ES2444001T3 - Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de conferir resistencia fúngica a una planta, en el que el procedimiento comprendetransformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo el polinucleótidoheterólogo: (a) una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen depatogenicidad fúngica; y (b) una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido; en el que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse paraformar una región bicatenaria; en el que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menosaproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gende patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.

Description

Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas
5 [0001]
CAMPO DE LA INVENCIÓN ............................................................................................................. 4 RESUMEN DE LA INVENCIÓN ........................................................................................................ 6 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ...................................................................................... 7
10 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS............................................................................... 8 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN E INVENCIÓN............................................. 11
Definiciones .......................................................................................................................... 11 Homología de genes de patogenicidad de la plaga.............................................................. 15
15 Vectores ............................................................................................................................... 17 Plantas huésped................................................................................................................... 17 Tipos de células huésped..................................................................................................... 18 Plagas .................................................................................................................................. 19 Tabla 1 Plagas – Bacterias .................................................................................................. 19
20 Tabla 2 Plagas – Mildius ...................................................................................................... 20 Tabla 3 Plagas - Nematodos parasíticos.............................................................................. 22 Tabla 4 Plagas – Fúngicos ................................................................................................... 23 Tabla 5 Plagas – Royas ....................................................................................................... 23 Genes de patogenicidad de la plaga.................................................................................... 24
25 Tabla 6 Plagas, genes de patogenicidad de plagas y plantas huésped............................... 25 Secuencias sentido (y antisentido) ....................................................................................... 25 Procedimientos de transformación ....................................................................................... 26 Ruta de polinización............................................................................................................. 27 Tecnología de Agrobacterium .............................................................................................. 27
30 Bombardeo con microproyectiles ......................................................................................... 28 Electroporación .................................................................................................................... 30 Vectores virales.................................................................................................................... 30 Genes marcadores............................................................................................................... 31 Marcadores de selección ..................................................................................................... 31
35 Marcadores cribables........................................................................................................... 32 Naturaleza de las cadenas de genes marcadores ............................................................... 33 Tabla 7 Polinucleótidos heterólogos..................................................................................... 34 Elementos promotores y reguladores................................................................................... 36 Terminador ........................................................................................................................... 37
40 Regeneración y propagación de plantas.............................................................................. 37 Apilamiento de genes........................................................................................................... 38 Despatogénesis.................................................................................................................... 39 Ejemplos .............................................................................................................................. 40 Ejemplo 1. Estrategia de clonación ................................................................................. 40
45 Ejemplo 2. Construcción del plásmido intermedio pVZA1 ............................................. 40 Ejemplo 3. Construcción de los plásmidos pVZA2, pVZA3, pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400 plásmidos ........................................................................................ 40 Ejemplo 4. Procedimientos de transformación ............................................................... 42 Ejemplo 5. Transformación de tabaco con pVZA100 y regeneración............................ 42
50 Ejemplo 6. Transformación fúngica y protocolos de selección ..................................... 42 Ejemplo 7. Transformación de maíz, sojas y patata........................................................ 43 Ejemplo 8. Extracción de ADN y de ARN de tejidos de planta y fúngicos y protocolos de PCR y RT/PCR ............................................................................................ 43 Ejemplo 9. Detección de ARNip en tejidos de planta y fúngicos ................................... 44
55 Ejemplo 10. Tinción de GUS de tejidos de planta y fúngicos ........................................ 44 Ejemplo 11. Pruebas de inoculación de plantas con hongos ........................................ 45 Ejemplo 12. Caracterización molecular de plantas de tabaco resistentes a P. nicotianae .................................................................................................................... 45 Tabla 8. Detección y expresión de genes en plantas de tabaco
transgénicas y naturales ...................................................................................................... 46 Ejemplo 13. Transformación fúngica y caracterización.................................................. 46 Tabla 9. Detección y expresión de genes en Phytophthora nicotianae transgénica y natural............................................................................................................ 47 5 Ejemplo 14. Demonstración del silenciamiento de genes en tabaco por detección de ARNip ............................................................................................................................. 48 Ejemplo 15. Secuencias de cutinasa de Phytophthora altamente homólogas útiles en el presente documento....................................................................................... 49 Tabla 10. Las secuencias de nucleótidos de los genes cutinasa de 25 cepas aisladas 10 que comprenden 9 especies de Phytophthora..................................................................... 49
Ejemplo 16. La resistencia intergenérica en tabaco se confirió por el silenciamiento del gen de P. nicotianae a una enfermedad producida por una Peronospora tabacina........................................................................................................ 55 Tabla 11. Reacciones de diferentes genotipos de tabaco a una epidemia natural de 15 moho azul del tabaco producida por Peronospora tabacina en el invernadero.................... 55
Tabla 12. Relación taxonómica entre Phytophthora nicotianae y Peronospora tabacina ....................................................................................................... 56
Ejemplo 17. Sojas transformadas y hechas resistentes con construcciones de silenciamiento de genes de Phytophthora . ............................................................... 56 20 Ejemplo 18 Patatas transformadas y hechas resistentes a Phytophthora infestans .. 57 Ejemplo 19. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo ARN de (Phialophora gregata) ........................................................................................................ 57 Ejemplo 20. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo (marcador de ADN de genotipo B de Phialophora gregata).............................................................. 57 25 Ejemplo 21. Sojas se hacen resistentes a podredumbre del tallo y de la raíz (cutinasa de Phytophthora sojae) ..................................................................................... 57 Ejemplo 22. Sojas se hacen resistentes a la enfermedad del moho blanco (subunidad de ARN polimerasa de Sclerotinia sclerotiorum) ........................................ 57 Ejemplo 23. Sojas se hacen resistentes a la enfermedad del moho blanco 30 (transportador de hexosa de Sclerotinia sclerotiorum) .................................................. 58 Ejemplo 24. Sojas se hacen resistentes a síndrome de muerte súbita (cutinasa de Fusarium solani pisi) .................................................................................................... 58 Ejemplo 25. Sojas se hacen resistentes a la roya asiática (homólogo de cutinasa de Phakopsora pachyrhizi) ................................................................................ 58 35 Ejemplo 26. Sojas se hacen resistentes a la roya asiática (ADNr de Phakopsora pachyrhizi) .......................................................................................................................... 58 Ejemplo 27. Prueba de tabaco, soja, patata y maíz para transgénesis, resistencia a Phytophthora spp. y resistencia a áfidos ..................................................................... 58
40 Tabaco ...................................................................................................................... 58 pVZA100 en soja....................................................................................................... 59 pVZA100 en patata ................................................................................................... 59 pVZA100 en maíz ..................................................................................................... 59 pVZA200 en patata ................................................................................................... 59 45 pVZA300 en patata ................................................................................................... 60 pVZA300 en sojas..................................................................................................... 60 pVZA400 en sojas..................................................................................................... 61 pVZA400 en patata ................................................................................................... 61
50 Ejemplo 28. Patata se hace resistente a la podredumbre del tubérculo (factor de elongación 1 alfa de la traducción de Fusarium sambucinum) ..................................... 61 Ejemplo 29. Tomate se hace resistente al tizón tardío (gen elicitina de Phytophthora infestans).................................................................................................... 61 Ejemplo 30. Colza se hace resistente a la podredumbre del tallo (subunidad de 55 ARN polimerasa de Sclerotinia sclerotiorum) ................................................................. 62 Ejemplo 31. Algodón se hace resistente al marchitamiento del algodón (homólogo de cutinasa de Fusarium solani pisi) ............................................................ 62 Ejemplo 32. Maíz se hace resistente a micotoxinas (cutinasa de F. solani pisi) .......... 62 Ejemplo 33. Maíz se hace resistente a la podredumbre del tallo (ADNr de
Stenocarpella maydis) ....................................................................................................... 62 Ejemplo 34. Maíz se hace resistente al tizón de las hojas (ADNr 18S de Cercospora zeae-maydis) ....................................................................................................................... 62 Ejemplo 35. Patata se hace resistente al áfido del melocotón verde (catepsina B 5 proteasa de Myzus persicae)............................................................................................. 62 Ejemplo 36. Patata se hace resistente al escarabajo de la patata de Colorado (cisteína proteasa de Leptimotarsa decemlineata) ......................................................... 62 Ejemplo 37. Patata se hace resistente al marchitamiento por Verticillium (ADNr de V. dahliae) ........................................................................................................... 63 10 Ejemplo 38. Sojas se hacen resistentes a mildiu (ADNr de Peronospora berteroae) ............................................................................................................................ 63 Ejemplo 39. Patata se hace resistente al nematodo de los nodos de la raíz de la patata (citocromo oxidasa II de Meloidogyne chitwoodi) ............................................... 63 Ejemplo 40. Sojas se hacen resistentes a infestación por nematodos (genes de 15 ARN ribosómico de Pratylenchus scribneri y Heterodera glycines) ............................. 63 Ejemplo 41. Diversas plantas se hacen resistentes a infección por diversas Phytophthora spp. (cutinasa de Phytophthora nicotianae) ............................................ 64 Ejemplo 42. Pita se hace resistente a la podredumbre de la raíz de la pita (cutinasa de Fusarium solani pisi) .................................................................................................... 64 20 Ejemplo 43. Arroz se hace resistente al añublo (ARN polimerasa II de Magnaporthe grisea) ......................................................................................................... 64 Ejemplo 44. Diversas plantas se hacen resistentes a enfermedad de la raíz inducida por Phytophthora (cutinasa de Phytophthora citricola).................................. 65 Ejemplo 45. Cebada se hace resistente a la roya de las hojas de la cebada (ARN 25 ribosómico 18S de Puccinia hordei)................................................................................. 65 Ejemplo 46. Cebada se hace resistente a mildiu (ADNr de Pseudoperonospora humuli) ................................................................................................................................ 65 Ejemplo 47. Cebada se hace resistente a la enfermedad del moho gris (citocromo P450 monoxigenasa de Botrytis cinerea) ........................................................................ 65 30 Ejemplo 48. Tomate se hace resistente a la enfermedad de moteado del tomate (ADNr de Pseudomonas syringae) ....................................................................... 65 Ejemplo 49. Tomate se hace resistente al marchitamiento bacteriano (gen Cel A de Clavibacter michiganense michiganense) .............................................................. 65 Ejemplo 50. Maíz se hace resistente al marchitamiento y tizón bacteriano de 35 Goss (gen endo l-glucosidasa de Clavibacter michiganense) ...................................... 65 Ejemplo 51. Un procedimiento de construcción de silenciamiento para proteger sojas contra una o dos enfermedades fúngicas ............................................................. 66 Ejemplo 52. Un procedimiento de construcción de silenciamiento policistrónico para proteger sojas contra tres enfermedades fúngicas ................................................ 66 40 Ejemplo 53. Despatogénesis de especies de Phytophthora alimentando sobre plantas transgénicas o por transformación directa con pVZA100, pVZA300 o pVZA400 .............................................................................................................................. 66 Ejemplo 54. Despatogénesis: Sandía transformada con un polinucleótido heterólogo de silenciamiento de cutinasa (cutinasa de F. oxysporum) ........................ 66 45 Ejemplo 55. Amplia resistencia de plantas y despatogénesis con polinucleótidos heterólogos de silenciamiento de ARN ribosómico ............................ 67 Tabla 13. Secuencias de GenBank de ADN ribosómico que producen alineamientos significativos con especies diana ............................................................ 68 Ejemplo 56. Control de múltiples plagas de plantas usando múltiples 50 polinucleótidos heterólogos de silenciamiento .............................................................. 68
REIVINDICACIONES .................................................................................................................... 118 Resumen ....................................................................................................................................... 135
55 [0002] La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE.UU. nº de serie 60/621.542 presentada el 21 de octubre de 2004 y la solicitud provisional de EE.UU. nº de serie 60/657.821 presentada el 1 de marzo de 2005.
CAMPO DE LA INVENCIÓN [0003] Plagas de plantas (por ejemplo, patógenos fúngicos, bacterias, nematodos, insectos, virus, etc.) producen grandes pérdidas de alimento y fibra en todo el mundo, especialmente en países desarrollados. Las pérdidas incluyen producción directa o pérdidas antes de la recolección, pérdidas después de la recolección y
5 durante el almacenamiento, y la diminución de la calidad y seguridad alimentaria (por ejemplo, por producción de micotoxinas).
Otras pérdidas resultantes de plagas de plantas se observan en plantas valiosas por propiedades estéticas, olfativas
o ecológicas.
10 [0004] Las plagas de plantas pueden algunas veces controlarse por la aplicación de productos químicos (por ejemplo, fungicidas, insecticidas, nematicidas, parasiticidas), manipulación o gestión del microentorno o por genes para resistencia al patógeno.
15 [0005] El descubrimiento e introducción de un “nuevo” gen para resistencia frecuentemente produce el desarrollo o selección de una nueva raza de patógeno capaz de infectar plantas que contienen ese “nuevo” gen. Esto se ha demostrado por las royas y hollines de cultivos de cereales, pero también se produce con enfermedades transmitidas por la tierra tales como chancro del tabaco y podredumbre de la raíz y del tallo de la soja, producida por Phytophthora nicotianae y P. sojae, respectivamente. Hay al menos dos razas de P. nicotianae y más 70 razas de P.
20 sojae, requiriendo todos diferentes genes o combinaciones de genes para la resistencia a enfermedad.
[0006] El género fúngico Phytophthora comprende muchas especies de patógenos muy destructores queproducen graves enfermedades de las plantas. Éstas incluyen tizones, podredumbres, chancros, podredumbres de los frutos, podredumbres de las raíces, marchitamientos, y muchos otros síntomas que afectan una amplia variedad
25 de cultivos de alimento, fibra y aceite que incluyen aguacate, cacao, colza, cítrico, pimiento, patata, soja, tabaco, tomate, piña, caucho, robles, etc.
[0007] En la década pasada, el fenómeno del silenciamiento de genes o interferencia por ARN (iARN) se describió y caracterizó en organismos tan diversos como plantas, hongos, nematodos, hidras y seres humanos 30 (Zamore y Haley, 2005). Se considera que es un mecanismo de defensa antiguo en el que el organismo huésped reconoce como extraña una molécula de ARN bicatenario y la hidroliza. Los productos de hidrólisis resultantes son pequeños fragmentos de ARN de 21-30 nucleótidos de longitud, llamados ARN interferentes pequeños (ARNip). Entonces, los ARNip difunden o son llevados por todo el huésped, donde se hibridan con el ARNm para ese gen específico y producen su hidrólisis para producir más ARNip. Este procedimiento se repite cada vez que el ARNip se
35 hibrida con su ARN homólogo, previniendo eficazmente que el ARNm sea traducido, y “silenciando” así la expresión de ese gen específico.
[0008] Fire y col. (2003) describen un procedimiento de administrar ARN a un huésped en el que el ARN está compuesto por secuencias sentido y antisentido homólogas a un gen de esa célula huésped para silenciar ese gen
40 de célula huésped. Documento US 6.506.559.
[0009] Los resultados por van West y col. (1999) demostraron el silenciamiento de genes internuclear en Phytophthora infestans. Transformaron P. infestans con el gen infl elicitina en tanto las orientaciones sentido como antisentido. Esto produjo el silenciamiento de ambos transgenes, además del gen endógeno. Por fusión somática de
45 una cepa transgénica silenciada y una cepa natural, demostraron dos puntos esenciales; primero, que la propia presencia del transgén no es necesaria para mantener el estado silenciado; y segundo, la participación de un factor de acción trans puede transferir la señal de silenciamiento entre núcleos, posteriormente se encontró que eran los ARNip.
50 [0010] Waterhouse y col. (documento WO9953050A1) han descrito procedimientos de conferir resistencia viral a una planta transformando la planta con una construcción de silenciamiento de genes dirigida hacia un gen viral de la planta.
[0011] Wang y col. (documento US20030180945A1) describen un procedimiento de silenciamiento de genes 55 en un hongo proveyendo al hongo de una construcción de silenciamiento de genes dirigida hacia un gen fúngico.
[0012] Lo que se necesita en la materia es un procedimiento de resistencia de plantas que se sea fácilmente adaptable a cambios en el entorno biológico tales como una nueva y grave enfermedad de la planta. Por ejemplo, no hubo manifestaciones de la roya asiática en la soja en los EE.UU. hasta en noviembre de 2004. Se predice que la
roya asiática produjo pérdidas estimadas a 1 a 7 billones de dólares (USDA) en 2005-2006.
[0013] La materia también avanzaría sustancialmente si existiera un procedimiento genético versátil de conferir resistencia a una planta contra un espectro de hongos, insectos, nematodos, bacterias, etc. 5 [0014] El documento WO 01/96584 describe materiales y procedimientos para el control de nematodos.
[0015] El documento WO 00/68374 describe la regulación de la expresión génica viral.
10 RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0016] La invención se define por las reivindicaciones.
RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN
15 [0017] La memoria descriptiva describe un procedimiento y construcciones para conferir resistencia a plagas a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
20 (a) una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga, y
(b) una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido;
en el que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que 25 comprende nucleótidos codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido;
en el que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y
30 en el que la secuencia antisentido es homóloga al gen de patogenicidad de al menos dos plagas de diferentes especies por lo que la planta es resistente a dichas dos plagas con respecto a sustancialmente la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
[0018] La memoria descriptiva describe un procedimiento y construcciones para conferir resistencia a plagas a 35 una planta que comprende una etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a) una primera secuencia antisentido que tiene homología con un primer gen de patogenicidad de la plaga; 40 (b) una segunda secuencia antisentido que tiene homología con un segundo gen de patogenicidad de la plaga;
(c)
una primera secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha primera secuencia antisentido; y
(d)
un segundo secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha segunda secuencia antisentido,
45 en el que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos codificados por la primera secuencia antisentido y la primera secuencia sentido,
en el que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que 50 comprende nucleótidos codificados por la segunda secuencia antisentido y la segunda secuencia sentido, y
en el que dicha primera y segunda secuencias sentido y dicha primera y segunda secuencias antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.
55 [0019] Por consiguiente, una planta pueden ahora hacerse resistente a una pluralidad de plagas que pertenecen al mismo miembro o a diferentes miembros seleccionados del grupo que consiste en insectos, bacterias, hongos, plantas y nematodos.
[0020] La memoria descriptiva describe un procedimiento y construcciones para conferir resistencia a plagas a una planta que comprende una etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a) un primer promotor operativamente ligado a una secuencia antisentido en el que dicha secuencia antisentido es 5 homóloga a un gen de patogenicidad de la plaga y operativamente ligado a un terminador,
(b) un segundo promotor operativamente ligado a una secuencia sentido en el que dicha secuencia sentido es sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido y operativamente ligado a un terminador,
10 en el que dicho segundo promotor es un promotor fuerte con respecto al primer promotor,
en el que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria entre secuencias codificadas por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
15 en el que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.
[0021] La memoria descriptiva describe un procedimiento y construcciones para conferir resistencia a plagas a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, 20 comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga, y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido,
25 en el que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
en el que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de 30 longitud,
en el que la plaga está seleccionada del grupo que consiste en insectos, bacterias, hongos y nematodos, y
en el que el gen de patogenicidad de la plaga y la plaga están seleccionados de aquellos enseñados en el presente 35 documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0022]
40 La Figura 1 es el mapa genético del plásmido de transformación de plantas pCAMBIA1201 usado como un ejemplo en toda esta enseñanza y que es el esqueleto de pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400.
La Figura 2 es un dibujo del inserto en el plásmido intermedio pVZA1.
45 La Figura 3 es el casete de silenciamiento pVZA100 clonado en el plásmido pVZA3 y listo para la transferencia a pCAMBIA1201.
La Figura 4 es autorradiogramas que muestran el ARNip aislado de tabaco transgénico y de Phytophthora 50 nicotianae transgénica. Las Figuras 4A y 4B muestran los resultados de hibridación de la sonda del gen cutinasa con ARNip de plantas de tabaco naturales y transgénicas y P. nicotianae, respectivamente.
La Figura 5 muestra reacciones de plantas a una epidemia natural de la enfermedad del moho azul del tabaco producida por Peronospora tabacina en el invernadero. Los números en las fotografías se refieren a las diferentes 55 clasificaciones de enfermedad como se exponen en la Tabla II.
Las Figuras 6A-6D muestran brotes que emergen de embriones de soja transgénica.
La Figura 7 muestra los resultados de soja transformada con pVZA100. La Fig 7A muestra callos de soja transformada. La Fig 7B muestran genes GUS e higromicina fosfotransferasa detectados en el callo de soja transformado.
La Figura 8 muestra raíces y minitubérculos producidos en las placas de cultivo de células de patata transformadas 5 con pVZA100.
La Figura 9 muestra una construcción de silenciamiento de genes policistrónicos que puede silenciar genes esenciales en tres especies fúngicas causando graves enfermedades de sojas.
10 La Figura 10 muestra construcciones de silenciamiento de genes basadas en ADNr y que pueden silenciar estos genes esenciales en Phytophthora, en Phakopsora y en ambas especies.
La Figura 11 muestra una planta de tabaco natural (A) y una planta de tabaco transgénica pVZA100 (B), susceptible y resistente a Phytophthora nicotianae, respectivamente.
15 La Figura 12 es un autorradiograma que muestra el ARNip aislado de una planta de tabaco transgénica (3) y de Phytophthora nicotianae que crece en una planta de tabaco transgénica silenciada (4). El carril 1 muestra los oligonucleótidos de 35 nt VZA 3F (SEQ ID NO: 3) y VZA 4R (SEQ ID NO: 4) que sirven de control de tamaño molecular. El carril 2 muestra el ARN mensajero de 620 nt del hongo natural. El carril 3 muestra el ARNip de una
20 planta de tabaco transgénica silenciada. El carril 4 muestra el ARNip del hongo no patógeno aislado del tabaco transgénico resistente.
La Figura 13 muestra plantas de soja transgénicas resistentes a Phytophthora sojae.
25 La Figura 14 muestra los efectos de pVZA300 y pVZA400 sobre el crecimiento y desarrollo de Phytophthora nicotianae y Phytophthora sojae transgénicas. El examen microscópico de cultivos de P. nicotianae y P. sojae bombardeados con pCAMBIA1201, pVZA100 y pVZA200 indicó que todas crecen normalmente como las naturales y sin malformaciones visuales (FIG. 14A). Se observaron resultados similares para cultivos de P. nicotianae reaislado de tabaco natural infectado o tabaco transformado con pVZA100. Sin embargo, aquellos cultivos de P. nicotianae
30 bombardeados con pVZA300 o pVZA400 (FIGS. 14B, C, D) y aquellos de P. sojae también bombardeados con pVZA300 o pVZA400 (FIGS. 14E, F) crecieron muy lentamente, sus hifas estuvieron gravemente malformadas, y algunos cultivos murieron.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS 35
[0023] SEQ ID NO: 1 es el cebador de PCR VZA I F como se usa según la invención objeto.
40 SEQ ID NO: 2 es el cebador de PCR VZA 2R como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO: 3 es el cebador de PCR VZA 3F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO: 4 es el cebador de PCR VZA 4R como se usa según la invención objeto.
45 SEQ ID NO: 5 es la construcción de silenciamiento pVZA100 usada según la invención objeto. SEQ ID NO: 6 es la construcción de silenciamiento pVZA200 usada según la invención objeto. 50 SEQ ID NO: 7 es la construcción de silenciamiento pVZA300 usada según la invención objeto. SEQ ID NO: 8 es la construcción de silenciamiento pVZA400 usada según la invención objeto. SEQ ID NO: 9 es el cebador de PCR directo GUS como se usa según la invención objeto. 55
SEQ ID NO: 10 es el cebador de PCR de PCR inverso GUS como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO: 11 es el cebador de PCR pVZA100 e higromicina fosfotrasferasa como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO: 12 es el cebador de PCR pVZA100 e higromicina fosfotrasferasa como se usa según la invención objeto. 5 SEQ ID NO. 13 es el cebador VZA 1 65R como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 14 es el cebador VZA 2 69F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 15 es el cebador VZA 3 73F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 16 es el cebador VZA 3 73F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 17 es el cebador VZA 1 65 como se usa según la invención objeto.
15 SEQ ID NO. 18 es el cebador VZA 6 70F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 19 es el cebador de PCR VZA 7 72F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 20 es el cebador de PCR VZA 8 79F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 21 es el cebador de PCR VZA 9 84F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 22 es el cebador de PCR VZA 10 87F como se usa según la invención objeto.
25 SEQ ID NO. 23 es el cebador de PCR VZA 11 89F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 24 es el cebador de PCR VZA 12 90F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 25 es el cebador de PCR VZA 13 91F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 26 es el cebador de PCR VZA 14 81F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 27 es el cebador de PCR VZA 15 82F como se usa según la invención objeto.
35 SEQ ID NO. 28 es el cebador de PCR VZA 6 83F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 29 es el cebador de PCR VZA 17 85F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 30 es el cebador de PCR VZA 18 86F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 31 es el cebador de PCR VZA 19 64R como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 32 es el cebador de PCR VZA 20 77F como se usa según la invención objeto.
45 SEQ ID NO. 33 es el cebador de PCR VZA 21 63F como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 34 es el cebador de PCR VZA 22 66R como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 35 es el cebador de PCR VZA 23 80F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 36 es el cebador de PCR VZA 24 92F como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 37 es el cebador de PCR VZA 25 93F como se usa según la invención objeto.
55 SEQ ID NO. 38 es el cebador de PCR VZA 2R como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 39 es el cebador de PCR catepsina como se usa según la invención objeto. SEQ ID NO. 40 es el cebador de PCR elicitina como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 41 es el cebador de PCR FP de ADNr como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 42 es el cebador de PCR RP de ADNr como se usa según la invención objeto.
5 SEQ ID NO. 43 es el gen ARN ribosómico (ADNr) de Phialophora gregata marcador como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 44 es el gen ARN ribosómico (ADNr) de Phialophora gregata marcador de ADN de genotipo B como se 10 usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 45 es el gen rpb2 parcial de Sclerotinia sclerotiorum de la subunidad de polimerasa II para ARN como se usa según la invención objeto.
15 SEQ ID NO. 46 es el gen ARN ribosómico 18S de Puccinia hordei como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 47 es el gen transportador de hexosa (hxt2) de Sclerotinia sclerotiorum como se usa según la invención objeto.
20 SEQ ID NO. 48 es ARNm de cutinasa de Fusarium solani pisi como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 49 es el genoma o motivo de proteína conservado de Phytophthora nicotianae como se usa según la invención objeto.
25 SEQ ID NO. 50 es una secuencia de ADN ribosómico encontrada en el genoma de Phakopsora pachyrhizi como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 51 es un factor de elongación 1 alfa de la traducción de Fusarium sambucinum como se usa según la invención objeto.
30 SEQ ID NO. 52 es una secuencia del gen elicitina encontrada en el genoma de Phytophthora infestans como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 53 es un gen rpb2 parcial para la subunidad de ARN polimerasa II de Sclerotinia sclerotiorum como se 35 usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 54 es ARNr de Stenocarpella maydis como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 55 es el ARN ribosómico 18S de un grupo II de Cercospora zeae-maydis como se usa según la 40 invención objeto.
SEQ ID NO. 56 es catepsina B proteasa de Myzus persicae como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 57 es cisteína proteasa de Leptinotarsa decemlineata como se usa según la invención objeto. 45 SEQ ID NO. 58 es ADNr de Verticillium dahliae como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 59 es la secuencia parcial de ARN ribosómico 5.8S encontrada en el genoma de Peronospora berteroae como se usa según la invención objeto.
50 SEQ ID NO. 60 es una subunidad de genoma de citocromo oxidasa de Meloidogyne chitwoodi como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 61 es ARN ribosómico de P. scribneri como se usa según la invención objeto. 55 SEQ ID NO. 62 es ARN ribosómico de Heterodera glycines como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 63 es secuencia de ARN polimerasa II de Magnaporthe grisea como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 64 es ARNr 18S de Puccinia hordei como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 65 es la secuencia parcial de ARN ribosómico 5.8S de Pseudoperonospora humuli como se usa según la invención objeto. 5 SEQ ID NO. 66 es citocromo P450 monoxigenasa de Botrytis cinerea como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 67 es ARNr de Pseudomonas syingae como se usa según la invención objeto.
10 SEQ ID NO. 68 es el gen Cel A de Clavibacter michiganense michiganense como se usa según la invención objeto.
SEQ ID NO. 69 es el gen endo B-glucosidasa de Clavibacter michiganense como se usa según la invención objeto.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN E INVENCIÓN 15
Definiciones
[0024] Como se usa en el presente documento, se aplican las siguientes definiciones:
20 Célula (o célula de planta huésped) significa una célula o protoplasto de una célula de planta e incluye células aisladas y células en una planta completa, órgano de planta, o fragmento de una planta. También incluye células no aisladas.
