放電は、２重チャンネル記録
オシロスコープ（Ｔｅｃｔｒｏｎｉｃｓ モデル ５８
４Ａ）を使用して監視した。アンペア数はエレクトロポ
ーレーションの間に１個の１オーム抵抗にかかる放電を
測定することによって決定した。 【０１６３】エレクトロポーレーションに先だって、プ
ロトプラストを、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、および、０．２Ｍマン
ニトール（ｐＨ７．２）中で１度洗浄し、それから、同
じ緩衝液（Ｆｒｏｍｍ ｅｔａｌ（１９８５））を用い
て約３×１０6 プロトプラスト／ｍｌの密度にした。１
ｍｌの再懸濁プロトプラストに２０ｍｌのプラスミド
ＤＮＡを加え、混合した。このプロトプラストに種々の
電圧と容量でエレクトロポーレーションを行った。プロ
トプラストは氷上に約１０分間保ち、その後、液体培養
基中でのプレーティングを行った。 【０１６４】種々のエレクトロポーレーション処理によ
って細胞溶解された双子葉類プロトプラストの数を評価
するために、パルス放電を与える前および直後にＴＣプ
ロトプラストの密度を測定した。測定値は残存割合で表
わした。生存率測定は、エレクトロポーレーションの２
日後のフェノサフラニン（ｐｈｅｎｏｓａｆｒａｎｉ
ｎ）染料排除（Ｗｉｄｈｏｌｍ（１９７２））を基礎に
した。結果はエレクトロポーレーションを行っていない
対照と比較したパーセント生存率で表わした。エレクト
ロポーレーションを行った双子葉類プロトプラストのコ
ロニー形成率評価は、培養の３〜４週後に形成されたコ
ロニー数を数えることによって得た。これを、エレクト
ロポーレーションを行っていない対照の割合として表わ
した。 【０１６５】形質転換したコロニーは、フロムら（Ｆｒ
ｏｍｍ ｅｔ ａｌ（１９８６））の開示に従い、カナ
マイシンを含む培地に移した後に選抜した。同様にし
て、工学的に処理したウイルス コートたんぱく質とカ
ナマイシン選抜可能標識とを含むｐＭＯＮ３１９、ｐＭ
ＯＮ４０１、ｐＭＯＮ９８００、ｐＭＯＮ９８０９、お
よび、ｐＭＯＮ９８１６などのプラスミドを遊離ＤＮＡ
形質転換に使用することができる。再生植物は、例２に
記述した方法を使用して、コートたんぱく質ｍＲＮＡと
たんぱく質生産とを監視することができる。 【０１６６】参照文献 ・アベルら、サイエンス、１９８６年 ２３２巻 ７３
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ｅｍ．２５９： ６１８− ２７（１９８４）］
る植物を生産する方法と、そのようなウイルス耐性の付
与に用いる遺伝物質と、その方法の産物とに関する。従
って、本発明は、植物分子生物学、植物ウイルス学およ
び植物遺伝子工学の分野の応用を含んでいる。 【０００２】植物においてウイルス感染は、成長阻害、
形態変化および収穫減少などの種々の不利な効果の原因
となる。更に、ウイルス感染はしばしば植物を他の害虫
や病原菌による損傷に対してより影響され易くする。植
物ウイルスについての一般的な知見は、文献（例えば、
Ｍａｔｔｈｅｗｓ（１９８１）、Ｌａｕｆｆｅｒ（１９
８１）およびＫａｄｏ ＆ Ａｇｒａｗａｌ（１９７
２））に記述されている。 【０００３】植物は、動物のように抗体が関与する免疫
系を持たない。しかし、植物は病原菌による感染に抵抗
するために、幾つかの方法を発達させてきた。例えば、
ある型の植物は、侵入する真菌の表面の糖部分に結合し
て真菌を不動化するレクチンを産生する。更に、ある型
の植物は、明らかに、細菌、昆虫、それに多分ウイルス
による攻撃に応答して植物中を循環する種々の分子を産
生する。 【０００４】ある型の植物では、幼若な植物に「減衰さ
せた（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」ウイルス株、つまり、
重大な症状を起こさないウイルス株を感染させることに
よって、ある程度のウイルス耐性を誘導することができ
る（例えば、Ｒａｓｔ（１９７２）およびＣｏｓｔａ
（１９８０）を参照）。この方法には次のような幾つか
の限界がある。つまり、（１）一定の型の農作物（ｃｒ
ｏｐ）中でのみ都合良く行うことができる。（２）一定
の型のウイルスに対してのみ行うことができる。（３）
感染ウイルスの適切な減衰株が同定されているかまたは
単離されている場合にのみ、行うことができる。（４）
この方法によって与えられる保護は、限られた数の種々
のウイルスに対してのみ効果があり得る。（５）減衰感
染は第２の関連の無いウイルスによる感染を、相乗効果
によって更に深刻に悪化する可能性がある。 【０００５】それで、上述した問題が解決されていて、
しかも、減衰ウイルスの同定、単離および使用を必要と
しないようなウイルス感染から植物を保護する方法が必
要とされている。また、天然の遺伝的耐性または交叉免
疫（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）耐性が利用で
きないときにウイルス耐性を与える必要がある。 【０００６】 【発明の概要】従って、本発明の目的は、減衰ウイルス
の使用、耐性を与える遺伝的決定基の存在、または、交
叉免疫の利用可能性のいずれにも依存しないウイルス耐
性植物を生産する方法を提供することである。 【０００７】また、本発明の目的は、工学的に処理した
植物が植物ウイルスに対して耐性を示すように、植物の
ゲノムに、植物ウイルスのゲノムの小部分を他のものと
共に含むＤＮＡ構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を挿入す
ることにより、植物を遺伝子工学的に処理する方法を提
供することである。 【０００８】また、本発明の他の目的は、遺伝的に形質
転換されたウイルス耐性植物の生産に使用できる組換体
ＤＮＡ分子を提供することである。 【０００９】更に、本発明の他の目的は、植物ウイルス
のＲＮＡ配列の生産を起こすＤＮＡ配列の存在をそれぞ
れ特徴とする、遺伝的に形質転換された細胞および分化
植物を提供することである。 【００１０】上述の目的を達成する中で、本発明の一つ
の観点として、植物ウイルスによる感染に耐性である遺
伝的に形質転換された植物を生産する方法が提供され
た。この方法は次の工程を包含する。 【００１１】（ａ）植物細胞のゲノムに、（ｉ）植物細
胞中で機能して、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産を起
こすプロモーターと、（ii）植物ウイルスから誘導した
ＤＮＡ配列であって、植物ウイルスのＲＮＡ配列の生産
を起こすＤＮＡ配列と、（iii)植物細胞中で機能して、
ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌクレオチド
の付加を起こす３′非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔ
ｅｄ）ＤＮＡ配列とを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子
を、挿入する工程。 【００１２】（ｂ）形質転換された植物細胞を得る工
程。 【００１３】（ｃ）形質転換された植物細胞から、植物
ウイルスによる感染に対する耐性が増した遺伝的に形質
転換した植物を再生する工程。 【００１４】一つの好ましい具体例では、植物ウイルス
のＲＮＡ配列はそのウイルスのコートたんぱく質をコー
ドする。 【００１５】本発明の他の観点として、配列中に次のも
のを包含する組換体２本鎖ＤＮＡ分子が提供された。 【００１６】（ａ）植物細胞中で機能して、植物ウイル
スのＲＮＡ配列の生産を起こすプロモーター、（ｂ）植
物ウイルスから誘導されたＤＮＡ配列であって、植物ウ
イルスのコートたんぱく質をコードするＲＮＡ配列の生
産を起こすＤＮＡ配列、および、（ｃ）植物細胞中で機
能して、ＲＮＡ配列の３′末端へのポリアデニル化ヌク
レオチドの付加を起こす３′非翻訳領域。 【００１７】また、本発明の他の観点として、上述の
（ａ），（ｂ）および（ｃ）の要素を包含するＤＮＡ
を、それぞれ含む細菌細胞および形質転換された植物細
胞が提供された。 【００１８】更に、本発明の他の観点として、上述のよ
うに形質転換された植物細胞を包含し、植物ウイルスに
対して耐性を示す分化した植物が提供された。また、本
発明の他の観点として、そのような植物を栽培するこ
と、外植片（ｅｘｐｌａｎｔｓ）、挿木およびサッド
（ｓｕｄｓ）などの胎芽（むかご、ｐｒｏｐａｇｕｌｅ
ｓ）を用いてそのような植物を繁殖させること、また
は、この植物を他の植物と交雑（ｃｒｏｓｓ）させて同
じくこの植物ウイルスに対して耐性を示す後代（ｐｒｏ
ｇｅｎｙ）を生産することを伴う方法を提供する。 【００１９】本発明の他の目的、特質および利点は、本
明細書の以下の説明から明らかとなるだろう。しかし、
本明細書中の詳しい説明および特定の具体例は、本発明
の好ましい具体例を示してはいるが、説明のためだけの
ものであり、本発明の技術的範囲を定めるものではな
い。本発明の技術的範囲内で成される種々の変形および
修正は、この詳細な説明から当業者には明らかであろ
う。 【００２０】図面には次の通りの内容を示している。 【００２１】図１はトランスジェニック植物におけるウ
イルス病耐性の生物試験の概略を示す。 【００２２】図２はダイズ モザイク ウイルス コー
トたんぱく質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列を示
す。 【００２３】図３は、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／
ＮＯＳ 構成物を含む植物形質転換ベクター、ｐＭＯＮ
３１９を示す。このベクターは植物細胞に構成物を挿入
するために使用した。 【００２４】図４は、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌII
とＥｃｏＲＩに対する唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）開裂部位
を有する合成マルチリンカーに隣接してＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターを含む発現ベクター、ｐＭＯＮ３１６を
示す。このマルチリンカーの後には、ノパリン シンタ
ーゼ遺伝子アデニル化シグナルをコードする２６０塩基
対の断片が続いている。 【００２５】図５は、図４に示したＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーター、マルチリンカーおよびノパリン シンター
ゼ断片の完全配列を示している。 【００２６】図６および図７は、本発明によってそれぞ
れ生産したトランスジェニックなタバコ植物とトマト植
物に対する異なる水準のウイルス接触（ｅｘｐｏｓｕｒ
ｅ）の効果を含む例３（Ａ）と３（Ｂ）に記述した実験
からのデータを、それぞれ示している。 【００２７】図８は、遺伝的に耐性な系のトマト植物
と、本発明によって生産したトランスジェニック植物の
間のウイルス耐性の比較を含む例３（Ｃ）に記述した実
験からのデータを示している。 【００２８】図９は、タバコ モザイク ウイルスの種
々の株に対して効果的である、本発明に従ったトマト植
物中への交叉免疫の導入を含む例４に記述した実験から
のデータを示す。 【００２９】図１０は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の単離と中
間体ベクターへの導入を示している。 【００３０】図１１は、例５で使用したペチュニア由来
のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌクレオチ
ド配列を示している。 【００３１】図１２は、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター
をペチュニアのｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモーターに置換
したＤＮＡ構成物の生産の概略を示す。 【００３２】図１３は、アルファルファ モザイク ウ
イルスのコートたんぱく質（ＡＭＶＣＰ）をコードする
ｃＤＮＡを製造するために使用した方法を示す。 【００３３】図１４は、ポテト ウイルス Ｘ のコー
トたんぱく質遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクタ
ーを製造するために使用した方法を示す。 【００３４】図１５は、ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオ
チド配列を示す。 【００３５】図１６は、トマト ゴールデン モザイク
ウイルス コートたんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）をコ
ードするヌクレオチド断片を単離するための工程を示
す。 【００３６】図１７は、ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチ
センス相補体をコードするＤＮＡを含む植物ベクターを
生産するために例９で使用した工程の概略を示す。 【００３７】 【好ましい具体例の説明】本発明は、植物細胞中で機能
し、ウイルス耐性を生じるＤＮＡ構成物の製造を含む。
以下に詳細に説明するように、「ウイルス耐性」という
語は、ここでは、一つまたはそれ以上の型の植物ウイル
スに抵抗する植物の能力を意味している。 【００３８】多数の植物ウイルスが世界的に重大な農作
物の損失を引起こしている。本発明は、植物ウイルスに
感染され易い植物を保護する方法を提供する。そのよう
なウイルスには、例えば、ダイズ モザイク ウイル
ス、ビーン ポッド モトル（ｂｅａｎ ｐｏｄ ｍｏ
ｔｔｌｅ） ウイルス、タバコ リング スポットウイ
ルス、バーレイ イエロー ドゥワーフ（ｂａｒｌｅｙ
ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ） ウイルス、コムギ ス
ピンドル ストリーク（ｓｐｉｎｄｌｅ ｓｔｒｅａ
ｋ） ウイルス、ソイル ボーン（ｓｏｉｌ ｂｏｒ
ｎ） モザイクウイルス、コムギ ストリーク ウイル
ス イン メイズ（ｉｎ ｍａｉｚｅ）、メイズ ドゥ
ワーフ モザイク ウイルス、メイズ クロロティック
（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ） ドゥワーフ ウイルス、キュ
ーリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ） モザイク ウイルス、タバ
コ モザイク ウイルス、アルファルフア モザイク
ウイルス、ポテト ウイルス Ｘ、ポテト ウイルス
Ｙ、ポテト リーフロール（ｌｅａｆｒｏｌｌ） ウイ
ルス、トマト ゴールデン モザイク ウイルスがあ
る。これらの中で、メイズ ドゥワーフ モザイク ウ
イルス、バーレイ イエロー ドゥワーフ ウイルス、
コムギ ストリーク モザイク ウイルス、ソイル ボ
ーン モザイク ウイルス、ポテト リーフロール ウ
イルス およびキューリ モザイク ウイルス に対す
る保護が特に重要である。 【００３９】本発明の実施によりウイルス耐性となる植
物には、ジャガイモ、トマト、コショウ、タバコ、ダイ
ズ、コムギ、コーン、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、スカ
ッシュ（ｓｑｕａｓｈ）、キューリおよびビート（ｂｅ
ｅｔ）などがある。しかし、これらに限られるわけでは
ない。 【００４０】２本鎖ＤＮＡ中に存在する植物遺伝子の発
現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ＲＮＡポリメラーゼ酵