[0025] Región bicatenaria significa una región de un polinucleótido en el que los nucleótidos pueden enlazarse
25 por hidrógeno entre sí. Tal enlace de hidrógeno puede ser intramolecular o intermolecular (por ejemplo, unidad de transcripción individual que forma una región bicatenaria con la llamada horquilla o dos unidades de transcripción que se alinean apropiadamente para secuencias complementarias con enlace de hidrógeno). Para ser una región bicatenaria, según la presente invención, es necesario que el 100 % de los nucleótidos sean complementario y estén unidos por hidrógeno dentro de una región. Es simplemente necesario dar al ARN un carácter bicatenario sustancial
30 (por ejemplo, un punto de fusión indicativo) para que se produzca el apareamiento suficiente de bases.
[0026] Gen exógeno significa un gen que normalmente no está presente en un genoma del huésped dado en la presente forma. A este respecto, el propio gen puede ser nativo para el genoma del huésped, sin embargo el gen exógeno comprenderá el gen nativo alterado mediante la adición o deleción de uno o más elementos reguladores
35 diferentes o genes adicionales.
[0027] Gen o genes significa secuencias de ácidos nucleicos (que incluyen tanto ARN como ADN) que codifican información genética para la síntesis de un ARN completo, una proteína completa, o cualquier porción funcional de tal ARN completo o proteína completa, suficiente para poseer una característica deseada.
40 [0028] Polinucleótido heterólogo significa cualquier polinucleótido que no se encuentra en una planta huésped no transformada. Un polinucleótido no se excluye de ser un polinucleótido heterólogo por la presencia de secuencias de polinucleótidos endógenos.
45 [0029] Homólogo, en el contexto de la relación entre la secuencia antisentido y un gen de patogenicidad de la plaga (es decir, la hebra de ADN que se une a ARN polimerasa y dirige la transcripción del ARNm de gen de patogenicidad de la plaga que está en la hebra antisentido), significa que tienen similitud de secuencias suficiente para permitir la hibridación in vivo, in vitro y/o ex vivo bajo condiciones de baja rigurosidad entre la secuencia antisentido y el ARNm de gen de patogenicidad de la plaga.
50 [0030] Resistencia de células de planta huésped significa que una planta es menos susceptible a los efectos perjudiciales de una plaga de plantas cuando se compara con una célula de planta huésped no transformada con dicha construcción.
55 [0031] Inhibición de la expresión génica significa una disminución en el nivel de proteína y/o producto de ARNm de un gen diana. Las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse por examen de las propiedades externas de la célula u organismo (como se presenta más adelante en los ejemplos) o por técnicas bioquímicas tales como hibridación en disolución de ARN, protección de nucleasas, hibridación de Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR por transcripción inversa (RT) transcripción inversa (RT/PCR), monitorización de la expresión génica con una micromatriz, unión a anticuerpos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos, y análisis de células activado por fluorescencia (FACS).
5 [0032] Gen marcador significa un gen que confiere un fenotipo distinto a una célula que expresa el gen marcador y así permite que tales células transformadas se distingan de células que no contienen el gen.
[0033] Operativamente ligado significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionado y orientado para la transcripción que va a iniciarse desde un promotor.
10 [0034] Gen de patogenicidad de la plaga significa cualquier gen de plaga que cumple una función en tales efectos perjudiciales de la plaga sobre una planta huésped. Efectos perjudiciales significa, a modo de ejemplo, un efecto negativo sobre el crecimiento (números y/o tamaño de la planta), desarrollo, calidad y/o reproducción de la planta. A modo de ejemplo solo, un gen de patogenicidad de la plaga puede ser uno que cumple una función en
15 cualquiera de crecimiento, desarrollo, replicación y/o reproducción de plagas, o invasión o infección por la plaga de la planta huésped.
[0035] Patógeno, en referencia a una plaga, significa la capacidad de una plaga para producir efectos perjudiciales sobre una planta. La patogenicidad es aumentada por algunos genes de patogenicidad de la plaga.
20 [0036] Plaga de planta significa cualquier organismo vivo que es perjudicial para el crecimiento de la planta (números y/o tamaño de la planta), desarrollo, calidad, rendimiento y/o reproducción. Ejemplos no limitantes de tales plagas son insectos, hongos, nematodos, bacterias y virus.
25 [0037] La calidad significa cualquier aspecto de una planta que puede considerarse deseable. A modo de ejemplo no limitante, la calidad puede referirse al aspecto de una planta, rendimiento, sabor, valor nutritivo, aroma o contenido.
[0038] Sustancialmente complementario, con respecto a las secuencias sentido y antisentido, significa 30 suficientemente complementario para permitir la formación de una molécula bicatenaria.
[0039] Transformación significa un procedimiento de introducción de una secuencia de ADN exógeno (por ejemplo, un vector, una molécula de ADN recombinante) en una célula o protoplasto en el que ese ADN exógeno se incorpora en un cromosoma o puede replicarse autónomamente de un modo de forma que se transcriba un ARN
35 heterólogo.
[0040] Transcrito significa ARN codificado por ADN. En el contexto de transcritos sentido y antisentido de la presente invención, tales transcritos sentido y antisentido pueden ser parte del mismo polinucleótido o pueden ser 2 polinucleótidos separados (es decir, cada uno que tiene su propio extremo 5' y 3').
40 [0041] Tratar una plaga de plantas significa un procedimiento para reducir, eliminar, invertir o prevenir los efectos perjudiciales de una plaga de plantas sobre la planta.
[0042] Vector significa una molécula de ADN que puede replicarse en una célula huésped y/o con la que otro 45 segmento de ADN puede estar operativamente ligada de manera que se provoque la replicación del segmento unido. Un plásmido es un vector a modo de ejemplo.
[0043] Subyaciendo las diversas divulgaciones de la presente memoria descriptiva está tratar una planta para conferir resistencia a plagas transformando una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo que 50 comprende:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga, y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido;
55 en el que dichas secuencias sentido y antisentido pueden hibridarse entre sí para formar una región bicatenaria y en el que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud.
[0044] Sin desear quedar ligado a teoría, se cree que las plantas transformadas según la presente invención transcriben una molécula(s) de ARN con una región homóloga a y una región complementaria al gen de patogenicidad de la plaga, y en las que el (los) transcrito(s) forma(n) una molécula ARN bicatenario (ARNbc). La planta reconoce el ARNbc como una posible sustancia extraña (por ejemplo, una sustancia de origen viral). La 5 enzima dicer de la planta corta el ARN bicatenario en trozos de ARN monocatenario de aproximadamente 23 nucleótidos de longitud, llamado ARN interferente pequeño (ARNip). Estos ARNip son consumidos invadiendo plagas que han entrado en la planta mediante la digestión de células de plantas (por ejemplo, cutina). Una vez absorbido, el ARNip puede incorporarse en los complejos de silenciamiento inducidos por el ARN de la plaga (RISC). El complejo RISC puede entonces digerir el ARNm del gen homólogo de la plaga limitando la capacidad de la plaga
10 para dañar la planta.
[0045] En una divulgación, la resistencia a plagas se confiere a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga, y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido, en la que un transcrito del
polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos 20 codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
en la que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud,
25 en la que dicho gen de patogenicidad de la plaga está seleccionado del grupo que consiste en cutinasas, cinasas, ARN ribosómicos, adhesinas, elicitinas y proteínas G; y en la que dicha plaga es un hongo.
[0046] En una divulgación, la resistencia a plagas se confiere a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido 30 heterólogo:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga; y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido, en la que un transcrito del
35 polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
en la que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud,
40 en la que dicho gen de patogenicidad de la plaga está seleccionado del grupo que consiste en cinasas, ARN ribosómicos, proteínas G, factores de muda de la piel, serina proteasas, cisteína proteasas y esterasas de la hormona juvenil; y
45 en la que dicha plaga es un insecto.
[0047] En una divulgación, la resistencia a plagas se confiere a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga; y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido,
55 en la que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
en la que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud;
en la que dicho gen de patogenicidad de la plaga está seleccionado del grupo que consiste en cinasas, ARN ribosómicos, proteínas G, proteínas de colágeno de la cutícula y catepsina proteasas, y
5 en la que dicha plaga es un nematodo.
[0048] En una divulgación, la resistencia a plagas se confiere a una planta que comprende la etapa de transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo dicho polinucleótido heterólogo:
(a)
una secuencia antisentido que tiene homología con un gen de patogenicidad de la plaga; y
(b)
una secuencia sentido sustancialmente complementaria a dicha secuencia antisentido
15 en la que un transcrito del polinucleótido heterólogo puede hibridarse para formar una región bicatenaria que comprende nucleótidos codificados por la secuencia antisentido y la secuencia sentido,
en la que dichas secuencias sentido y antisentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud,
20 en la que dicho gen de patogenicidad de la plaga está seleccionado del grupo que consiste en cutinasas, enzimas de maceración, cinasas, ARN ribosómicos, adhesinas y proteínas G; y
en la que dicha plaga es una bacteria.
25 [0049] En una realización, la planta huésped es una soja y la plaga es un miembro seleccionado del grupo que consiste en Fusarium solani (por ejemplo, muerte súbita), Sclerotinia sclerotiorum (por ejemplo, moho blanco), Phialophora gregata (por ejemplo, podredumbre parda del tallo), Phakopsora pachyrhizi (por ejemplo, roya asiática) y Phytophthora sojae (por ejemplo, podredumbre de la raíz y del tallo).
30 [0050] En una realización, la planta huésped es una planta crucífera y la plaga es Alubgo (por ejemplo, roya blanca).
[0051] En una realización, la planta huésped es tabaco y la plaga es Phytophthora (por ejemplo, podredumbre 35 del tallo, podredumbre de la raíz).
[0052] En una realización, la planta huésped es patata y la plaga es Phytophthora (por ejemplo, tizón tardío).
[0053] En una realización, la planta huésped es brócoli y la es Pythium (por ejemplo, podredumbre).
40 [0054] En una realización, la planta huésped es guisante y/o remolacha azucarera y la plaga es Aphanomyces (por ejemplo, podredumbre de la raíz).
[0055] En una realización, la planta huésped es tabaco y la plaga es Peronospora (por ejemplo, moho azul).
45 [0056] Se ha descubierto adicionalmente que el silenciamiento de genes en la plaga según la presente divulgación puede conferirse con la progenie de la plaga -progenie que nunca había tenido contacto directo con la planta huésped transformada.
50 [0057] En una divulgación, la memoria descriptiva describe además la etapa de cultivar una plaga con la célula de planta huésped transformada.
[0058] En una divulgación, una célula de planta huésped transformada de la presente invención se cocultiva con una plaga.
55 [0059] Opcionalmente, la progenie de la plaga es menos patógena para una célula de planta distinta de la célula de planta huésped transformada.
[0060] En una vez divulgación, una planta regenerada de una célula de planta huésped transformada según la presente invención se cultiva en tierra contaminada con una plaga
[0061] En otra divulgación, una planta regenerada de una célula de planta huésped transformada según la presente invención se cultiva en tierra en riesgo de ser contaminada con una plaga
5 [0062] En otra divulgación, una plaga se co-cultiva con una planta regenerada de una célula de planta huésped transformada según la presente invención y luego se cultiva en tierra contaminada con una plaga.
[0063] En otra divulgación, una plaga se co-cultiva con una planta regenerada de una célula de planta 10 huésped transformada según la presente invención y luego se cultiva en tierra en riesgo de ser contaminada con una plaga.
[0064] En una divulgación, una plaga se co-cultiva con la planta transformada y luego se cultiva en tierra en riesgo de ser contaminada con una plaga. 15
Homología de genes de patogenicidad de la plaga
[0065] Se ha descubierto adicionalmente que el silenciamiento de genes según la presente invención puede conferir resistencia a una variedad sorprendentemente amplia de plagas y que la identidad exacta entre una región 20 de la secuencia sentido y el gen infeccioso de plaga no se requiere para que la presente invención sea eficaz.
[0066] En una realización de la presente invención, el gen de patogenicidad de la plaga es un gen que proporciona resistencia cruzada. Un gen de plaga tal se conserva dentro del filo de la plaga de forma que cuando se use con la presente invención, una planta se haga resistente a una pluralidad de miembros del filo de la plaga (es 25 decir, resistencia cruzada). Además, genes de patogenicidad de la plaga pueden elegirse según la presente invención por análisis de homología bioinformática como es conocido para aquellos expertos en la materia para proporcionar resistencia cruzada que es resistencia a especies cruzadas, a géneros cruzados, a familias cruzadas o a órdenes cruzados. Por ejemplo, como será evidente de los ejemplos en el presente documento, un gen cutinasa es útil en plantas para conferir resistencia a una pluralidad de especies de hongos. El gen para ADNr es útil en las 30 plagas de la presente invención (es decir, nematodos de hongos). Otros ejemplos no limitantes de tales genes conservados son cinasas, adhesiones, proteínas G, elicitinas, enzimas de maceración, ADN y ARN polimerasas, factores de elongación, factores de muda de la piel, serina proteasas, cisteína proteasas, esterasa de la hormona juvenil, proteínas de colágeno de la cutícula y catepsina proteasas y otros expuestos más adelante. En otra realización, un gen de patogenicidad de la plaga está seleccionado por carecer de suficiente homología con un gen
35 de planta para producir efectos perjudiciales del polinucleótido heterólogo sobre la planta huésped (por ejemplo, prevenir el silenciamiento de un gen de planta). Por ejemplo, en una realización, la homología entre la secuencia antisentido y el gen de patogenicidad de la plaga es inferior a aproximadamente el 70 %.
[0067] En una realización, la secuencia antisentido es homóloga al gen de patogenicidad de la plaga al menos 40 aproximadamente el 70 %.
[0068] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 75 %.
[0069] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 80 %. 45 [0070] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 85 %.
[0071] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 90 %.
50 [0072] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 95 %.
[0073] En una realización, un transcrito de la secuencia sentido es homólogo a un transcrito del gen de patogenicidad de la plaga (por ejemplo, ARNm de gen de patogenicidad de la plaga) al menos aproximadamente el 70 %.
55 [0074] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 75 %.
[0075] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 80 %.
[0076] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 85 %.
[0077] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 90 %.
5 [0078] Opcionalmente, la homología es al menos aproximadamente el 95 %.
[0079] La homología anteriormente mencionada puede extenderse opcionalmente sobre un estiramiento de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, o al menos aproximadamente 25 nucleótidos, o al menos aproximadamente 50 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100 nucleótidos.
10 [0080] Opcionalmente, la homología puede demostrarse entre la secuencia antisentido y el gen de patogenicidad de la plaga (es decir, la hebra de ADN que se une a ARN polimerasa y dirige la transcripción del ARNm de gen de patogenicidad de la plaga) en cualquiera de al menos tres formas.
15 (1) hibridación entre la secuencia antisentido y la región correspondiente de la hebra sentido del gen de plaga.
(2) hibridación entre el transcrito antisentido y la región correspondiente del gen de patogenicidad de la plaga.
(3) hibridación entre un transcrito de un ADN complementario a la secuencia antisentido (es decir, ADNc antisentido) 20 y una región correspondiente del ARNm de gen de patogenicidad de la plaga.
[0081] La hibridación, como se expone anteriormente, puede demostrarse en condiciones de baja rigurosidad. Opcionalmente, las condiciones son unas de rigurosidad de moderada a alta por técnicas muy conocidas en la técnica, como se describen, por ejemplo, en Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, Nueva
25 York, NY, pág. 169-170.
[0082] Ejemplos de condiciones de rigurosidad de moderada a alta se proporcionan en el presente documento. Específicamente, la hibridación de ADN inmovilizado sobre transferencias Northern con sondas específicas de gen marcadas con 32P se realiza usando procedimientos convencionales (Maniatis y col.). En general, 30 la hibridación y lavados posteriores se llevan a cabo bajo condiciones de rigurosidad de moderada a alta que permiten la detección de secuencias diana con homología con secuencias ejemplificadas en el presente documento. Para sondas de genes de ADN bicatenario, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 20-25 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6X SSPE, 5X disolución de Denhardt, 0,1 % de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula de Beltz y col. (1983):
35 Tm=81,5 ºC+16,6 Log[Na+]+0,41(% de G+C)-0,61(% de formamida)-600/longitud del dúplex en pares de bases.
[0083] Los lavados se llevan a cabo normalmente del siguiente modo:
(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1X SSPE, 0,1 % de SDS (lavado de baja rigurosidad). 40
(2) Una vez a Tm -20 ºC durante 15 minutos en 0,2X SSPE, 0,1 % de SDS (lavado de rigurosidad moderada).
[0084] Para sondas de oligonucleótidos, la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 10-20 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6X SSPE, 5X disolución de Denhardt, 0,1 % de SDS, 0,1 mg/ml de 45 ADN desnaturalizado. Tm para las sondas de oligonucleótidos se determinó por la siguiente fórmula de Suggs y col. (1981): Tm (ºC)=2(número de pares de bases T/A) +4(número de pares de bases G/C).
[0085] Los lavados se llevan a cabo normalmente del siguiente modo:
50 (1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1X SSPE, 0,1 % de SDS (lavado de baja rigurosidad).
(2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1X SSPE, 0,1 % de SDS (lavado de rigurosidad moderada).
55 [0086] En general, la sal y/o temperatura pueden alterarse para cambiar la rigurosidad. Con un fragmento de ADN marcado de más de aproximadamente 70 bases en longitud o así pueden usarse las siguientes condiciones:
Baja: 1 o 2X SSPE, temperatura ambiente Baja: 1 o 2X SSPE, 42 ºC
Moderada: 0,2X o 1X SSPE, 65 ºC Alta: 0,1 X SSPE, 65 ºC.
[0087] La formación y estabilidad del dúplex dependen de la complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido, y, como se observa anteriormente, puede tolerarse un cierto grado de desapareamiento. Por tanto, secuencias de polinucleótidos útiles en la invención objeto incluyen mutaciones (tanto únicas como múltiples),
5 deleciones e inserciones en las secuencias descritas, y combinaciones de las mismas, en las que dichas mutaciones, inserciones y deleciones permiten la formación de híbridos estables con un polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones y deleciones pueden producirse en una secuencia de polinucleótidos dada usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Otros procedimientos pueden llegar a conocerse en el futuro.
10 [0088] Las variantes mutacionales, insercionales y delecionales de las secuencias de polinucleótidos de la invención pueden usarse del mismo modo que las secuencias ejemplificadas de polinucleótidos, mientras que las variantes tengan similitud de secuencias sustancial con la secuencia original. Como se usa en el presente documento, similitud de secuencias sustancial se refiere al grado de similitud de nucleótidos que es suficiente para
15 permitir que el polinucleótido de variante funcione en la misma capacidad que la secuencia original. Preferentemente, esta similitud es superior al 75 %; más preferentemente, esta similitud es superior al 90 %; y lo más preferentemente, esta similitud es superior al 95 %. El grado de similitud necesario para que la variante funcione en su capacidad prevista dependerá del uso previsto de la secuencia. Está perfectamente dentro de la experiencia de un experto cualificado en esta materia hacer mutaciones mutacionales, insercionales y delecionales
20 que se diseñan para mejorar la función de la secuencia o de otro modo proporcionar una ventaja metodológica.
Vectores
[0089] Aquellos expertos en la materia son muy capaces de construir vectores de la presente invención
25 (incluyendo aquellos basados en ADN desnudo) y diseñar protocolos para la expresión génica recombinante. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tales técnicas y protocolos aplicables para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Protocols in Molecular
30 Biology, segunda edición, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992.
[0090] Procedimientos y vectores específicos previamente usados con amplio éxito en plantas se describen por Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721), y Guerineau y Mullineaux, (1993). Plant transformation and expression vectors. En: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed). Oxford, BIOS Scientific Publishers, pág 121
35 148.
[0091] Los vectores según la presente invención pueden proporcionarse aislados y/o purificados (es decir, de su entorno natural), en forma sustancialmente pura o homogénea, o libre o sustancialmente libre de otro ácido nucleico. El ácido nucleico según la presente invención puede ser completamente o parcialmente sintético.
Plantas huésped
[0092] La presente invención puede usarse para la transformación de cualquier planta, que incluye, pero no se limita a, maíz (Zea mays), colza (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza 45 sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Cofea ssp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guava
50 (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidental), nueces de macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolachas azucareras (Beta vulgaris), avena, cebada, verduras, plantas ornamentales y coníferas.
[0093] Opcionalmente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y
55 leguminosas, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, yuca, cebada, guisante, y otros cultivos de raíz, tubérculo o semilla. Cultivos de semilla importantes para la presente invención son colza oleaginosa, remolacha azucarera, maíz, girasol, soja y sorgo. Plantas hortícolas a las que puede aplicarse la presente invención pueden incluir lechuga, endivia, y la verdura brassicas que incluyen col, brócoli y coliflor, y claveles, geranios, petunias y begonias. La presente invención puede aplicarse a tabaco, cucurbitáceas, zanahoria, fresa, girasol, tomate, pimiento, crisantemo, álamo, eucalipto y piña.
5 [0094] Opcionalmente, las plantas de la presente invención incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc.
[0095] Opcionalmente, las plantas de la presente invención incluyen plantas de semilla de aceite. Las plantas de semilla de aceite incluyen colza, algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc.
10 [0096] Opcionalmente, las plantas de la presente invención incluyen plantas leguminosas. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarroba, fenogreco, soja, judías comunes, judía carilla, fríjol de oro, alubia de Lima, haba, lentejas, garbanzo, etc.
15 [0097] Plantas huésped útiles en la presente invención son cultivos en hilera y cultivos de difusión. Ejemplos no limitantes de cultivos en hilera útiles son maíz, sojas, algodón, amaranto, verduras, arroz, sorgo, trigo, milo, cebada, girasol, trigo duro y avena.
[0098] Ejemplos no limitantes de cultivos de difusión útiles son girasol, mijo, arroz, sorgo, trigo, milo, cebada, 20 trigo duro y avena.
[0099] Plantas huésped útiles en la presente invención son monocotiledóneas y dicotiledóneas.
[0100] Ejemplos no limitantes de monocotiledóneas útiles son arroz, maíz, trigo, palmera, hierbas de césped, 25 cebada y avena.
[0101] Ejemplos no limitantes de dicotiledóneas útiles son soja, algodón, alfalfa, colza, lino, tomate, remolacha azucarera, girasol, patata, tabaco, maíz, trigo, arroz, lechuga, apio, pepino, zanahoria, coliflor, vid y hierbas de césped.
30 [0102] Plantas huésped útiles en la presente invención incluyen plantas cultivadas para beneficios estéticos u olfativos. Ejemplos no limitantes incluyen plantas en flor, árboles, céspedes, plantas esciófilas y plantas ornamentales en flor y no en flor.
35 [0103] Plantas huésped útiles en la presente invención incluyen plantas cultivadas para valor nutritivo.
Tipos de células huésped
[0104] Un experto en la materia reconocerá la amplia variedad de células huésped que pueden ponerse en
40 contacto con los polinucleótidos heterólogos según la presente invención. Ejemplos no limitantes de tales células son aquellas en tejido embriogénico, tejido de callo tipos I, II y III, hipocótilo, meristemo, tejido de raíz, tejidos para la expresión en floema, y similares.
[0105] Las células vegetales huésped pueden opcionalmente enriquecerse en células con un mayor potencial
45 para transformarse y/o un mayor potencial para regenerar plantas maduras. La selección manual de células vegetales huésped, por ejemplo, seleccionando células embriogénicas de la superficie de un callo tipo II, es un medio que pueden usarse para enriquecer células vegetales huésped antes de cultivar (tanto cultivadas sobre medios sólidos como en suspensión). Opcionalmente, las células pueden seleccionarse de aquellas localizadas en la superficie de una agrupación de células, y pueden adicionalmente ser identificables por su falta de diferenciación,
50 su tamaño y citoplasmo denso. En una realización, las células vegetales huésped están menos diferenciadas, o todavía no se han comprometido a la diferenciación. Así, en una realización, las células se identifican y se seleccionan de aquellas células que son citoplásmicamente densas, relativamente sin vacuolar con una alta relación núcleo a citoplasma (por ejemplo, determinado por observaciones citológicas), de tamaño pequeño (por ejemplo, 1020 µm), y capaces de divisiones sostenidas y formación de proembriones somáticos.
55 [0106] Opcionalmente, las células vegetales huésped se identifican mediante el uso de colorantes, tales como azul de Evan, que son excluidos por células con membranas relativamente no permeables tales como células embriogénicas, y captados por células relativamente diferenciadas tales como células similares a raíz y células de serpiente (así llamadas debido a su aspecto similar a serpiente).
[0107] Opcionalmente, las células vegetales huésped se identifican mediante el uso de marcadores de isozimas de células embriogénicas, tales como glutamato deshidrogenasa, que puede detectarse por tinciones citoquímicas (Fransz y col., 1989). Un experto en la materia reconocerá que los marcadores de isozimas tales como
5 glutamato deshidrogenasa pueden conducir a algún grado de positivos falsos de células no embriogénicas tales como células de raíz que sin embargo tienen una actividad metabólica relativamente alta.
[0108] Casi todos los tejidos de planta pueden transformarse durante la desdiferenciación usando técnicas apropiadas descritas en el presente documento. Las dianas de células receptoras incluyen, pero no se limitan a,
10 mericitoblastos, callo tipo I, tipo II y tipo III, embriones inmaduros y células gaméticas tales como microesporas, polen, esperma y óvulos. Se contempla que cualquier célula a partir de la cual pueda regenerarse una planta fértil es útil como célula receptora. El callo tipo I, tipo II y tipo III pueden iniciarse a partir de fuentes de tejido que incluyen, pero no se limitan a, embriones inmaduros, inflorescencias inmaduras, meristemos apicales de planta de semillero, microesporas, y similares.
15 [0109] Aquellas células que pueden proliferar como callo también son células receptoras para transformación genética. La presente invención proporciona técnicas para transformar embriones inmaduros y la posterior regeneración de plantas transgénicas fértiles. La transformación directa de embriones inmaduros obvia la necesidad de desarrollo a largo plazo de cultivos celulares receptores. El polen, además de sus células precursoras,
20 microesporas, puede ser capaz de funcionar como células receptoras para la transformación genética, o como vectores para llevar ADN extraño para la incorporación durante la fertilización. La transformación de polen directa obviará la necesidad de cultivo celular.
[0110] Las células meristemáticas (es decir, células vegetales capaces de división celular continua y
25 caracterizadas por un aspecto citológico no diferenciado, normalmente encontrado en puntos en crecimiento o tejidos en plantas tales como puntas de raíz, vértices de tallos, brotes laterales, etc.) pueden representar otro tipo de célula de planta receptora. Debido a su crecimiento no diferenciado y capacidad para la diferenciación de órganos y totipotencia, una única célula meristemática transformada podría recuperarse como una planta transformada completa. En realidad, se propone que los cultivos en suspensión embriogénicos puedan ser un sistema de células
30 meristemáticas in vitro, que retienen una capacidad para la división celular continua en un estado no diferenciado, controlado por el entorno del medio.
Plagas
35 [0111] Plagas de plantas útiles en la presente invención (es decir, pueden convertirse en no patógenas según la presente invención) incluyen hongos.
[0112] Ejemplos no limitantes de hongos útiles incluyen aquellos expuestos en la Tabla 4.
40 [0113] Ejemplos no limitantes de nematodos incluyen aquellos expuestos en la Tabla 3.
[0114] Ejemplos no limitantes de insectos incluyen áfidos, chicharras, cicadelas, chinches harinosas y larvas de Lepidoptera.
45 [0115] Plagas de plantas descritas en la presente memoria descriptiva incluyen bacterias. Ejemplos no limitantes de tales bacterias se muestran en la Tabla 1.
[0116] Plagas de plantas útilmente tratadas por la presente invención incluyen royas. Ejemplos no limitantes de tal roya se muestran en la Tabla 5.
50 [0117] Plagas de plantas útilmente tratadas por la presente invención incluyen los mildius. Ejemplos no limitantes de tales se muestran en la Tabla 2.
Tabla 1 Plagas -Bacterias
Enfermedad
Agente causante
Tizón de las hojas y podredumbre del tallo bacterianos
Pseudomonas avenae subsp.avenae
Mancha foliar bacteriana
Xanthomonas campestris pv.holcicola
Podredumbre del tallo bacteriana
Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens
Podredumbre del tallo y la parte superior bacteriana
Erwinia carotovora subsp. carotovora, Erwinia chrysanthemi pv. Zeae
Franja bacteriana
Pseudomonas andropogonis
Mancha de chocolate
Pseudomonas syringae pv. Coronafaciens
Marchitamiento y tizón bacteriano de Goss (pecas y marchitamiento de las hojas)
Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis = Corynebacterium michiganense pv. Nebraskense
Mancha de Holcus
Pseudomonas syringae pv. Syringae
Vaina de la hoja púrpura
Bacterias hemiparasíticas + (Véase bajo Hongos)
Podredumbre de semillas-tizón de plantas de semillero
Bacillus subtilis
Enfermedad de Stewart (marchitamiento bacteriano)
Pantoea stewartii = Erwinia stewartii
Enanismo del maíz (enanismo de Mesa Central o Rio Grande)
achaparramiento, enanismo, Spiroplasma kunkelii
Tabla 2 Plagas -Mildius
Enfermedad
Agente causante
Mildiu de franja marrón
Sclerophthora rayssiae var. zeae
Mildiu punta loca
Sclerophthora macrospora = S. macrospore
Mildiu de la mazorca verde
Sclerospora graminicola
Mildiu de Java
Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis
Mildiu de Filipinas
Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis
Mildiu del sorgo
Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi
Mildiu espontáneo
Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spontanea
Mildiu de la caña de azúcar
Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari
Podredumbre de mazorcas secas (podredumbre de la mazorca, grano y del tallo)
Nigrospora oryzae (teleomorfo: Khuskia oryzae)
Podredumbre de mazorcas, menor
Aspergillus glaucus, A. niger, Aspergillus spp., Cunninghamella sp., Curvularia pallescens, Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis, Fusarium culmorum, Gonatobotrys simplex, Pithomyces maydicus, Rhizopus microsporus, R. stolonifer = R. nigricans, Scopulariopsis brumptii
Cornezuelo (horse's tooth, diente del caballo)
Claviceps gigantea (anamorfo: Sphacelia sp.)
Mancha ocular
Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae
Podredumbre de las mazorcas y el tallo por Fusarium
Fusarium subglutinans = F. moniliforme var. subglutinans
Podredumbre del grano, la raíz y el tallo, podredumbre de semillas y tizón de plantas de semillero por Fusarium
Fusarium moniliforme (teleomorfo: Gibberella fujikuroi)
Podredumbre del tallo, podredumbre de la raíz de las plantas de semillero por Fusarium
Fusarium avenaceum (teleomorfo: Gibberella avenacea)
Podredumbre de las mazorcas y el tallo por Gibberella
Gibberella zeae (anamorfo: Fusarium graminearum)
Podredumbre de las mazorcas grises
Botryosphaeria zeae =Physalospora zeae (anamorfo: Macrophoma zeae)
Mancha foliar gris
Cercospora mancha foliar) Cercospora sorghi = C. sorghi var. maydis, C. zeae-maydis
Podredumbre de la raíz por Helminthosporium
Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum (teleomorfo: Setosphaeria
Podredumbre de las mazorcas por Hormodendrum
(Cladosporium Cladosporium cladosporioides = Hormodendrum cladosporioides,rot), C. herbarum (teleomorfo: Mycosphaerella tassiana)
Tabla 2 Plagas -Mildius
Enfermedad
Agente causante
Mancha foliar por Hyalothyridium
Hyalothyridium maydis
Marchitamiento tardío
Cephalosporium maydis
Manchas foliares, menores
Alternaria alternata, Ascochyta maydis, A. tritici, A. zeicola, Bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae (teleomorfo: Cochliobolus victoriae), C. sativus (anamorfo: Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum), Epicoccum nigrum, Exserohilum prolatum = Drechslera prolata (teleomorfo: Setosphaeria prolata) Graphium penicillioides, Leptosphaeria maydis, Leptothyrium zeae, Ophiosphaerella herpotricha, (anamorfo: Scolecosporiella sp.), Paraphaeosphaeria michotii, Phoma sp., Septoria zeae, S. zeicola, S. zeina
Tizón de las hojas del maíz del norte
Exserohilum turcicum =Helminthosporium turcicum, Setosphaeria turcica
Mancha foliar del maíz del norte
Cochliobolus carbonum
Podredumbre de las mazorcas por Helminthosporium (raza 1)
Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum
Podredumbre de las mazorcas por Penicillium (ojo azul, moho azul)
Penicillium spp., P. chrysogenum, P. expansum, P. oxalicum
Podredumbre del tallo y podredumbre de la raíz por Phaeocytostroma
Phaeocytostroma ambiguum, Phaeocytosporella zeae
Mancha foliar por Phaeosphaeria
Phaeosphaeria maydis, Sphaerulina maydis
Podredumbre de las mazorcas por Physalospora
Botryosphaeria Botryosphaeria festucae = Physalospora zeicola, (anamorfo: Diplodia frumenti)
Vaina de la hoja púrpura
Bacteria y hongos hemiparasíticos
Podredumbre del tallo y podredumbre de la raíz por Pyrenochaeta
Phoma terrestris, Pyrenochaeta terrestris
Podredumbre de la raíz por Pythium
Pythium spp., P. arrhenomanes, P. graminicola
Podredumbre del tallo por Pythium
Pythium aphanidermatum = P. butleri L.
Enfermedad de granos rojos (moho de la mazorca, podredumbre de las hojas y las semillas)
Epicoccum nigrum
Podredumbre de las mazorcas por Rhizoctonia
Rhizoctonia zeae (teleomorfo: Waitea circinata)
Podredumbre de la raíz y podredumbre del tallo por Rhizoctonia
Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae
Podredumbres de las raíces, menor
Alternaria alternata, Cercospora sorghi, Dictochaeta fertilis, Fusarium acuminatum (teleomorfo: Gibberella acuminata), F. equiseti (teleomorfo: G. intricans), F. oxysporum, F. pallidoroseum, F. poae, F. roseum, F. cyanogena, (anamorfo: F. sulphureum), Microdochium bolleyi, Mucor sp., Periconia circinata, Phytophthora cactorum, P. drechsleri, P. nicotianae var. parasitica, Rhizopus arrhizus
Mancha foliar por Rostratum (enfermedad de la hojas, podredumbre de las mazorcas y del tallo)
Setosphaeria rostrata, Helminthosporium (anamorfo: Exserohilum rostratum = Helminthosporium rostratum)
Roya, maíz común
Puccinia sorghi
Roya, maíz del sur
Puccinia polysora
Roya, maíz tropical
Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae
Podredumbre de las mazorcas por Sclerotium (tizón del sur)
Sclerotium rolfsii (teleomorfo: Athelia rolfsii)
Tabla 2 Plagas -Mildius
Enfermedad
Agente causante
Podredumbre de semillas-tizón de plantas de semillero
Bipolaris sorokiniana, B. zeicola = Helminthosporium carbonum, Diplodia maydis, Exserohilum pedicillatum, Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum, Fusarium avenaceum, F. culmorum, F. moniliforme, Gibberella zeae (anamorfo: F. graminearum), Macrophomina phaseolina, Penicillium spp., Phomopsis sp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, R. zeae, Sclerotium rolfsii, Spicaria sp.
Mancha foliar por Selenophoma
Selenophoma sp.
Vaina roja
Gaeumannomyces graminis
Cascarilla roja
Myrothecium graminaum
Moho de silaje
Monascus purpureus, M. rubber
Hollín, común
Ustilago zeae = U. maydis
Hollín, falso
Ustilaginoidea virens
Hollín, cabeza
Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holci-sorghi
Tizón de las hojas y podredumbre del tallo del maíz del sur
Cochliobolus heterostrophus (anamorfo: Bipolaris maydis = Helminthosporium maydis)
Mancha foliar del sur
Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora
Podredumbres de los tallos, menor
Cercospora sorghi, Fusarium episphaeria, F. merismoides, F. oxysporum, F. poae, F. roseum, F. solani (teleomorfo: Nectria haematococca), F. tricinctum, Mariannaea elegans, Mucor sp., Rhopographus zeae, Spicaria sp.
Podredumbre durante el almacenamiento
Aspergillus spp., Penicillium spp. y otros hongos
Mancha de alquitrán
Phyllachora maydis
Podredumbre de las mazorcas y podredumbre de la raíz por Trichoderma
Trichoderma viride = T. lignorum teleomorfo: Hipocrea sp.
Podredumbre de las mazorcas blancas, podredumbre de la raíz y del tallo
Stenocarpella maydis = Diplodia zeae
Tizón de las hojas amarillas
Ascochyta ischaemi, Phyllosticta maydis (teleomorfo: Mycosphaerella zeae-maydis)
Mancha foliar zonal
Gloeocercospora sorghi
Tabla 3 Plagas -Nematodos parasíticos
Enfermedad
Patógeno
Punzón
Dolichodorus spp., D. heterocephalus
Bulbo y tallo (Europa)
Ditylenchus dipsaci
Excavador
Radopholus similes
Quiste
Heterodera avenae, H. zeae, Punctodera chalcoensis
Daña
Xiphinema spp., X. americanum, X. Mediterraneum
Nodo de la raíz falso
Nacobbus dorsalis
Lanza, Columbia
Hoplolaimus Columbus
Lanza
Hoplolaimus spp., H. galeatus
Lesión
Pratylenchus spp., P. brachyurus, P. crenatus, P. hexincisus, P. neglectus, P. penetrans, P. scribneri, P. thornei, P. zeae
Aguja
Longidorus spp., L. breviannulatus
Anillo
Criconemella spp., C. ornata
Nodo de la raíz
Meloidogyne spp., M. chitwoodi, M. incognita, M. javanica
Espiral
Helicotylenchus spp.
Picadura
Belonolaimus spp., B. longicaudatus
Raíz corta y gruesa
Paratrichodorus spp., P. christiei, P. minor, Quinisulcius acutus, Trichodorus spp.
Enanismo
Tylenchorhynchus dubius
Tabla 4 Plagas -Fúngicos
Enfermedad
Plaga fúngica
Tizón de las hojas por antracnosis y podredumbre del tallo por antracnosis
Colletotrichum graminicola (teleomorfo: Glomerella graminicola), Glomerella tucumanensis (anamorfo: Glomerella falcatum)
Podredumbre de las mazorcas y los granos por Aspergillus
Aspergillus flavus
Mancha de las hojas y las vainas en bandas
Rhizoctonia solani = Rhizoctonia microsclerotia (teleomorfo:Thanatephorus cucumeris)
Enfermedad de haces negros
Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium
Podredumbre de granos negros
Lasiodiplodia theobromae = Botryodiplodia theobromae
Borde blanco
Marasmiellus sp.
Mancha marrón (mancha negra, podredumbre del tallo)
Physoderma maydis
Podredumbre de granos por Cephalosporium
Acremonio strictum = Cephalosporium acremonium
Podredumbre de carbón vegetal
Macrophomina phaseolina
Podredumbre de las mazorcas por Corticium
Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii
Mancha foliar por Curvularia
Curvularia clavata, C. eragrostidis, = C. maculans (teleomorfo: Cochliobolus eragrostidis), Curvularia inaequalis, C. intermedia (teleomorfo: Cochliobolus intermedius), Curvularia lata (teleomorfo: Cochliobolus latus), Curvularia pallescens (teleomorfo: Cochliobolus pallescens), Curvularia senegalensis, C. tuberculata (teleomorfo: Cochliobolus tuberculatus)
Mancha foliar por Didymella
Didymella exitalis
Podredumbre de las mazorcas y podredumbre del tallo por Diplodia
Diplodia frumenti (teleomorfo: Botryosphaeria festucae)
Podredumbre de las mazorcas, podredumbre del tallo, podredumbre de semillas y tizón de plantas de semillero por Diplodia
Diplodia maydis = Stenocarpella maydis
Mancha foliar o raya de las hojas por Diplodia
Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospore
Tabla 5 Plagas -Royas
Planta huésped
Nombre común de la enfermedad Roya Especies
Cebada
Roya de la corona Puccinia coronata
Roya de las hojas
Puccinia hordei
Roya del tallo
Puccinia graminis
Roya en franjas (amarillas)
Puccinia striiformis
Maíz
Roya común Puccinia sorghi
Roya del sur
Puccinia polysora
Roya tropical
Physopella pallescens, P. zeae = Angiopsora zeae
Avena
Roya de la corona Puccinia coronata
Roya del tallo
Puccinia graminis
Centeno
Roya del tallo Puccinia gramminis. = P. graminis f. sp. secalis
Roya de las hojas (marrón)
Puccinia recondita (anamorfo: Aecidium clematidis)
Sorgo
Roya Puccinia purpurea
Caña de azúcar
Roya común Puccinia melanocephala. = P. erianthi
Roya naranja
Puccinia kuehnii
Trigo
Roya de las hojas (marrón) Puccinia triticina. = P. Recondita f. Sp. tritici = P. tritici-duri
Roya del tallo (negro)
Puccinia gramminis = P. graminis f. sp. tritici
Roya en franjas (amarillas)
Puccinia striiformis (anamorfo: P. uredoglumarum)
Tabla 5 Plagas -Royas
Planta huésped
Nombre común de la enfermedad Roya Especies
Manzana
Roya del espino blanco americano Gymnosporangium globosum
Roya de la manzana de sidra
Gymnosporangium juniperi-virginianae
Roya de la manzana japonesa
Gymnosporangium yamadae miyabe ex yamada
Roya de la costa del Pacífico del peral
Gymnosporangium libocedri
Roya del membrillo
Gymnosporangium clavipes
Espárrago
Roya Puccinia asparagi
Banana
Roya de las hojas Uredo musae, uromyces musae
Judía
Roya Uromyces appendiculatus
Remolacha
Roya de las planta de semillero Puccinia subnitens
Zanahoria
Roya Aecidium foeniculiuromyces graminis, Uromyces lineolatus subsp. nearcticus
Garbanzo
Roya Uromyces ciceris-arietini, Uromyces striatus
Café
Roya (roya naranja o de las hojas) Hemileia vastatrix
Roya (roya pulverulenta o gris)
Hemileia coffeicola
Algodón
Roya del algodón Puccinia schedonnardi
Roya del suroeste
Puccinia cacabata
Roya tropical
Phakopsora gossypii
Eucalipto
roya Puccini apsidii
Lino
Roya Melampsora lini
Crepé
Roya Physopella ampelopsidis
Lechuga
Roya Puccinia dioicae = P. extensicola var. hieraciata
Espárrago
Roya del espárrago Puccinia asparagi
Cebolla
Roya de la cebolla Puccinia allii
Guisante
Roya Uromyces fabae
Cacahuete
Roya Puccinia arachidis
Pera
Roya del espino blanco americano Gymnosporangium globosum
Roya de las peras de pepita
Gymnosporangium kernianum
Roya de la costa del Pacífico del peral
Gymnosporangium libocedri
Roya de espaldera del peral
Gymnosporangium fuscum
Roya de las Montañas Rocosas del peral
Gymnosporangium nelsonii
Álamo
Roya del álamo europeo Melampsora larici-populinakle
Roya de las hojas americana
Melampsora medusae
Patata
Roya común Puccinia pittierianap
Roya deformante
Aecidium cantensis
Trébol rojo
Roya Uromyces trifolii-repentis
Soja
Roya Phakopsora pachyrhizi
Fresa
Roya de las hojas Phragmidium potentillae = Frommea obtusa
Girasol
Roya Puccinia helianthi, P. xanthii, Uromyces junci
Boniato
Red roya Coleosporium ipomoeae
Genes de patogenicidad de la plaga
[0118] El experto puede identificar fácilmente genes de plagas para ser elegidos como diana en la presente
5 invención. Un gen tal podría ser cualquier gen de plaga que cumpliera una función directa o indirecta en los efectos perjudiciales de una plaga tal sobre una planta huésped. A modo de ejemplo solo, un gen tal puede ser uno que cumpla una función en el crecimiento, desarrollo, replicación y reproducción de plagas, e invasión o infección.
[0119] En una realización, la planta huésped no contiene un gen que sea superior a aproximadamente el 70 % 10 homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
[0120] Opcionalmente, la homología no es superior a aproximadamente el 60 %.
[0121] Opcionalmente, la homología no es superior a aproximadamente el 50 %.
[0122] En una realización, la planta huésped no contiene un gen que contenga un estiramiento de 25 5 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 70 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
[0123] En una realización, la planta huésped no contiene un gen que contenga un estiramiento de 25 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 60 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
10 [0124] En una realización, la planta huésped no contiene un gen que contenga un estiramiento de 25 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 50 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
[0125] En una realización, la planta huésped no contiene más de un gen que contenga un estiramiento de 25 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 70 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
15 [0126] En una realización, la planta huésped no contiene más de un gen que contenga un estiramiento de 25 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 60 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
[0127] En una realización, la planta huésped no contiene más de un gen que contenga un estiramiento de 25 20 nucleótidos que sea superior a aproximadamente el 50 % homólogo al gen de patogenicidad de la plaga.
Tabla 6 Plagas, genes de patogenicidad de plagas y plantas huésped
Plaga o grupo patógeno
Gen de patogenicidad de la plaga Plantas huésped
Hongos
Cutinasas Todas
Cinasas
Todas
ARN ribosómicos
Todas
Adhesinas
Todas
Proteínas G
Todas
Elicitinas
Todas
Bacterias
Cutinasas Todas
Enzimas de maceración
Todas
Cinasas
Todas
ARN ribosómicos
Todas
Adhesinas
Todas
Proteínas G
Todas
Insectos
Cinasas Todas
ARN ribosómicos
Todas
Proteínas G
Todas
Factores de muda de la piel
Todas
Serina proteasas
Todas
Cisteína proteasas
Todas
Esterasa de la hormona juvenil
Todas
Nematodos
Cinasas Todas
ARN ribosómicos
Todas
Proteínas G
Todas
Proteínas de colágeno de la cutícula
Todas
Catepsina proteasas
Todas
[0128] A modo de ejemplo, la cutinasa es un gen útil según la presente invención. Cuando una hifa fúngica invade una célula de planta y absorbe nutrientes, absorbe el ARNip de la planta y silencia la cutinasa esencial y
25 constitutiva del hongo.
[0129] A modo de ejemplo solo, un gen tal puede ser uno que cumple una función en el crecimiento, desarrollo, replicación y reproducción de plagas, e invasión o infección. Otros ejemplos no limitantes incluyen aquellos en la Tabla 6.
Secuencias sentido (y antisentido)
[0130] Las secuencias sentido y antisentido según la presente memoria descriptiva pueden ser cualquier secuencia con homología con una hebra sentido y antisentido (respectivamente) de gen de patogenicidad de la plaga.
5 [0131] Las secuencias sentido y antisentido pueden estar sobre la misma hebra de ADN o sobre hebras de ADN diferentes. Cuando las secuencias sentido y antisentido están sobre la misma hebra de ADN, la transcripción de estas secuencias puede alejarse del mismo promotor o de diferentes promotores (por ejemplo, diferentes copias del mismo promotor o diferente promotor). Cuando las secuencias sentido y antisentido están sobre diferentes hebras de ADN, la transcripción de estas secuencias se aleja de diferentes promotores.
10 [0132] Las secuencias sentido y antisentido pueden estar dispuestas en ADN como ADN de dúplex complementario o las secuencias pueden estar en diferentes regiones del ADN (es decir, no forman dúplex de ADN entre sí).
15 [0133] Cada una de las secuencias sentido y antisentido comprenden al menos aproximadamente 19 nucleótidos. Opcionalmente, cada secuencia comprende al menos aproximadamente 50 nucleótidos, opcionalmente al menos aproximadamente 100 nucleótidos, opcionalmente al menos aproximadamente 150 nucleótidos, opcionalmente al menos aproximadamente 250 polinucleótidos, opcionalmente al menos aproximadamente 500 nucleótidos, opcionalmente al menos aproximadamente 600 polinucleótidos.
20 [0134] En una realización, las secuencias se modifican del gen de patogenicidad de la plaga para crear o aumentar la homología con el gen de patogenicidad de más de una plaga.
[0135] En otra realización, las secuencias se modifican del gen de patogenicidad de la plaga para acortar un 25 marco de lectura abierto.
[0136] En otra realización, las secuencias se modifican del gen de patogenicidad de la plaga para producir menos homología con un gen de planta, animal o humano.
30 [0137] En otra realización, secuencias sentido y antisentido comprenden regiones duplicadas de un gen de patogenicidad de la plaga. La selección de tales regiones se hace según las enseñanzas de la invención en el presente documento (por ejemplo, regiones altamente conservadas).
[0138] En otras realizaciones, las regiones de un gen de patogenicidad de la plaga o incluso la región sentido
35 entera de un gen de patogenicidad de la plaga puede duplicarse para comprender secuencias sentido y antisentido para aumentar la longitud de la región bicatenaria formada por las secuencias sentido y antisentido. Sin desear quedar ligado a teoría, se cree que en algunas realizaciones de la presente invención debe formarse un nivel umbral de ARNip para provocar silenciamiento de genes útil en la plaga y para conferir resistencia a plagas a la planta. La duplicación de secuencias de genes es una forma útil de aumentar la longitud de la región bicatenaria y aumentar el
40 número de ARNip.
[0139] Este enfoque (duplicación génica) se demuestra en los ejemplos en el presente documento usando el polinucleótido heterólogo pVZA300 (SEQ ID 7) que comprende la elicitina INF1 de Phytophthora infestans (sitio de GenBank AY766228). Esta secuencia se seleccionó debido a su alta homología con muchos otros genes de elicitina
45 expresados por el género Phytophthora, sugiriendo que podría silenciar muchos otros genes de elicitina y así proporcionar resistencia a muchas especies de Phytophthora. La secuencia seleccionada tuvo 282 nt de longitud, por tanto la secuencia se repitió (= 564 nt) en tanto las orientaciones sentido como antisentido para aproximar las longitudes de las porciones sentido y antisentido de pVZA100 (SEQ ID 5), pVZA200 (SEQ ID 6) y pVZA400 (SEQ ID 8) que habían sido sorprendentemente satisfactorias.
50 [0140] El éxito de este enfoque se demostró por el espectacular efecto de pVZA300 en reducir el crecimiento y causar malformación de hifas de Phytophthora nicotianae y Phytophthora sojae transformadas (Figura 14D, F) con respecto a los efectos de transformaciones con pCAMBIA1201, pVZA100 o pVZA200. Los plásmidos pVZA200 y pVZA300 son parcialmente idénticos, conteniendo ambos un gen catepsina, pero pVZA300 también contiene el gen
55 elicitina repetido. Por tanto, el impacto perjudicial de pVZA300 sobre los hongos debe ser debido al gen elicitina. Esto tiene implicaciones muy positivas para desarrollar plantas resistentes a Phytophthora y la aplicación de este enfoque para la despatogenización de tierras contaminadas con Phytophthora.
Procedimientos de transformación
[0141] Están disponibles una amplia variedad de procedimientos para introducir polinucleótidos heterólogos de la presente invención en el huésped diana en condiciones que permitan el mantenimiento y expresión estables del polinucleótido. La elección particular de una tecnología de transformación se determinará por su eficiencia para
5 transformar ciertas especies de plantas, además de la experiencia y preferencia de la persona que pone en práctica la invención con una metodología de elección particular. Será evidente para el experto que la elección particular de un sistema de transformación para introducir ácido nucleico en células vegetales no es esencial para o una limitación de la invención, ni lo es la elección de técnica para la regeneración de plantas.
10 [0142] Aunque en el presente documento se enseñan diversos procedimientos de transformación como procedimientos separados, el experto reconocerá fácilmente que ciertos procedimientos pueden usarse en combinación para potenciar la eficiencia del procedimiento de transformación. Ejemplos no limitantes de tales procedimientos incluyen bombardeo con micropartículas recubiertas con Agrobacterium (documento EP-A-486234) o bombardeo con microproyectiles para inducir lesiones, seguido de co-cultivo con Agrobacterium (documento EP-A
15 486233).
[0143] La administración directa puede usarse para transformar plantas huésped según la presente invención. A modo de ejemplo no limitante, tales procedimientos de administración directa incluyen tratamiento con polietilenglicol, electroporación, captación de ADN mediada por liposomas (por ejemplo Freeman y col. Plant Cell
20 Physiol. 29: 1353 (1984)), o el procedimiento de agitación con vórtex (por ejemplo Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d). Una forma de administración de ADN directa es dirigir la transferencia de genes a protoplastos de, por ejemplo, cultivos en suspensión de células embriogénicas (Lazzeri y Lorz (1988) Advances in Cell Culture, vol. 6, Academic Press, pág. 291; Ozias-Akins y Lorz (1984) Trends in Biotechnology 2: 119).
25 Ruta de polinización
[0144] El experto conoce ciertos retos de transformación dependiente de genotipo que se producen a partir del bajo potencial de regeneración de cereales. Por consiguiente, en una realización de la presente invención, la transformación se lleva a cabo por un enfoque de transformación independiente de genotipo basado en la ruta de 30 polinización (Ohta Y., 1986). En maíz, la transformación genética de alta eficiencia puede lograrse por una mezcla de polen y ADN exógeno (Luo Z. X. y Wu R., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:715-719). El maíz puede cultivarse por tanto técnicas de autopolinización como de polinización cruzada. El maíz tiene flores macho y hembra separadas en la misma planta, localizadas en la panoja y la mazorca, respectivamente. La polinización natural se produce en maíz cuando el viento sopla el polen de las panojas a las sedas que sobresalen de la parte superior de las
35 mazorcas.
[0145] La transformación de arroz según la presente invención también puede llevarse a cabo mediante la ruta de tubo polínico (Plant Molecular Biology Reporter 6:165-174). Las posibles ventajas importantes del enfoque de la ruta del tubo polínico incluyen: (a) independencia del genotipo; (b) falta de mosaicismo; (c) no necesita 40 complicadas técnicas de cultivo de células y de tejido. La transformación de tomate y melón con polinucleótidos heterólogos según la presente invención puede llevarse a cabo en plantas intactas mediante la ruta de polinización (Chesnokov, Yu. V., y col., 1992, patente de USSR nº 1708849; Boletín de Patentes de USSR, nº 4; Chesnokov Yu.
V. & Korol A. B. 1993; Genetika USSR, 29:1345-1355). Los procedimientos de transformación genética basados en la ruta de polinización-fecundación incluyen: (i) empleo de una mezcla (pasta) del polen y ADN transformante; (ii)
45 administración del ADN extraño en el tubo polínico, después de la polinización; y (iii) bombardeo con micropartículas de microesporas o granos de polen.
Tecnología de Agrobacterium
50 [0146] En una realización de la presente invención, plantas huésped se transforman usando tecnología de Agrobacterium. La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales debido a que el ADN puede introducirse en tejidos de planta completos, obviándose así la necesidad de regeneración de una planta intacta de un protoplasto. El uso de vectores integrantes de plantas mediadas por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es muy conocido en la técnica. Véase, por
55 ejemplo, los procedimientos descritos por Fraley y col., (1985), Rogers y col., (1987) y la patente de EE.UU. nº
5.563.055.
[0147] La transformación mediada por Agrobacterium pueden usarse eficazmente con plantas huésped dicotiledóneas de la presente invención que incluyen, a modo de ejemplo no limitante, Arabidopsis, maíz, soja,
algodón, colza, tabaco, tomate y patata.
[0148] La transformación mediada por Agrobacterium también es aplicable a casi todas las plantas monocotiledóneas de la presente invención. Por ejemplo no limitante, tales tecnologías de plantas monocotiledóneas 5 son adaptables a arroz (Hiei y col., 1997; Zhang y col., 1997; (Ishida y col., 1996); la patente de EE.UU. nº 5.591.616), trigo (McCormac y col. 1998) y cebada (Tingay y col., 1997; McCormac y col., 1998).
[0149] La transformación mediada por Agrobacterium, según la presente invención, puede llevarse a cabo con protoplastos aislados cultivados y por transformación de células o tejidos intactos.
10 [0150] La transformación mediada por Agrobacterium en dicotiledones facilita la administración de trozos más grandes de ácido nucleico heterólogo en comparación con otros procedimientos de transformación tales como bombardeo con partículas, electroporación, procedimientos de transformación mediados por polietilenglicol, y similares. Además, la transformación mediada por Agrobacterium parece producir relativamente pocas
15 transposiciones de genes y más normalmente produce la integración de bajos números de copias de genes en el cromosoma de la planta.
[0151] Vectores de transformación por Agrobacterium modernos son capaces de replicación en E. coli, además de Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes como se ha descrito (Klee y col., 1985). 20 Además, los recientes avances tecnológicos en vectores para la transferencia de genes mediada por Agrobacterium han mejorado la disposición de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores que pueden expresar diversos genes sentido de polipéptidos. Los vectores descritos (Rogers y col., 1987) tienen regiones de multi-ligador convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de genes sentido de polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes fines. Además, para las
25 transformaciones puede usarse Agrobacterium que contiene tanto genes Ti armados como desarmados. En aquellas cepas de planta en las que la transformación mediada por Agrobacterium es eficaz, es el procedimiento de elección debido a la fácil y definida naturaleza de la transferencia génica.