素によるＤＮＡの一つの鎖からのメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の転写と、核の中でのｍＲＮＡ一次転写体
のその後のプロセッシングを含んでいる。このプロセッ
シングは、ウイルスＲＮＡの３′末端にポリアデニル化
ヌクレオチドを付加する３′非翻訳領域を含んでい
る。 【００４１】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、普通「プロ
モーター」と称されるＤＮＡ領域によって制御されてい
る。プロモーター領域はＲＮＡポリメラーゼに対してＤ
ＮＡと会合し、更に、ＤＮＡ鎖の一つを鋳型（ｔｅｍｐ
ｌｅｔｅ）として使用してｍＲＮＡの転写を始め、対応
するＲＮＡ鎖をつくるように合図する配列を含む。 【００４２】植物細胞中で活性な多数のプロモーターが
文献に記載されてきた。これらには、例えば、ノパリン
シンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）
（ＮＯＳ）とオクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ） シンタ
ーゼ（ＯＣＳ） プロモーター（これらは、アグロバク
テリウム タメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘導プラスミド
に保有されている）、カリフラワー モザイク ウイル
ス （ＣａＭＶ） １９Ｓ および ３５Ｓ プロモー
ター、リブロース２リン酸 カルボキシル化酵素の小サ
ブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富な植物ポ
リペプチド）からの光誘導プロモーター、および、ヒド
ロキシプロリンに富む糖たんぱく質をコードする遺伝子
のプロモーターなどがある。これらのプロモーターの全
てが、植物中で発現される種々の型のＤＮＡ構成物をつ
くるために使用された（ＰＣＴ公報 ＷＯ ８４／０２
９１３（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｓａｎｔ
ｏ）を参照）。 【００４３】植物細胞中でウイルスＲＮＡの転写を起こ
すことが知られているあるいは見出されているプロモー
ターを、本発明で使用することができる。そのようなプ
ロモーターは植物またはウイルスから得ることができ、
例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子などの植物遺伝子から単離されたプロモータ
ーがある。しかし、これらに限定されるわけではない。
後述するように、好ましくは、選んだ特定のプロモータ
ーは、植物を実質的にウイルス感染に対して耐性にする
有効量のコートたんぱく質の生産をもたらすための十分
な発現を引起こすことができなければならない。耐性を
誘導するために必要なコートたんぱく質の量は、植物お
よび／または 保護の目標となるウイルスの型に応じて
変化する。従って、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターが好
ましい。しかし、このプロモーターが本発明の全ての具
体例で最適なプロモーターであるとは限らない。 【００４４】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるプロ
モーターは、必要ならば、修飾してその制御特性を変化
させることができる。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモ
ーターを、光のないところでｓｓＲＵＢＩＳＣＯの発現
を抑制するｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の一部分に連結さ
せ、葉では活性であるが根では活性でないプロモーター
をつくることができる。生成のキメラ プロモーターを
ここに示すように使用することができる。ここでの説明
では、「ＣａＭＶ３５Ｓ」の語は、例えば、オペレータ
ー領域との連結、無作為のまたは制御を伴った突然変異
生成（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって誘導されたプ
ロモーターなどの、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの変
形も含む。 【００４５】本発明のＤＮＡ構成物は、２本鎖ＤＮＡ形
の中にウイルスのコートたんぱく質をコードするウイル
ス ゲノムの一部分を含むことが好ましい。多くの型の
植物ウイルスはＤＮＡではなくＲＮＡを含んでいるが、
１本鎖または２本鎖のＤＮＡを含むものもある。ＲＮＡ
を含むウイルスは、標準の転写プロモーター および／
または ３′制御配列を含まない。この場合には、ポリ
ペプチドまたはたんぱく質は、ウイルスに保有されるＲ
ＮＡ鎖またはその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）から
直接翻訳される。コートたんぱく質をコードしているウ
イルス ゲノムの部分は、当業者によく知られている幾
つかの方法のいずれかによって決定できる（後述の例１
を参照）。 【００４６】例えば、ある場合には、コートたんぱく質
をシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、ウイ
ルスのコートたんぱく質をコードするＤＮＡ配列の合成
を選択することができる。その代わりに、コートたんぱ
く質をコードするウイルスからのＲＮＡを同定し、生成
することもできる。ＲＮＡを含む植物ウイルスの大部分
では、コートたんぱく質遺伝子はウイルスＲＮＡの３′
末端に位置している。ある場合には、コートたんぱく質
遺伝子は、その配列がウイルスのコートたんぱく質のア
ミノ酸配列を反映しているオリゴヌクレオチド プロー
ブを用いて位置を定めることができる。ウイルスがＲＮ
Ａを保有している場合には、ＤＮＡコード配列は逆転写
酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成すること
によって得られる。上述したように、多くの型の植物ウ
イルスはＲＮＡを含んでいる。これらには、例えば、タ
バコ モザイク ウイルス、トマト スポッティド（ｓ
ｐｏｔｔｅｄ） ウィルト（ｗｉｌｔ） ウイルス、キ
ューリ モザイク ウイルス、アルファルファ モザイ
ク ウイルス、ポテト ウイルス Ｘ などのポテック
スウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓｅｓ）、ポテト ウ
イルス Ｙ などのポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕ
ｓｅｓ）、ポテト リーフロール ウイルスなどがあ
る。 【００４７】ポティウイルスなどの一定のウイルスの場
合には、コートたんぱく質は、プロセッシングを受けて
コートたんぱく質を放出するポリプロテインの一部であ
る。当業者は、次の例１に詳述するように、コートたん
ぱく質をコードするウイルスゲノムの領域を単離し、翻
訳開始シグナルを導入するためには、これらのことを考
慮しなければならない。 【００４８】それほど好ましくはないが、ウイルスＲＮ
Ａ配列の生産を起こす本発明のＤＮＡ構成物で用いられ
る配列はアンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）の配置
をとることができる。例えば、ＤＮＡの転写によって生
産されるＲＮＡは、最終的には、天然のウイルス コー
トたんぱく質ｍＲＮＡの相補的配列を持つＲＮＡ分子を
生産することができる。（アンチセンス配置が使用され
る場合は、ＤＮＡ配列は、コートたんぱく質ｍＲＮＡの
５′領域に相補的なアンチセンスＲＮＡをつくるために
短くなると、信じられている。）その代わりに、アンチ
センスＤＮＡはウイルス ゲノムの他の断片から誘導で
きる。好ましい領域には、試験管中でウイルスＲＮＡの
翻訳を阻害することが示されている（Ｂｅａｃｈｙ ｅ
ｔ ａｌ．（１９８５））ウイルスＲＮＡの５′末端な
どがある。いずれの場合も、アンチセンス転写体は安定
性が低く、あるいは、宿主植物中でのより高い水準での
発現を必要とすると信じられているので、この配置はあ
まり好ましくない。 【００４９】本発明のＤＮＡ構成物中で用いられるコー
ド配列は、必要ならば、当業者に既知の方法を使用し
て、無作為のまたは制御を伴った突然変異生成のいずれ
かにより修飾して突然変異体をつくることができる。そ
れで、そのような突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）と変異
体（ｖａｒｉｅｎｔｓ）は本発明の範囲に含まれる。従
って、「コートたんぱく質」の語は、ここでは、トラン
ケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）たんぱく質、融合
（ｆｕｓｉｏｎ）たんぱく質、並びに、無修飾のコート
たんぱく質を含んでいる。 【００５０】３′非翻訳領域は、植物中で機能してウイ
ルスＲＮＡの３′末端へのポリアデニル化 ヌクレオチ
ドの付加を起こすポリアデニル化シグナルを含む。適切
な３′領域は、例えば、（１）アグロバクテリウム（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のノパリン シンターゼ
（ＮＯＳ）遺伝子などの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺
伝子の、ポリアデニル化シグナルを含む３′転写非翻訳
領域、および、（２）ダイズ貯蔵たんぱく質遺伝子およ
びＲｕＢＰカルボキシル化酵素遺伝子の小サブユニット
などの植物遺伝子である。好ましい３′領域は、例え
ば、ＮＯＳ遺伝子のものである。これについては後述の
例に詳しく述べる。 【００５１】本発明のＤＮＡ構成物によって生産される
ＲＮＡは、また、５′非翻訳のリーダー（ｌｅａｄｅ
ｒ）配列を含む。この配列は、遺伝子を発現するために
選んだプロモーターから誘導できるし、また、ｍＲＮＡ
の翻訳を増加させるために特別に修飾することができ
る。また、５′非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡから、適
当な真核細胞の遺伝子から、または、合成遺伝子配列か
ら得ることができる。本発明は、後述の例に示すよう
に、非翻訳領域が、プロモーター配列に伴う５′非翻訳
配列、および、ウイルス コートたんぱく質遺伝子の
５′非翻訳領域の部分の両者から誘導される構成物には
限定されない。そうではなくて、非翻訳リーダー配列
は、ウイルス コートたんぱく質に対するコード配列の
非翻訳領域の５′末端の部分、または、プロモーター配
列の部分であってよく、あるいは、関連のないプロモー
ター配列または上述のようなコード配列から誘導でき
る。 【００５２】本発明のＤＮＡ構成物は任意の適当な方法
によって植物のゲノムに挿入できる。適当な植物形質転
換ベクターには、例えば、アグロバクテリウム タメフ
ァシエンスのＴｉプラスミドから誘導したもの、並び
に、文献に開示されたものがある（例えばＨｅｒｒｅｒ
ａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１９８３）、Ｂｅｖａｎ（１９
８３）、Ｋｌｅｅ（１９８５）およびＥＰＯ公報第１２
０５１６号（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．））。アグロバクテリウムのＴｉまたは根誘導（Ｒ
ｉ）プラスミドから誘導した植物形質転換ベクターに加
えて、本発明のＤＮＡ構成物を植物細胞へ挿入する他の
方法を用いることができる。そのような方法には、例え
ば、リポゾームの使用、エレクトロポーレーション（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遊離ＤＮＡ取込みを
増加させる化学物質、および、ウイルスまたは花粉を使
用する形質転換などがある。 【００５３】本発明の一つの具体例では、２本鎖ｃＤＮ
Ａは、タバコ モザイク ウイルス（ＴＭＶ）のコート
たんぱく質をコードするＲＮＡ断片（ＣＰ−ｍＲＮＡ）
から製造される。このコード配列をＣａＭＶ３５Ｓ プ
ロモーター および ＮＯＳ３′非翻訳領域に連結し
て、本発明のＤＮＡ構成物を形成することができる。Ｄ
ＮＡ構成物を、部分的にアグロバクテリウム タメファ
シエンスのＴｉプラスミドから誘導した中間体プラスミ
ドに挿入して、プラスミド ｐＭＯＮ３１９をつくる。
それから、ベクターを、弱めた（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ
ｉプラスミドを含む培養Ａ．タメファシエンスに挿入す
る。二つのプラスミドは、交叉（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ
ｅｖｅｎｔ）によりコインテグレート（ｃｏｉｎｔｅｇ
ｒａｔｅ） プラスミドを形成する。 【００５４】コインテグレート プラスミドを含む細菌
細胞を、タバコ植物から誘導した細胞と共に培養し、形
質転換した植物細胞をカナマイシンを含む栄養培地を用
いて選抜する。それから、その細胞をカルス組織に培養
し、分化した植物に再生する。生成した本発明の植物
は、ウイルス耐性を与えるＤＮＡ構成物を含む。 【００５５】本発明の実施においては、特定のウイルス
に由来するＣＰコード配列を含むＤＮＡ構成物が持つ耐
性付与能力を、第１の例としてそのウイルスに対する全
身性の（ｓｙｓｔｅｍｉｃ）宿主を用いて利用すること
が好ましい。「全身性の」宿主植物中では、ウイルス
は、複製し、依然として非特定的な方法で接種部位（典
型的には、葉上）から植物中を移動して、局部的でない
全身的な感染の症状を起こすことができる。（逆に、
「非全身的な」宿主は、壊疽性斑点の発達のような、接
種部位の周辺領域に制限された症状を示す。）特定のウ
イルスとそれに対して全身性である宿主とのペアリング
は、植物病理学ではよく認められている。例えば、多く
のトマトおよびタバコの変種並びにアルファルファは、
アルファルファ モザイク ウイルス （ＡＭＶ）に対
して全身性である。また、キューリモザイク ウイルス
（ＣｕＭＶ）は、トマト、タバコ、キューリおよび他の
メロン作物に全身性の感染を起こし、、タバコ、トマト
および多数のランの変種は、ＴＭＶに対する全身性の宿
主である。一般的には文献を参照（ＩＮＤＥＸ ＯＦＰ
ＬＡＮＴ ＶＩＲＵＳ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ．３０７（ＡＲ
Ｓ−ＵＳＤＡ １９６６）。 【００５６】特に、本発明によって製造されたＤＮＡ構
成物は、ＲＮＡ配列の生産を起こす構成物中のＤＮＡ配
列を与える源として使用するウイルスに対して、全身性
であるような植物から誘導した植物細胞またはプロトプ
ラストに、上に述べた適当なベクターを介して導入され
る。ＤＮＡ配列がウイルスのコートたんぱく質をコード
している場合には、このように修飾された植物物質は、
例えば、ノーザン ブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によりＣＰ−ｍＲＮＡの存在を試
験される。ＣＰ−ｍＲＮＡが検出されない（または力価
が低すぎる）場合には、ＣＰをコードする断片を制御す
るために構成物中で使用されているプロモーターを、よ
り強力な可能性のある他のプロモーターと置換えて、こ
の変化した構成物を再び試験することができる。 【００５７】その代わりに、この監視を全体（ｗｈｏｌ
ｅ）の再生した植物に行うことができる。いずれの場合
も、ウイルスｍＲＮＡしの適切な生産が行われたときに
は、形質転換細胞（またはプロトプラスト）は全植物に
再生され、後者（植物）をウイルスに対する耐性に関し
てスクリーニングする。再生工程のための方法論の選択
は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、ク
ローバーなど）、セリ科（ニンジン、セロリー、アメリ
カボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、ハツカダイコ
ン、ナタネなど）、ウリ科（メロンとキューリ）、イネ
科（コムギ、イネ、コーンなど）、ナス科（ジャガイ
モ、タバコ、トマト、コショウ）および種々の植物作物
の宿主に対する適当なプロトコルが利用できる。文献
（例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８
４））を参照。上記の科のそれぞれの植物に、本発明に
よってウイルス耐性を与えることができる。 【００５８】ウイルス耐性を試験される再生植物は、病
気の発達の速度が接種物中のウイルス濃度と線形に相関
する範囲の濃度で、ウイルスに接させることが好まし
い。この線形の範囲は、一定のウイルスと宿主種のペア
リングに関して、形質転換していない植物を用いて試験
的に決定することができる。 【００５９】ウイルス接種の方法は当業者にはよく知ら
れており、文献（Ｋａｄｏ ＆ Ａｇｒａｗａｌ（１９
７２））にまとめられている。一つの方法は、カルボラ
ンダム（ｃａｒｂｏｒｕｎｄｕｍ）またはケイソウ土な
どの研磨剤とウイルスとを含む水性懸濁液（典型的には
ｐＨ７〜８に緩衝化する）を用いて、葉表面を研磨する
工程を含む。この方法での接種はその簡便さのために一
般に好まれているが、一定の植物ウイルスに対しては他
の方法が好ましい可能性があることは当業者には認めら
れるだろう。例えば、アフィドボーン（ａｐｈｉｄ−ｂ
ｏｒｎ） ポテト リーフロール ウイルスは機械的な
研磨によっては容易に接種されないことが知られてい
る。これは適当な昆虫ベクターを用いて移入される。一
般的には文献（Ｔｈｏｍａｓ（１９８３））を参照。 【００６０】再生物の後代に接種を行い、形質転換され
ていない植物、および／または、ウイルスＲＮＡ配列の
生産を起こすＤＮＡ配列を欠いている構成物を用いて形
質転換された植物である、同様に処理した対照と共に観
測し、例えば、症状の発生の時期について群の間の相違
に反映される比較耐性を測定する（図１参照）。例え
ば、本発明によるウイルス コートたんぱく質をコード
する配列を含む植物は、ウイルス感染の症状を示すとし
ても、対照の植物に比較して相当に長い期間の後にの
み、症状を示すことが見出された。トランスジェニック
（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物の間で観測された耐性
は、ウイルスｍＲＮＡまたはコートたんぱく質の測定さ
れた水準と相関している。このように、ウイルス ゲノ
ムの小部分の発現は、ウイルス感染に対する耐性を与え
ることができることが見出された。 【００６１】ある場合には、ウイルスｍＲＮＡまたはコ
ートたんぱく質の発現は検出することができない。これ
は多分ｍＲＮＡまたはたんぱく質の不安定性のためと思
われる。しかし、ｍＲＮＡまたはたんぱく質を安定化す
る方法が当業者には知られている。例えば、安定なｍＲ
ＮＡの形成には、イントロンのスプライシングが重要な
役割を果たすことが知られている（Ｈａｍｅｒ ＆ Ｌ
ｅｄｅｒ（１９７９））。ウイルス コートたんぱく質
遺伝子の発現は、イントロンをコード配列または非コー
ド配列に挿入することにより十分に高められる。更に、
ｍＲＮＡの３′非翻訳配列が、対応するｍＲＮＡの安定
性を決定することが知られている（Ｓｈａｗ ＆ Ｋａ
ｍｅｎ（１９８６））。工学的に処理したコートたんぱ
く質ｍＲＮＡの安定性は、その３′非翻訳領域の交替に
よって十分に増加させることができる。最後に、幾つか
のたんぱく質はたんぱく質分解の際にその機能活性を保
持することが知られている（Ｍｏｏｒｅ（１９８１）、
Ｓａｎｄｍｅｉｅｒ（１９８０）、Ｚｕｒｉｎｉ（１９
８４））。 【００６２】本発明によって生産されたトランケートさ
れたコートたんぱく質は、トランスジェニック植物中に
高水準で発現されたときに、その生物活性を保持しウイ
ルス耐性を与えることができた。 【００６３】 【実施例】例１ 交叉免疫で使用するためのウイルス コートたん
ぱく質の典型的な単離 ポティウイルスは、最も広範で経済的に重要な既知の植
物ウイルスの群を包含する。それで、一つのポティウイ
ルス、ダイズ モザイク ウイルス（ＳＭＶ）を選び、
本発明に従ってウイルス病耐性（「交叉免疫」）を与え
るために使用することができるウイルス ゲノムの小部
分、コートたんぱく質をコードする配列を単離する一般
的な方法を説明した（図１参照）。 【００６４】ＳＭＶを、ＳＭＶのＮ鎖を用いて感染され
たダイズ葉から精製した。文献（Ｖａｎｃｅ ＆ Ｂｅ
ａｃｈｙ（１９８４））に開示されている方法に従っ
て、ウイルスを単離し、ウイルスＲＮＡを調製した。Ｓ
ＭＶに対する抗体は定法によりウサギ中で産生させた。
これは、１ｍｇの精製ＳＭＶをウサギに注射し、４週後
に５０μｇのＳＭＶの第２の注射を行い、更に２週後に
ＳＭＶ（５０μｇ）を注射する工程を含んでいた。最後
の追加抗原注射の後、２週間隔でこの例で使用するため
に血清を集めた。 【００６５】ウイルス コートたんぱく質遺伝子のｃＤ
ＮＡクローニングは、当業者によく知られている方法を
用いて行った。ｃＤＮＡは、まず、オリゴｄＴを用いて
ポリアデニル化されたＳＭＶ ＲＮＡをプライミング
し、それから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生産する
ことにより、ウイルスＲＮＡから生産した。２本鎖ｃＤ
ＮＡを生産するために、第１の鎖ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッド分子をＲＮｓａｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩ
を用いて処理した。それから、この分子をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて処理し、その後、ＥｃｏＲＩメチラ
ーゼにより処理した。この分子を、ＥｃｏＲＩ部位を含
む合成オリゴヌクレオチド リンカーの存在下でＴ４
ＤＮＡ リガーゼと反応させた。その後、この分子をＥ
ｃｏＲＩを用いて消化し、プラスミドｐＥＭＢＬ１８に
連結した。このプラスミドは、ヨーロッパ分子生物学研
究所（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １０−２２０９，６９００ Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ． Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌ
ｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ）で構築された広く利用さ
れているクローニングベクターのクラスの一つである。
ｐＥＭＢＬ１８ ＤＮＡに予め酵素ＥｃｏＲＩを用いて
制限を行い、プラスミドの再アニーリングを防ぐために
リン酸アルカリを用いて処理した。露出したＥｃｏＲＩ
部位を持つ２本鎖ｃＤＮＡを開いたプラスミドに連結し
た。これらの連結されたｃＤＮＡを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）ＤＨ５α株を形質転換するために使用した。 【００６６】形質転換した細菌のコロニーを32Ｐ標識し
たｃＤＮＡを用いてスクリーニングし、32Ｐ標識分子と
反応したコロニーを選んだ。抗原産生に対するスクリー
ニングのために、ＩＰＴＧを使用してポジティプな形質
転換体を誘導し、予め産生させたウサギ 抗コートたん
ぱく質 抗体を用い、抗体ブロット法を介して成長する
コロニーをスクリーニングした。（一定の適当な抗ＣＰ
抗体は市販もされている。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉ
ｎ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ。）抗体と
反応したそれらのコロニーを更にスクリーニングして選
抜し、それらが実際にコートたんぱく質：ｌａｃＺ融合
たんぱく質を生産することを確めた。融合たんぱく質を
生産するコロニーから単離したプラスミドＤＮＡをプロ
ーブとして使用し、ｃＤＮＡを含む他のコロニーを同定
した。この方法は標準的なハイブリダイゼーション法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２））と一
部重複している。 【００６７】クローンしたｃＤＮＡのＤＮＡ配列は標準
法によって決定した（図２参照）。ウイルス コートた
んぱく質のアミノ酸シークエンシングを完成して、ＮＨ
2 末端アミノ酸配列を決定することができる。ある場合
にはアミノ末端断片がブロックされている可能性がある
ので、ウイルス コートたんぱく質は、当業者に既知の
方法を応用し、ファースト アトム ボンバードメント
（ｆａｓｔ ａｔｏｍｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡ
Ｂ）と質量分析計によりシークエンシングすることがで
きる。それから、たんぱく質のアミノ酸配列をクローン
化ｃＤＮＡのシークエンシングにより誘導した配列と比
較できる。これによってウイルス コートたんぱく質を
コードすると同定されたｃＤＮＡ断片を、新たな制限部
位とＡＴＧ翻訳開始コドンを成熟コートたんぱく質のＮ
Ｈ2 末端アミノ酸のコドンの、５′末端に関して、すぐ
隣に導入することにより得ることができる。これはゾラ
ーとスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１
９８２））によって行うことができる。コートたんぱく
質コード配列を切取るための制限酵素消化の後、単離し
たＣＰコード配列を上に述べたように、適当なプロモー
ターに連結し、本発明によってウイルス耐性を与えるた
めに植物中に置いた。 【００６８】例２ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（タバコ モザイク ウイルス）を含むトランスジェニ
ック植物におけるウイルス病耐性 この例では、ウイルス コートたんぱく質のヌクレオチ
ド配列が利用できる場合に本発明を実施する方法を説明
する。 【００６９】Ａ．プラスミド ｐＭＯＮ３１９の製造 文献（Ｂｒｕｅｎｉｎｇ（１９８２））に記述されるよ
うに、フェノール抽出によってタバコ モザイク ウイ
ルス（ＴＭＶ、普通のＵ１ バルガー（ｖｕｌｇａｒ
ｅ）株、配列は公表されている（Ｇｏｅｌｅｔ ｅｔ
ａｌ．（１９８２）））からＲＮＡを除いた。ウイルス
ＲＮＡの３′末端に相補的であり、しかも、ＮｄｅＩと
ＢａｍＨＩ開裂部位を有する３５−ｍｅｒ オリゴヌク
レオチドプライマーを合成した。オリゴヌクレオチドを
ウイルスＲＮＡに対してアニーリングし、マニアチスの
方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２））に従って、ｃＤ
ＮＡの合成（逆転写酵素を用いる）のためのプライマー
として用いた。１本鎖ＤＮＡをマニアチスの方法（Ｍａ
ｎｉａｔｅｓ（１９８２））により２本鎖（ｄｓ）ＤＮ
Ａに変換した。 【００７０】ｄｓ−ｃＤＮＡを、プライマー上の部位で
開裂するＢａｍＨＩ、および、ＴＭＶ配列の５０８０の
塩基で開裂するＨｉｎｄ IIIにより開裂した。生成した
１．３ｋｂの断片を、同じくＨｉｎｄ IIIとＢａｍＨＩ
を用いて開裂したプラスミドｐＵＣ９ ＤＮＡと混合し
た。生成のアンピシリン耐性プラスミド ｐＴＭ３７を
その後の操作に使用するコートたんぱく質コード配列Ｄ
ＮＡの源とした。これはＢａｍＨＩ部位に隣接してＥｃ
ｏＲＩ部位を有している。 【００７１】コートたんぱく質コード配列を有するより
小さいＤＮＡ断片を得るために、プラスミド ｐＴＭ３
７を、ＴＭＶ配列の５７０７の塩基（コートたんぱく質
ｍＲＮＡに対するＡＴＧ翻訳開始コドンから５塩基対）
で開裂するＡｈａIII 、および、ｐＴＭ３７中のＴＭＶ
配列の末端をちょうど越えて開裂するＥｃｏＲＩを用い
て消化した。それから、生成した長さ約７００塩基対
（ｂｐ）の断片を、コートたんぱく質コード断片の５′
および３′末端に対する制限部位を付加するために、他
の二つのプラスミドに移してクローンした。これらの制
限部位の付加はその後のプラスミドの構築を容易にし
た。その代わりに、制限部位を付加するために、サイト
ダイレクティッド（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突
然変異生成、または、合成ＤＮＡリンカーの連結などの
他の方法を選択することもできる。これらの技術は全て
従来技術の範囲内にある。 【００７２】ＢｇｌII部位で５′末端に接し、ＥｃｏＲ
Ｉ部位で３′末端に接する７００ｂｐのコートたんぱく
質コード配列断片を、ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用いる消
化によって中間体プラスミドから切取った。この７００
ｂｐの断片を精製し、同じくＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用
いて消化した プラスミド ｐＭＯＮ３１６のＤＮＡと
混合した。プラスミド ｐＭＯＮ３１６は、３５Ｓ転写
体の生産を指示するカリフラワー モザイク ウイルス
（ＣａＭＶ）の３３０ｂｐ断片を保有するｐＭＯＮ２
００（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８５）、Ｒｏｇ
ｅｒｓ ｅｔａｌ（１９８５））の誘導体である。 【００７３】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター断片を、Ｓ
ａｌＩ挿入物としてＣａＭＶ ＣＭ４−１８４株（Ｈｏ
ｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８１））の完全なゲノム
を保有するｐＢＲ３２２誘導体であるプラスミド ｐＯ
Ｓ−１から単離した。ＣＭ４−１８４株はＣＭ１８４１
株の天然に存在する欠失突然変異体である。ＣａＭＶの
ＣＭ１８４１株（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８
１））とＣａｂｂ−Ｓ株（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ
（１９８０））のヌクレオチド配列は公表されており、
異なるＣＭ４−１８４ クローン（Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ
ａｌ（１９８２））に対するある部分的な配列を有し
ている。これらの全ての株の３５Ｓ プロモーターのヌ
クレオチド配列は非常に類似している。以下の説明中に
参照するヌクレオチド番号（「ｎ・・・」）は、ガード
ナーら（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８１））に
より開示されているＣＭ１８４１の配列に対するもので
ある。 【００７４】まずＢａｍＨＩを用いて開裂された ｐＢ
Ｒ３２２に挿入し、その後ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて処理し、最後にＥｃ
ｏＲＩを用いて開裂したＡｌｕＩ（ｎ ７１４３）−Ｅ
ｃｏＲＩ* （ｎ ７５１７）断片として、３５Ｓ プロ
モーターをＣＭ４−１８４のｐＯＳ−１クローンから単
離した。それから、プロモーター断片をＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＩを用いてｐＢＲ３２２から切取り、クレノー