[0152] Cuando Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens y A. rhizogenes) se usan para transformar células
30 vegetales según la presente invención, el ADN que va a insertarse puede clonarse en plásmidos especiales, concretamente tanto en un vector intermedio como en un vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri por recombinación homóloga debido a secuencias que son homólogas a secuencias en el T-ADN. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacteria. El vector intermedio puede transferirse a
35 Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido colaborador (conjugación).
[0153] Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Tales vectores pueden comprender un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones frontera de T-ADN derecha e izquierda. Pueden transformarse directamente en Agrobacteria (Holsters y 40 col. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El Agrobacterium usado como célula huésped va a comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN en la célula de planta. T-ADN adicional puede estar contenido. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células vegetales. Los explantes de planta pueden cultivarse ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la célula de planta. Las plantas completas pueden
45 entonces regenerarse a partir del material de planta infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas pueden entonces probarse para la presencia de los polinucleótidos heterólogos insertados. No se requieren exigencias especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos convencionales tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
50 [0154] Otra tecnología de transformación incluye tecnología de fibras cortas monocristalinas. Véanse las patentes de EE.UU. nº 5.302.523 y 5.464.765, ambas a Zeneca.
Bombardeo con microproyectiles
55 [0155] Opcionalmente, las células vegetales huésped se transforman según la invención por bombardeo con microproyectiles (patente de EE.UU. nº 5.550.318; patente de EE.UU. nº 5.538.880; patente de EE.UU. nº 5.610.042; y patente de EE.UU. nº 5.590.390). En esta realización, las partículas están recubiertas con ácidos nucleicos y se administran a células por una fuerza propulsora. Partículas a modo de ejemplo incluyen aquellas compuestas por tungsteno, platino, y preferentemente, oro. Se contempla que en algunos casos la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para la administración de ADN a una célula receptora usando bombardeo con microproyectiles. Sin embargo, se contempla que partículas pueden contener ADN en vez de recubrirse con ADN. Por tanto, se propone que las partículas recubiertas de ADN pueden aumentar el nivel de
5 administración de ADN mediante bombardeo de partículas, pero no es, de por sí solo, necesario.
[0156] Para el bombardeo, células en suspensión se concentran sobre filtros o medio de cultivo sólido. Alternativamente, embriones inmaduros u otras células diana se disponen sobre medio de cultivo sólido. Las células que van a bombardearse se disponen a una distancia apropiada por debajo de la placa de detención de los
10 microproyectiles.
[0157] Una realización ilustrativa de un procedimiento de transformación para administrar vectores objeto a células vegetales es por aceleración es el sistema de administración de partículas biolísticas (BioRad, Hercules, Calif.), que se usa para propulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz
15 de acero inoxidable o de Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células vegetales cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de manera que no son administradas a las células receptoras en grandes agregados. Sin desear quedar ligado a teoría, se cree que un tamiz que interviene entre el aparato de proyectiles y las células que van a bombardearse reduce el tamaño del agregado de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación reduciendo la lesión ocasionada sobre las células receptoras por
20 proyectiles que son demasiado grandes.
[0158] Para el bombardeo, células en suspensión se concentran preferentemente sobre filtros o medio de cultivo sólido. Alternativamente, embriones inmaduros u otras células diana pueden disponerse sobre medio de cultivo sólido. Las células que van a bombardearse se disponen a una distancia apropiada por debajo de la placa de
25 detención de los microproyectiles. Si se desea, uno o más tamices pueden posicionarse entre el dispositivo de aceleración y las células que van a bombardearse. Mediante el uso de técnicas expuestas en el presente documento pueden obtenerse hasta 1000 o más focos de células que expresan transitoriamente un gen marcador. El número de células en un foco que expresan el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo oscila frecuentemente de 1 a 10 y en promedio 1 a 3.
30 [0159] Un experto en la materia pueden optimizar las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los parámetros de bombardeo para dar los máximos números de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como biológicos para el bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son aquellos que implican manipular el precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan el vuelo y velocidad de tanto los
35 macro- como los microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas que participan en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de células diana para ayudar a aliviar el traumatismo asociado al bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos superenrollados intactos. Se cree que las manipulaciones pre-bombardeo son especialmente importantes para la transformación satisfactoria de embriones inmaduros.
40 [0160] Por consiguiente, se contempla que el experto puede ajustar los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Puede desearse particularmente ajustar parámetros físicos tales como distancia de huecos, distancia de vuelo, distancia de tejido y presión del helio. También pueden minimizarse los factores de reducción del traumatismo (TRF) modificando condiciones que influyen
45 en el estado fisiológico de las células receptoras y que pueden, por tanto, influir en las eficiencias de transformación e integración. Por ejemplo, el estado osmótico, hidratación de tejido y la etapa del subcultivo o ciclo celular de las células receptoras pueden ajustarse para la transformación óptima. Resultados de tales estudios de optimización a pequeña escala se desvelan en el presente documento y la ejecución de otros ajustes rutinarios será conocida para aquellos expertos en la materia en vista de la presente divulgación.
50 [0161] La transformación por bombardeo con microproyectiles es ampliamente aplicable, y puede usarse para transformar prácticamente cualquier especie de planta. Las monocotiledóneas se transforman opcionalmente por bombardeo según la presente invención, por ejemplo, maíz (la patente de EE.UU. nº 5.590.390), cebada (Ritala y col., 1994; Hensgens y col., 1993), trigo (patente de EE.UU. nº 5.563.055), arroz (Hensgens y col., 1993), avena
55 (Torbet y col., 1995; Torbet y col., 1998), centeno (Hensgens y col., 1993), caña de azúcar (Bower y col., 1992) y sorgo (Casa y col., 1993; Hagio y col., 1991);
[0162] Las dicotiledóneas se transforman opcionalmente por bombardeo según la presente invención, por ejemplo, tabaco (Tomes y col., 1990; Buising y Benbow, 1994), soja (patente de EE.UU. nº 5.322.783), girasol (Knittel y col. 1994), cacahuete (Singsit y col., 1997), algodón (McCabe y Martinell, 1993), tomate (Van Eck y col. 1995) y legumbres en general (patente de EE.UU. nº 5.563.055).
Electroporación
5 [0163] En una realización, las células vegetales se transforman usando el procedimiento de electroporación, Véanse, por ejemplo, documento WO 87/06614 a Boyce Thompson Institute; patentes de EE.UU. nº 5.472.869 y 5.384.253, ambas a Dekalb; y documentos WO 92/09696 y WO 93/21335, ambos a Plant Genetic Systems.
10 [0164] El procedimiento de Krzyzek y col. (patente de EE.UU. nº 5.384.253) es muy adecuado para la presente invención. En este procedimiento, ciertas enzimas que degradan la pared celular, tales como enzimas que degradan pectina, se emplean para hacer las células receptoras diana más susceptibles para transformación por electroporación que las células sin tratar. Alternativamente, las células receptoras se hacen más susceptible para transformación por herida mecánica.
15 [0165] El procedimiento de Tada, Y., y col. (Efficient gene introduction to rice by electroporation and analysis of transgenic plants: Use of electroporation buffer lacking chloride ions, Theor Appl Genet, vol. 80: 475-480, 1990) es, por ejemplo, adecuado para transformar arroz.
20 [0166] En una realización, para efectuar la transformación por electroporación se usan tejidos desmenuzables tales como un cultivo de células en suspensión o callo embriogénico.
[0167] Opcionalmente, embriones inmaduros u otro tejido organizado se transforman directamente. En esta técnica, paredes celulares se degradan parcialmente exponiéndolas a enzimas que degradan pectina (pectoliasas) o
25 que hieren mecánicamente de una manera controlada.
[0168] Ejemplos no limitantes de huéspedes de células de planta que pueden transformarse por electroporación de células intactas según la presente invención son trigo (según, por ejemplo, Zhou y col., 1993), tomate (según, por ejemplo Hou y Lin, 1996), soja (según, por ejemplo Christou y col., 1987) y tabaco (Lee y col.,
30 1989). Véanse también la patente de EE.UU. nº 5.384.253; Rhodes y col., 1995; y D'Halluin y col., 1992
[0169] En una realización, las plantas se transforman para electroporación de protoplastos (según, por ejemplo, Bates, 1994; Lazzeri, 1995). Ejemplos no limitantes de huéspedes de células de planta que pueden transformarse por electroporación de protoplastos células según la presente invención son plantas de soja (según,
35 por ejemplo, Dhir y Widholm en la publicación PCT nº WO 92/17598), cebada (por ejemplo, Lazerri, 1995), sorgo (por ejemplo, Battraw y col., 1991), (por ejemplo, Bhattacharjee y col., 1997), trigo (por ejemplo, He y col., 1994) y tomate (por ejemplo Tsukada, 1989).
Vectores virales
40 [0170] Además, también pueden usarse vectores virales para transformar plantas según la presente invención. Por ejemplo, plantas monocotiledóneas pueden transformarse con un vector viral usando los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.569.597 a Mycogen Plant Science y Ciba-Giegy, ahora Novartis.
45 [0171] La patente de EE.UU. nº 5.589.367 también describe transformación de plantas con un vector viral.
[0172] La patente de EE.UU. nº 5.316.931 describe transformación de plantas con un vector viral.
50 [0173] Un gran número de vectores de clonación útiles para plantas superiores (que incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas) según la presente invención comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas. Estos vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, series de pUC, series de M13mp, pACYC184, etc., y pCAMBIA 1201. Por consiguiente, la secuencia que comprende un polinucleótido heterólogo de la presente invención puede insertarse en el vector en un sitio de
55 restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado, luego se recogen y se lisan. El plásmido se recupera. El análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis, y otros procedimientos bioquímicos-de biología molecular se llevan a cabo generalmente como procedimientos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido u otros plásmidos. Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la transformación de la célula de planta, entonces al menos la frontera derecha, pero frecuentemente la frontera derecha y la izquierda del plásmido de Ti o Ri T-ADN, se unen como la región flanqueante de los genes que van a insertarse (Figura 1).
5 [0174] El uso de T-ADN para la transformación de células vegetales se describe en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Capítulo 5; Fraley y col., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; An y col. (1985) EMBO J. 4:277-287; y muchas referencias posteriores ampliamente conocidas y disponibles para aquellos expertos en la materia.
Genes marcadores
[0175] Con el fin de mejorar la capacidad para identificar transformantes, puede desearse emplear uno o más genes marcadores en un polinucleótido heterólogo de la presente invención.
15 [0176] Genes marcadores, según la presente invención, incluyen aquellos que codifican un marcador de selección y aquellos que codifican un marcador cribable, dependiendo de si el marcador confiere o no un rasgo que pueda “seleccionarse” por medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, o similares), o si es o no simplemente un rasgo “indicador” que puede identificarse mediante
20 observación o prueba, es decir, por “cribado”. Por supuesto, muchos ejemplos de genes marcadores o genes indicadores adecuados se conocen en la técnica y pueden emplearse en la práctica de la invención.
[0177] Dentro de los términos genes marcadores de selección o cribables también están incluidos genes que codifican un “marcador secretable” cuya secreción puede detectarse como un medio de identificación o selección de
25 células transformadas. Ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno secretable que puede identificarse por interacción con anticuerpo, o incluso enzimas secretables que pueden detectarse por su actividad catalítica. Las proteínas secretables se clasifican en varias clases, que incluyen proteínas detectables difusibles pequeñas, por ejemplo, por ELISA, y proteínas que se insertan o son atrapadas en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia conductora tal como la encontrada en la unidad de expresión de extensina o PR-S de
30 tabaco).
[0178] Con respecto a marcadores secretables de selección, se considera que es particularmente ventajoso el uso de un gen que codifica una proteína que es secuestrada en la pared celular, y cuya proteína incluye un único epítope. Un antígeno marcador secretado tal emplearía idealmente una secuencia de epítope que proporcionaría
35 baja referencia en el tejido de planta, una secuencia promotor-conductora que conferiría expresión eficaz y elección de diana a través de la membrana plasmática, y produciría proteína que se une en la pared celular y todavía accesible a anticuerpos. Una proteína de pared normalmente secretada modificada para incluir un único epítope satisfaría todos aquellos requisitos.
40 [0179] Un ejemplo de una proteína adecuada para modificación de este modo es extensina, o glucoproteína rica en hidroxiprolina (HPRG). El uso de HPRG (Stiefel y col., 1990) está bien caracterizado en términos de biología molecular, expresión y estructura de proteínas. Sin embargo, una cualquiera de una variedad de extensinas y/o proteínas de la pared ricas en Glycine (Keller y col., 1989) podría modificarse mediante la adición de un sitio antigénico para crear un marcador cribable.
45 [0180] Elementos de la presente divulgación se ejemplifican en detalle mediante el uso de genes marcadores particulares. Sin embargo, en vista de esta divulgación, numerosos otros genes marcadores de selección y/o cribables posibles serán evidentes para aquellos expertos en la materia, además del expuesto en el presente documento más adelante. Por tanto, se entenderá que la siguiente discusión es a modo de ejemplo en vez de
50 exhaustivo.
Marcadores de selección
[0181] Los marcadores de selección para su uso a propósito de la presente invención incluyen, pero no se
55 limitan a, un gen neo (Potrykus y col., 1985) que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, G418, y similares; un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen que codifica una proteína EPSP sintasa alterada (Hinchee y col., 1988) confiriendo así resistencia a glifosato; un gen nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker y col., 1988); un gen acetolactato sintasa (ALS) mutante o gen acetohidroxiácido sintasa (AHAS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otros productos químicos inhibidores de ALS (solicitud de patente europea 154.204); un gene DHFR resistente a metrotrexato (Thillet y col., 1988); un gen dalapon dehalogenasa que confiere resistencia al herbicida dalapon (patente de EE.UU. nº 5.780.708); o un gen antranilato sintasa mutado que confiere resistencia a 5-metiltriptófano (publicación PCR nº WO 97/26366). Si se emplea un gen EPSP sintasa mutante, puede obtenerse beneficio
5 adicional mediante la incorporación de un péptido de tránsito de cloroplastos adecuado, CTP (patente de EE.UU. nº 4.940.835). Véase, por tanto, Lundquist y col., patente de EE.UU. nº 5.508.468.
[0182] Una realización ilustrativa de un gen marcador de selección que puede usarse en realizaciones de la presente invención para seleccionar transformantes son aquellos que codifican la enzima fosfinotricina
10 acetiltransferasa, tal como el gen bar de Streptomyces hygroscopicus o el gen pat de Streptomyces viridochromogenes (patente de EE.UU. nº 5.550.318). La enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT) inactiva el principio activo en el herbicida bialafos, fosfinotricina (PPT). La PPT inhibe glutamina sintetasa (Murakami y col., 1986; Twell y col., 1989) causando la rápida acumulación de amoniaco y muerte celular.
15 [0183] Genes marcador de selección adecuados contemplados en el presente documento incluyen un gen aminoglucósido fosfotransferasa, gen neomicina fosfotransferasa, gen de resistencia a G418, gen de resistencia a glifosato, gen de resistencia a higromicina, gen de resistencia a metrotrexato, gen de resistencia a imidazolinonas, gen de resistencia a sulfonilureas, gen de resistencia al herbicida triazolopirimidina, gen de resistencia a ampicilina, gen de resistencia a tetraciclina, gen de resistencia a kanamicina bacteriana, gen de resistencia a fosfinotricina, gen
20 cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y gen luciferasa, entre otros.
Marcadores cribables
[0184] Marcadores cribables que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, una beta-glucuronidasa o
25 gen uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos; un gen del sitio R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de planta (Dellaporta y col., 1988); un gen beta-lactamasa (Sutcliffe, 1978), que codifica una para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen xyle (Zukowsky y col., 1983), que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogénicos; un gen alfa-amilasa (Ikuta y col.,
30 1990); un gen tirosinasa (Katz y col., 1983), que codifica una enzima que puede oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez condensa para formar el compuesto fácilmente detectable melanina; un gen betagalactosidasa, que codifica una enzima para la que hay sustratos cromogénicos; un gen luciferasa (lux) (Ow y col., 1986), que permite la detección de bioluminiscencia; o incluso un gen aecuorina (Prasher y col., 1985), que puede emplearse en detección de bioluminiscencia sensible al calcio, o un gen proteína verde fluorescente (Niedz y col.,
35 1995).
[0185] Los genes del complejo del gen R se contemplan como marcadores cribables útiles. El complejo génico de R codifica una proteína que actúa regulando la producción de pigmentos de antocianina en gran parte del tejido de semilla y de planta. Las líneas de maíz pueden tener uno, o como mucho cuatro, alelos R que se combinan para 40 regular la pigmentación en un modo específico de desarrollo y de tejido. Así, un gen R introducido en tales células producirá la expresión de un pigmento rojo y, si se incorpora establemente, puede puntuarse visualmente como un sector rojo. Si una línea lleva alelos dominantes para genes que codifican los productos intermedios enzimáticos en la ruta biosintética de antocianina (C2, A1, A2, Bz1 y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el sitio R, la transformación de cualquier célula de esa línea con R producirá la formación de pigmento rojo. Líneas a modo de
45 ejemplo incluyen Wisconsin 22 que contiene el alelo rg-Stadler y TR112, un derivado de K55 que es r-g, b, P1. Alternativamente puede utilizarse cualquier genotipo de maíz si los alelos C1 y R se introducen juntos.
[0186] Se contempla adicionalmente que las regiones reguladoras del gen R pueden emplearse en polinucleótidos heterólogos de la presente invención con el fin de proporcionar mecanismos para controlar la 50 expresión de tales polinucleótidos heterólogos. Se conoce más diversidad de expresión fenotípica en el sitio R que en cualquier otro sitio (Coe y col., 1988). Se contempla que regiones reguladoras obtenidas a partir de regiones 5' con respecto al gen R estructural serían valiosas en dirigir la expresión de genes, por ejemplo, resistencia a insectos, resistencia a la sequía, tolerancia a herbicidas u otras regiones sentido de proteína. Para los fines de la presente invención se cree que cualquiera de los diversos miembros de la familia del gen R pueden emplearse
55 satisfactoriamente (por ejemplo, P, S, Lc, etc.). Sin embargo, el más preferido será generalmente Sn (particularmente Sn:bo13). Sn es un miembro dominante del complejo del gen R y es funcionalmente similar a los sitios R y B porque Sn controla la deposición específica de tejido de los pigmentos de antocianina en ciertas células de planta de semillero y vegetales, por tanto, su fenotipo es similar a R.
[0187] Otros marcadores cribables contemplados para su uso en la presente invención es luciferasa de luciérnaga, codificada por el gen lux. La presencia del gen lux en células transformadas puede detectarse usando, por ejemplo, película de rayos X, recuento por centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de baja luminosidad, cámaras contadoras de fotones o luminometría de múltiples pocillos. También se concibe que este
5 sistema puede desarrollarse para el cribado de poblaciones para bioluminiscencia, tal como sobre placas de cultivo de tejido, o incluso para el cribado de plantas completas.
Naturaleza de las cadenas de genes marcadores
10 [0188] Según la presente invención, los genes marcadores pueden diseñarse por selección de secuencia y posición dentro del heteropolinucleótido para producir un marcador positivo o negativo. Si un heteropolinucleótido contiene secuencias de un gen marcador, pero no contiene suficientes secuencias complementarias al gen marcador, un transcrito del heteropolinucleótido contendrá el gen marcador en una región monocatenaria y puede expresarse. Así, la expresión se correlaciona con la integración del heteropolinucleótido en la planta huésped. Si un
15 heteropolinucleótido contiene secuencias de un gen marcador y suficientes secuencias complementarias al gen marcador, un transcrito del heteropolinucleótido contendrá el gen marcador en una región bicatenaria y se silenciará. Así, la expresión de un gen marcador tal indicará que el heteropolinucleótido no está siendo silenciado en la planta huésped (es decir, “marcador negativo”). Si una célula de planta se transforma con un heteropolinucleótido que comprende tanto un gen marcador positivo como marcador negativo expresa el gen marcador positivo pero no
20 expresa el gen marcador nativo, esto indica que la planta está transcribiendo y silenciando al menos parte del heteropolinucleótido. Así, la expresión se correlaciona con la integración del heteropolinucleótido en la planta huésped (es decir, pueden seleccionarse secuencias positivas).
Elección de secuencia de genes marcadores.
25 [0189] Un experto reconocerá ahora fácilmente cómo pueden efectuarse combinaciones de marcadores en diferentes posiciones dentro de un polinucleótido heterólogo de la presente invención. Tales diferencias en el efecto de la posición efecto si el marcador está silenciado o no (por ejemplo, un gen dentro de la región que forma una estructura bicatenaria a modo de enlace de hidrógeno es reconocido como extraña por los mecanismos de defensa
30 internos de la planta e hidrolizado en ARNip [es decir, “silenciado”]).
[0190] Por ejemplo, en una realización, un polinucleótido heterólogo de la presente invención contiene el gen A hipotético (es decir, cualquier gen marcador de la presente invención) en la dirección 5' de la región bicatenario y un gen B hipotético dentro de la región bicatenaria. Una célula no transformada es deficiente en la expresión de A
35 (“A-). También es B- y C-. Una célula transformada que inactiva funcionalmente la región B (por ejemplo, por silenciamiento de genes de la región en la que se encuentra el gen B) es A+ y B-. Una célula transformada que fracasa en activar la región B es A+ y B+.
[0191] Un experto reconocerá ahora que la presencia de secuencias antisentido de un gen marcador,
40 apropiadamente dispuesto en la dirección 3' de las secuencias sentido del gen marcador, facilitarán adicionalmente el silenciamiento de genes (por ejemplo, formación de hebra doble) de tal gen marcador.
[0192] Debe también ahora reconocerse fácilmente que un marcador localizado en la dirección 3' de una región bicatenaria también será silenciado si ningún promotor se encuentra entre tal región bicatenaria y tal
45 marcador.
[0193] En una realización, los polinucleótidos heterólogos de la presente invención incluyen aquellos con las estructuras expuestas en la Tabla 7.
50 Tabla 7. Polinucleótidos heterólogos
Elementos promotores y reguladores
5 [0194] Según la presente invención, un polinucleótido heterólogo, o una porción del mismo, puede transcribirse en una planta. En plantas, tal transcripción requiere un promotor que está operativamente ligado al polinucleótido heterólogo. Un promotor tal puede ser endógeno a la planta. A modo de ejemplo, un polinucleótido heterólogo puede insertarse adyacente a un promotor de planta constitutivo o inducible.
10 [0195] El polipéptido heterólogo de la presente invención puede contener opcionalmente un promotor. Un promotor tal puede ser un promotor de planta o un promotor de no planta que funciona en una planta.
[0196] Los promotores de planta incluyen, pero no se limitan a, subunidad pequeña (ssu) de ribulosa-1,6bisfosfato (RUBP) carboxilasa, promotor de beta-conglicinina, promotor de beta-faseolina, promotor de ADH,
15 promotores de choque térmico y promotores específicos de tejido tales como un promotor constitutivo donde se desee dirigir la expresión génica continua en todos los tipos de células y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares).
[0197] Pueden usarse eficazmente promotores de una variedad de fuentes en células vegetales para expresar
20 genes extraños. Por ejemplo, pueden usarse elemento reguladores promotores de origen bacteriano, tales como el promotor octopina sintasa, el promotor nopalina sintasa, el promotor manopina sintasa; promotores de origen viral tales como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un promotor de 35S remanipulado, véase la patente de EE.UU. nº 6.166.302, especialmente el Ejemplo 7E) y similares.
25 [0198] Puede desearse usar un promotor inducible, que es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como: estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, productos químicos y estrés. Pueden usarse otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas. En la técnica se conocen numerosos vectores de transferencia de genes específicos de planta.
30 [0199] Puede desearse usar un promotor que es activo durante una cierta etapa del desarrollo de la planta, además de activo en tejidos y órganos de planta. Ejemplos de tales incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de polen, específicos de embrión, específicos de seda del maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de raíz, específicos de endospermo de semilla y similares. Pueden usarse elementos reguladores
5 promotores específicos de tejido cuando se desee promover la transcripción en tejidos tales como hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares).
[0200] Mientras que cualquier promotor que funcione en una célula de planta (es decir, soporte la transcripción de un polinucleótido heterólogo) es útil en la presente invención, puede desearse seleccionar un 10 promotor relativamente más fuerte o más débil. Una realización de la presente invención usa un promotor fuerte para conducir la secuencia sentido de un gen de patogenicidad de la plaga y un promotor más débil para conducir la secuencia antisentido del gen de patogenicidad de la plaga. Un experto en la materia puede determinar fácilmente la intensidad del promotor empíricamente dentro de las realizaciones de la presente invención. Cuando una realización contiene dos promotores (que conducen dos transcritos diferentes), la tasa de transcripción relativa puede
15 determinarse cuantificando los transcritos (por ejemplo, PCR cuantitativa).
[0201] Ejemplos de promotores que son relativamente fuertes son el promotor del virus del mosaico de escrofularia y el promotor del CaMV 35S potenciado. Un ejemplo de un promotor que es relativamente más débil es el promotor del CaMV 35 S. Un experto en la materia apreciará fácilmente que promotores “más débiles” y “más
20 fuertes” es un término relativo, y que pueden identificarse empíricamente, por ejemplo, por PCR cuantitativa con los cebadores apropiados contra el transcrito que es conducido por los promotores.
[0202] Otros elementos tales como regiones de unión a matriz, regiones de unión a andamiaje, intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilación y similares puede estar presentes y así pueden mejorar la eficiencia de 25 transcripción o integración de ADN. Tales elementos pueden o pueden no ser necesarios para la función de ADN, aunque pueden proporcionar mejor expresión o funcionamiento del ADN. Tales elementos pueden incluirse en el ADN según se desee para obtener rendimiento óptimo del transformado ADN en la planta. Elementos típicos incluyen, pero no se limitan a, Adh-intrón 1, Adh-intrón 6, la secuencia conductora de la proteína de la envuelta del virus del mosaico de alfalfa, la secuencia conductora de la proteína de la envuelta del virus del rayado del maíz,
30 además de otros disponibles para un experto.
Terminador
[0203] Los polinucleótidos heterólogos de la presente invención pueden contener opcionalmente un
35 terminador. El término “terminador” se refiere a una secuencia de ADN al final de una unidad de transcripción que señaliza la terminación de la transcripción. Terminadores eucariotas son secuencias de ADN no traducidas en 3' que contienen una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias de poli (A) al extremo 3' de un transcrito primario.
40 [0204] Terminadores activos en células derivadas de virus, levadura, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y se describen en la bibliografía y son útiles en la presente invención. Pueden aislarse de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.
[0205] Ejemplos de terminadores adecuados para su uso en la presente invención incluyen el terminador del
45 gen nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el terminador del gen zeína de Zea mays, las secuencias terminadoras del gen subunidad pequeña de Rubisco (S SU), terminadores de la secuencia de genes del virus del enanismo de trébol subterráneo (SCSV) (solicitud de patente internacional nº PCT/AU95/00552), y el terminador del gen enzima málica de Flaveria bidents NSEA3 (documento PCT/AU95/00552).
50 [0206] Aquellos expertos en la materia conocerán secuencias promotoras y secuencias terminadoras adicionales adecuadas para su uso en la realización de la invención. Tales secuencias pueden usarse fácilmente sin experimentación excesiva.
55 [0207] Las realizaciones de la presente invención se enseñan en el presente documento en el que se desea que tengan más de un terminador. Ejemplos de tales son realizaciones en las que las secuencias sentido y antisentido van a estar contenidas en transcritos separados (es decir, teniendo cada uno su propio extremo 3' y 5').
Regeneración y propagación de plantas
[0208] Tras la transformación, una planta puede regenerarse, por ejemplo, a partir de células individuales, tejido de callo o discos de hojas, como es convencional en la materia. Casi cualquier planta puede regenerarse por completo a partir de células, tejidos y órganos de la planta. Técnicas disponibles se revisan en Vasil y col. (1984) en
5 Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, vols. I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications (Academic press); y Weissbach y col. (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.
[0209] Durante el desarrollo del cultivo en suspensión, agregados de células pequeñas (10-100 células) se forman, aparentemente a partir de agrupaciones de células más grandes, dando al cultivo un aspecto disperso. Tras 10 la siembra de estas células en medios sólidos, el desarrollo de embriones somáticos puede inducirse, y estos embriones pueden madurarse, germinarse y cultivarse plantas que llevan semillas. Alternativamente, puede inducirse células de callo que crecen sobre medio de cultivo sólido para formar embriones somáticos a partir de los cuales pueden desarrollarse plantas que llevan semillas. Las características de embriogenicidad, regenerabilidad y fertilidad de las plantas se pierden gradualmente en función del tiempo en el cultivo en suspensión. La
15 criopreservación de células en suspensión detiene el desarrollo del cultivo y previene la pérdida de estas características durante el periodo de criopreservación.