ポリメラーゼを用いて処理し、ｍｐ８マルチリンカーの
ＥｃｏＲＩ部位がプロモーター断片の５′末端にくるよ
うにＭ１３ ｍｐ８ （Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｉ
ｒａ（１９８２））のＳｍａＩ部位に挿入した。その
後、サイト ダイレクティッド 突然変異生成（Ｚｏｌ
ｌｅｒ ＆Ｓｍｉｔｈ（１９８２））を使用して、ヌク
レオチド ７４６４にグアニジン残基を導入し、Ｂｇｌ
II部位を形成した。 【００７５】それから、３５Ｓ プロモーター断片を、
Ｍ１３から、３３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌII断片と
して切取った。これは、３５Ｓ プロモーター、転写開
始部位、および、５′非翻訳リーダーの３０個のヌクレ
オチドを含むが、ＣａＭＶ翻訳イニシエーター、また、
転写の開始点から１８０ヌクレオチド下に位置する３５
Ｓ転写ポリアデニル化シグナル （Ｃｏｖｅｙ ｅｔ
ａｌ（１９８１）、Ｇｕｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９
８２））は含まない。３５Ｓ プロモーター断片を、合
成マルチリンカーと、ＮＯＳ ３′非翻訳領域からのｐ
ＴｉＴ３７ ノパリン シンターゼ遺伝子（Ｂｅｖａｎ
ｅｔ ａｌ（１９８３））の２６０ｂｐ Ｓａｕ３Ａ
断片（ヌクレオチド ６６５〜４１７）とに結合させ
た。このようにして製造した断片をｐＭＯＮ２００に挿
入し、ｐＭＯＮ３１６を得た（図３）。３５Ｓ プロモ
ーター、マルチリンカーおよびＮＯＳ ３′断片の完全
な配列を図４に示す。この配列は、３５Ｓ プロモータ
ー断片の５′末端に位置するＥｃｏＲＩ部位を除くため
のクレノー ポリメラーゼ処理によって形成されたＸｍ
ｎＩ部位で始まっている。 【００７６】プラスミド ｐＭＯＮ３１６は、５′リー
ダーとＮＯＳポリアデニル化シグナルの間に、制限エン
ドヌクレアーゼ ＢｇｌII、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、Ｘｈ
ｏＩおよびＥｃｏＲＩに対する唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）
開裂部位を有するコインテグレート型の中間体ベクター
である。この開裂部位のために、３５Ｓ転写リーダー配
列のすぐ隣に、それ自身の翻訳開始シグナルを保有する
コード配列を挿入することができる。ｐＭＯＮ３１６
プラスミドは、大腸菌およびＡ．タメファシエンスにお
ける選抜のためのスペクチノマイシン耐性を含むｐＭＯ
Ｎ２００の全ての性質、並びに、形質転換された植物組
織の選抜のためのキメラ カナマイシン遺伝子（ＮＯＳ
−ＮＰＴＩＩ′−ＮＯＳ）、および、後代中での形質転
換体と遺伝形質の容易なスコアリングのためのノパリン
シンターゼ遺伝子を保持している。ｐＭＯＮ３１６
プラスミドは上述のＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ カセット
を含む。これはｐＭＯＮ２００には欠けていたものであ
る。しかし、実質的にはｐＭＯＮ２００と同様に使用す
ることができる（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８
５）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ（１９８６）を参
照）。 【００７７】７００ｂｐのＴＭＶコートたんぱく質コー
ド断片を挿入することにより、形質転換植物細胞中での
このたんぱく質の合成の適切なシグナルが提供される。
生成のプラスミドを図５に示す。このプラスミドを「ｐ
ＭＯＮ３１９」と称する。 【００７８】Ｂ．ＣＰ遺伝子を含むＤＮＡ構成物の植物
細胞への挿入 プラスミド ｐＭＯＮ３１９を、フレーリーら（Ｆｒａ
ｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８５））に従い、「ｐＴｉＢ
６Ｓ３−ＳＥ」と称する弱めたＴｉ プラスミドを含む
Ａ．タメファシエンス細胞に挿入した。このプラスミド
は、完全に機能的なＴ−ＤＮＡ領域を含まず、左のＴ−
ＤＮＡ境界を含む。 【００７９】ｐＭＯＮ３１９ プラスミドは、細菌中の
スペクチノマイシン（Ｓｐｃ）とストレプトマイシン
（Ｓｔｒ）に対する選択可能な耐性を伝達する標識遺伝
子を保有している。更に、ｐＭＯＮ３１９をｐＴｉＢ６
Ｓ３−ＳＥと組合わせて、それにより、ＣａＭＶ３５Ｓ
／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含む再構成されたＴ
−ＤＮＡ領域を有するコインテグレート Ｔｉ プラス
ミドをつくる交叉を起こすことができる相同性の領域を
保有している。しかし、ｐＭＯＮ３１９はＡ．タメファ
シエンス細胞中で独立して複製することができない。そ
れで、ＳｐｃおよびＳｔｒ存在下では、コインテグレー
ト プラスミドを有するＡ．タメファシエンス細胞のみ
が生存できる。 【００８０】コインテグレート Ｔｉ プラスミドを含
むＡ．タメファシエンスの培養を、ホーシュら（Ｈｏｒ
ｓｃｈ ｅｔ ａｌ（１９８５））に記述されるよう
に、タバコ植物（Ｎｉｃｉｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｕｍ
ｃｖ．“Ｓａｍｓｕｎ”）から採取した葉のディスク
と接触させた。アグロバクテリウム細胞は、ＤＮＡ構成
物を植物細胞の染色体に挿入した。カナマイシンに耐性
の植物細胞を選抜し、ホーシュら（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ
ａｌ（１９８５））が記述する方法により分化植物に
再生した。 【００８１】実験で対照とした植物は、（１）外来性の
遺伝子を全く含んでいないか、または、（２）ｐＭＯＮ
２００ プラスミドのみを含むかのどちらかであった。 【００８２】ｐＭＯＮ３１９：：ｐＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥ
コインテグレート プラスミドを含むＡ．タメファシ
エンス細胞の培養を、ＡＴＣＣにブダベスト条約に基づ
く国際寄託をした。受託番号は第５３２９４号であっ
た。 【００８３】Ｃ．植物細胞中でのウイルスＲＮＡの発現 文献（Ｌａｎｅ ＆ Ｔｒｅｍｉａｔｅｓ−Ｋｅｎｎｅ
ｄｙ（１９８１））に記載される方法により、再生した
植物の葉からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、マニアチス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ（１９８２）））が
記述するように、ホルムアルデヒドを含むアガロースゲ
ル中での電気泳動により大きさに従って分離し、ニトロ
セルロースに対してブロッティングした。ウイルスＲＮ
Ａは、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ
（１９８２）））の方法を使用して、32Ｐ標識ＤＮＡク
ローンに対してハイブリダイゼーションさせることによ
って、ニトロセルロース上に検出した。 【００８４】このＲＮＡハイブリダイゼーション分析に
基づいて、形質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を保有す
る植物）はウイルスＲＮＡを保有するが、ｐＭＯＮ２０
０のみを含む植物はウイルスＲＮＡを含まないことが決
定された。ＴＭＶ コートたんぱく質の存在は、ｐＭＯ
Ｎ３１９を含むが、ｐＭＯＮ２００は含まない植物中に
検出された。リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０））
に従い、試料緩衝液中で粉砕することにより葉からたん
ぱく質を抽出した。リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７
０））が開示するように、たんぱく質の５０μｇの部分
に、ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドゲル中での
電気泳動を行った。たんぱく質は、トービンら（Ｔｏｗ
ｂｉｎ ｅｔ ａｌ（１９８１））の開示するように、
電気泳動的にニトロセルロースへ移された。 【００８５】ブロッティングしたたんぱく質を、シミン
グトンら（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８
１））の開示に従い、精製したＴＭＶに対してウサギ中
で産生させた抗血清と反応させた。ニトロセルロース上
でＴＭＶと結合したウサギ抗体は、 125Ｉ標識したロバ
抗ウサギ 抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．，Ｃｈ
ｉｃａｇｏ）との結合により検出した。 【００８６】イムノブロット分析の結果に基づいて、形
質転換した植物（ｐＭＯＮ３１９を含む）はＴＭＶ コ
ートたんぱく質を生産するが、ｐＭＯＮ２００のみを含
む植物はＴＭＶ コートたんぱく質を生産しないことが
決定された。これらの葉中で生産されるコートたんぱく
質の量は、葉の全たんぱく質の５０μｇ中にコートたん
ぱく質が約５０ナノグラム、つまり０．１％であった。 【００８７】Ｄ．タバコ植物のＴＭＶに対する耐性 形質転換した植物と対照の植物とを約２フィートの高さ
に成長させ、それから、幹部を腋芽を伴った挿木に分割
し、これを根付かせ個々の植物に再生させた。これらの
植物にＴＭＶを接種した。これは、研磨粒子をウイルス
粒子の水性懸濁液に加え、研磨溶液を葉上でこすること
によって行った。特に、ＴＭＶは０．０５Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁した。約５０μｌ
の溶液を、カルボランダム（３２０グリット、Ｆｉｓｈ
ｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．製造）を撒いたタ
バコ葉に、こすることによって適用した。葉の表面が乾
燥した後、葉を水ですすぎ、植物を温室または生育室に
置いた。 【００８８】対照植物は接種後約３〜５日以内に感染の
症状を示した。それに対して、本発明のＤＮＡ構成物を
含む植物は、接種後８〜１０日まで症状を生じなかっ
た。この結果は独立した３組の実験で確められた。 【００８９】他の実験では、ｐＭＯＮ３１９を含む二つ
の異なる形質転換植物により生産された種子を発芽さ
せ、実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）を土壌で成長させた。そ
れぞれの実生に、上述のイムノブロッティング法によっ
てＴＭＶ コートたんぱく質が存在するか否かを試験し
た。全部で３９の実生に、上に述べたＴＭＶを含む懸濁
液（０．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、実生がＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含むか否かを前もって知らない盲検法
で接種を行った。実験の結果、１１／３９の植物がコー
トたんぱく質を含んでいた。残りはコートたんぱく質を
含んでいず、この実験の対照とした。 【００９０】接種後５日に、３／１１（２７％）の対照
植物がＴＭＶ感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コ
ートたんぱく質を含む植物はいずれもそのような症状を
示さなかった。 【００９１】接種後６日に、４５％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。一方、ＴＭＶ コートた
んぱく質を含む植物では１８％のみがそのような症状を
示した。 【００９２】接種後７日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では５７％がそのような症状を示した。 【００９３】接種後８日に、８２％の対照植物がＴＭＶ
感染の典型的な症状を生じた。ＴＭＶ コートたんぱく
質を含む植物では６４％がそのような症状を示した。 【００９４】ウイルスによる重大な攻撃（ｍａｓｓｉｖ
ｅ ａｓｓａｕｌｔ）にもかかわらず症状の発生が相当
に遅れたという結果は、形質転換された植物が、形質転
換されない植物よりもウイルスに対して相当に耐性が大
きいことの証明である。この実験で観測された耐性の増
加の程度は、形質転換された植物が、開放田畑または温
室で起こる可能性がある感染接触の型に耐えることがで
きることを示している。 【００９５】例３．トランスジニック植物におけるウイ
ルス病耐性の確認（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ） Ａ．タバコにおける適用量応答（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ） 例２に説明した形質転換したタバコ植物の実生をこの実
験に使用した。上に述べたイムノブロッティング法によ
り、ＣＰコード配列を発現するか、または、ＣＰコード
配列を発現しないかを決定された植物を、３群に分け、
上記のＴＭＶ（Ｕ１バルガー株）を含む懸濁液を用いて
接種した。この３群はそれぞれ、０．４μｇ／ｍｌ、
０．８μｇ／ｍｌおよび２．０μｇ／ｍｌの濃度でＴＭ
Ｖを含む懸濁液を用いて接種を行った。接種した植物を
温室に入れ、ウイルス感染の症状を観察した。図６の棒
グラフはこの実験の結果を示している。データは、明ら
かに、コートたんぱく質を発現する植物が、〜０．４μ
ｇ／ｍｌまたはそれ以下でウイルスに対して全く耐性で
あったことを示している。 【００９６】Ｂ．トマトにおける適用量応答 コインテグレート プラスミド ｐＭＯＮ３１９：：ｐ
ＴｉＢ６Ｓ３−ＳＥを含むＡ．タメファシエンス細胞の
培養を、再び例２に説明した方法を使用して、トマト植
物から採取した葉のディスクと接触させた。ＣａＭＶ３
５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を含むカナマイシ
ン耐性組織を選抜し、植物に再生した。自家受精したト
ランスジェニックなトマト植物の実生後代を、試験植物
とした。この実験に対する対照植物は、形質転換されて
いない親植物および非発現の実生後代であった。 【００９７】試験植物と対照植物とに例２の接種方法に
従い、０．５μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間の濃度で
ＴＭＶを含む懸濁液を用いて接種を行った。この実験の
結果を図７に示す。図７に示すように、全ての対照植物
が３０日以内にウイルス感染の症状を示した。更に、対
照植物はウイルス接種物の増加に伴ってより速やかに症
状を示した。これと対照的に、ＴＭＶコートたんぱく質
を発現する実生はＴＭＶ感染に対して実質的に耐性であ
り、感染の症状を示す場合でも接種後３０日までは症状
を発達させなかった。 【００９８】Ｃ．遺伝的耐性との比較 本発明によって上記の実生後代に付与された耐性を更に
確認するために、ＴｏＭＶ耐性のための遺伝的決定基を
含むことが知られているトマト植物のＴｏＭＶ接種に対
する応答を、例２の方法を用いて調製したトランスジェ
ニック植物の対応する応答と比較した。特に、通常の育
種方法によってそれぞれ耐性決定基Ｔｍ−２またはＴｍ
−２ａを導入された「クライゲラ（Ｃｒａｉｇｅｌｌ
ａ）」変種植物に、「ＴｏＭＶ２」または「ＴｏＭＶ２
ａ」と称するＴｏＭＶ株を用いて接種を行った。（種々
の株によるＴｏＭＶ感染に対する異なる耐性決定基を保
有する植物の相対感受性のデータを、次の表に示す。）
形質転換されＴＭＶ コートたんぱく質を発現したほか
はＴｏＭＶ２感受性である変種のトランスジェニック植