[0210] Las plantas transformadas pueden entonces cultivarse, y tanto polinizarse con la misma cepa transformada o cepas diferentes, e identificarse la línea resultante que tiene expresión de la característica fenotípica
20 deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga establemente y se herede, y entonces se recojan semillas para garantizar la expresión de la característica fenotípica deseada que se ha conseguido.
[0211] Además de una planta, la presente memoria descriptiva describe cualquier clon de una planta tal,
25 semilla, descendientes autofecundados o híbridos, y cualquier parte de cualquiera de estos, tal como esquejes, polen o semilla. La memoria descriptiva describe cualquier propágula de planta, que es cualquier parte que puede usarse en reproducción o propagación, sexual o asexual, que incluye esquejes, semilla, etc.
[0212] La memoria descriptiva describe una planta que es una cría sexualmente o asexualmente propagada,
30 clon o descendiente de una planta tal; o cualquier parte o propágula de dicha planta, cría, clon o descendiente. También se proporcionan extractos de plantas y derivados.
Apilamiento de genes
35 [0213] Un polinucleótido heterólogo según la presente invención puede comprender una pluralidad de secuencia sentido y una pluralidad de secuencias antisentido (es decir, un “polinucleótido heterólogo policistrónico”). Así, un polinucleótido heterólogo puede proteger una planta contra múltiples plagas.
[0214] Un experto en la materia reconocerá ahora que, usando apilamiento de genes, una planta puede
40 hacerse resistente a una pluralidad de plagas. La pluralidad de plagas pueden ser del mismo filo o de filos diferentes. Por ejemplo, una planta puede hacerse resistente a una pluralidad de plagas fúngicas. Como un ejemplo no limitante de apilamiento de genes según la presente invención, las sojas pueden hacerse resistentes a podredumbre parda del tallo (Phialophora gregata), podredumbre del tallo y de la raíz (Phytophthora sojae), la enfermedad del moho blanco (Sclerotinia sclerotiorum), síndrome de muerte súbita (Fusarium solani pisi) y la roya
45 asiática (Phakopsora pachyrhizi).
[0215] Opcionalmente, una planta puede hacerse resistente a una pluralidad de nidos de insectos. Como un ejemplo no limitante de apilamiento de genes según la presente divulgación, las patatas pueden hacerse resistentes un chicharra de la patata (Empoasca filament), escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata) y
50 áfido del melocotón verde (Myzus persicae).
[0216] Opcionalmente, una planta puede hacerse resistente a una pluralidad de plagas fúngicas y no fúngicas. Como un ejemplo no limitante de apilamiento de genes según la presente invención, las patatas pueden hacerse resistentes al nematodo dorado de patata (Globodera rostochiensis), escarabajo de la patata de Colorado
55 (Leptinotarsa decemlineata) y tizón tardío de la patata (Phytophthora infestans).
[0217] En una realización de la presente invención, el polinucleótido heterólogo comprende dos secuencias sentido diferentes y dos antisentido diferentes.
[0218] En una realización de la presente invención, el polinucleótido heterólogo comprende al menos tres secuencias sentido diferentes y al menos tres antisentido diferentes.
[0219] Plagas de plantas frecuentemente hacen que las plantas infectadas se vuelvan amarillas o marrones,
5 reduzcan su tamaño, produzcan menos exudados de raíz y maduren más rápidamente. Por tanto, el controlar una única plaga importante de una planta puede a su vez hacer que la planta sea más susceptible a otras plagas. Si una enfermedad fúngica de una planta está controlada, entonces la planta sana seguirá estando grande y verde durante un periodo prolongado, y por tanto será atractiva a y susceptible a insectos y enfermedades fúngicas transmitidas por el aire. La planta verde también puede producir más exudados de raíz que atraerán más nematodos y hongos
10 que infectan la raíz. Se ha descubierto en el presente documento que puede ser sorprendentemente ventajoso transformar una planta con un polinucleótido heterólogo que contiene secuencias homólogas a una pluralidad de genes de plagas, siendo tales genes de plagas de diferentes taxones (por ejemplo, subespecies, especies, géneros, familias, órdenes, clase).
15 Despatogénesis
[0220] Se ha descubierto que cuando una plaga infecta una célula de planta huésped transformada según la presente invención, la plaga se vuelve menos patógena para la célula de planta huésped transformada y células de plantas huésped no transformadas. Además, en una divulgación, una plaga infecta una célula de planta huésped 20 transformada según la presente invención y luego las moléculas silenciadoras del gen derivadas de la planta por alimentación se transmiten posteriormente mediante cruce (por ejemplo, por transmisión citoplásmica, conjugación, anastomosis hifal, etc.) a poblaciones de la plaga y producen una plaga menos patógena. De esta forma, poblaciones de plagas pueden hacerse no patógenas (es decir, menos patógenas) por, por ejemplo, una plaga que es incapaz de multiplicarse, y el macroentorno (por ejemplo, tierra, follaje de la planta, residuos de la planta,
25 edificios) contaminado con una plaga puede protegerse o descontaminarse de la misma.
[0221] Opcionalmente, la progenie de la plaga es menos patógena para la célula de planta huésped transformada y células de plantas huésped no transformadas.
30 [0222] Por consiguiente, una divulgación de esta memoria descriptiva es un mecanismo para el control biológico, y tiene un gran valor económico porque puede usarse para empobrecer campos importantes de cepas aisladas de plagas patógenas de hongos y reducir la aplicación de pesticidas. En la presente divulgación, la planta transgénica transmite el ARNip a la plaga a modo de comportamiento de alimentación de la plaga, y la plaga pierde su patogenicidad debido al posterior silenciamiento de su propio gen patógeno. Además, la progenie de la plaga
35 será a su vez no patógena (por ejemplo, por transmisión citoplásmica, cruce, conjugación, anastomosis hifal), limpiando así eficazmente el entorno local de esa plaga y previniendo o reduciendo significativamente su comportamiento destructor de plantas.
[0223] La despatogénesis, en una divulgación, se lleva a cabo co-cultivando plagas no patógenas (tanto
40 directamente transformadas como que han obtenido ARNip) con plagas patógenas. Tal co-cultivo se lleva a cabo, a modo de ejemplo no limitante, por difusión de la plaga transgénica para cultivar e infestar la tierra en la que las plagas no patógenas se cruzan entonces con especies similares. Tal difusión puede llevarse a cabo para hongos, a modo de ejemplo no limitante, cultivando hongos transformados sobre semillas de cebada o trigo y luego distribuyendo tales semillas a la tierra que está en necesidad de ser despatogenizada o protección de plagas
45 patógenas.
[0224] Esta divulgación es adecuada para proteger plantas valiosas establecidas tales como árboles (por ejemplo, secuoyas, robles, palmeras, arces, etc.).
50 [0225] Aunque la anterior discusión usa patógenos de plantas fúngicas como un ejemplo, la estrategia para la despatogénesis puede adaptarse a cualquier otra plaga de plantas que transmitiría el rasgo “silenciado” a su progenie, como será rápidamente evidente para el experto.
[0226] Primero, es posible “despatogenizar” una plaga silenciando un gen de patogenicidad de la plaga. La
55 plaga podría entonces sobrevivir en el entorno (por ejemplo, tierra) y diseminar el ARNip en toda la población y no atacar más las planas. Segundo, silenciando genes estructurales importantes o genes de nutrición esenciales tales como ARN ribosómico o genes elicitina, respectivamente, es posible debilitar o destruir una plaga, eliminándola así de campos de cultivo o reduciendo su presencia por debajo de umbrales económicos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Estrategia de clonación
5 [0227] Los plásmidos pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400 son realizaciones que se diseñaron para la transformación de diversas especies de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, tabaco (Nicotiana tobacum, cv. Xanthi), soja (Glycine max cv. Williams 82), patata (Solanum tuberosum cv. Alfa) y maíz (Zea mays cv. Hi II x B73). pVZA100 contiene el gen cutinasa de longitud completa de Phytophthora nicotianae en tanto las orientaciones sentido (S) como antisentido (AS), separadas por una región espaciadora que contiene una porción (817 pb) del gen
10 �-glucuronidasa (GUS) de E. coli denominado dGUS. La expresión de pVZA100 en plantas está bajo el control del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y la región sin traducir de 5' (5' UTR) del gen de la proteína de la cápside del virus del mosaico del pepino (CMV). El señal de terminación también es del gen CaMV 35S. El esqueleto del plásmido pVZA100 es el plásmido pCAMBIA1201 (Figura 1) (Roberts y col., 2000). Su marcador de selección de planta es el antibiótico higromicina. La expresión de higromicina fosfotransferasa en pCAMBIA 1201
15 también está controlada por el promotor y terminador de CaMV 35S. El gen indicador en pCAMBIA 1201 es GUS con un intrón de catalasa, también con el promotor CaMV 35S, pero con el terminador de nopalina sintasa (NOS).
Ejemplo 2. Construcción del plásmido intermedio pVZA1
20 [0228] Debido a su versatilidad, el plásmido de expresión génica pUC18cpexp (Slightom, 1991) se seleccionó para contener el casete de silenciamiento del gen. Este plásmido es pUC18, que contiene el promotor de CaMV 35S, seguido de 5' UTR del gen de la proteína de la cápside del CMV y la señal de terminación del gen CaMV 35S. Se manipuló un sitio Bgl II en el poliligador entre 5' UTR de CMV y el terminador de CaMV 35S. Para obtener dGUS, el plásmido pCAMBIA 1201 (Figura 1) se digirió dos veces con Nco I y Hinc II. El fragmento de GUS de 821 pb de
25 longitud, correspondiente a los nucleótidos 9540 a 10361 de pCAMBIA1201, se aisló y se purificó por electroforesis en gel de agarosa. Ese fragmento se digirió entonces (de forma roma) en el sitio 3' Nco I usando nucleasa de fríjol de oro para reducirlo a 817 pb. Este dGUS de extremos romos se repurificó entonces por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en el sitio Bgl II de pUC18cpexp dando el plásmido intermedio pVZA1 (Figura 2).
30 Ejemplo 3. Construcción de los plásmidos pVZA2, pVZA3, pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400
[0229] El gen cutinasa de longitud completa de P. nicotianae se amplificó en la orientación antisentido por PCR a partir de una clon de cutinasa en el plásmido pZErO-2.1 (Munoz y Bailey, 1998) usando los cebadores VZA 1F (SEQ ID NO: 1) y VZA 2R (SEQ ID NO: 2) que contenían los sitios de restricción Not I y Nco I, respectivamente. 35 Entonces se purificó por electroforesis en gel de agarosa y se ligó en los sitios Not I y Nco I del plásmido pVZA1. El plásmido resultante, pVZA2, se clonó en E. coli y se purificó. Una copia del gen cutinasa en la orientación sentido se amplificó por PCR a partir del mismo clon de cutinasa en el plásmido pZErO-2.1 usando los cebadores VZA 3F y VZA 4R (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente) que contenían los sitios de restricción Apa I y Xho I, respectivamente. Se purificó por electroforesis en gel de agarosa, y se ligó en los sitios de restricción Apa I y Xho I
40 en el plásmido pVZA2 produciendo el plásmido intermedio final pVZA3 (Figura 3). La porción que contiene dGUS y que separa el gen cutinasa en orientación sentido y antisentido se denomina la construcción de silenciamiento. La porción que contiene la construcción de silenciamiento más los elementos reguladores para la construcción (promotor de 35S, 5' UTR y el terminador de 35S) se denomina el casete de silenciamiento (Figura 3).
45 [0230] El casete de silenciamiento se escindió del plásmido pVZA3 por digestión con restricción doble con EcoR I y Hind III y se purificó por electroforesis en gel de agarosa. El plásmido pCAMBIA1201 se digirió dos veces con EcoR I y Hind III, y el casete de silenciamiento se ligó en aquellos sitios para producir el plásmido de transformación de plantas final pVZA100. La presencia del casete de silenciamiento entero se confirmó por digestión con restricción de pVZA100 con PstI (que ligera el inserto entero) y por digestiones con las diversas enzimas de
50 restricción usadas en su ensamblaje. Los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se compararon con patrones molecular conocidos. La secuencia, 2201 nt, de la construcción de silenciamiento se confirmó por secuenciación del ADN, y es SEQ ID NO: 5. Los siguientes pares de oligonucleótidos se usaron como cebadores de PCR para detectar la presencia de los genes respectivos en pVZA100 y en plantas transgénicas: cutinasa (SEQ ID NO: 1 y 2, o SEQ ID NO: 3 y 4); GUS (SEQ ID NO: 9 y 10) e higromicina fosfotrasferasa (SEQ ID
55 NO: 11 y 12).
[0231] La plásmidos de transformación de plantas pVZA200, pVZA300 y pVZA400 se basaron en el mismo principio que pVZA100. La construcción de silenciamiento fue una repetición invertida del gen de patogenicidad de la plaga seleccionado en tanto las orientaciones sentido como antisentido, separadas por el fragmento dGUS. Sin embargo, las construcciones de silenciamiento para pVZA200, pVZA300 y pVZA400 se sintetizaron comercialmente por GenScript Corporation (Piscataway, NJ) con sitios de restricción ApaI y Not I en los extremos 5' y 3', respectivamente, y se clonaron en el vector pUC57.
5 [0232] La construcción de silenciamiento de pVZA200 contuvo los nucleótidos 221 a 820 del gen catepsina B (sitio de GenBank AY702822) del áfido de Myzus persicae. Este áfido es una plaga importante y el vector más eficaz de muchos virus de planta. La catepsina B es una cisteína proteasa, una enzima digestiva requerida para la supervivencia y desarrollo de Myzus persicae. La secuencia de 2031 nt de la construcción de silenciamiento para pVZA200 se muestra como SEQ ID NO: 6.
10 [0233] Entonces se añadieron los elementos reguladores a la construcción de silenciamiento de pVZA200 para dar el casete de silenciamiento de pVZA200. Para esto, el casete de silenciamiento de pVZA100 entero se escindió de pVZA100 por digestión con EcoR I y Hind III y se purificó por electroforesis en gel de agarosa. Se clonó en un pUC19 similarmente digerido. Este plásmido se digirió entonces con ApaI y Not I. La porción de pUC19 que
15 contiene los elementos reguladores de pVZA100 se purificó y se ligó a la construcción de silenciamiento de pVZA200 liberada de pUC57 por digestión con ApaI y Not I. El casete de silenciamiento de pVZA200, ahora flanqueado por los elementos reguladores de pVZA100, aumentó en pUC19. El casete de silenciamiento de pVZA200 entero se escindió de pUC19 por digestión con EcoR I y Hind III y luego se ligó en los sitios EcoR I y Hind III de pCAMBIA1201 para completar el plásmido de transformación de plantas pVZA200. Al igual que con pVZA100,
20 la presencia del casete de silenciamiento entero se confirmó por digestión con restricción de pVZA200 con PstI y por digestiones con las diversas enzimas de restricción usadas en su ensamblaje. Los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se compararon con patrones moleculares conocidos.
Los siguientes pares de oligonucleótido se usaron como cebadores de PCR para detectar la presencia de los genes
25 respectivos en pVZA200 y en plantas transgénicas: catepsina (SEQ ID NO: 38 y 39); GUS (SEQ ID NO: 9 y 10) e higromicina fosfotrasferasa (SEQ ID NO: 11 y 12).
[0234] Los plásmidos de transformación de plantas pVZA300 y pVZA400 se planearon y sintetizaron similarmente. La construcción de silenciamiento de pVZA300 fue una construcción de doble gen que contenía 30 secuencias de genes de dos plagas de plantas diferentes. Se diseñó para contener la misma repetición invertida del gen catepsina B alrededor del fragmento dGUS como la construcción de silenciamiento de pVZA200. Pero además, en cada extremo contuvo la secuencia sentido parcial para la elicitina INF1 de Phytophthora infestans (sitio de GenBank AY766228). Este gen elicitina se requiere por Phytophthora infestans para patogenicidad y como receptor de esterol debido a que Phytophthora spp. no sintetiza los esteroles esenciales para su crecimiento y desarrollo. La
35 secuencia de elicitina tuvo 282 nt de longitud. Por tanto, para obtener una secuencia que se aproxime a 600 nt, la secuencia se repitió para obtener 564 nt.
[0235] Un sitio de restricción ApaI se incluyó en el extremo 5' de la secuencia sentido de elicitina, y un sitio de restricción NotI se incluyó en el extremo 3' de la secuencia antisentido de elicitina. La secuencia sentido de elicitina
40 se añadió al extremo 5' de la secuencia de pVZA200, y la secuencia antisentido de elicitina se añadió al extremo 5' de la secuencia de pVZA200 para completar la construcción de silenciamiento de pVZA300. Tiene 3159 nt de longitud y está compuesto del gen elicitina y el gen catepsina ambos en la orientación sentido, seguido de dGUS, seguido del gen catepsina y gen elicitina, respectivamente, ambos en la orientación antisentido.
45 [0236] La secuencia de la construcción de silenciamiento para pVZA300 se muestra como SEQ ID NO: 7. Esta secuencia se sintetizó por GenScript Corporation y se clonó en el vector pUC57. Los elementos reguladores se añadieron entonces como se ha descrito para pVZA200 para completar el casete de silenciamiento para pVZA300, y se clonó en los sitios EcoR I y Hind III de pCAMBIA1201. Como previamente, la presencia del casete de silenciamiento entero se confirmó por digestión con restricción de pVZA300 con PstI y por digestiones con las
50 diversas enzimas de restricción usadas en su ensamblaje. Los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se compararon con patrones moleculares conocidos. Los siguientes pares de oligonucleótidos se usaron como cebadores de PCR para detectar la presencia de los genes respectivos en pVZA300 y en plantas transgénicas: solapamiento de elicitina y catepsina (SEQ ID NO: 40 y 39), catepsina (SEQ ID NO: 38 y 39); GUS (SEQ ID NO: 9 y 10) e higromicina fosfotrasferasa (SEQ ID NO: 11 y 12).
55 [0237] La construcción de silenciamiento del plásmido de transformación de planta pVZA400 contuvo nt 1-600 de los genes de ARN ribosómico (ADNr) de Phytophthora infestans (sitio de GenBank AJ854293) en las orientaciones sentido y antisentido, respectivamente, separadas por dGUS. Un sitio de restricción ApaI y NotI se incluyeron en los extremos 5' y 3', respectivamente. La secuencia de la construcción de silenciamiento (2031 nt) para pVZA400 se muestra como SEQ ID NO: 8. Se sintetizó por GenScript Corporation y se clonó en el vector pUC57. Los elementos reguladores se añadieron entonces como se ha descrito para pVZA200 para completar el casete de silenciamiento para pVZA400, y se clonó en los sitios EcoR I y Hind III de pCAMBIA1201. Como previamente, la presencia del casete de silenciamiento entero se confirmó por digestión con restricción de pVZA400 con PstI y por
5 digestiones con las diversas enzimas de restricción usadas en su ensamblaje. Los productos de digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se compararon con patrones moleculares conocidos.
[0238] Los siguientes pares de oligonucleótidos se usaron como cebadores de PCR para detectar la presencia de los genes respectivos en pVZA400 y en plantas transgénicas: ADN ribosómico (SEQ ID NO: 41 y 42); GUS (SEQ
10 ID NO: 9 y 10) e higromicina fosfotrasferasa (SEQ ID NO: 11 y 12).
Ejemplo 4. Procedimientos de transformación
[0239] Células vegetales (incluyendo tabaco, soja, patata y maíz) se transformaron con plásmidos de
15 transformación pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400 usando biolística o con pVZA100 usando la cepa PGV 2260 de Agrobacterium tumefaciens. Los cultivos fúngicos se transformaron solo por biolística con los plásmidos de transformación pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400.
[0240] La preparación de microproyectiles de tungsteno u oro para el bombardeo con el dispositivo biolístico
20 accionado por helio fue según el protocolo de Shark y col. 1991. Los microproyectiles se recubrieron con tanto pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300, pVZA400 como sin ADN. Para la transformación de tejido de planta y de cultivo fúngico se usó el aparato Dupont PDS-1000 a vacío (23 mm Hg) y a 1200 PSI con tejidos a 8 y 12 cm de la placa de detención. Para la transformación de plantas de semillero y de plántulas se usó una pistola de partículas casera portátil a 200 PSI, y se mantuvo tan próxima como fue posible al meristemo en desarrollo.
25 [0241] Las transformaciones con Agrobacterium tumefaciens se realizaron esencialmente como se describe por Rogers y col. (1987). Aunque se usan transformación biolística y con Agrobacterium tumefaciens para ejemplificar esta porción de la invención objeto, podrían usarse cualquier procedimiento de introducción de ADN heterólogo en células diana para los fines de transformación que se conocen en la técnica, como se apreciaría
30 fácilmente por el experto en la materia, y como se optimizaría dependiendo de las especies diana.
Ejemplo 5. Transformación de tabaco con pVZA100 y regeneración
[0242] Cultivos de callo organogénico de Nicotiana tabacum cv Xanthi se mantuvieron en cultivos con
35 agitación en el laboratorio y se transfirieron mensualmente a medio fresco MS (Murashige y Skoog, 1962). Los callos se extrajeron de matraces asépticamente, se liberaron por filtración del líquido y se extendieron sobre papel de filtro estéril en una placa de petri de plástico estéril. Se bombardearon con pVZA100 según los procedimientos descritos anteriormente, y el papel de filtro se transfirió a medio sin fitohormona MS durante la noche. Al día siguiente, el papel de filtro se transfirió a medio MS que contiene 1 mg/l de 6-benciladenina, 0,1 mg/l de ácido naftalenoacético, 1 mg/l
40 de tiamina-HCl, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de sacarosa, 6 g/l de Phytagar y 30 ug/ml de higromicina para la selección de las células transgénicas. Para la regeneración, los callos en expansión se transfirieron a medio fresco MS cada 2 semanas. Entonces, los brotes emergentes se transfirieron a medio MS sin fitohormonas para formar raíces. Las plántulas enraizadas se transfirieron a tierra o se probaron directamente para la resistencia a P. nicotianae. Las plantas se cultivaron a madurez en tierra y se recogí la semilla para el posterior análisis.
Ejemplo 6. Transformación fúngica y protocolos de selección
[0243] Cinco mm de discos miceliares de Phytophthora nicotianae, P. sojae y P. infestans se bombardearon según los procedimientos y con las construcciones descritas en los Ejemplos 3 y 5. Los cultivos bombardeados se 50 dispusieron sobre placas de agar V-8 y se incubaron a 27 ºC durante la noche. Al día siguiente se transfirieron a placas de agar V-8 que contenían 400 ug/ml de higromicina y se incubaron a 27 ºC durante 3-4 días. Se cortaron discos (5 mm) del nuevo crecimiento y se transfirieron a placas de petri que contenían 15 ml del caldo V-8 y se incubaron a 27 ºC durante 2 días. Los tapetes miceliares se lavaron con agua estéril, se secaron presionando y se incubaron durante 2 días con 10 ml de extracto de tierra para inducir la formación de esporangios. Para inducir la
55 liberación de zoosporas, los tapetes se colocaron en agua desmineralizada estéril y se enfriaron a 4 ºC durante 3060 min. Las zoosporas se recogieron por centrifugación durante 5 min a 5.000 g y 4 ºC. Para la selección, la concentración de zoosporas se ajustó a aproximadamente 1.000/ml y se sembró en agar V-8 que contenía 400 ug/ml de higromicina y X-gluc (Jefferson y col., 1986) y se incubaron durante varios días a 27 ºC.
[0244] Aquellas cepas aisladas establemente transformadas con el gen GUS en pCAMBIA1201 aparecieron sobre el agar X-gluc como pequeñas colonias azules que se originaron a partir de zoosporas individuales. Se transfirieron a placas individuales de agar V-8 que contenían 400 ug/ml de higromicina, y los cultivos se tiñeron consistentemente de azul, positivo para GUS, después de muchas transferencias. Aquellas cepas aisladas
5 transformadas con los plásmidos de silenciamiento pVZA3100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400 también aparecieron inicialmente como pequeñas colonias azules que se originaron a partir de zoosporas individuales. Se transfirieron a placas de agar V-8 que contenían 400 ug/ml de higromicina y X-gluc. Después de 2-3 transferencias sobre este medio, aquellas colonias que sobrevivieron se volvieron blancas, que indica que el gen GUS se había silenciado. Todos los cultivos se mantuvieron a 27 ºC y se transfirieron mensualmente a medio fresco.
Ejemplo 7. Transformación de maíz, sojas y patata
[0245] Se transformó maíz bombardeando callo tipo II de germoplasma Hi II con partículas de oro recubiertas con dos plásmidos, pVZA100 y pBAR184 (Frame y col., 2000). pBAR184 se incluyó de manera que los co
15 transformantes pudieran seleccionarse y regenerarse sobre medios que contenían el herbicida bialafos en vez de higromicina. Los callos se cultivaron y se seleccionaron sobre medios basados en N6 medios que contenían 2 mg/l cada uno de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y bialafos. Para la regeneración y enraizamiento, embriones se transfirieron a medio MS que contenía 2 mg/l de bialafos, y sin fitohormonas. Las plántulas enraizadas se ensayaron por PCR.
20 [0246] Se transformó soja tanto por Agrobacterium tumefaciens como biolística. Embriones maduros se escindieron asépticamente de semillas hidratadas de soja Williams. Entonces, los embriones se pusieron en remojo durante 15 min en algunos mililitros de un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que se había cultivado sobre un agitador durante la noche a 28 ºC y contuvieron tanto pCAMBIA1201 como pVZA100. Los embriones tratados se
25 dispusieron sobre medio MS que contenía 15 mg/l de higromicina y fitohormonas (BAP y NAA) y luego sobre medio MS libre de fitohormonas para enraizar. Se formaron y germinaron estructuras similares a embriones y se produjeron hojas (Figuras 6A-6D), pero no se regeneraron plantas ni enraizaron, a pesar de probar muchos medios. Las transformación biolística de soja se realizó usando la pistola de partículas casera portátil. Plantas de semillero de 810 días de edad y 6-10 cm de alto se bombardearon con partículas de oro recubiertas con tanto pCAMBIA1201,
30 pVZA100, pVZA200, pVZA300 o VZA400 como sin ADN. Las plantas se cultivaron en el invernadero y se ensayaron por PCR. Se recogió semilla maduro y se probó para resistencia a P. sojae.
[0247] Se transformó patata tanto por Agrobacterium tumefaciens como biolística. Patatas Russett Burbank y Alpha se transformaron por Agrobacterium tumefaciens. Los tubérculos se desinfectaron superficialmente y los “ojos” 35 de las patatas se escindieron y se sembraron sobre medio sólido MS sin fitohormonas. Los ojos germinaron, y se produjeron plántulas cortando una sección de nodo que contenía una hoja y colocando el tallo en medio fresco MS. Se produjeron plántulas enraizadas de 5-7 cm de altura en 10-15 días. Las hojas se quitaron de las plántulas, y los tallos se cortaron en trozos de 1 cm de longitud. Entonces, los trozos se pusieron en remojo como antes durante 15 min en algunos mililitros de un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que se había cultivado en un agitador durante 40 la noche a 28 ºC y contuvo tanto pCAMBIA1201 como pVZA100. Los trozos se transfirieron sobre papel de filtro estéril y se siguió el procedimiento de cultivo de tejido de Cearley y Bolyard (1997). Se produjeron estructuras similares a tubérculos bulbosos y similares a raíz (Figura 8), pero no se regeneraron plantas ni enraizaron, a pesar de probar muchos medios. Para transformación biolística, plántulas de patata de 3-5 cm de altura se trasplantaron en tierra. Después de 2-3 días se bombardearon usando la pistola de partículas casera portátil y partículas de oro
45 recubiertas con tanto pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 o pVZA400 como sin ADN. Las plantas se cultivaron en el invernadero y se ensayaron por PCR y para sus reacciones a áfidos y P. infestans.
Ejemplo 8. Extracción de ADN y de ARN de tejidos de planta y fúngicos y protocolos de PCR y RT/PCR
50 [0248] Se extrajo ADN total de tejido de hoja del tabaco y micelio de Phytophthora nicotianae mediante el procedimiento de Dellaporta y col., 1983. Normalmente, una muestra de 100 mg de tejido congelado se molió a un polvo fino en un tubo de microcentrífuga que contenía nitrógeno líquido, y luego se homogeneizó en 500 ul de tampón de extracción con un pistilo de acero inoxidable accionado por motor.
55 [0249] Se extrajo ARN total para reacciones de RT/PCR de tejido de hoja y micelio fúngico por el procedimiento de TRIzol de Invitrogen. Normalmente, 100 mg de tejido se congelaron en nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. Se molió a polvo fino y luego se homogeneizó en 1,0 ml de TRIzol con un pistilo accionado por motor: La mezcla se dejó incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Entonces se añadieron 200 ul de cloroformo y se mezclaron por agitación con vórtex. La suspensión se incubó 5 min a temperatura ambiente.
Los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 min a 4 ºC. La fase acuosa se transfirió a un tubo limpio, se añadieron 500 ul de isopropanol y las muestras se mezclaron y se incubaron 10 min a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron de nuevo durante 10 min a 4 ºC, y el sobrenadante se desechó. El sedimento se aclaró una vez con 250 ul de etanol al 75 % por agitación con vórtex y centrifugando 5 min a 4 ºC. El sedimento de ARN se
5 secó brevemente al aire, se disolvió en 20 ul de agua sin RNasa y se guardó a -70 ºC hasta que se usó.
[0250] Se usó un procedimiento similar para grandes preparaciones de ARN total para detección de ARNip. Normalmente, 1 gramo de hojas congeladas o micelio fúngico se molió a polvo fino en nitrógeno líquido y se homogeneizó con 15 ml de reactivo TRIzol. Luego se añadieron 3 ml de cloroformo y se incubaron como antes. El
10 sobrenadante se recuperó por centrifugación y el ARN se precipitó con 1/2 volumen de isopropanol. El sedimento se lavó con 75 % de etanol, se secó al aire y se resuspendió en 80 ul de agua sin RNasa.
[0251] Las reacciones de PCR para tanto tejidos de planta como fúngicos se realizaron esencialmente como se describe por Munoz y Bailey, 1998, excepto que los volúmenes de reacción ascendieron a 50 ul. Las reacciones
15 contuvieron 1X tampón PCR (10X disolución: KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM a pH 9,0, y 1 % de Triton X-100), MgCl2 2,5 mM, 200 µM de cada trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP), 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Invitrogen o Promega), 100 pmoles del cebador de oligonucleótidos directo e inverso apropiado (véase SEQ ID NO:), 1-10 ul de molde y agua desionizada suficiente igual a 50 ul. Las preparaciones de ADN usadas como moldes se diluyeron normalmente a 50 ng por microlitro, y 1 microlitro se usó como molde.
20 [0252] Las condiciones de reacción de PCR se normalizaron, excepto la temperatura de hibridación, que se varió dependiendo de Tm de los cebadores de oligonucleótidos para el gen que se amplificaba. Las condiciones normalizadas fueron 94 ºC durante 2 min para la fusión, seguido de 40 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a la temperatura de hibridación y 2 min a 72 ºC para la elongación. Después de 40 ciclos hubo 10 min de elongación a
25 72 ºC, y las reacciones se mantuvieron a 4 ºC hasta que se ensayaron.
[0253] Las reacciones de RT/PCR se llevaron a cabo en 3 etapas separadas, tratamiento con DNasa, transcripción inversa y luego PCR, como se recomienda por Invitrogen. El tratamiento con DNasa se realizó para eliminar cualquier ADN llevado en la purificación de ARN para garantizar que solo el ARN mensajero estaba siendo
30 transcrito, y no el ADN genómico. La mezcla de DNasa contuvo por reacción: 3 ug de ARN, 1 ul de 10X tampónDNasa I, 2 ul ADNsa I, 0,5 ul de RNasa OUT y agua (sin RNasa) a 10 ul de volumen final. Ésta se incubó a 26 ºC durante 30 min. Luego se añadieron 6,5 ul de EDTA 25 mM por tubo y se incubó durante 15 min a 65 ºC.
[0254] Para las reacciones de transcriptasa inversa (RT) se prepararon una mezcla I y mezcla II. La mezcla I
35 contuvo por reacción: 1 ul de dNTPs, 4 ul de 5X tampón RT y 2 ul de ditiotreitol. La mezcla II contuvo por reacción: 0,5 ul de RNasa OUT, 1 ul de transcriptasa inversa y 1 ul de agua. Los cebadores de oligonucleótidos apropiados (1 ul de cada uno o agua) se dispusieron en los tubos apropiados y se añadieron apropiadamente la mezcla I y II. La mezcla I se colocó en cada tubo, la mezcla II en los tubos numerados impares y 2,5 ul agua en los tubos numerados pares; luego se añadieron 10 ul de ARN tratado con RNasa a cada tubo. Las reacciones de RT se incubaron a 42 ºC
40 durante 60 min y luego a 70 ºC durante 15 min.
Ejemplo 9. Detección de ARNip en tejidos de planta y fúngicos
[0255] El procedimiento fue esencialmente como se describe por Hutvagner y col., 2000. Se extrajo ARN total
45 de hojas de tabaco o micelio fúngico como antes. Se cuantificó en un espectrofotómetro a 260 nm y 80 ug se fraccionaron por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante sobre 15 % de geles durante 2,5 h a 0,025 Amp. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio, se fotografiaron y el ARN se transfirió a Hybond N+ (Amersham) durante 1 h a 10 voltios a 4 ºC. la hibridación se realizó como se describe por Sambrook y col. (1989) para transferencia Northern.
50 [0256] La sonda se transcribió a partir de un producto de PCR de 500 pb del gen cutinasa y se marcó con 32P por cebado al azar. Las membranas se prehibridaron 1 h a 50 ºC con disolución de tampón HYBAID de Amersham y se hibridaron durante al menos 16 h a 50 ºC. Los lavados se realizaron dos veces con 5X SSC a temperatura ambiente. Las señales de hibridación se detectaron por detección y cuantificación de la radiactividad usando un
55 escáner de detección y cuantificación de la radiactividad Storm 860 de Molecular Dynamics.
Ejemplo 10. Tinción de GUS de tejidos de planta y fúngicos
[0257] Preparación del sustrato X-GLUC: para 200 ml, poner un vaso de precipitados con 150 ml de agua destilada y añadir los siguientes componentes: Tampón fosfato de sodio pH 7,0 (1 M), 20 ml, EDTA pH 8,0 (500 mM), 4 ml, ferrocianuro de potasio K4Fe(CN)6.3H2O, 0,042 g, Triton X-100, 0,2 ml. Agitar durante 10 min. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Disolver 100 mg de X-GLUC en 2 ml de DMSO o dimetilformamida. Añadir el X-GLUC en DMSO al vaso de precipitados. Esterilizar por filtración la disolución, dispensar en alícuotas de 10 ml y guardar a -20
5 ºC. Para incorporación en medio de crecimiento, añadir 100 mg de polvo de X-GLUC disuelto en DMSO a 250 ml de agar V8 enfriado y listo para dispensar para cepas aisladas fúngicas o a medio MS para materiales de planta.
[0258] Procedimiento de tinción: añadir suficiente disolución de X-GLUC para cubrir el explante pequeño de tejido de planta e incubar a 37 ºC durante 3-24 horas. Para cepas aisladas fúngicas o materiales de planta en placas
10 de agar X-gluc, incubar a 24-27 ºC durante 3-24 horas.
[0259] Este procedimiento es esencialmente como se describe por Jefferson, y col., 1986.
Ejemplo 11. Pruebas de inoculación de plantas con hongos
15 [0260] Se probaron tres procedimientos para inocular tabaco con P. nicotianae. Todas dieron resultados satisfactorios, pero el procedimiento del palillo fue más riguroso y más fiable.
1. Procedimiento del palillo: Este procedimiento se proporcionó por Dr. A. Csinos (comunicación persona). Se
20 rompieron por la mitad palillos de madera redondos y se esterilizaron en autoclave en caldo V-8. Los palillos estériles se pusieron planos en placas de agar V-8, y 6-8 discos miceliares (5 mm de diámetro) de P. nicotianae se separaron equidistantes sobre la placa. Las placas se incubaron a 27 ºC para al menos 2 semanas, cuando las clamidosporas fueron obvias por examen microscópico. La inoculación de plantas se lleva a cabo dejando 1 ó 2 palillos en la tierra cerca de la corona de la planta. Las plantas se cubrieron con una tienda de campaña de plástico para mantener la
25 humedad relativa al 100 % y se incubaron a 27 ºC. Los síntomas fueron normalmente evidentes después de 2-4 días, y plantas susceptibles murieron normalmente después de 5-8 días. Las reacciones de plantas transgénicas resistentes varían de ser asintomáticas a producir lesiones del tallo limitadas de 1-4 cm de longitud, que no interfieren con el crecimiento de la planta y posterior desarrollo de flores y semillas.
30 2. El procedimiento de remojo miceliar: Micelios de P. nicotianae se cultivaron durante la noche a 27 ºC en caldo V
8. Plantas de semillero transgénicas o plantas en tierra se lavaron libres de medio y se dispusieron en 100 ml de estéril agua desionizada. Los micelios se cortaron en tiras con pinzas y se añadieron al agua. Las plantas se cubrieron con una tienda de campaña de plástico para mantener la humedad relativa al 100 % y se incubaron a 27 ºC. Los síntomas fueron normalmente evidentes después de 2-4 días, y plantas susceptibles murieron normalmente
35 después de 5-8 días. Las raíces y corona de las plantas susceptibles se maceraron completamente (Figura 11A). Las raíces de las plantas transgénicas resistentes parecieron estar “quemadas” en las puntas (Figura 11B), o se definieron lesiones en la corona, pero esto no interfirió con el crecimiento de la planta y posterior desarrollo de flores y semillas después de plantar las plantas en tierra.
40 3. Inoculación de zoosporas: Se produjeron abundantes esporangios colocando tiras de hojas de tabaco esterilizadas en la superficie en cultivos en crecimiento de P. nicotianae a 27 ºC en caldo V-8 durante la noche. Se liberaron millones de de zoosporas, colocando las esteras en agua desmineralizada estéril y se enfriaron a 4 ºC durante 30-60 min. Las zoosporas se recogieron por centrifugación durante 5 min a 5.000 g y 4 ºC.
45 [0261] Se inocularon plantas de soja con P. sojae por dos procedimientos diferentes. Las plantas de semillero se inocularon cortando un cilindro de 3 mm de un cultivo activamente en crecimiento sobre agar V8 con un perforacorchos y colocando el cilindro en la axila de un hipocotilo. El inóculo se mantuvo en su sitio por Parafilm y las plantas se encerraron en una bolsa de plástico para dar el 100 % de humedad. Las hojas de plantas de soja se inocularon con P. sojae colocando una hoja en una placa de petri con10 ml de agua estéril y añadiendo 1 ó 2
50 tapones de inóculo como antes.
[0262] Se inocularon hojas de patata con P. infestans colocando una hoja en una placa de petri con10 ml de agua estéril y añadiendo 1 ó 2 tapones de inóculo como antes, o colocando 10 ul de una suspensión de zoosporas por foliolo.
55 [0263] En todas las pruebas de inoculación, las reacciones de planta u hoja se leyeron y se registraron diariamente hasta que las plantas u hojas inoculadas dejaron de morir o no mostraron pruebas de infección.
Ejemplo 12. Caracterización molecular de plantas de tabaco resistentes a P. nicotianae
[0264] Se extrajeron ADN y ARN de plantas transformadas de la generación T0 y T2 del Ejemplo 27. Se realizaron pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y transcripción inversa/PCR (RT/PCR) sobre las muestras de ADN y ARN, respectivamente. Las reacciones de PCR se realizaron para determinar la presencia de los
5 transgenes en las plantas. Las reacciones de RT/PCR se realizaron para determinar si los transgenes estaban siendo expresaron o se habían silenciado. Los resultados fueron los mismos para tanto las generaciones T0 como T2, y se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8. Detección y expresión de genes en plantas de tabaco transgénicas y naturales
Higromicina fosfotransferasa
GUS
Tejido ensayado
PCR RT-PCR PCR RT-PCR
Tabaco natural
- - - -
Tabaco + pCAMBIA1201
+ + + +
Línea transgénica 4 de pVZA100
+ + + -
Línea transgénica 23 de pVZA100
+ + + -
Línea transgénica 26 de pVZA100
+ + + -
Línea transgénica 27 de pVZA100
+ + + -
ADN de plásmido de PVZA100
+ na + na
Cutinasa
ARN ribosómico 16S
Tejido ensayado
PCR RT-PCR PCR RT-PCR
Tabaco natural
- - + +
Tabaco + pCAMBIA1201
- - + +
Línea transgénica 4 de pVZA100
+ - + +
Línea transgénica 23 de pVZA100
+ - + +
Línea transgénica 26 de pVZA100
+ - + +
Línea transgénica 27 de pVZA100
+ - + +
ADN de plásmido de PVZA100
+ na - Na
+ = Positiva (banda de gel) - = Negativa (sin banda de gel) na = No aplicable
[0265] En el panel superior de la Tabla 8, los datos en la primera columna demuestran que el gen de
10 resistencia a higromicina (higromicina fosfotransferasa) no estaba presente en las plantas de tabaco natural, pero estaba presente en todas las plantas transformadas con tanto el plásmido pCAMBIA 1201 solo como con pVZA100. Los datos en la segunda columna demuestran que el gen de resistencia a higromicina se expresó en todas las plantas en las que estaba presente. Los datos en la tercera columna demuestran que el gen GUS no estaba presente en las plantas de tabaco natural, pero estaba presente en todas las plantas transformadas con tanto el
15 plásmido pCAMBIA 1201 solo como con pVZA100. Los datos en la cuarta columna demuestran que el gen GUS se expresó solo en las plantas transformadas con pCAMBIA 1201, en la que no estaba presente construcción de silenciamiento de GUS. Sin embargo, GUS se silenció en todas las plantas transgénicas que contenían la construcción de silenciamiento pVZA100.
20 [0266] En el panel inferior de la Tabla 8, los datos en la primera columna demuestran que el gen cutinasa fúngico no estaba presente en las plantas de tabaco natural, ni en aquellas plantas transformadas con el plásmido pCAMBIA 1201 solo. Sin embargo, estaba presente en todas las plantas transformadas con pVZA100. Los datos en la segunda columna demuestran que el gen cutinasa fúngico no se expresó en ninguna de las plantas naturales ni en aquellos plantas transformadas con tanto el plásmido pCAMBIA 1201 solo como con pVZA100. Los datos en la
25 tercera columna demuestran que el gen ARN ribosómico 16S estaba presente en las plantas de tabaco transgénicas y todas las naturales, pero no en la construcción de silenciamiento. Los datos en la cuarta columna demuestran que el gen ARN ribosómico 16S se expresó en todas las plantas de tabaco, tanto naturales como transgénicas.
[0267] Cuando las plantas de tabaco naturales o aquellas transformadas con pCAMBIA1201 se inocularon
30 con P. nicotianae, siempre fueron susceptibles, mientras que aquellas transformadas con pVZA100, tales como las líneas transgénicas 4, 23, 26 y 27 fueron resistentes (Figura 11A y B, respectivamente).
Ejemplo 13. Transformación fúngica y caracterización
35 [0268] Se bombardean diferentes cultivos de tanto P. nicotianae como P. sojae con tanto pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 como pVZA400 como antes, y se producen cultivos de zoosporas individuales a partir de los cultivos viales.
[0269] Aquellos cultivos de P. nicotianae bombardeados con pCAMBIA1201 y pVZA100 se probaron para patogenicidad sobre tabaco Xanthi natural normalmente susceptible. Aquellos cultivos transformados con pCAMBIA1201 siguieron patógenos, mientras que aquellos cultivos transformados con pVZA100 fueron no patógenos. Se cultivaron cultivos naturales y transgénicos de P. nicotianae en medio V8 líquido y se extrajeron ADN
5 y ARN como se ha descrito anteriormente. Aquellas muestras se analizaron por PCR y RT/PCR como antes. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
Tabla 9. Detección y expresión de genes en Phytophthora nicotianae transgénica y natural
Higromicina fosfotransferasa
GUS
Tejido ensayado
PCR RT-PCR PCR RT-PCR
P. nicotianae natural
- - - -
P. nicotianae + pCAMBIA 1201
+ + + +
P. nicotianae + pVZA100
+ + + -
ADN de plásmido de pVZA100
+ na + na
Cutinasa
ARN ribosómico 16S
Tejido ensayado
PCR RT-PCR PCR RT-PCR
P. nicotianae natural
+ + + +
P. nicotianae + pCAMBIA 1201
+ + + +
P. nicotianae + pVZA100
+ - + +
ADN de plásmido de pVZA100
+ na - Na
+ = Positiva (banda de gel) - = Negativa (sin banda de gel) na = No aplicable
[0270] En el panel superior de la Tabla 9, los datos en la primera columna demuestran que el gen de resistencia a higromicina no estaba presente en P. nicotianae natural, pero estaba presente en aquellos cultivos de
10 P. nicotianae transformados con tanto el plásmido pCAMBIA 1201 solo como con pVZA100. Los datos en la segunda columna demuestran que el gen de resistencia a higromicina se expresó en todos los cultivos en los que estaba presente.
[0271] Los datos en la tercera columna demuestran que el gen GUS no estaba presente en P. nicotianae
15 natural, pero estaba presente en aquellos cultivos de P. nicotianae transformados con tanto el plásmido pCAMBIA 1201 solo como con pVZA100. Los datos en la cuarta columna demuestran que el gen GUS estaba siendo expresado solo en P. nicotianae transformado con pCAMBIA 1201, donde no estaba presente construcción de silenciamiento de GUS. Sin embargo, GUS se silenció en todos los cultivos de P. nicotianae transgénicos que contenían la construcción de silenciamiento de pVZA100.
20 [0272] En el panel inferior de la Tabla 9, los datos en la primera columna demuestran que el gen cutinasa fúngico estaba presente en P. nicotianae natural, además de aquellos cultivos transformados con tanto el plásmido pCAMBIA 1201 solo como con la construcción de silenciamiento de pVZA100, debido a que la cutinasa es un gen constitutivo de P. nicotianae. Los datos en la segunda columna demuestran que el gen cutinasa fúngico se expresó
25 en tanto P. nicotianae natural, además de en los cultivos transformados con el plásmido pCAMBIA 1201. Sin embargo, la expresión de cutinasa se silenció en aquellos cultivos de P. nicotianae transformados con la construcción de silenciamiento de pVZA100.
[0273] Los datos en la tercera columna demuestran que el gen ARN ribosómico 16S estaba presente en P.
30 nicotianae natural y todos los transgénicos, pero no en la construcción de silenciamiento. Los datos en la cuarta columna demuestran que el gen ARN ribosómico 16S estaba siendo expresado en tanto los cultivos de P. nicotianae naturales como transgénicos.
El examen microscópico de cultivos de P. nicotianae y P. sojae bombardeados con pCAMBIA1201, pVZA100 y
35 pVZA200 indicó que todos crecieron normalmente como las naturales y sin malformaciones visuales (Figura 14A). Se observaron resultados similares para cultivos de P. nicotianae reaislados de tabaco natural infectado o tabaco transformado con pVZA100. Sin embargo, aquellos cultivos de P. nicotianae bombardeados con pVZA300 o pVZA400 (Figura 14B, C, D) y aquellos de P. sojae también bombardeados con pVZA3 00 o pVZA400 (Figura14E, F) crecieron muy lentamente, sus hifas estuvieron gravemente malformadas y algunos cultivos murieron.
40 [0274] La transformación de P. nicotianae y P. sojae con pCAMBIA1201 y pVZA200 no tuvo efectos perjudiciales sobre los hongos debido a que aquellos plásmidos no contenían genes fúngicos y no podían inducir silenciamiento en aquellos hongos. Además, la transformación de P. nicotianae y P. sojae con pVZA100, que contenía el gen cutinasa de P. nicotianae, les permitió crecer normalmente, pero provocó que ambas especies
fueran no patógenas, debido a que el gen cutinasa, que es esencial para patogenicidad, se silenció por pVZA100.
[0275] La transformación de P. nicotianae y P. sojae con pVZA300 o pVZA400, que contenían los genes elicitina y de ARN ribosómico de P. infestans, respectivamente, tuvieron ambos marcados efectos perjudiciales sobre 5 el crecimiento y el desarrollo de tanto P. nicotianae como P. sojae. Hubo insuficiente crecimiento incluso para proporcionar suficiente inóculo para las pruebas de patogenicidad. Esto sugiere que los genes elicitina y de ARN ribosómico se silenciaron en los hongos transformados, y que el silenciamiento de cualquiera de estos genes importantes es muy perjudicial o letal para los hongos. Esto se soporta adicionalmente por el hecho de que tanto pVZA200 como pVZA300 contuvieran el gen catepsina de Myzus persicae. Pero además, pVZA300 contuvo el gen
10 elicitina de P. infestans. Como pVZA200 no provocó efectos visibles, y pVZA300 provocó efectos perjudiciales, el gen elicitina parece ser responsable de la malformación producida por pVZA300.
[0276] Como antes, cuando P. nicotianae cutinasa indujo planta resistencia a otras especies de Phytophthora, estos resultados demuestran que genes esenciales de una especie de Phytophthora (P. infestans), cuando se 15 introdujeron en construcciones de silenciamiento, pueden producir efectos muy perjudiciales sobre otras especies de Phytophthora (P. nicotianae y P. sojae), que deben ser útiles en controlar Phytophthora spp. directamente en plantas
o por despatogénesis de tierra y campos infestados.
Ejemplo 14. Demonstración del silenciamiento de genes en tabaco por detección de ARNip
20 [0277] Otra prueba de que el silenciamiento de genes está produciéndose es la detección de ARN interferentes pequeños (ARNip) en las plantas transformadas supuestamente silenciadas (Ejemplos 5 y 13) y hongo transformado (Ejemplo 13). Los ARNip tienen 21 a 25 nucleótidos (nt) de longitud, con homología con el ARN que está siendo “silenciado”.
25 [0278] Se extrajo ARN total de plantas de tabaco de la generación T0 y T1 naturales y transgénicas supuestamente silenciadas y P. nicotianae natural y supuestamente silenciada. El ARN se separó por electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfirió a una membrana y se hibridó con una sonda transcrita de un producto de PCR de 500 pb del gen cutinasa y se marcó con 32P por cebado al azar. Las condiciones de hibridación y detección
30 fueron como en el Ejemplo 9 anterior.
[0279] Las Figuras 4a y 4b muestran los resultados de hibridación de la sonda del gen cutinasa con ARN de plantas de tabaco naturales y transgénicas y P. nicotianae transgénica. En la Figura 4a, el carril 1 muestra la hibridación con una mezcla de los oligonucleótidos de 35 nt VZA 3F (SEQ ID NO: 3) y VZA 4R (SEQ ID NO: 4). 35 Éstos se usaron para cebar la reacción de PCR para sintetizar el molde para la producción de la sonda. Por tanto, son completamente homólogos al molde, y también de un tamaño molecular conocido. Los carriles 2 y 3 contuvieron ARN de plantas de tabaco naturales. No hay hibridación debido a ni el gen cutinasa ni la construcción de silenciamiento están presentes en plantas naturales, de ahí que no se produzca ARNip. Los carriles 4 a 11 contuvieron el ARN de plantas de la generación T0 y T1 de las líneas transgénicas 4, 23, 26 y 27. La hibridación
40 demuestra la presencia del ARNip en cada una de las plantas transgénicas, que indica la degradación del ARNm de cutinasa, y el silenciamiento concomitante del gen cutinasa en las plantas transgénicas.
[0280] En la Figura 4b, el carril 1 muestra de nuevo la hibridación con una mezcla de los oligonucleótidos de 35 nt VZA 3F y VZA 4R. El carril 2 muestra la hibridación con el ARN de P. nicotianae natural. La intensa mancha de 45 620 nt de longitud se corresponde con el transcrito de longitud completa del gen cutinasa en P. nicotianae natural. El gen cutinasa es constitutivo en este cultivo, y no está presente construcción de silenciamiento. Por tanto, el transcrito de ARNm de longitud completa sobrevive y no es digerido a ARNip. Los carriles 3 a 6 contuvieron el ARN de cuatro cultivos de P. nicotianae transformados con la construcción de silenciamiento. La hibridación demuestra la presencia de ARNip en cada uno de los cultivos transgénicos de P. nicotianae, que indica la degradación del ARNm
50 de cutinasa, y el silenciamiento concomitante del gen cutinasa en P. nicotianae transgénica.
[0281] La prueba biológica para el silenciamiento del gen cutinasa esencial en P. nicotianae transgénica procede del hecho de que aquellos cultivos transformados con la construcción de silenciamiento del gen cutinasa, pVZA100, se vuelven no patógenos, mientras que aquellos cultivos transformados con el plásmido pCAMBIA 1201 55 solo permanecen igualmente patógenos para los cultivos naturales de los que se derivaron. Otra prueba del silenciamiento de genes en presencia de la construcción de silenciamiento pVZA100 se proporciona por el gen GUS. La reacción de GUS siempre fue positiva en aquellos cultivos que se transformaron con pCAMBIA1201 y fueron patógenos. Mientras que siempre fue negativo en aquellos cultivos que se transformaron con pVZA100 y fueron no patógenos. Esto se correlaciona directamente con la actividad o silenciamiento del gen cutinasa en el mismo cultivo.
Ejemplo 15. Secuencias de cutinasa de Phytophthora altamente homólogas útiles en el presente documento
[0282] El análisis de secuencias del gen de Phytophthora proporciona una base para diseñar polinucleótidos
5 heterólogos que confieren resistencia a especies cruzadas. Como una ilustración del uso de análisis bioinformático para seleccionar secuencias de genes de patogenicidad de la plaga útiles según la presente invención, se clonaron y se secuenciaron 25 cepas aisladas diferentes de Phytophthora. Las cepas aisladas incluyeron las nueve especies P. capsici, P. cinnamomi, P. citricola, P. citrophthora, P. hevea, P. megakarya, P. megasperma (P. sojae), P. nicotianae y P. palmivora. Cada una de estas secuencias (véanse SEQ ID NO 13 a 37) son útiles para polinucleótidos de la
10 presente invención.
[0283] Por ejemplo, nueve de las secuencias son idénticas y 11 son > 99 % idénticas a la secuencia del gen cutinasa de P. nicotianae. Una letra X sombreada indica una diferencia en secuencia.
15 Tabla 10. Las secuencias de nucleótidos de los genes cutinasa de 25 cepas aisladas que comprenden 9 especies de Phytophthora.
[0284] Sin desear quedar ligado a teoría, estas secuencias de cutinasa proporcionan la base molecular para la resistencia cruzada demostrada anteriormente y soportan la aplicación general de la secuenciación de genes y 5 análisis bioinformático para seleccionar otros genes de patogenicidad de plagas con resultados similares.
10 [0285] Una epidemia natural de la enfermedad del moho azul del tabaco producida por Peronospora tabacina se produjo en el invernadero que contenía las plantas de tabaco. Se observaron diferencias claras en la gravedad del moho azul. Estuvieron disponibles tres genotipos de plantas para evaluación: plantas transgénicas que contenían el gen cutinasa y que ya se habían seleccionado para resistencia a P. nicotianae, plantas transgénicas para cutinasa que todavía no se habían seleccionado para resistencia a P. nicotianae, y plantas de tabaco Xanthi naturales o no
15 transgénicas. Los números en las fotografías en la Figura 5 se refieren a las diferentes clasificaciones de enfermedad, no las diferentes líneas o genotipos de planta.
Tabla 11. Reacciones de diferentes genotipos de tabaco a una epidemia natural de moho azul del tabaco producida por Peronospora tabacina en el invernadero
20 [0286] La Tabla 11 muestra que entre las plantas resistentes a P. nicotianae, el 68 % de ellas estuvieron
Genotipo de tabaco
Clasificación y análisis de enfermedad
1*
2 3 4 Nº Plantas 1+2 Nº Plantas 3+4
Resistente a Phytophthora
34** 11 9 12 45 (68)*** 21 (32)
Transgénico no seleccionado
62 20 67 26 82 (47) 93 (53)
Xanthi Natural
0 3 12 30 3 (7) 42 (93)
* = Clasificaciones de enfermedad.
1 = Sin síntomas
** = Número de plantas en esa clase.
2 = Síntomas obvios
*** = Porcentaje de plantas en esa clase.
3 = Síntomas graves
4 = Muerta o muriendo
moderadamente afectadas por Peronospora tabacina (clasificaciones de enfermedad 1 + 2), y el 32 % estuvieron
gravemente afectadas (clasificaciones de enfermedad 3 + 4); aproximadamente una relación 2:1 en favor de la
5 resistencia a Peronospora tabacina. Para las plantas sin seleccionar transgénicas, el 47 % estuvieron
moderadamente y el 53 % gravemente afectadas; aproximadamente una relación 1:1 en favor de resistencia a
Peronospora tabacina. De las plantas naturales, 7 % estuvieron moderadamente y 93 % estuvieron gravemente
afectadas; aproximadamente una relación 13:1 en favor de susceptibilidad. Por tanto, la Figura 5 y la Tabla 11
demuestran claramente diferentes niveles de resistencia en los diferentes genotipos de tabaco, y que el gen cutinasa 10 de P. nicotianae induce una amplia resistencia en tabaco a Peronospora tabacina, un hongo distantemente
relacionados con P. nicotianae.