物を含む試験群（「ＶＦ３６」）に、形質転換されない
ＶＦ３６植物の対照群と同様に、同じウイルス株を用い
て接種を行った。 【００９９】ＴｏＭＶ株 植物群 ＴＭＶ* ２ ２ａ ＶＦ３６ ５／５ ５／５ ５／５ Ｔｍ−１ ０／５ ０／５ ０／５ Ｔｍ−２ ０／５ ５／５ ０／５ Ｔｍ−２ａ ０／５ ０／５ ３／５ トランス− ジェニック １／５ ３／５ １／５ ＊ ＝ ＴＭＶ株 ＰＶ２３０ ＋ ＝ 感染性 − ＝ 耐性 それぞれの群の５つの植物が、接種後１４日に病気の症
状を記録された。接種後１４日以内に対照植物およびＴ
ｍ−２決定基を含む植物の両方が全てＴｏＭＶ感染の症
状を発達させた。５つのトランスジェニック植物のうち
３つが同じ期間にわたって症状を示した（図８参照）。
前記の表中のデータは、トランスジェニックな植物が、
形質転換されていない対照よりも相当に良く、しかも、
ＴｏＭＶの多くの株に対して非選択性の耐性の水準を示
すことを証明している（図８参照）。これと対照的に、
遺伝的耐性はかなり範囲が狭い。試験植物中、最終的に
は６０％が感染の徴候を示したが、症状はＴｍ−２植物
のものよりも重大でなかった。この結果は、試験植物中
でのＣＰ発現により付与されたＴｏＭＶ２に対する耐性
は、Ｔｍ−２によりコードされる遺伝的耐性より、優れ
てはいないとしてもそれと比較できるものであったこと
を示している。 【０１００】例４ タバコ モザイク ウイルスの種々
の株に対する交叉免疫 ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有
する形質転換したトマト植物を例３に記述した方法で製
造した。自家受精トランスジェニック トマト植物の実
生後代をこの実験の試験植物とした。対照植物は、ＴＭ
Ｖ コートたんぱく質を発現しない実生後代、および、
親型の正常の形質転換していない植物であった。 【０１０１】試験植物と対照植物に次の二つの異なるＴ
ＭＶ株を用いて接種を行った。 【０１０２】ＰＶ−２３０ − ＡＴＣＣから得たＴＭ
Ｖのヴィルレント株（受託番号ＰＶ−２３０） Ｌ−ＴＭＶ − トマト植物に感染することが知られて
いる株 試験植物と対照植物に、例２に記述した方法に従い、そ
れぞれ２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの濃度で前記のそ
れぞれのＴＭＶ株を接種した。この実験の結果を図９に
示す。このデータは、「ＭＶ コートたんぱく質を発現
するトランスジェニックなトマト植物がＴＭＶ感染に耐
性であったことを明らかに示している。試験したＴＭＶ
の両方の株に対して耐性が示された。更に、２０μｇ／
ｍｌもの高濃度でヴィルレント株ＰＶ−２３０を使用し
たにもかかわらず、高い割合のトマト植物（４０％から
１００％）が接種後２９日内に症状を発達させなかっ
た。 【０１０３】例５ 種々のプロモーターによるウイルス
コートたんぱく質の制御 本発明の他のプロモーターの使用を示すため、および、
コートたんぱく質の発現の水準とウイルス耐性の間の相
関を示すために、一つの実験を行った。 【０１０４】第１群の植物は、例２に記述したように形
質転換されてＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ
構成物を保有するトランスジェニックなタバコ植物の実
生後代であった。 【０１０５】第２群と第３群の植物は、第１群の植物と
同様に、ＴＭＶ コートたんぱく質遺伝子を発現するよ
うに形質転換されたトランスジェニックなタバコ植物の
実生後代であるが、ただ、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモータ
ーを次の方法によって、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）
由来のｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（Ｔｕｎｅｒ
ｅｔ ａｌ （１９８６））に置換した。 【０１０６】ペチュニア １１Ａ 小サブユニット（ｓ
ｓ）プロモーター断片を、バクテリオファージ λに保
有されるゲノム クローン（Ｔｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ
（１９８６））から、ＥｃｏＲＩを用いる開裂を経て単
離した。このプロモーターを保有する生成した１．３ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片を更にＰｓｔＩを用いて消化し、フ
ァージ Ｍ１３ｍｐ８のＰｓｔＩ部位とＥｃｏＲＩ部位
との間に挿入して、サイト ダイレクティド 突然変異
生成のために、小サブユニット転写体の５′非翻訳配列
にＢｇｌIIを導入した（図１０）。ペチュニア １１Ａ
ｓｓ プロモーターと突然変異生成プライマーの部分
配列を図１１に示す。ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIを用いて開
裂した後、生成の８００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩとＢｇ
ｌIIを用いて開裂したｐＭＯＮ２００に挿入した。生成
のプラスミド ｐＭＯＮ８０４６をＥｃｏＲＩを用いて
消化し、ＤＮＡポリメラーゼの大クレノー断片およびＤ
ＮＡリガーゼを用いて処理した。ＥｃｏＲＩ部位を失っ
たプラスミドを単離し、ｐＭＯＮ８０４８と命名した
（図１０）。 【０１０７】ペチュニア ｓｓ−ＮＯＳ ３′カセッ
ト、プラスミド ｐＭＯＮ３１１を構築するために、Ｓ
ｍａＩ部位をＢａｍＨＩリンカーで置換え、その後クレ
ノーポリメラーゼとリガーゼを用いて処理することによ
りＢａｍＨＩ部位を除いたｐＭＯＮ２００誘導体を、Ｓ
ｔｕＩとＨｉｎｄ IIIを用いて消化した。生成の８ｋｂ
断片を、ｐＭＯＮ３１６から精製した３００ｂｐのＢｇ
ｌII−ｔｏ−ＨｉｎｄIII断片、および、ｐＭＯＮ８０
４８の２．６ｋｂのＳｔｕＩ−ｔｏ−ＢｇｌII断片と混
合した。生成のプラスミド ｐＭＯＮ８０４９は、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターがペチュニア ｓｓ プロモー
ターと置換えられている以外はｐＭＯＮ３１６と同様で
ある（図１２）。５′末端にＢｇｌII部位を３′末端に
ＥｃｏＲＩ部位を含む上記の７００ｂｐのＴＭＶ−ＣＰ
コード断片を、ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用いて開裂した
ｐＭＯＮ８０４９に挿入し、ペチュニア ｓｓ プロモ
ーター／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有するｐＭ
ＯＮ８０５９を得た（図１２）。 【０１０８】第４群の植物はプラスミド ｐＭＯＮ２０
０のみを含むように形質転換し、対照植物とした。 【０１０９】それぞれの群は、例２（Ｄ）に概説した方
法に従ってＴＭＶを接種した３０の植物を含んでいた。
接種後、これらの植物を温室に置き、ウイルス感染の症
状を観察した。 【０１１０】ＴＭＶ コートたんぱく質の相対的な水準
は、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析により
評価した。第１群の植物におけるコートたんぱく質遺伝
子発現の程度に対する平均値を１００％とし、次のよう
に決定した。 【０１１１】ＣＰ発現の平均値 第１群 − １００ 第２群 − １４ 第３群 − ３ 第４群 − ０ 症状を示す植物の割合（％）群 （接種後の日数） ３ ４ ５ ６ ７ ８ １０ １ ０ ３ ７ ２３ ４０ ４７ ５０ ２ ０ ３ １３ ６３ ８３ ９７ ９７ ３ ０ ０ １５ ８８ １００ ４ ０ １３ ７０ １００ 上に示したデータは次の結論を支持している。 【０１１２】（１）リブロース２リン酸 カルボキシル
化酵素 小サブユニット プロモーターは、本発明での
使用に対して有用なプロモーターである。しかし、一定
の植物ではＣａＭＶ２５Ｓ プロモーターのように強力
なプロモーターではない可能性がある。 【０１１３】（２）コートたんぱく質の発現の水準とウ
イルス耐性との間には正の相関がある。 【０１１４】例６ ウイルス コートたんぱく質遺伝子
（アルファルファ モザイク ウイルス）を含むトラン
スジェニックな植物におけるウイルス病耐性 アルファルファ モザイク ウイルスのコートたんぱく
質コード配列（ＡＭＶＣＰ）を含むＤＮＡ構成物を、Ｔ
ＭＶ耐性を工学的に処理するために用いた戦略と同様の
戦略を使用して製造した。ＡＭＶのコートたんぱく質を
コードする全長さの（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ｃＤＮ
Ａクローンを次に記述し、図１３に概略的に示すように
して得た。ＡＭＶ コートたんぱく質ｃＤＮＡを、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓ プロモーターとＮＯＳ ３′末端に、既に
述べたようにして融合させた。それから、この構成物を
アグロバクテリウム介在形質転換系を用いて植物に移入
することができる。 【０１１５】ＡＭＶの３分節系（ｔｒｉｐａｒｔｉｔ
ｅ）ＲＮＡゲノムの完全なヌクレオチド配列は既に知ら
れている。このデータは、ＡＭＶゲノムが４つの主要な
遺伝子生成物をコードしていることを示している。これ
らは、ＲＮＡ １によってコードされている１２６キロ
ダルトン（ｋｄ）のたんぱく質、ＲＮＡ ２によってコ
ードされている９０ｋｄのたんぱく質、および、ＲＮＡ
３によってコードされている３２ｋｄのたんぱく質で
ある。コートたんぱく質は、ＲＮＡ ３の３′末端 ８
８１ヌクレオチドと相同する「ＲＮＡ ４」と称される
サブゲノム メッセンジャー（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ（１９８３ｂ））から翻訳される。 【０１１６】ＡＭＶのコートたんぱく質をコードする全
長さのｃＤＮＡを合成するために、第１鎖および第２鎖
の両方のＤＮＡ合成に対する合成オリゴヌクレオチド
プライマーを使用した。図１３に参照されるように、使
用したプライマーは、ＡＭＶコートたんぱく質コード配
列のそれぞれの末端に唯一の（ｕｎｉｑｕｅ）ＥｃｏＲ
Ｉ部位を含んでいた。第１鎖のｃＤＮＡは、１００ｍｌ
の反応中５μｇのＡＭＶ全ＲＮＡと５５ｎｇのプライマ
ーから、４ｍＭのピロリン酸ナトリウムと逆転写酵素を
用いて合成した。この方法によって、分子量が１．０４
×１０6 ダルトン（ＲＮＡ １）、０．７３×１０6 ダ
ルトン（ＲＮＡ ２）および０．６８×１０6 ダルトン
（ＲＮＡ ３）のｃＤＮＡが合成された。ＲＮＡ鋳型を
加水分解した後、ｃＤＮＡ生成物をＰ−６０カラムで分
別した。１本鎖ｃＤＮＡをアニーリングして２本鎖プラ
イマーとして、逆転写酵素と共にインキュベーションし
た。ＡＭＶ コートたんぱく質配列を含む生成した２本
鎖ｃＤＮＡは、それぞれの末端でＥｃｏＲＩ部位に接し
ていた。ＥｃｏＲＩを用いて消化した後、ｃＤＮＡをｐ
ＵＣ９のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、大腸菌ＪＭ１０１細
胞を形質転換し、それから、アンピシリン、ＩＰＴＧお
よびＸ−Ｇａｌを含む培地上で選抜した。約１０００の
形質転換体を得た。２５％の形質転換体に５′および
３′特異プライマーの両方に対してハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ＤＮＡを３つのポジティブから調製し
た。ＥｃｏＲＩ消化物は予期した大きさ（８８１ｂｐ）
の挿入物の存在を明らかにした。ヌクレオチド シーク
エンシング（それぞれの末端に〜１００ｂｐ）により、
これらのクローンが実際に全長さのＡＭＶ コートたん
ぱく質挿入物を含むことが確認された。 【０１１７】ＡＭＶ コートたんぱく質をコードする８
８１ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、意味を持つ配向および意
味を持たない配向（ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）とで（それぞれ、ｐ
ＭＯＮ９８００とｐＭＯＮ９８０１）、植物発現ベクタ
ーｐＭＯＮ３１６に結合させた。ｐＭＯＮ９８００の構
造を図１３に示す。それから、これらのベクターを例２
に記述したアグロバクテリウム介在形質転換系を使用し
て、タバコ、トマトおよびペチュニアに移入した。 【０１１８】ＡＭＶ コートたんぱく質ｍＲＮＡの発現
を更に調べるために、ＡＭＶ コートたんぱく質遺伝子
を意味のある配向（ｐＭＯＮ９８００）で含むトランス
ジェニックなタバコ植物（ｃｖ．“Ｓａｍｓｕｎ”）由
来のカルス組織に、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ブロ
ット分析を行った。ｐＭＯＮ９８００からと、ＡＭＶＣ
Ｐコード配列を欠くｐＭＯＮ２００から誘導した対照ベ
クターであるｐＭＯＮ２７３からの全ＲＮＡ（４０μ
ｇ）をアガロースゲル上に仕込み、膜（Ｇｅｎｅ Ｓｃ
ｒｅｅｎR 、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
製造）に移し、それから、ＡＭＶ コートたんぱく質を
コードする８８１ｂｐのｃＤＮＡ挿入物をプローブとし
て調べた。予期した大きさの転写体（１．２ｋｂ）に対
応するバンドの群は非常に強いハイブリダイゼーション
を示した。プローブとハイブリダイゼーションする、よ
り小さい大きさの転写体も存在した。ｐＭＯＮ２７３を
用いて形質転換した対照カルスに対してはハイブリダイ
ゼーションは検出されなかった。 【０１１９】同じく、ＡＭＶ コートたんぱく質検出の
ためのウエスタン ブロット プロトコルを、トランス
ジェニックな植物と感染植物とに発達させた。市販の抗
ＡＭＶ ＩｇＧ分画（Ａｇｄｉａ Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｈ
ａｗａｋａ，ＩＮ）を、トランスジェニックなタバコ
カルスおよび葉中、および、トランスジェニックなトマ
ト葉中でのコートたんぱく質の検出にうまく使用するこ
とができた。特に、対照およびトランスジェニックなタ
バコ カルスからの３０μｇのたんぱく質、および、対
照およびトランスジェニックなトマト材料からの４０μ
ｇのたんぱく質をウエスタン ブロットに適用し、精製
ＡＭＶ コートたんぱく質標品と共に移動する分子量２
８〜２９ｋｄ付近の免疫反応性のバンドが得られた。 【０１２０】ＡＭＶ コートたんぱく質を発現すると同
定されたトランスジェニックなタバコ植物に、ＡＭＶの
接種を行った。また、形質転換されていないか、また
は、ベクター ｐＭＯＮ３１６を用いて形質転換された
かのいずれかの対照植物に、接種を行った。症状の発達
を生育室内で毎日監視した。用いた対照植物とトランス
ジェニック植物とは、大きさ、外観および発達段階（全
て開花を始めていた）が類似していた。対照植物とトラ
ンスジェニック植物からの３枚の葉に、それぞれ、ＡＭ
Ｖ感染植物の抽出物を接種した。その後の滴定分析か
ら、この接種に用いたＡＭＶの濃度は約５０μｇ／ｍｌ
であったことが示された。 【０１２１】対照のトランスジェニックなタバコ植物お
よび形質転換されていないタバコ植物の接種を施された
葉は、ＡＭＶの感染後１週以内に症状を示した。これと
対照的に、ＣＰを発現するトランスジェニック植物はい
ずれも感染後１週以内に症状を示さなかった。１０日
後、後者の植物の一つは、３枚の接種した葉の１枚に１
または２の病害を示した。感染後２週には、対照植物の
接種を施され葉の多数の病害は同様のままだったが、接
種しなかった上側の葉は葉の表面に均一に広がった症状
（緑退環）を示した。ＡＭＶ コートたんぱく質を生産
するトランスジェニック試験植物は、接種した葉または