[0287] La Tabla 12 demuestra que Phytophthora nicotianae y Peronospora tabacina no están estrechamente
relacionadas taxonómicamente. Todavía, como se muestra anteriormente, el gen cutinasa de Phytophthora 15 nicotianae confiere resistencia a tanto Phytophthora nicotianae como a Peronospora tabacina. Por tanto, el gen
cutinasa de Phytophthora nicotianae proporciona amplia resistencia contra al menos tres especies fúngicas
diferentes y tres enfermedades fúngicas. Protege contra dos especies diferentes de Phytophthora, P. nicotianae en
tabaco y P. sojae en sojas, y también protege el tabaco contra tanto Phytophthora nicotianae como Peronospora
tabacina. Estos dos especies fúngicas se clasifican en el mismo orden, pero en familias y géneros perfectamente 20 diferentes (Tabla 12).

Tabla 12. Relación taxonómica entre Phytophthora nicotianae y Peronospora tabacina
Phytophthora nicotianae
Peronospora tabacina
Clase
Oomycetes Oomycetes
Orden
Peronosporales Peronosporales
Familia
Pythiaceae Peronosporaceae
Género
Phytophthora Peronospora
Especie
Phytophthora nicotianae Peronospora tabacina
25 Ejemplo 17. Sojas transformadas y hechas resistentes con construcciones de silenciamiento de genes de
Phytophthora
[0288] Cultivo de tejido de soja: Emergieron brotes de muchos de los embriones de soja transformados con pVZA100 (Ejemplo 7) por A. tumefaciens y por biolística (Figura 6). Otros callos sobre la placa permanecieron
30 verdes y fueron muy desmenuzables (Figura 7A). Se extrajo ADN de tres muestras cada uno de los brotes y callos desmenuzables, y se realizó PCR usando los cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar los genes GUS (SEQ ID NO: 9 y 10) e higromicina fosfotransferasa (SEQ ID NO: 11 y 12).
[0289] Tanto los genes GUS como de resistencia a higromicina (HPT) se detectaron en el callo de soja, como
35 se muestra en la Figura 7B. El panel superior de la Figura 7B muestra que 6 de las muestras (carriles 1-6) fueron transgénicas para HPT (el carril 7 es el control de plásmido). El panel inferior muestra que al menos 4 (carriles 1, 2, 4, 5) de las 6 muestras fueron transgénicas para el gen GUS (el carril 7 es el control de plásmido). Estos datos demuestran que las células vegetales huésped fueron transgénicas con el polinucleótido heterólogo pVZA100.
40 [0290] El crecimiento continuo de las plántulas y brotes sobre el medio que contenía 15 mg/l de higromicina demuestra que los callos expresaron el polinucleótido heterólogo.
[0291] El hecho de que los callos de soja fueran negativos para GUS en su reacción de tinción demostró que la expresión de GUS en la célula de planta huésped se silenció por el polinucleótido heterólogo.
[0292] A continuación, los callos se cultivan, echan raíces, se trasplanta a tierra y crecen hasta la madurez para obtener polen y semilla. Las plantas no transformadas se polinizan con polen de una planta transformada
5 madura, y la semilla fecundada resultante se cultiva dando una planta madura. Las plantas maduras (plantas F0), plantas cultivadas a partir de semillas de una planta F0, y plantas no transformadas regeneradas a partir de semillas de polen de plantas transformadas y flores de plantas no transformadas muestran todas resistencia a Phytophthora sojae.
10 [0293] Plantas de soja: Este ejemplo (17) con cultivo de tejido de soja se demostró claramente en el Ejemplo 27 en el que plantas de soja transformadas por bombardeo con pVZA100 fueron resistentes a P. sojae (Figura 13). Este resultado también demuestra que la amplia resistencia se confirió por el gen cutinasa de P. nicotianae contra P. sojae.
15 Ejemplo 18 Patatas transformadas y hechas resistentes a Phytophthora infestans.
[0294] Del Ejemplo 7 se produjeron tanto raíces como minitubérculos en las placas de cultivo (Figura 8). Las plántulas, raíces y minitubérculos se cultivaron sobre el medio que contenía 15 mg/l de higromicina demostrando que los callos se transformaron y que expresan el transgén higromicina fosfotransferasa. Callos de patata
20 transformados con pCAMBIA1201 dieron tinción de GUS positiva, mientras que callos de patata transformados con pVZA100 dieron tinción de GUS negativa. Esto demuestra que GUS se silenció en aquellos tejidos transformados con pVZA100.
[0295] El análisis por PCR demuestra la presencia de los transgenes. Las plantas de progenie de esquejes y 25 tubérculos dan positivo para ARNip.
Las patatas transformadas con la construcción de silenciamiento son resistentes a Phytophthora infestans.
[0296] Plantas de patata: Este ejemplo (18) con cultivo de tejido de patata se demostró claramente en el 30 Ejemplo 27 en el que plantas de patata transformadas por bombardeo con pVZA300 y pVZA400 fueron resistentes a
P. infestans.
Ejemplo 19. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo (ADNr de Phialophora gregata)
35 [0297] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen ARN ribosómico de (ADNr) Phialophora gregata (sitio de GenBank U66728, SEQ ID NO: 43). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a podredumbre parda del tallo tras la inoculación con Phialophora gregata. Plantas resistentes a Phialophora gregata también son resistentes a
40 Phakopsora pachyrhizi y Aspergillus nidulans.
Ejemplo 20. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo (marcador de ADN de genotipo B de Phialophora gregata)
45 [0298] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen ARN ribosómico (ADNr) de Phialophora gregata (sitio de GenBank U66728, SEQ ID NO: 44). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a podredumbre parda del tallo tras la inoculación con Phialophora gregata. Plantas resistentes a Phialophora gregata también son resistentes a
50 Phakopsora pachyrhizi y Aspergillus nidulans.
Ejemplo 21. Sojas se hacen resistentes a podredumbre del tallo y de la raíz (cutinasa de Phytophthora sojae)
[0299] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo
55 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con cutinasa de Phytophthora sojae (es decir, SEQ ID NO: 36). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a podredumbre del tallo y de la raíz tras la inoculación con Phytophthora sojae.
Ejemplo 22. Sojas se hacen resistentes a la enfermedad del moho blanco (subunidad de ARN polimerasa de
Sclerotinia sclerotiorum)
[0300] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA-100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen rpb2 parcial de Sclerotinia 5 sclerotiorum para la segunda mayor subunidad de ARN polimerasa II, exón 1, cepa 484 (sitio de GenBank AJ745716, SEQ ID NO: 45). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la enfermedad del moho blanco tras la inoculación con Sclerotinia sclerotiorum. Plantas resistentes a Sclerotinia sclerotiorum también son resistentes a Phakopsora, Aspergillus nidulans, Magnaporthae orizae, Candida sojae, Gibberella zeae y Puccinia graminis. Plantas transformadas
10 muestran crecimiento normal, que carece de un gen con alta homología con el gen rpb2 de S. sclerotiorum. Se obtienen resultados similares usando secuencias sentido y antisentido correspondientes al gen ARN ribosómico 18S de Puccinia hordei, secuencia parcial del sitio de GenBank AY125412 (SEQ ID NO: 46).
Ejemplo 23. Sojas se hacen resistentes a la enfermedad del moho blanco (transportador de hexosa de 15 Sclerotinia sclerotiorum)
[0301] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen transportador de hexosa (hxt2) de Sclerotinia sclerotiorum (sitio de GenBank AY647268,1, SEQ ID NO: 47). Se generan plantas de soja de células
20 transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la enfermedad del moho blanco tras la inoculación con Sclerotinia sclerotiorum. Plantas resistentes a Sclerotinia sclerotiorum también demuestran alguna resistencia a Botrytis cinerea.
Ejemplo 24. Sojas se hacen resistentes a síndrome de muerte súbita (cutinasa de Fusarium solani pisi)
25 [0302] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ARNm de cutinasa de F. solani pisi (sitio de GenBank K02640.1, SEQ ID NO: 48) Se generan plantas de soja de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a síndrome de muerte súbita tras la inoculación con Fusarium solani
30 glycines. Plantas resistentes a Fusarium solani glycines muestran resistencia algo elevada a A. nidulans.
Ejemplo 25. Sojas se hacen resistentes a la roya asiática (homólogo de cutinasa de Phakopsora pachyrhizi)
[0303] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo
35 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con motivo de proteína conservada de Phakopsora pachyrhizi de Phytophthora nicotianae y se encuentran en el genoma de Phakopsora pachyrhizi (sitio de GenBank AC149367.2, SEQ ID NO: 49). Basándose en la homología con cutinasa de Phytophthora nicotianae, es probable que este motivo de proteína conservada sea un homólogo de cutinasa y participe en la penetración de cutina de soja. Se generan plantas de soja de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para
40 resistencia conferida a la roya asiática tras la inoculación con Phakopsora pachyrhizi.
Ejemplo 26. Sojas se hacen resistentes a la roya asiática (ADNr de Phakopsora pachyrhizi)
[0304] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo
45 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con una secuencia de ADN ribosómico encontrada en el genoma de Phakopsora pachyrhizi (sitio de GenBank AF333491, SEQ ID NO: 50). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la roya asiática tras la inoculación con Phakopsora pachyrhizi.
50 Ejemplo 27. Prueba de tabaco, soja, patata y maíz para transgénesis, resistencia a Phytophthora spp. y resistencia a áfidos
Tabaco.
55 [0305] Plantas de tabaco maduras producidas en el Ejemplo 5 por transformación con pVZA100 se probaron para resistencia contra P. nicotianae. Se probaron tres procedimientos para la inoculación con P. nicotianae. Todos dieron resultados satisfactorios, pero como se ha explicado anteriormente, el procedimiento del palillo fue más rigoroso y más fiable. Generalmente, aproximadamente el 20 % de las plantas T0 transformadas con pVZA100 (generación transgénica inicial) sobrevivieron a la infección con P. nicotianae, mientras que el 0 % de las plantas
naturales y aquellas plantas transformadas con pCAMBIA 1201 sobrevivieron.
[0306] Las plantas supervivientes transformadas con pVZA100 se cultivaron a madurez en tierra, y se recogió semilla para posterior el análisis. La progenie de semilla (= generación T1) se cultivó sobre medio MS que contenía 5 30 ug/ml de higromicina, y las plantas supervivientes se probaron de nuevo para resistencia a P. nicotianae.
[0307] Las plantas supervivientes transformadas se cultivaron a madurez en tierra y se recogió semilla para posterior el análisis. Un grupo de progenie de semilla (=generación T2) de cuatro líneas diferentes (líneas nº 4, nº 23, nº 26 y nº 27; = diferentes eventos de transformación) de estas plantas se inoculó dos veces sucesivamente para
10 garantizar que cualquier superviviente era resistente a P. nicotianae. En la primera inoculación 192 de 442 plantas fueron resistentes (= 43 %). Tras la reinoculación: 150 de 192 plantas fueron resistentes (= 78 %). En resumen, 150 de 442 plantas fueron resistentes (= 34 %). Todas de estas 150 plantas resistentes también se ensayaron para actividad de GUS y se encontró que eran negativas.
15 [0308] Las reacciones por plantas de tabaco se muestran en la Figura 11. La planta A muestra reacciones típicas de plantas de tabaco naturales o aquellas transformadas con pCAMBIA1201. Las plantas son susceptibles, hay lesiones del tallo importantes, y el sistema de raíces está esencialmente destruido. Tales plantas normalmente mueren 5-8 días después de la inoculación. La planta B es de la línea transgénica 26 (véase más adelante). Es típicos de aquellas plantas transformadas con pVZA100. Fue altamente resistente a P. nicotianae y no mostró
20 síntomas distintos de pequeñas lesiones sobre las puntas de las raíces superiores. Tales plantas crecen a madurez y dan semilla fértil.
pVZA100 en soja:
25 [0309] Se bombardearon plantas de soja con pVZA100. La PCR con los cebadores apropiados demostró que 15 de las 32 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas transgénicas se cultivaron para producir semillas y las semillas de plantas se probaron para resistencia a P. sojae. Como se muestra en la Figura 13, 43 de las 495 semillas de plantas probadas fueron resistentes a P. sojae (Figura 13) mientras que el 100 % de un número similar de plantas naturales y transformadas con pCAMBIA1201 (es decir, “transformadas de control”) murieron.
pVZA100 en patata
[0310] Se bombardearon plantas de patata con pVZA100. La PCR con los cebadores apropiados demostró que 15 de las 18 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas transgénicas se prueban para resistencia
35 a P. infestans. El 100 % de estas plantas son resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
pVZA100 en maíz
40 [0311] Se bombardearon plantas de maíz con pVZA100. La PCR con los cebadores apropiados demostró que 33 de las 44 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas transgénicas se cultivan para producir semillas y las plantas de semillas se prueban para resistencia a Pythium graminicola. El 25 % de las plantas F1 probadas son resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
45 [0312] Los resultados anteriores demuestran que plantas útiles en la presente invención incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas.
[0313] Similarmente, plantas de maíz se transforman con pVZA100 y se prueba e ilustra resistencia cruzada a Phytophthora y Peronospora.
50 pVZA200 en patata
[0314] Se bombardearon plantas de patata con pVZA200 (catepsina B de Myzus persicae). La PCR con los cebadores apropiados demostró que 7 de las 12 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas
55 transgénicas se prueban para resistencia a áfidos (Myzus persicae). El 80 % de tales plantas, en comparación con el 0 % de plantas de control o naturales, son resistentes.
[0315] Se examinan los áfidos después de alimentarse de plantas transformadas. Se determina que silenciar catepsina B en áfidos según la presente memoria descriptiva no solo protege la planta (es decir, produce resistencia
a áfidos en plantas), sino que también reduce la población de áfidos.
[0316] Según la presente memoria descriptiva y este ejemplo, se confiere resistencia a insectos a plantas mediante la transformación con una construcción de silenciamiento que contiene un gen de insecto tal como 5 catepsina B.
pVZA300 en patata
[0317] Se bombardearon plantas de patata con pVZA300, una construcción que contenía secuencias sentido
10 y antisentido homólogas y complementarias a catepsina B de Myzus persicae y elicitina INF1 de Phytophthora infestans. La PCR con los cebadores apropiados demostró que 15 de las 18 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Tales plantas transgénicas se prueban para resistencia a áfidos (Myzus persicae) y a Phytophthora infestans.
15 [0318] En un conjunto de experimentos, un grupo de plantas transformadas de patata se exponen a áfidos solo y un grupo se expone a Phytophthora infestans solo.
[0319] Para las plantas expuestas a áfidos, el 80 % de tales plantas probadas son resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
20 [0320] Para las plantas expuestas a Phytophthora infestans, el 75 % de tales plantas probadas fueron resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas no transformadas o de control.
[0321] En otro conjunto de experimentos, plantas de patata similarmente transformadas y no transformadas se 25 exponen a áfidos y Phytophthora infestans al mismo tiempo. El 60 % de las plantas transgénicas probadas son resistentes a ambas plagas con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
[0322] Después de alimentarse de plantas transformadas, Phytophthora infestans se aísla y se cultiva. Tales cultivos tanto crecen muy lentamente como mueren. El examen microscópico revela que las hifas están gravemente 30 malformadas.
[0323] Además, silenciar el ARNr según la presente memoria descriptiva ilustra adicionalmente una divulgación por la cual la población de patógenos en la tierra se reduce espectacularmente.
35 pVZA300 en sojas
[0324] Se bombardearon plantas de soja con pVZA300 (una construcción que contenía secuencia sentido y antisentido homóloga y complementaria a catepsina B de Myzus persicae y elicitina INF1 de Phytophthora infestans). La PCR con los cebadores apropiados demostró que el 60 % de las plantas bombardeadas son transgénicas. Las
40 plantas transgénicas se cultivan para producir semillas y las semillas de plantas se cultivan. Tales plantas F1 se prueban para resistencia a áfidos (Myzus persicae) y a Phytophthora sojae.
[0325] En un conjunto de experimentos, un grupo de plantas de soja transformadas se exponen a áfidos solo y un grupo se expone a Myzus persicae solo.
45 [0326] Para las plantas expuestas a áfidos, el 70 % de las plantas F1 probadas son resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
[0327] Para las plantas expuestas a Phytophthora sojae, el 15 % de las plantas F1 probadas son resistentes 50 con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales y transformadas de control.
[0328] En otro conjunto de experimentos, plantas de sojas transformadas y no transformadas se exponen a áfidos y Phytophthora sojae al mismo tiempo. El 10 % de las plantas F1 probadas son resistentes a ambas plagas con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
55 [0329] Según la presente memoria descriptiva y estos ejemplos, la resistencia a insectos y la resistencia a hongos se confiere en una planta (tanto para especies monocotiledóneas como dicotiledóneas) por un único polinucleótido heterólogo que comprende una pluralidad de genes (es decir, por apilamiento de genes). Además, se confiere un sorprendente nivel de resistencia en plantas silenciando genes de más de una plaga.
[0330] Después de alimentarse de plantas transformadas, Phytophthora sojae se aísla y se cultiva. Tales cultivos tanto crecen muy lentamente como mueren. El examen microscópico revela que las hifas están gravemente malformadas.
pVZA400 en sojas
[0331] Se bombardearon plantas de soja con pVZA400 que comprende secuencia antisentido y sentido homóloga y complementaria al gen ARNr de Phytophthora infestans. La PCR con los cebadores apropiados
10 demostró que 12 de las 18 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas transgénicas se cultivan para producir semillas y las semillas de plantas se prueban para resistencia a Phytophthora sojae. El 15 % de las plantas F1 que se prueban son resistentes con respecto al 0 % de resistencia en plantas transgénicas no transformadas o de control.
15 [0332] Después de alimentarse de plantas transformadas, Phytophthora sojae se aísla y se cultiva. Tales cultivos tanto crecen muy lentamente como mueren. El examen microscópico revela que las hifas están gravemente malformadas.
[0333] A continuación, sojas naturales se exponen a cultivos de Phytophthora sojae derivados de las plantas 20 transformadas con pVZA400. Tales cultivos de P. sojae son no patógenos en comparación con cultivos de sojae que se derivan de sojas naturales o transformadas de control.
[0334] Los resultados anteriores ilustran la utilidad de silenciamiento de ARNr en una plaga (por ejemplo hongos) y adicionalmente ilustra resistencia cruzada a una especie de plaga distintos de la plaga de la que se 25 construyó el gen de patogenicidad de la plaga.
[0335] Después de alimentarse de plantas transformadas, Phytophthora sojae se aísla y se cultiva. Tales cultivos tanto crecen muy lentamente como mueren. El examen microscópico revela que las hifas están gravemente malformadas.
30 [0336] Además, el silenciar el ARNr según la presente memoria descriptiva ilustra adicionalmente una divulgación por la cual la población de patógenos en la tierra se reduce espectacularmente.
pVZA400 en patata
35 [0337] Se bombardearon plantas de patata con pVZA400 que comprende secuencia antisentido y sentido homóloga y complementaria al gen ARNr de Phytophthora infestans. La PCR con los cebadores apropiados demostró que 6 de las 12 plantas bombardeadas fueron transgénicas. Las plantas transgénicas se cultivaron y se probaron para resistencia a Phytophthora infestans. Estas plantas se probaron y mostraron resistencia en el 100 %
40 de estas plantas con respecto al 0 % de resistencia en plantas naturales o transformadas de control.
[0338] Después de de alimentarse de plantas transformadas, Phytophthora infestans se aísla y se cultiva. Tales cultivos tanto crecen muy lentamente como mueren. El examen microscópico revela que las hifas están gravemente malformadas.
45 [0339] Los resultados anteriores ilustran la utilidad de una única construcción de silenciamiento de ARNr en conferir resistencia a plagas en una pluralidad de plantas a una plaga (por ejemplo, hongos).
Ejemplo 28. Patata se hace resistente a la podredumbre del tubérculo (factor de elongación 1 alfa de la 50 traducción de Fusarium sambucinum)
[0340] Se transforman células huésped de patata con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con una secuencia de ADN de factor de elongación 1 alfa de la traducción de Fusarium sambucinum (sitio de GenBank AJ543605, SEQ ID NO: 51). Se
55 generan plantas de patata a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la podredumbre de tubérculos por Fusarium sambucinum.
Ejemplo 29. Tomate se hace resistente al tizón tardío (gen elicitina de Phytophthora infestans)
[0341] Se transforman células huésped de tomate con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con una secuencia del genes elicitina encontrados en el genoma de Phytophthora infestans (sitio de GenBank AY766228, SEQ ID NO: 52). Se generan plantas de tomate a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al tizón tardío del tomate tras la inoculación con Phytophthora infestans.
Ejemplo 30. Colza se hace resistente a la podredumbre del tallo (subunidad de ARN polimerasa de Sclerotinia sclerotiorum)
[0342] Se transforman células huésped de colza con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con un gen rpb2 parcial de Sclerotinia sclerotiorum para la segunda mayor subunidad de ARN polimerasa II, exón 1, cepa 484 1096 pb (sitio de GenBank AJ745716, SEQ ID NO: 53). Se generan plantas de colza a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a podredumbre del tallo tras la inoculación con Sclerotinia sclerotiorum.
Ejemplo 31. Algodón se hace resistente al marchitamiento del algodón (homólogo de cutinasa de Fusarium solani pisi)
[0343] Se transforman células huésped de algodón con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con un gen cutinasa de F. solani pisi (sitio de GenBank K02640,1, SEQ ID NO: 48). Esta secuencia se escoge en el presente documento debido a la homología de genes dentro del género Fusarium. Se generan plantas de algodón a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la marchitamiento del algodón tras la inoculación con
Fusarium oxysporium.
Ejemplo 32. Maíz se hace resistente a micotoxinas (cutinasa de F. solani pisi)
[0344] Se transforman células huésped de maíz con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con un gen cutinasa de F. solani pisi (sitio de GenBank K02640,1, SEQ ID NO: 48). Esta secuencia se escoge en el presente documento debido a la homología de genes dentro del género Fusarium. Se generan plantas de maíz a partir de células transformadas y se seleccionan para elevada resistencia a micotoxinas tras la inoculación con Fusarium moniliforme.
Ejemplo 33. Maíz se hace resistente a la podredumbre del tallo (ADNr de Stenocarpella maydis)
[0345] Se transforman células huésped de maíz con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ARNr de Stenocarpella maydis (sitio de GenBank AY332489, SEQ ID NO: 54). Esta secuencia se escoge en el presente documento debido a la homología de genes dentro de los géneros Stenocarpella y Fusarium. Se generan plantas de maíz a partir de células transformadas y se seleccionan para elevada resistencia a podredumbre del tallo tras la inoculación con Stenocarpella maydis y varias Fusarium spp.
Ejemplo 34. Maíz se hace resistente al tizón de las hojas (ADNr 18S de Cercospora zeae-maydis)
[0346] Se transforman células huésped de maíz con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ARN ribosómico 18S de un grupo II de Cercospora zeae-maydis (sitio de GenBank AF291710, SEQ ID NO: 55). Se generan plantas de maíz a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al tizón de las hojas tras la inoculación con Cercospora zeae-maydis.
Ejemplo 35. Patata se hace resistente al áfido del melocotón verde (catepsina B proteasa de Myzus persicae)
[0347] Se transforman células huésped de patata con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con catepsina B proteasa de Myzus persicae (sitio de GenBank AY702822, SEQ ID NO: 56). Se generan plantas de patata a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a áfidos del melocotón verde tras la inoculación con Myzus persicae.
Ejemplo 36. Patata se hace resistente al escarabajo de la patata de Colorado (cisteína proteasa de Leptinotarsa decemlineata)
[0348] Se transforman células huésped de patata con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con cisteína proteasa de Leptinotarsa decemlineata (sitio de GenBank AY159377, SEQ ID NO: 57). Se generan plantas de patata a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al escarabajo de la patata de Colorado tras la inoculación con Leptinotarsa decemlineata. Tales patatas regeneradas demuestran una elevada resistencia a cada una de los siguientes: Callosobruchus maculatus, Diabrotica virgifera virgifera, Acanthoscelides obtectus, Helicoverpa armigera, Leptinotarsa decemlineata, Anthonomus grandis, Triatoma infestans, Tenebrio molitor, Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Pandalus borealis, Myzus persicae, Delia radicum, Sarcofaga peregrine, Sitophilus zeamais, Boophilus microplus, Hypera postica, Frankliniella occidentalis y H. americanus.
Ejemplo 37. Patata se hace resistente al marchitamiento por Verticillium (ADNr de V. dahliae)
[0349] Se transforman células huésped de patata con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ADNr de Verticillium dahliae (sitio de GenBank AF108478, SEQ ID NO: 58). Se generan plantas de patata a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al marchitamiento por Verticillium tras la inoculación con
Verticillium dahliae.
Ejemplo 38. Sojas se hacen resistentes a mildiu (ADNr de Peronospora berteroae)
[0350] Se transforman células huésped de soja con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con la secuencia parcial del espaciador 1 transcrito interno de ARN ribosómico 5.8S encontrada en el genoma de Peronospora berteroae (sitio de GenBank AY531450, SEQ ID NO: 59). Se generan plantas de soja a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al mildiu tras la inoculación con Peronospora manchurica. Tales sojas seleccionadas también tienen elevada resistencia a especies de Hyaloperonospora (por ejemplo H. camelinae, H. niessleana, H. parasitica, y H. thlaspeos-perfoliati) y especies de Peronospora (por ejemplo P. arabidopsidis, P. arabis-alpinae, P. buniadis, P. cardaminopsidis, P. cochleariae, P. dentariae, P. galligena, P. hesperidis, P. iberidis,
P. isatidis, P. nesleae, P. sisymbrii-loeselii, P. sisymbrii-officinalis, P. sisymbrii-sophiae, P. thlaspeos-alpestris y P. thlaspeos-arvensis).
Ejemplo 39. Patata se hace resistente al nematodo de los nodos de la raíz de la patata (citocromo oxidasa II de Meloidogyne chitwoodi)
[0351] Se transforman células huésped de patata con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con una secuencia encontrada en el genoma de Meloidogyne chitwoodi (es decir, gen subunidad II de citocromo oxidasa, (sitio de GenBank AY757882, SEQ ID NO: 60). Se generan plantas de patata a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al nodo de la raíz de la patata tras la inoculación con Meloidogyne chitwoodi. Se encuentra que tales plantas de patata seleccionadas también son resistentes a Bombyx mandarina, Bombyx mori, Chilo tumidicostalis, Hemileuca, Hydrotaea aenescens, Meloidogyne hapla, Meloidogyne partityla, Oecetis avara, Papilio aegeus, Papilio demoleus, Papilio erithonioides, Papilio hipponous, Papilio oribazus, Papilio protenor, Papilio troilus, Papilio xuthus, Sabethes cianeus y amia cynthia ricini.
Ejemplo 40. Sojas se hacen resistentes a infestación por nematodos (genes de ARN ribosómico de Pratylenchus scribneri y Heterodera glycines)
[0352] La presente memoria descriptiva puede usarse para producir plantas huésped con elevada resistencia a nematodos adicionales. Las secuencias de polinucleótidos de nematodos que son conocidas y pueden buscarse en bases de datos públicas tales como NCBI/NIH GenBank demuestran motivos de nucleótidos conservados entre diferentes géneros de nematodos. Los motivos de nucleótidos conservados sugieren fuertemente que estas secuencias están asociadas a viabilidad y/o parasitismo y se conservan y expresan funcionalmente en tanto Meloidogyne incognita (nematodo de los nodos de la raíz) como Globodera rostochiensis y Globdera pallids (nematodos de los quistes de la patata), y también en los bien estudiados Heterodera glycines y Caenorhabditis elegans. Así, el uso de estas secuencias y variantes de las mismas es ventajoso debido a que tal iARN puede diseñarse para tener amplia especificadas de iARN y así son útiles para controlar un gran número de nematodos parasíticos de las plantas en planta. Debido a que los genes identificados en el presente documento están asociados a supervivencia de nematodos y/o inhibición de iARN parasítica de estos genes (que surge de poner en contacto nematodos con composiciones que comprenden moléculas de iARN tales como, por ejemplo, dejando que los nematodos se alimenten sobre plantas transformadas como se enseña en el presente documento) previene y/o reduce el crecimiento, desarrollo y/o parasitismo de nematodos parasíticos.