全体の（接種していない）葉のいずれにも症状を示さな
かった（または、追加の症状を示さなかった）。 【０１２２】トランスジェニック植物および対照植物中
のＡＭＶの複製は、ウエスタンおよびドット（ｄｏｔ）
ブロット分析を介してコートたんぱく質の水準を監視
することによって測定した。感染後１週に、トランスジ
ェニック植物ではウエスタンブロッティングによって背
景の水準の発現のみが検出された。つまり、検出された
発現の水準は、導入されたコートたんぱく質コード配列
の固有の水準と比較できるものであった。一方、対照植
物は相当に高い水準のＡＭＶ コートたんぱく質を含ん
でいた。デンシトメーター スキャンニングによるハイ
ブリダイゼーションのシグナルの量化から、トランスジ
ェニックと形質転換されていない対照のタバコ植物との
間には２１１倍の差が示された。トランスジェニックな
タバコ対照植物は、ＡＭＶ形質転換体の水準より１１０
ないし８１５倍高いＡＭＶ コートたんぱく質の水準に
よって確認された。この結果は、上記のたんぱく質をつ
くるトランスジェニックな植物ではＡＭＶ複製は相当に
低いことを示している。 【０１２３】例７ ポテト ウイルス Ｘ コートたん
ぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成物 ポテト ウイルス Ｘのコートたんぱく質コード配列
（ＰＶＸ ＣＰ）を包含する構成物を、ＴＭＶおよびＡ
ＭＶ構成物の工学的処理に用いた同様の方法を使用して
製造した。ポテックスウイルス群に属するポテト ウイ
ルス Ｘ（ＰＶＸ）は、２×１０6 ダルトンの１本の感
染性のゲノムＲＮＡを含んでいる。ＰＶＸＲＮＡの３′
末端領域をクローニングし、シークエンシングを行っ
た。この領域は、長さが２３７アミノ酸残基のたんぱく
質をコードするコートたんぱく質遺伝子を含む（Ｚａｋ
ｈａｒｙｅｖ ｅｔ ａｌ（１９８４））。 【０１２４】５′末端から最初の１０個のコドンを除い
て、ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を含むｃＤＮＡ複
製物を、ポリアデニル化したＰＶＸ ウイルス ＲＮＡ
から合成した。「クローン ｐ３ａ」と称するｃＤＮＡ
複製物を、文献（Ｚａｋｈａｒｙｅｖ ｅｔ ａｌ（１
９８４））記載のｄＧ．ｄＣ テイリング（ｔａｉｌｉ
ｎｇ）法を介してｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位へクロー
ニングした。遺伝子の５′末端を修復するために、開始
コドン ＡＴＧの直前、および２２コドン後に１８塩基
の真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）５′非コード配列を含む
合成のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ 断片を用いて、ｄＧ．ｄ
Ｃ テイル（ｔａｉｌ）および１１番目から２１番目ま
でのコドンを含むより小さいＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を
置換えた。この遺伝子のｄＧ．ｇＣ テイルと３′末端
のｄＡ．ｄＴ 伸長の部分を、ｐＵＣ１８中でサブクロ
ーニングしたより大きいＨｐａII−ＰｓｔＩ断片のＢａ
ｌ３１消化によって除去し、それから、ＣｌａＩ部位を
リンカー付加によって形成した。ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断
片（約 １７０ｂｐ）を使用して、それぞれ、ｐ３ａ由
来の本来の３′末端配列、および、ｐＢＲ３２２由来の
ＰｓｔＩ−ＣｌａＩ配列を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断
片を置換えた。 【０１２５】最終構成物は、１８ｂｐの５′非コード領
域のｃＤＮＡ、６５７ｂｐのコートたんぱく質配列コー
ド領域（翻訳終結コドンであるＴＡＡを含む）、７２ｂ
ｐの３′非コード領域、および、４０ｂｐのｐＥＭＢＬ
１２（＋）中のｄＡ．ｄＴ伸長を含んでいた（図１４参
照）。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子の配列を図１５
に示す。水平の矢印はｐ３ａ中のＰＶＸ配列の５′境界
を示す。合成ＤＮＡから誘導した領域は配列上部の波線
で示した。構築に用いた制限部位には下線を施した。こ
のシークエンシングデータと文献（Ｚａｋｈａｒｙｅｖ
ｅｔ ａｌ（１９８４））に発表されているデータと
の相違を、配列の下に示す。コードされている新たなア
ミノ酸を本来のものの上に示す。 【０１２６】ＰＶＸ コートたんぱく質の全長さのｃＤ
ＮＡを、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター（ｐＭＯＮ９８
１８）またはｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーター（ｐＭ
ＯＮ９８１８）のいずれかとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端
（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ（１９８５））を用いて、両
方の配向で、ｐＭＯＮ５０５から誘導した発現ベクター
に挿入した。ＰＶＸ コートたんぱく質遺伝子を発現さ
せるために次に示すベクターを作成し、例２に記述した
アグロバクテリウム介在の形質転換系を使用して、タバ
コ植物へ移入した。 【０１２７】（ａ）ｐＭＯＮ９８０９ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１８のＣａＭＶ３５ＳプロモーターとｒｂｃＳ−
Ｅ９３′末端の間に挿入した。 【０１２８】（ｂ）ｐＭＯＮ９８１０ − ＰＶＸコー
トたんぱく質ｃＤＮＡを、意味のない（アンチセンス）
配向で、ｐＭＯＮ９８１８のＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーとｒｂｃＳ−Ｅ９ ３′末端の間に挿入した。 【０１２９】（ｃ）ｐＭＯＮ９８１１ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列の５′断片を、意味のある配向
で、ｐＭＯＮ９８１８に挿入した。 【０１３０】（ｄ）ｐＭＯＮ９８１２ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列の５′断片を、意味のない配向
で、ｐＭＯＮ９８１８に挿入した。 【０１３１】（ｅ）ｐＭＯＮ９８１３ − ＰＶＸコー
トたんぱく質コード配列を、意味のある配向で、ｐＭＯ
Ｎ９８１９のｒｂｃＳ８ＢプロモーターとＥ９ ３′末
端の間に挿入した。 【０１３２】上記に従い、植物にＰＶＸを用いて接種を
行い、ウイルス耐性の水準を測定した。 【０１３３】ＡＭＶのｍＲＮＡと異なり、ポックスウイ
ルスのＲＮＡはポリアデニル化されており、このため
に、オリゴｄＴを第１鎖合成のプライマーとして使用
し、ＤＮＡポリメラーゼまたは鳥骨髄芽球症ウイルス逆
転写酵素を第２鎖合成に使用することが可能になる。こ
の例の始めに詳細に記述したように、２本鎖ＤＮＡの単
離と、植物中でコートたんぱく質配列の発現との操作を
行うことができる。 【０１３４】例８ トマト ゴールデン モザイク ウ
イルス コートたんぱく質コード配列を含むＤＮＡ構成
物 トマト ゴールデン モザイク ウイルス（ＴＧＭＶ）
コートたんぱく質に対するｍＲＮＡの生産を起こすこ
とができるコード配列を含むＤＮＡ構成物を包含するプ
ラスミドを、以下のようにして構築した。プラスミド
ｐＢＨ４０４（Ｂｉｓａｒｏ ｅｔ ａｌ（１９８
２））をＸｈｏIIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コートた
んぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）のコード配列を保有するヌ
クレオチド３１２から１２８５におよぶ約１ｋｂの断片
（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４））を単離
した（図１６参照）。この断片を、ｐＭＯＮ２００をＮ
ｄｅＩを用いて開裂し９００ｂｐのＮｄｅＩ断片を除く
ことにより構築したプラスミドであるｐＭＯＮ５３０に
挿入した。このようにしてｐＭＯＮ５０３を得た。これ
をＨｉｎｄ IIIとＳｍａＩを用いて開裂し、同じくＨｉ
ｎｄ IIIとＳｍａＩを用いて開裂したｐＴＪＳ７５（Ｓ
ｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ（１９
８５））と混合した。ｐＴＪＳ７５の３．８ｋｂのＨｉ
ｎｄ III−ＳｍａＩ断片を含む生成したプラスミドを、
８ｋｂのｐＭＯＮ５０３断片と結合させ、これをとり、
ｐＭＯＮ５０５と命名した。ｐＭＯＮ３１６由来のＣａ
ＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ 発現カセット（図３参照）を、
２．４ｋｂのＳｔｕＩ−ＨｉｎｄIII断片上に単離し、
ＳｔｕＩ−Ｈｉｎｄ IIIを用いて開裂したｐＭＯＮ５０
５ＤＮＡと混合した。 【０１３５】生成のプラスミド ｐＭＯＮ５３０（図１
６参照）をＢｇｌIIを用いて消化し、ＴＧＭＶ コート
たんぱく質コード配列を保有する１ｋｂのＸｈｏII断片
を挿入した。プラスミドは１ｋｂ断片を意味のある配向
で含んでいることを同定された。「ｐＭＯＮ４０１」と
称するこのプラスミドは、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＧＭＶ−
ＣＰ／ＮＯＳ 構成物を保有していた（図１６参照）。
例２に記述される方法と実質的に同じ方法により、タバ
コ植物をｐＭＯＮ４０１を用いて形質転換した。カナマ
イシンに耐性であるこれらの植物の自家受精により、上
に詳述した方法に従ってウイルス耐性を試験できる実生
後代を得た。 【０１３６】例９ ＴＭＶ ＲＮＡに相補的なアンチセ
ンスＲＮＡの発現ベクター コートたんぱく質に関するｍＲＮＡに対して相対的にア
ンチセンスの極性を有するＲＮＡを生産するように、Ｔ
ＭＶ−ＣＰ 遺伝子を中間体プラスミド（ｐＭＯＮ３１
６）に挿入する実験を行った。 【０１３７】図１７に参照されるように、ＴＭＶ コー
トたんぱく質遺伝子を、酵素ＡｈａIII およびＢａｍＨ
Ｉを用いて中間体プラスミド（ｐＴＭ３７）から切取っ
た。この配向においては、ｍＲＮＡをコードする遺伝子
の５′末端はＡｈａIII 部位の近くに位置する。Ａｈａ
III ：ＢａｍＨＩ 断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａＩを用
いて既に消化したプラスミド ｐＵＣ１３に導入した。 【０１３８】コートたんぱく質遺伝子を、ＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩを用いる消化によってｐＵＣ１３から切取っ
た。このＤＮＡ断片を、酵素ＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用
いて制限したｐＭＯＮ３１６（図３参照）に連結した。 【０１３９】この配置においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロ
モーターは、ＴＭＶ コートたんぱく質 ｍＲＮＡに相
補的なＲＮＡを生産する。このＲＮＡは次のものを包含
する（転写体の５′末端から）。 【０１４０】（１）ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターから
誘導した約３０のヌクレオチド （２）ｃＤＮＡの第１鎖の調製に使用したヌクレオチド
プライマーから誘導した約８のヌクレオチド （３）ＴＭＶ ＲＮＡのヌクレオチド （−） ６３９
５ （−） ５７０７ （４）ＮＯＳ ３′末端によって付与された約１５０の
ヌクレオチド この構成物を植物に導入し、それらの植物に例２の記述
に従ってウイルス耐性の試験を行うことができる。 【０１４１】例１０ キューリ モザイク ウイルス
（ＣｕＭＶ） コートたんぱく質遺伝子のクローニング ＲＮＡ ４が豊富であるＣｕＭＶ−Ｄ株（Ｊ．Ｍ．Ｋａ
ｐｅｒ，ＵＳＤＡ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ より入手可能）の大きさに従って分
別したゲノムＲＮＡを、ＣｕＭＶ ＲＮＡ分子当りのＡ
ＭＰ残基の概算値（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｎｕｍｂｅ
ｒ）が約３０になるようにポリアデニル化した。２本鎖
ｃＤＮＡを合成するために、ウイッケンズら（Ｗｉｃｋ
ｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９７８））の方法論を第１鎖ｃ
ＤＮＡの製造に適用した。更に詳しくは、３μｇのポリ
アデニル化ＣｕＭＶ−ＲＮＡ４、１００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１９ｍＭ β−メルカプトエタノール、
１．５μｇ（ｄＴ）15 、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ、
２０μＣｉ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ （３０００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）、および、４８単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．）を含む８０μｌの反応混
合物を、４２℃で９０分間インキュベートした。それか
ら、４μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを反応混合物に加え、
続いてこれをフェノール／クロロホルムで抽出し、その
後、２０μｌの０．５トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
逆抽出した。１／３容の８Ｍ酢酸アンモニウムおよび２
容のエタノールを用いて連続して２回沈澱させることに
より、生成物を遊離のヌクレオチドとして回収した。 【０１４２】上記の反応から得たｃＤＮＡを乾燥させ、
４０μｌの水に再懸濁した。第２鎖合成にはガブラーと
ホフマンの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ
（１９８３））を適用した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ、３０単位のＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）、２０μＣｉ〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ、および、２単
位のＲＮＡｓｅ Ｈ（ＢＲＬ）を、０．１ｍｌの容積中
に含む反応混合物に、４０μｌの水中のｃＤＮＡを加え
た。まず、この反応混合物を１１℃で１時間インキュベ
ートし、その後２２℃で１時間インキュベートした。第
１鎖ｃＤＮＡの合成について記述した同じ方法で、生成
物を回収した。 【０１４３】文献（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ（１９８
５））に開示された方法に従って、２本鎖ｃＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ メチラーゼを用いてメチル化し、リン酸化し
たＥｃｏＲＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）に連結し、ＥｃｏＲＩ酵素で消化し、それ
から、過剰のリンカーから分離した。その後、ｃＤＮＡ
を、試料レーンと接したレーン中に適用した標識ＤＮＡ
と共に、１％アガロースゲル上で電気泳動した。標識を
エチジウム プロミド染色によって可視化し、約９００
〜１３００ｂｐの大きさのｃＤＮＡを含むゲル薄片を切
取った。ｃＤＮＡを電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔ
ｉｏｎ）し、５μｇのグリコーゲン坦体（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）の存在下で沈澱させ、１０μｌの連結反応容積と相
溶性である容積の水中に再懸濁した。それから、ｃＤＮ
Ａを室温で４時間、２０ｎｇのＥｃｏＲＩ消化リン酸化
ｐＥＭＢＬ１２（＋） ＤＮＡに連結させた。その後、
生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ１０１株中に形質転換さ
せた。コロニーを、アンピシリン耐性、並びに、０．６
ｍｇＸ−ＧａｌとＩＰＴＧを用いて広げたプレート上の
白色により選抜した。挿入物の大きさを、ミニプレップ
（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ（１９８２））のＥｃｏＲＩ消化によって決定し
た。 【０１４４】６００ｂｐから１３００ｂｐの範囲にわた
る挿入物を有する１６のコロニーに、ジデオキシシーク
エンシングによって更にスクリーニングを行い、文献
（Ｇｏｕｌｄ ＆ Ｓｙｍｏｎｓ（１９８２））に報告
されているように、Ｘ株のＣＭＶ コートたんぱく質に
対する配列相同性の存在を決定した。最長のクローンを
完全にシークエンシングし、ＣｕＭＶ ＣＰに対する全
長さのｃＤＮＡを得たことを確認した。ＣｕＭＶ コー
トたんぱく質コード配列を、発現ベクター ｐＭＯＮ９
８１８とｐＭＯＮ９８１９（前記の例７を参照）中にク
ローニングすることができる。その後、これらのベクタ
ーを使用して、ＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列
からの意味のある配列と意味のない（アンチセンス）配
列を生産することができる。 【０１４５】次のベクターを構築し、植物に移入させ
た。 【０１４６】ｐＭＯＮ９８１６ − ｐＭＯＮ９８１８
中の意味のある配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コー
ド配列 ｐＭＯＮ９８１７ − ｐＭＯＮ９８１８中の意味のな
い配向のＣｕＭＶ コートたんぱく質コード配列 これらのベクターを例２に従って、アグロバクテリウム
細胞に導入し、生産したトマトおよびタバコ植物に形質
転換させた。上記に従って、これらの植物にＣｕＭＶを
接種し、ウイルス耐性の水準を決定することができる。 【０１４７】例１１ ポテト リーフロール ウイルス
由来のＲＮＡの操作 精製したポテト リーフロール ウイルス（ＰＬＲＶ）
（Ｄｒ．Ｐｅｔａ Ｔｈｏｍａｓ，ＵＳＤＡ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｔａｔｉｏ
ｎ，Ｐｒｏｓｓｅｒ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ から入
手）から、大きさが約６ｋｂの完全なウイルスＲＮＡを
単離した。このＲＮＡを、大腸菌 ポリ（Ａ） ポリメ
ラーゼを用いてポリアデニル化することができる。更
に、上記に従って、ｃＤＮＡの第１鎖をオリゴ ｄＴ
プライミングにより合成できる。その後、ガブラーとホ
フマン（Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８
３））に従い、ＲＮＡｓｅ Ｈの存在下でＤＮＡ ポリ
メラーゼＩを使用することによって、第２のｃＤＮＡ鎖
を合成できる。 【０１４８】上記の例１０に従って、このようにして生
産した２本鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル
化し、ＥｃｏＲＩ リンカーに連結し、それから、Ｅｃ
ｏＲＩで消化したｐＥＭＢＬ１２（＋）に連結すること
ができる。生成のプラスミドを大腸菌ＪＭ １０１（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｉｒａ（１９８２））に形質
転換させ、それによって得た組換体クローンを、トーマ
ス（Ｔｈｏｍａｓ（１９８３））の記述に従い、ＰＬＲ
Ｖにたいする抗体を使用してスクリーニングすることが
できる。ウイルス コートたんぱく質をコードしている
ことが同定されたｃＤＮＡ断片は、成熟コートたんぱく
質のＮＨ2 末端アミノ酸に対するコドンのすぐ隣（ｖｉ
ｓ−ａ−ｖｉｓ ５′末端）に、新たな制限部位および
ＡＴＧ翻訳開始コドンを導入することによって得られ
る。これはゾラーとスミスの方法（Ｚｏｌｌｅｒ ＆
Ｓｍｉｔｈ（１９８２））によって行うことができる。 【０１４９】例１２ カリフラワー モザイク ウイル
ス由来ＤＮＡの操作 カリフラワー モザイク ウイルス（ＣａＭＶ）のコー
トたんぱく質コード配列は、プラスミド ｐＯＳ１（Ｈ
ｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ（１９８１））をＡｃｃＩを
用いて開裂し、ＤＮＡ ポリメラーゼのクレノー断片で
処理し、ＢａｍＨＩで開裂することによって、１．６ｋ
ｂの断片上に単離することができる。プラスミドそのも
のはＤｒ．ロバート シェファード（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒ
ｔ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）から入手でき
る。１．６ｋｂの断片にゲル上で電気泳動による分離を
行った後、ＮＡ−４５膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｅｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いてそれを精
製し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ３１６ ＤＮＡと
混合し、クレノー断片を用いて処理し、ＢｇｌIIを用い
て消化することができる。 【０１５０】リガーゼで処理することによりＣａＭＶ
コートたんぱく質コード配列を含む組換体プラスミドを
得る。このプラスミドを上記に従って使用し、細胞を形
質転換させることができる。意味のある配向のコード配
列を有するプラスミドを保有するそれらの細胞は、Ｈｉ
ｎｄIII を用いるプラスミドＤＮＡの消化により、同定
することができる。つまり、そのようなＤＮＡは、１．
１ｋｂおよび０．７ｋｂのＨｉｎｄIII 断片、並びに、
プラスミドの残りに由来するより大きな断片を示す。そ
れから、正しく配向したＣａＭＶコートたんぱく質コー
ド配列を含むプラスミドＤＮＡをクローニングし、植物
細胞に導入し、それを今度は全植物へ再生することがで
きる。これらの形質転換植物のウイルス耐性は、その
後、既に記述した基本的な方法に従って決定することが
できる。例えば、形質転換したタバコ植物の耐性は、タ
バコに感染するＣａＭＶ Ｗ２６０株、Ｗ２６２株およ
びＷ２８３株（Ｇｒａｃｉａ ＆ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ
（１９８５））を用いる接種によって試験することがで
きる。 【０１５１】例１３ ＭＡＳ（２′）プロモーターによ
って制御されたＴＭＶコートたんぱく質コード配列を有
するＤＮＡ構成物 ＥｃｏＲＩ（２１，６３１）とＣｌａＩ（２０，１３
８）によるオクトピン型ｐＴｉＡ６プラスミド Ｂａｍ
ＨＩ２断片を保有するプラスミド ｐＮＷ３４Ｃ−２−
１（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ（１９８１））か
ら、ＭＡＳ プロモーターを保有するＤＮＡ断片を切取
った。（括弧内の数値は、オクトピン型Ｔｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡ配列のベーカーら（Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ
ａｌ（１９８３ａ））の発表配列から取った開裂部位の
座標である。）生成した１５０３ｂｐの断片を精製し、
ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ開裂ｐＭＯＮ５０５（Ｈｏｒ
ｓｃｈ ＆ Ｋｌｅｅ（１９８６））に挿入して、ｐＭ
ＯＮ７０６を生産した。ＮＯＳ３′末端を、ＢｇｌIIお
よびＢａｍＨＩを用いてｐＭＯ５３０から切取った。２
９８ｂｐのＮＯＳ３′断片を、ｐＭＯＮ７０６のＭＡＳ
プロモーターの３′末端に隣接するＢｇｌII部位に導
入し、ｐＭＯＮ７０７を得た。 【０１５２】生成したｐＭＯＮ７０７中のＭＡＳ プロ
モーター − ＮＯＳ３′ カセットを、ＳｔｕＩとＨ
ｉｎｄIII を用いてｐＭＯＮ７０７を開裂し、それか
ら、ＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ′−ＮＯＳ キメラ カナマイ
シン耐性遺伝子およびＭＡＳプロモーター − ＮＯＳ
３′ カセットを保有する３．２ｋｂの断片を単離する
ことにより、コインテグレート型ベクターに移入した。
この断片を、ｐＭＯＮ２００の７．７ｋｂのＳｔｕＩ−
ｔｏ−ＨｉｎｄIII 断片に付加した。生成のプラスミ
ド、ｐＭＯＮ９７４１はｐＭＯＮ３１６の類似物である
が、ＭＡＳ プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓ プロモー
ターと置換わった発現カセットを含んでいる。 【０１５３】ＴＭＶ−ＣＰコード配列は、例２の記述に
従って、または、アベルら（Ａｂｅｌ ｅｔ ａｌ（１
９８６））が開示するようにＢｇｌIIとＢａｍＨＩを用
いてｐＴＭ３１９ ＤＮＡを消化することによって、得
ることができる。それから、７００ｂｐのＣＰコード断
片をＢｇｌIIを用いて開裂したｐＭＯＮ９７４１に挿入
できる。プロモーターおよびＮＯＳ３′に関して意味の
ある配向でＣＰ挿入物を有するプラスミドは、ＢｇｌII
とＥｃｏＲＩを用いてプラスミド ＤＮＡを消化し、Ｍ
ＡＳプロモーターを１．５ｋｂの断片上に、更に、ＣＰ
コード配列を７００ｂｐの断片上に放出させることによ
り、同定できる。生成のプラスミドをＡ．タメファシエ
ンスに交配させ、ＭＡＳ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ３′構
成物を保有するＡ．タメファシエンス細胞を、上記に従
って、形質転換したタバコ植物およびトマト植物を得る
ために使用できる。既に記述した方法で、形質転換した
植物のウイルス耐性を試験することができる。 【０１５４】例１４ エレクトロポーレーション技術を
使用する遊離ＤＮＡベクターによる植物細胞の形質転換 以下の説明により、ウイルス病耐性を得るために、プラ
スミドＤＮＡを外膜を除去した種々の植物細胞（プロト
プラスト）に効果的に導入するアグロバクテリウムに基
づかない遊離のＤＮＡ受渡し（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）法を
概説する。 【０１５５】Ａ．双子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 ダイズ［Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＧＭ）］、ペチュニ
ア［Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ
（ＭＰ４）］およびニンジン［Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔ
ａ（ＴＣ）］由来の細胞培養をウィドホルム（Ｗｉｄｈ
ｏｌｍ（１９７７））に従い、ＴＣおよびＧＭに対して
は０．４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、あるいは、ＭＰ４に対
しては０．２ｍｇ／ｌのρ−クロロフェノキシ酢酸を含
む５０ｍｌのＭＳ培養基（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓ
ｋｏｏｇ（１９６２））中で、旋回振とう器上の２５０
ｍｌエルレンマイヤー フラスコ（１３５ｒｐｍ、２７
°〜２８℃）中に成長させた。 【０１５６】１０ｍｌパック（ｐａｃｋｅｄ）細胞容積
の対数成長している懸濁培養細胞を、１０％マンニトー
ルと０．１％ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ（ｐＨ５．７）とに
溶解した酵素４０ｍｌ中で１２時間インキュベートする
ことにより、ＧＭおよびＴＣ由来のプロトプラストを、
それぞれ生産した。酵素混合物は、２％セルラーゼＲ−
１０（Ｋｉｎｋｉ Ｙａｋｕｌｔ，Ｎｉｓｈｉｎｏｍｉ
ｙａ，Ｊａｐａｎ）、０．１％マセロザイム（Ｍａｃｅ
ｒｏｚｙｍｅ）Ｒ−１０（Ｋｉｎｋｉ Ｙａｋｕｌ
ｔ）、および、０．５％ペクトラヤーゼ（Ｐｅｃｔｏｌ
ａｙａｚｅ） Ｙ−２３（Ｓｅｉｓｈｉｎ Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｎｏｄａ，
Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）を含んでいた。生成のプロト
プラストは、ハウプトマンとウィンドホルム（Ｈａｕｐ
ｔｍａｎ ＆ Ｗｉｎｄｈｏｌｍ（１９８４））の開示
に従って、単離、精製および培養した。 【０１５７】ＭＰ４由来のメゾフィル（ｍｅｓｏｐｈｙ
ｌｌ） プロトプラストを、使用した酵素混合物が懸濁
培養に用いたものと同一だった以外はフレーリーら（Ｆ
ｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ（１９８４））の開示に従っ
て、単離し培養した。 【０１５８】Ｂ．単子葉類の種におけるプロトプラスト
の単離および培養 コムギ［Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔ
Ｍ）およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｔｉｕｕｍ（Ｔ
Ａ）、Ｍａｄｄｏｃｋら（１９８３）およびＯｚｉａｓ
−ＡｋｉｎｓとＶａｓｉｌ（１９８３）により開示］、
エレファント グラス［Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒ
ｐｕｒｅｕｍ（ＰＰ）、Ｖａｓｉｌら（１９８３）およ
びＫａｒｌｓｓｏｎとＶａｓｉｌ（１９８６）により開
示］、ギニアグラス ［Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｘｉｍｕ
ｍ（ＰＭ）、ＬｕとＶａｓｉｌ（１９８１）およびＫａ
ｒｌｓｓｏｎとＶａｓｉｌ（１９８６）により開示］、
イネ［Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＯＳ）、Ｈｅｙｓｅ
ｒら（１９８３）およびＹａｍａｄａら（１９８６）に
より開示］、コーン［Ｚｅａ ｍａｙｓ（ＺＭ）、Ｍｅ
ａｄｏｗｓ（１９８２）により開示］、サトウキビ［Ｓ
ａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ（ＳＣ）、
ＨｏとＶａｓｉｌ（１９８３）およびＳｒｉｎｉｖａｓ
ｉｎとＶａｓｉｌ（１９８５）により開示］、および、