[0353] La alimentación de nematodos es un indicador útil de la eficacia de los procedimientos de la presente memoria descriptiva. El ensayo de alimentación in vitro de Pratylenchus scribneri usa un exudado de raíz de maíz raíz como estímulo de alimentación y tanto el colorante rojo amaranto como arseniato de potasio, como indicadores de la alimentación. La alimentación se confirma después de siete días por la presencia de células intestinales teñidas rojas en gusanos vivos expuestos a amaranto o muerte de gusanos expuestos a arseniato. P. scribneri puede cultivarse sobre raíces de maíz naturales, arroz y Arabidopsis, y sobre raíces pilosas inducidas por Agrobacterium rhizogenes de remolacha azucarera y tomate. P. scribneri es muy valioso en la evaluación de raíces pilosas transgénicas (idealmente desarrollado usando cepas de Agrobacterium rhizogenes conocidas en la técnica como vectores de transformación) debido a la alimentación no específica de estos gusanos.
[0354] Se transforman maíz, arroz, tomate y remolachas azucareras con un polinucleótido heterólogo que contiene secuencias sentido y antisentido complementarias de ARN ribosómico de P. scribneri (sitio de GenBank SEQ ID NO:61). P. scribneri se prueba en un ensayo de alimentación usando maíz, arroz, tomate y remolachas azucareras transformados y naturales. Las plantas transformadas demuestran elevada resistencia a P. scribneri.
[0355] Se transforman sojas con un polinucleótido heterólogo que contiene secuencias sentido y antisentido complementarias de ARN ribosómico de Heterodera glycines (sitio de GenBank AY667456, SEQ ID NO: 62). Se prueba Heterodera glycines en un ensayo de alimentación usando sojas transformadas y naturales. Las sojas transformadas demuestran elevada resistencia a Heterodera glycines.
Ejemplo 41. Diversas plantas se hacen resistentes a infección por diversas Phytophthora spp. (cutinasa de Phytophthora nicotianae)
[0356] En una realización, el polinucleótido heterólogo pVZA100 (Ejemplo 3) se usa para transformar una variedad de plantas para conferir resistencia a diversas especies de Phytophthora. Por ejemplo, se confiere resistencia contra infecciones de la hoja y el tallo inducidas por Phytophthora spp. cuando cualquiera de Chrysalidocarpus palm, Catharanthus, Dendrobium, poinsettia, impatiens, salvia, spathiphyllum o cebolla se transforma con pVZA100 (SEQ ID NO: 5). Se confiere resistencia contra podredumbre de la raíz inducida por Phytophthora spp. cuando cualquiera de poinsettia, tomate, piña o anthurium se transforma con pVZA100.
[0357] Se confiere resistencia contra podredumbre las coronas y cuellos inducidos por Phytophthora spp. cuando cualquiera de sandía, protea o violeta africana se transforma con pVZA100.
[0358] Se confiere resistencia contra podredumbres de los frutos inducida por Phytophthora spp. cuando cualquiera de tomate, papaya o berenjena se transforma con pVZA100.
Ejemplo 42. Pita se hace resistente a la podredumbre de la raíz de la pita (cutinasa de Fusarium solani pisi)
[0359] Se transforman células huésped de pita con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con un gen cutinasa de Fusarium solani pisi (sitio de GenBank K02640,1, SEQ ID NO: 48). Esta secuencia se elige en el presente documento debido a la homología de genes dentro del género Fusarium. Se generan plantas de pita a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la podredumbre de pita tras la inoculación con Fusarium oxysporum
Ejemplo 43. Arroz se hace resistente al añublo (ARN polimerasa II de Magnaporthe grisea)
[0360] Se transforman células huésped de arroz con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con una secuencia de ARN polimerasa II de Magnaporthe grisea (sitio de GenBank XM 362268, SEQ ID NO: 63). La transformación se llevó a cabo por electroporación o Agrobacterium tumefaciens. Se generan plantas de arroz a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al añublo del arroz tras la inoculación con Magnaporthe grisea.
Ejemplo 44. Diversas plantas se hacen resistentes a enfermedad de la raíz inducida por Phytophthora (cutinasa de Phytophthora citricola)
[0361] Diversas células de plantas que incluyen aquellas de Rhododendron (por ejemplo Rh. catawbiefase, Rh. simsii, Rh. catawbiense), Erica sp., Calla sp., árboles de aguacate, árboles cítricos y lúpulo se transforman con el polinucleótido heterólogo pVZA100 (Ejemplo 3). Esto construcción se eligió debido a la homología entre Phytophthora nicotianae SEQ ID NO: 14 y Phytophthora citricola SEQ ID NO: 34. Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a enfermedad tras la inoculación con Phytophthora citricola.
Ejemplo 45. Cebada se hace resistente a la roya de las hojas de la cebada (ARN ribosómico 18S de Puccinia hordei)
[0362] Se transforman células de cebada con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ARNr 18S de Puccinia hordei (sitio de GenBank AY125412, SEQ ID NO:64). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la roya de las hojas de la cebada tras la inoculación con
Puccinia hordei.
Ejemplo 46. Cebada se hace resistente a mildiu (ADNr de Pseudoperonospora humuli)
[0363] Se transforman células de cebada con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con secuencias del espaciador 1 transcrito interno de la cepa aislada HV 148 de Pseudoperonospora humuli, secuencia parcial; ARN ribosómico 5.8S (sitio de GenBank AY198305, SEQ ID NO: 65). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al mildiu tras la inoculación con Pseudoperonospora humuli.
Ejemplo 47. Cebada se hace resistente a la enfermedad del moho gris (citocromo P450 monoxigenasa de Botrytis cinerea)
[0364] Se transforman células de cebada con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con secuencias de Botrytis cinerea para el gen aba2 para citocromo P450 monoxigenasa, exones 1-5 (sitio de GenBank AJ851088, SEQ ID NO: 66). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la enfermedad del moho gris tras la inoculación con Botrytis cinerea.
Ejemplo 48. Tomate se hace resistente a la enfermedad de moteado del tomate (ADNr de Pseudomonas syringae)
[0365] Se transforman células de tomate con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con ARN ribosómico de Pseudomonas syringae (sitio de GenBank AY342210, SEQ ID NO: 67). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida a la enfermedad de moteado del tomate tras la inoculación con Pseudomonas syringae.
Ejemplo 49. Tomate se hace resistente al marchitamiento bacteriano (gen Cel A de Clavibacter michiganense michiganense)
[0366] Se transforman células de tomate con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con gen Cel A de Clavibacter michiganense michiganense (sitio de GenBank AY007311, SEQ ID NO: 68). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al marchitamiento bacteriano tras la inoculación con Clavibacter michiganense michiganense.
Ejemplo 50. Maíz se hace resistente al marchitamiento y tizón bacteriano de Goss (gen endo l-glucosidasa de Clavibacter michiganense)
[0367] Se transforman células de maíz con el polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen para endo -glucosidasa de Clavibacter michiganense (sitio de GenBank X62582, SEQ ID NO: 69). Se generan plantas huésped a partir de células transformadas y se seleccionan satisfactoriamente para resistencia conferida al marchitamiento y tizón bacteriano de Goss (pecas y marchitamiento de las hojas) tras la inoculación con Clavibacter michiganense.
Ejemplo 51. Un procedimiento de construcción de silenciamiento para proteger sojas contra una o dos enfermedades fúngicas
[0368] Una célula de planta huésped de soja se transforma con cualquiera de las construcciones de silenciamiento de genes de la Figura 10 y se generan plantas maduras a partir de la misma. Las plantas maduras se criban para resistencia a dos enfermedades fúngicas principales, concretamente podredumbre de la raíz y del tallo de la soja producida por Phytophthora sojae y la roya asiática de la soja producida por Phakopsora pachyrhizi. Se identifica que las plantas se identifican son resistentes a cada una y a ambas de estos dos enfermedades. Aquellas plantas transformadas con la construcción superior son resistentes a podredumbre de la raíz y del tallo de la soja. Aquellas plantas transformadas con la construcción intermedia son resistentes a la roya asiática de la soja. Aquellas plantas transformadas con la construcción inferior son resistentes a tanto podredumbre de la raíz y del tallo de la soja como a roya asiática de la soja.
Ejemplo 52. Un procedimiento de construcción de silenciamiento policistrónico para proteger sojas contra tres enfermedades fúngicas
[0369] Una célula de planta huésped de soja se transforma con una construcción de silenciamiento de genes policistrónicos de la Figura 9 y se generan plantas maduras a partir de la misma. Las plantas maduras se criban para resistencia a tres enfermedades fúngicas importantes, concretamente podredumbre de la raíz y del tallo de la soja producida por Phytophthora sojae, síndrome de muerte súbita de la soja producida por Fusarium solani f. sp. glycines, y la roya asiática de la soja producida por Phakopsora pachyrhizi. Se identifica que las plantas son resistentes a cada una y todas de estas tres enfermedades.
Ejemplo 53. Despatogénesis de especies de Phytophthora alimentando sobre plantas transgénicas o por transformación directa con pVZA100, pVZA300 o pVZA400
[0370] Se transformaron células huésped de tabaco con la construcción de silenciamiento pVZA100 (SEQ ID NO: 5) y se generaron plantas a partir de las mismas. Tales plantas transformadas fueron altamente resistentes a P. nicotianae. Reacciones típicas por plantas de tabaco se muestran en la Figura 11. La planta A muestra reacciones típicas de plantas de tabaco naturales o aquellas transformadas con pCAMBIA1201. Las plantas son susceptibles, hay lesiones del tallo importantes, y el sistema de raíces está esencialmente destruido. Tales plantas normalmente mueren 5-8 días después de la inoculación. La planta B es de la línea transgénica 26 (véase más adelante). Es típico de aquellas plantas transformadas con pVZA100. Es altamente resistente a P. nicotianae y no muestra síntomas distintos de pequeñas lesiones sobre las puntas de las raíces superiores. Tales plantas crecen a madurez y dan semilla fértil.
[0371] Cuando P. nicotianae se reaisló de las lesiones limitadas en la planta resistente y se volvió a probar en plantas naturales, ya no fue patógena. El aislamiento de ARN de este hongo e hibridación con la sonda de cutinasa radiactiva como antes en el Ejemplo 14 indica la presencia de ARNip para el gen cutinasa en P. nicotianae, explicando así la pérdida de patogenicidad. En la Figura 12, el carril 1 muestra de nuevo los oligonucleótidos de 35 nt VZA 3F (SEQ ID NO: 3) y VZA 4R (SEQ ID NO: 4) que sirven de control de tamaño molecular, el carril 2 muestra el ARN mensajero de 620 nt del hongo natural, el carril 3 muestra el ARNip de una planta de tabaco transgénica silenciada y el carril 4 muestra el ARNip del hongo no patógeno aislado del tabaco transgénico resistente.
[0372] Como se muestra en el Ejemplo 13, transformar especies de una plaga directamente con construcciones de silenciamiento o alimentando especies de plagas de plantas transformadas con construcciones de silenciamiento tuvo mejores efectos sobre la patogenicidad, crecimiento y supervivencia de la plaga (en este ejemplo, los hongos). Estos resultados soportan directamente o indirectamente la utilidad de esta realización de la presente invención para minimizar pérdidas de cultivos a plagas y para potenciar la productividad agrícola.
Ejemplo 54. Despatogénesis: Sandía transformada con un polinucleótido heterólogo de silenciamiento de cutinasa (cutinasa de F. oxysporum):
[0373] En Florida y Georgia las sandías pueden plantarse en un campo solo durante un año. El agricultor debe entonces esperar 6 ó 7 años para usar ese campo de nuevo debido a que un único año de uso produce la alta formación de cepas patógenas de Fusarium oxysporum. Para usar un campo en años sucesivos, el agricultor debe recurrir a caros e intensos tratamientos anuales con bromuro de metilo u otros potentes productos químicos.
[0374] Se regeneran sandías de una célula de planta huésped transformada con un polinucleótido heterólogo similar a pVZA100 (Ejemplo 3), excepto que las secuencias sentido y antisentido se corresponden con el gen cutinasa en F. oxysporum. F. oxysporum infecta la sandía y el gen cutinasa de F. oxysporum se silencia. Otras especies de sandía (no transformadas según la presente invención) se plantan dentro de seis pies de la sandía regenerada (transgénica). Tales otras especies de sandía se infectan por F. oxysporum a un menor grado que lo que se predeciría si no fuera por el cultivo de las sandías regeneradas (transgénicas) adyacentes a ellas.
Ejemplo 55. Amplia resistencia de plantas y despatogénesis con polinucleótidos heterólogos de silenciamiento de ARN ribosómico:
[0375] Opcionalmente, para implementar eficazmente la despatogénesis, puede obtenerse una amplia protección o genérica cruzada contra varias especies de hongos patógenos. Esto puede llevarse a cabo utilizando construcciones de silenciamiento que contienen genes de ADN ribosómico (ADNr). Las secuencias de ADNr de patógenos fúngicos son suficientemente similares para servir en el control de especies fúngicas estrechamente relacionadas, pero son lo suficientemente distintas para permitir la diferenciación entre grupos de hongos, permitiendo así la selectiva elección como diana de grupos específicos de patógenos fúngicos con construcciones de silenciamiento de genes individuales o múltiples o policistrónicas.
[0376] Este enfoque se ilustra en la Tabla 13. Las secuencias de ADNr 18S de Phytophthora sojae y Phakopsora pachyrhizi “se buscaron con blast por comparación” con los datos en NCBI/NIH GenBank. La secuencia de Phytophthora sojae mostró fuerte homología (100 al 93 %) con las secuencias de 16 especies fúngicas estrechamente relacionadas adicionales, pero no mostró homología significativa con la de Phakopsora pachyrhizi. En cambio, la secuencia de ADNr 18S de Phakopsora pachyrhizi mostró una fuerte homología (100 al 93 %) con las secuencias de 19 especies fúngicas estrechamente relacionadas adicionales, pero no mostró homología significativa con la de Phytophthora sojae. Por tanto, pueden desarrollarse construcciones de silenciamiento de genes individuales según las enseñanzas en el presente documento para controlar el grupo de hongos relacionados con Phytophthora sojae o con Phakopsora pachyrhizi, o alternativamente puede desarrollarse una construcción de silenciamiento de genes policistrónicos para controlar ambos grupos simultáneamente.
Tabla 13. Secuencias de GenBank de ADN ribosómico que producen alineamientos significativos con especies diana
ADN ribosómico 18s de Phytophthora sojae Las identidades de las secuencias oscilan del 100 al 93 % con respecto a 129 nucleótidos.
ADN ribosómico 18s de Phakopsora pachyrhizi Las identidades de las secuencias oscilan del 100 al 93 % con respecto a 89 nucleótidos.
Especies de hongo = (17)
(bits) Especies de hongo = (18) (bits)
Phytophthora sojae
278 Phakopsora pachyrhizi 278
Phytophthora vignae
194 Phakopsora meibomiae 153
Phytophthora drechsleri
174 Uromyces aemulus 131
Phytophthora cinnamomi
174 Puccinia striiformis 123
Plasmopara viticola
168 Pandora neoaphidis 121
Phytophthora melonis
167 Puccinia allii 119
Phytophthora cryptogea
165 Piromyces sp. 119
Phytophthora pistaciae
161 Dioszegia sp. 117
Hyaloperonospora parasitica
161 Bullera sp. T 117
Phytophthora niederhauserii
161 Dioszegia crocea 117
Phytophthora sinensis
153 Cadophora sp. 117
Phytophthora cajani
153 Dioszegia laungarica 117
Pythium insidiosum
153 Phialophora sp. 117
Phytophthora palmivora
151 Anaeromyces sp. 117
Phytophthora ramorum
149 Phialophora melinii 117
Peronospora corydalis
149 Puccinia triticina 115
Pythium rostratum
141 Neocudoniella radicella 115
Pinctada nigra
115
Peziza vesiculosa
115
Phillipsia domingensis
115

Ejemplo 56. Control de múltiples plagas de plantas usando múltiples polinucleótidos heterólogos de silenciamiento
[0377] Las plantas son frecuentemente atacadas por una multiplicidad de plagas. Opcionalmente, puede ser
10 útil controlar varias plagas en la misma planta. Los procedimientos para apilamiento de genes para controlar múltiples plagas y las secuencias de genes útiles (por ejemplo, genes que codifica ARN ribosómicos, cutinasas, catepsinas y otras enzimas y proteínas esenciales) se enseñan en el presente documento. Un ejemplo no limitante es sojas y el control simultáneo de podredumbre de la raíz y del tallo por Phytophthora, la roya asiática, el nematodo de los quistes de la soja, síndrome de muerte súbita y áfidos. Genes a modo de ejemplo para apilarse para este fin
15 incluyen SEQ ID NO: 14 para podredumbre de la raíz y del tallo por Phytophthora, SEQ ID NO: 50 para la roya asiática, SEQ ID NO: 62 para el nematodo de los quistes de la soja, SEQ ID NO: 48 para síndrome de muerte súbita, y SEQ ID NO: 56 para áfidos.
[0378] Similarmente, el maíz puede hacerse resistente a las podredumbres de la raíz y del tallo, micotoxinas,
20 tizones de las hojas, barrenadores de tallos y mazorcas, áfidos y nematodos. Similarmente, el algodón puede hacerse resistente a la podredumbre de las cápsulas, marchitamientos por Verticillium y Fusarium, tizones de las plantas de semillero, caída de las plántulas, picudo del algodonero, gusanos de las cápsulas, áfidos y orugas agrimensoras. Similarmente, la colza puede hacerse resistente a pie negro, podredumbre del tallo, mancha negra, caída de las plántulas y tizones de las plantas de semilleros, escarabajos pulga, gorgojos, y áfidos.
25 [0379] Similarmente, el trigo puede hacerse resistente a roya de las hojas y el tallo, tizón de la cabeza, ronchas por Septoria, mal del pie, hollines, oídio y mildiu, áfidos y nematodos. Similarmente, el tomate puede hacerse resistente al tizón tardío, antracnosis, moho gris, marchitamiento por Verticillium, nematodos y áfidos. Similarmente, la patata puede hacerse resistente al tizón tardío, tizón temprano, marchitamiento por Verticillium,
30 nematodos, escarabajo de la patata de Colorado y áfidos.
[0380] Debe entenderse que, aunque la invención se ha descrito conjuntamente con la descripción detallada de la misma, la anterior descripción está previsto para ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguiente reivindicaciones.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0381]
<110> Niblett, Charles L.
<120> Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas
<130> VEN-100CXCZ1 PCT
<160> 69
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador VZA 1F
<400> 1 taaattagcg gccgcatgaa attcttcgct cgcagtag 38
<210> 2
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador VZA 2R
<400> 2 aaaaatccat ggtcaagcag aaccacggct tagtg 35
<210> 3
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador VZA 3F
<400> 3 aaataagggc ccatgaaatt cttcgctcgc agt 33
<210> 4
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador VZA 4R <400> 4
aaatatctcg agtcaagcag aaccacggct tagtg
5 <210> 5
<211> 2201
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> Construcción de silenciamiento pVZA100
<400> 5
<210> 6
<211> 2031 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción de silenciamiento pVZA200 10
<400> 6
<210> 7
<211>
3159 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción de silenciamiento pVZA300
<400> 7
<210> 8
<211>
2031 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> construcción de silenciamiento pVZA400 10
<400> 8
<210> 9
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador GUS directo
<400> 9 ggtgggaaag cgcgttacaa gaaagc 26
<210> 10
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador GUS inverso
<400> 10 gtttacgcgt tgcttccgcc actgg 25
<210> 11
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Higromicina PT FP
<400> 11 cgtctgtcga gaagtttctg atcga 25
<210> 12
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Higromicina PT RP
<400> 12 tacttctaca cagccatcgg tccaga 26
<210> 13
<211> 440
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora nicotianae (VZA 1 65R = Pnic Ri)
<400> 13 5 <210> 14
<211> 452
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora nicotianae (VZA 2 69F = Pnic 21)
<400> 14
<210> 15
<211> 388
<212> ADN 20 <213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora nicotianae (VZA 3 73F = Pnic 23)
25 <400> 15 <210> 16
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora nicotianae (VZA 3 73F = Pnic 23) 10
<400> 16
15 <210> 17
<211> 465
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora nicotianae (VZA 1 65R = Pnic Ri)
<400> 17
<210> 18
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 6 70F = Pcap 30) 10
<400> 18
15 <210> 19
<211> 395
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 7 72F = Pcap 31)
<400> 19
<210> 20
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 8 79F = Pcap 28) 10
<400> 20
15 <210> 21
<211> 461
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 9 84F = Pcap 01)
<400> 21
<210> 22
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 10 87F = Pcap 32) 10
<400> 22
15 <210> 23
<211> 416
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 11 89F = Pcap 03)
<400> 23
<210> 24
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 12 90F = Pcap 22) 10
<400> 24
15 <210> 25
<211> 467
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora capsici (VZA 13 91F = Pcap 25)
<400> 25
<210> 26
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora palmivora (VZA 14 81F = Ppal O2) 10
<400> 26
15 <210> 27
<211> 465
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora palmivora (VZA 15 82F = Ppal 10)
<400> 27
<210> 28
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora palmivora (VZA 16 83F = Ppal 11) 10
<400> 28
15 <210> 29
<211> 466
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora palmivora (VZA17 85F = Ppal 04)
<400> 29
<210> 30
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora palmivora (VZA 18 86F = Ppal 05) 10
<400> 30
15 <210> 31
<211> 420
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora cinnamomi (VZA 19 64R = Pcin Ri)
<400> 31
<210> 32
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora cinnamomi (VZA 20 77F = Pcin 01) 10
<400> 32
15 <210> 33
<211> 442
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora citrophthora (VXA 21 63R = Pcto Ri)
<400> 33
<210> 34
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora citricola (VZA 22 66R = Pctr Ri) 10
<400> 34
15 <210> 35
<211> 469
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora megakarya (VZA 23 80F = Pmek 01)
<400> 35
<210> 36
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa, Phytophthora megasperma/ P. sojae (VZA 24 92F = Pmeg 01) 10
<400> 36
15 <210> 37
<211> 460
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cutinasa, Phytophthora heve (VZA 25 93F = Phev 02)
<400> 37 <210> 38
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Catepsina FP de M. persicae
<400> 38
gggcccacaa gagcgaagat gc 22
<210> 39
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Catepsina RP de M. persicae
<400> 39
atttcacgta aacgcctgac ttgtaactgg 30
<210> 40
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Elicitina FP de P. infestans
<400> 40
gggcccgccc tcgtcggctc c 21
<210> 41
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADNr FP de P. infestans
5 <400> 41
gggccctttc cgtaggtgaa cc 22
<210> 42 10 <211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> ADNr RP de P. infestans
<400> 42
aaaccggtcg ccaactcgct ac 22 20
<210> 43
<211> 584
<212> ADN
<213> Artificial 25
<220>
<223> ADNr de Phialophora gregata
<400> 43 30
<210> 44
<213> Artificial
<220>
<223> Marcador de ADN de genotipo B de Phialophora gregata
<400> 44
<210> 45
<211> 1096
<212> ADN
<213> Artificial 10
<220>
<223> Subunidad de ARN Pol de Sclerotinia sclerotiorum
<400> 45 15
<210> 46
<213> Artificial
<220>
<223> Gen ARN ribosómico 18S de Puccinia hordei
<400> 46 <210> 47
<211> 2040 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Transportador de hexosa de Sclerotinia sclerotiorum 10
<400> 47
<210> 48
<213> Artificial
<220>
<223> Cutinasa de Fusarium solani pisi
<400> 48
<210> 49
<211> 595
<212> ADN 10 <213> Artificial
<220>
<223> Homólogo de cutinasa de Phakopsora pachyrhizi
15 <400> 49 <210> 50
<213> Artificial
<220>
<223> ADNr de Phakopsora pachyrhizi 10
<400> 50
<210> 51
<211> 624
<212> ADN
<213> Artificial 5
<220>
<223> Factor de elongación 1 alfa de la traducción de Fusarium sambucinum
<400> 51 10
<210> 52
<213> Artificial
<220>
<223> Gen elicitina de Phytophthora infestans 20
<400> 52
25 <210> 53
<211> 1096
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 5 <223> Subunidad de ARN polimerasa de Sclerotinia sclerotiorum
<400> 53
<210> 54
<211> 538
<212> ADN
<213> Artificial 15
<220>
<223> ARNr de Stenocarpella maydis
<400> 54
5 <210> 55
<211> 536
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> ADNr 18S de Cercospora zeae-maydis
<400> 55
<210> 56
<211> 1017 <212> ADN 20 <213> Artificial
<220>
<223> Catepsina B proteasa de Myzus persicae
<400> 56
<210> 57
<211> 248
<212> ADN 10 <213> Artificial
<220>
<223> Cisteína proteasa de Leptinotarsa decemlineata
15 <400> 57 <210> 58
<213> Artificial
<220>
<223> ADNr de Verticillium dahliae 10
<400> 58
15 <210> 59
<211> 762
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> ADNr de Peronospora manchurica
<400> 59 5 <210> 60
<211> 521
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> Citocromo oxidasa II de Meloidogyne chitwoodi
<400> 60 <210> 61
<211> 1773
<212>
ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> ADNr de Pratylenchus scribneri
<210> 62
<211> 949
<212>
ADN 5 <213> Artificial
10 <400> 61
<220>
<223> ADNr de Heterodera glycines
10 <400> 62
<210> 63 15 <211> 1120
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> ARN polimerasa II de Magnaporthe grisea
<400> 63 <210> 64
<213> Artificial
<220>
<223> ADNr 18S de Puccinia hordei
<400> 64 <210> 65
<213> Artificial
<220>
<223> ADNr de Pseudoperonospora humuli 10
<400> 65 <210> 66
<211> 1260 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Citocromo P450 monoxigenasa de Botrytis cinerea 10
<400> 66 5 <210> 67
<211> 536
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> ADNr de Pseudomonas syringae
<400> 67
<210> 68
<213> Artificial
<220>
<223> Gen Cel A de Clavibacter michiganense michiganense 10
<400> 68 <210> 69
<211> 1260 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Gen endo B-glucosidasa de Clavibacter michiganense 10
<400> 69

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de conferir resistencia fúngica a una planta, en el que el procedimiento comprende transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo el polinucleótido heterólogo:
    (a)
    una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad fúngica; y
    (b)
    una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido;
    en el que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse para formar una región bicatenaria; en el que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además un único promotor operativamente ligado a las secuencias antisentido y sentido.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el gen de patogenicidad fúngica está seleccionado del grupo que consiste en un gen cutinasa, un gen ARN ribosómico y un gen elicitina.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen ARN ribosómico.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la secuencia antisentido tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad de al menos dos hongos de diferentes especies, y en el que la planta es más resistente a los al menos dos hongos que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido heterólogo comprende además:
    (c)
    una segunda secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un segundo gen de patogenicidad fúngica;
    (d)
    una segunda secuencia sentido sustancialmente complementaria a la segunda secuencia antisentido;
    en el que el segundo gen de patogenicidad fúngica es diferente del primer gen de patogenicidad fúngica; y en el que un transcrito de la segunda secuencia antisentido y un transcrito de la segunda secuencia sentido pueden hibridarse para formar una segunda región bicatenaria; en el que las segundas secuencias antisentido y las segundas secuencias sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el primer o segundo gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una subespecie diferente.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una especie diferente.
  14. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a un género diferente.
  15. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una familia diferente.
  16. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a un orden diferente.
  17. 17.
    Una planta transgénica que comprende un polinucleótido heterólogo que comprende:
    (a)
    una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad fúngica seleccionado del grupo que consiste en gen cutinasa, gen ARN ribosómico, gen adhesina y gen elicitina; y
    (b)
    una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido;
    en la que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse para formar una región bicatenaria; en la que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en la que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
  18. 18.
    La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen ARN ribosómico.
  19. 19.
    La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa.
  20. 20.
    La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
  21. 21.
    La planta transgénica según la reivindicación 20, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
  22. 22.
    La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, (Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
  23. 23.
    La planta transgénica según la reivindicación 22, en la que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o (Fusarium solani.
  24. 24.
    La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que la secuencia antisentido tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad de al menos dos hongos de diferentes especies, y en la que la planta es más resistente a los al menos dos hongos que la misma planta que carece del
    5 polinucleótido heterólogo.
  25. 25. Una planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el polinucleótido heterólogo comprende además:
    10 (c) una segunda secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un segundo gen de patogenicidad fúngica seleccionado del grupo que consiste en gen cutinasa, gen ARN ribosómico, gen adhesina y gen elicitina;
    en el que el segundo gen de patogenicidad fúngica es diferentes del primer gen de patogenicidad fúngica; y 15
    (d) una segunda secuencia sentido sustancialmente complementaria a la segunda secuencia antisentido;
    en el que un transcrito de la segunda secuencia antisentido y un transcrito de la segunda secuencia sentido pueden hibridarse para formar una segunda región bicatenaria; en la que las segundas secuencias antisentido y las
    20 segundas secuencias sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en la que la planta es más resistente a un hongo que expresa el primera o segundo gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
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