ペニセタム アメリカナム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ａ
ｍｅｒｉｃａｎｕｍ）とＰ．プルプレウム（Ｐ．ｐｕｒ
ｐｕｒｅｕｍ）およびＰ．スクアマラタム（Ｐ．ｓｑｕ
ａｍｕｌａｔｕｍ）の間の複交雑（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒ
ｏｓｓ）トリスペシフィック（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ）ハイブリッド（ＰＡＰＳ）［ＤｕｊａｒｄｉｎとＨ
ａｎｎａ（１９８４）により開示］から単子葉類の細胞
を採取した。ＰＭおよびＰＡＰＳの懸濁培養を、５％コ
コナット ミルクおよび２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含む
変形ＭＳ培地（Ｖａｓｉｌ ＆ Ｖａｓｉｌ（１９８
１））中で成長させた。一方、ＳＣ培養に対して使用し
たＭＳ培地は、更に５００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解
物を含んでいた。ＴＭ懸濁培養は、ダディッツら（Ｄｕ
ｄｉｔｓ ｅｔａｌ（１９７７））に従って、脂質培地
中で成長させた。他の単子葉類の細胞培養は、それぞれ
上に引用した文献に従って成長させた。週に２度継代培
養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）したＴＭとＰＡＰＳを除
き、全ての懸濁培養は、３５ｍｌの培地中に２〜８ｍｌ
の接種物を用いて、７日の継代培養で成長させた。プロ
トプラスト単離に先だって、４〜５日目に、懸濁を２５
〜３５ｍｌの培地中に５〜８ｍｌの接種物を用いて継代
培養した。 【０１５９】それぞれの単子葉類細胞型に関するプロト
プラストを、バジルら（Ｖａｓｉｌｅｔ ａｌ（１９８
３））の開示に従い、３ｍＭ ＭＥＳ、０．４５Ｍマン
ニトール、７ｍＭ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、および、
０．７ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4ＯＨ（ｐＨ５．６）に溶解
した種々の酵素混合物を使用して、単離した。酵素混合
物は、ＴＭおよびＰＭに対しては、１．０％セルラーゼ
ＲＳ（ＫｉｎｋｉＹａｋｕｌｔ）と０．８％ペクチナ
ーゼ（Ｓｉｇｍａ）を；ＳＣに対しては、２％セルラー
ゼ ＲＳと０．７％ペクチナーゼを；ＰＰに対しては、
３％セルラーゼ Ｒ−１０と０．７％ペクチナーゼを；
ＰＡＰＳに対しては、２．５％セルラーゼ Ｒ−１０と
０．７５％ペクチナーゼを含んでいた。 【０１６０】それから、単離した単子葉類プロトプラス
トを、カオとミカイルク（Ｋａｏ＆ Ｍｉｃｈａｙｌｕ
ｋ（１９７５））により変形された８ｐ培地（Ｖａｓｉ
ｌ＆ Ｖａｓｉｌ（１９８０））中で培養した。この培
養基は、０．４〜０．５Ｍグルコース、０．５〜１．０
ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄおよび０．２ｍｇ／ｌゼアチンを
含んでいた。これを１週間後にプロトプラスト培養基を
用いて１：２．３に希釈した。ＰＡＰＳおよびＴＭのコ
ロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ）を測定するために、２〜３週間後に、２ｍｌの元の
プロトプラスト培養と等価な量を、０．４％のシープラ
ーク（Ｓｅａｐｌａｑｕｅ） アガロース（ＦＭＣ）を
用いて３６ｍｌに希釈した。それから、希釈した培養の
３ｍｌを、１０ｃｍペトリ皿の０．６％アガロースを含
む同じ培地の層上にプレートした。 【０１６１】Ｃ．エレクトロポーレーションによる遊離
ＤＮＡ受渡し カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの存在
下で、ジンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）細胞融合系
（ＧＣＡ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）、または、キャパシタ
− ディスチャージ バンク（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ
（１９８５））を用いて、プロトプラストにエレクトロ
ポーレーションを行った。ジンマーマン細胞融合系を用
いるエレクトロポーレーションは、ジンマーマン ヘリ
カルフュージョン チャンバー中で、または、ポッター
ら（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８４））の方法に
従ってキュベットと白金またはアルミニウム箔から構成
されたエレクトロポーレーション室中で行った。パルス
（直流２４０Ｖ）を、それぞれ９のパルスからなるパ
ルス列として９９９．９μｓｅｃで与えた。それぞれの
パルス列を、プロトプラスト洗浄溶液中、５０μｇの子
ウシ胸線ＤＮＡを伴ってまたはそれを伴わずに１４μｇ
のプラスミド ＤＮＡの存在下で、１回、１０回、５０
回および１００回与えた。 【０１６２】キャパシター バンクは、１個の１００μ
Ｆキャパシターと１個の２４００μＦキャパシター（Ｍ
ａｌｌｏｒｙ）と共に、それぞれ４０、１１０、２４
０、３４０μＦのキャパシターの４個を含むように構成
した。キャパシターは個々にまたは平行に充電と放電を
行うことができた。パルス放電は、２重チャンネル記録
オシロスコープ（Ｔｅｃｔｒｏｎｉｃｓ モデル ５８
４Ａ）を使用して監視した。アンペア数はエレクトロポ
ーレーションの間に１個の１オーム抵抗にかかる放電を
測定することによって決定した。 【０１６３】エレクトロポーレーションに先だって、プ
ロトプラストを、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、および、０．２Ｍマン
ニトール（ｐＨ７．２）中で１度洗浄し、それから、同
じ緩衝液（Ｆｒｏｍｍ ｅｔａｌ（１９８５））を用い
て約３×１０6 プロトプラスト／ｍｌの密度にした。１
ｍｌの再懸濁プロトプラストに２０ｍｌのプラスミド
ＤＮＡを加え、混合した。このプロトプラストに種々の
電圧と容量でエレクトロポーレーションを行った。プロ
トプラストは氷上に約１０分間保ち、その後、液体培養
基中でのプレーティングを行った。 【０１６４】種々のエレクトロポーレーション処理によ
って細胞溶解された双子葉類プロトプラストの数を評価
するために、パルス放電を与える前および直後にＴＣプ
ロトプラストの密度を測定した。測定値は残存割合で表
わした。生存率測定は、エレクトロポーレーションの２
日後のフェノサフラニン（ｐｈｅｎｏｓａｆｒａｎｉ
ｎ）染料排除（Ｗｉｄｈｏｌｍ（１９７２））を基礎に
した。結果はエレクトロポーレーションを行っていない
対照と比較したパーセント生存率で表わした。エレクト
ロポーレーションを行った双子葉類プロトプラストのコ
ロニー形成率評価は、培養の３〜４週後に形成されたコ
ロニー数を数えることによって得た。これを、エレクト
ロポーレーションを行っていない対照の割合として表わ
した。 【０１６５】形質転換したコロニーは、フロムら（Ｆｒ
ｏｍｍ ｅｔ ａｌ（１９８６））の開示に従い、カナ
マイシンを含む培地に移した後に選抜した。同様にし
て、工学的に処理したウイルス コートたんぱく質とカ
ナマイシン選抜可能標識とを含むｐＭＯＮ３１９、ｐＭ
ＯＮ４０１、ｐＭＯＮ９８００、ｐＭＯＮ９８０９、お
よび、ｐＭＯＮ９８１６などのプラスミドを遊離ＤＮＡ
形質転換に使用することができる。再生植物は、例２に
記述した方法を使用して、コートたんぱく質ｍＲＮＡと
たんぱく質生産とを監視することができる。 【０１６６】参照文献 ・アベルら、サイエンス、１９８６年 ２３２巻 ７３
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ｅｍ．２５９： ６１８− ２７（１９８４）］
【図面の簡単な説明】
【図１】ウイルス病耐性生物試験の概略図である。
【図２】ダイズ モザイク ウイルス コートたんぱく
質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列図である。 【図３】ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成
物を含む植物形質転換ベクター図である。 【図４】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターを含む発現ベク
ター図である。 【図５】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター、マルチリンカ
ーおよびノパリン シンターゼ断片の完全配列図であ
る。 【図６】トランスジェニックなタバコ植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。 【図７】トランスジェニックなトマト植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。 【図８】ウイルス耐性の比較のデータ図である。 【図９】交叉免疫の導入のデータ図である。 【図１０】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の
単離と中間体ベクターへの導入を示す系統図である。 【図１１】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌ
クレオチド配列図である。 【図１２】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターをｓｓＲＵＢ
ＩＳＣＯ プロモーターに置換したＤＮＡ構成物の製造
の系統図である。 【図１３】アルファルファ モザイク ウイルスのコー
トたんぱく質（ＡＭＶ ＣＰ）をコードするｃＤＮＡの
製造の系統図である。 【図１４】ポテト ウイルス Ｘ のコートたんぱく質
遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクターの製造の系
統図である。 【図１５】ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列図で
ある。 【図１６】トマト ゴールデン モザイク ウイルス
コートたんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）をコードするヌク
レオチド断片の単離の系統図である。 【図１７】ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチセンス相補体
をコードするＤＮＡを含む植物ベクターの製造の系統図
である。
質（ＳＭＶ ＣＰ）の部分アミノ酸配列図である。 【図３】ＣａＭＶ３５Ｓ／ＴＭＶ−ＣＰ／ＮＯＳ 構成
物を含む植物形質転換ベクター図である。 【図４】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターを含む発現ベク
ター図である。 【図５】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター、マルチリンカ
ーおよびノパリン シンターゼ断片の完全配列図であ
る。 【図６】トランスジェニックなタバコ植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。 【図７】トランスジェニックなトマト植物に対する異な
る水準のウイルス接触の効果のデータ図である。 【図８】ウイルス耐性の比較のデータ図である。 【図９】交叉免疫の導入のデータ図である。 【図１０】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの最初の
単離と中間体ベクターへの導入を示す系統図である。 【図１１】ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ プロモーターの部分ヌ
クレオチド配列図である。 【図１２】ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターをｓｓＲＵＢ
ＩＳＣＯ プロモーターに置換したＤＮＡ構成物の製造
の系統図である。 【図１３】アルファルファ モザイク ウイルスのコー
トたんぱく質（ＡＭＶ ＣＰ）をコードするｃＤＮＡの
製造の系統図である。 【図１４】ポテト ウイルス Ｘ のコートたんぱく質
遺伝子（ＰＶＸ ＣＰ）を含む植物ベクターの製造の系
統図である。 【図１５】ＰＶＸ ＣＰ遺伝子のヌクレオチド配列図で
ある。 【図１６】トマト ゴールデン モザイク ウイルス
コートたんぱく質（ＴＧＭＶ ＣＰ）をコードするヌク
レオチド断片の単離の系統図である。 【図１７】ＴＭＶ ＲＮＡに対するアンチセンス相補体
をコードするＤＮＡを含む植物ベクターの製造の系統図
である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
前置審査
(72)発明者 ロジャー・エヌ・ビーチイ
アメリカ合衆国、ミズーリ州 63124、
ラデュー、ゴッドウイン・レーン 17
(72)発明者 ロバート・テイー・フラレイ
アメリカ合衆国、ミズーリ州 63131、
セント・ルイス、トッピング・エステー
ツ 12917
(72)発明者 ステイーブン・ジー・ロジャース
アメリカ合衆国、ミズーリ州 63017、
チェスターフィールド、テインバーブル
ッフ・ドライブ 14788
(56)参考文献 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．２
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ｇ．）ｐ．４−５
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Ｖｏｌ．３（1984）ｐ．2197−2205
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．112
（1981）ｐ．678−685
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A01H 1/00
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（１）（ａ）植物細胞中で機能してｍＲＮＡポリヌ
クレオチドの生産を起こすプロモーターと、 （ｂ）植物ウイルスのコートたんぱく質をコードする配
列を有するＤＮＡポリヌクレオチドと、 （ｃ）植物細胞中で機能して該ｍＲＮＡポリヌクレオチ
ドの３´末端へのポリアデニレートの付加を起こす３´
非翻訳領域と、 を包含する、植物内で発現したときにウイルス感染に対
する抵抗性を生じるＤＮＡを植物細胞のゲノムに挿入
し、形質転換させ、該植物細胞から植物を再生すること
により、該ＤＮＡを含有する種子、胎芽または植物を準
備し、 （２）この種子、胎芽または植物を栽培し、かつ （３）この栽培によってウイルス耐性植物を得ることを
包含するウイルス耐性双子葉植物の生産方法において、 該植物ウイルスが、タバコ モザイク、ダイズ モザイ
ク及び キューリ モザイクからなる群から選ばれるも
のであるウイルス耐性双子葉植物の生産方法。 ２．ウイルス耐性の植物とウイルス耐性である第2の植
物とを少なくともいくらかの交雑後代が該ウイルス耐性
を示すように交雑を行うことによってウイルス耐性の植
物を繁殖させる特許請求の範囲第1項記載の方法。 ３．該ＤＮＡが植物の全身感染を引き起こすことができ
ず、植物ウイルスの病原性を抑制し得る特許請求の範囲
第１項記載の方法。
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