CN117721111B - 红树植物白骨壤内源启动子amgt1p5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红树植物白骨壤内源启动子AMGT1P5及其应用，涉及基因工程技术领域。该启动子AMGT1P5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明基于红树植物白骨壤的优良耐盐性能，开发了一种白骨壤来源的启动子AMGT1P5，该启动子含有已报道的盐诱导顺式作用元件GT1‑motif(GGTTAA)，可以为红树植物耐盐机制研究提供新的借鉴，也能够调控转基因植物(包括双子叶植物和单子叶植物)中外源基因的表达。本发明为转基因植物的外源基因表达提供了新的工具和选择，具有十分重要的意义。

Description

红树植物白骨壤内源启动子AMGT1P5及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及红树植物白骨壤内源启动子AMGT1P5及其应用。

背景技术

白骨壤(Avicennia marina(Forsk.)Vierh.)是马鞭草科(Verbenaceae)海榄雌属(Aricennia)的一种红树林先锋种，在我国分布十分广泛。在红树植物中，白骨壤是耐盐碱、耐水淹、耐贫瘠、抗风浪、抗低温的物种。一般陆生植物的细胞内渗透压范围为5-10个大气压，而白骨壤最高可达62个大气压。白骨壤主干四周长有细棒状的出水呼吸根，帮助其进行气体交换，其叶肉内有泌盐细胞，能把叶内的多余的盐分排出叶面，保证了植株能从沼泽性盐渍土中吸取足够的水分和养分，这让它成为耐水淹和耐盐能力最强的红树植物之一，可生长于60‰盐度的海滩，高者甚至可达90‰。

目前红树类植物耐盐机制虽然有大量研究成果，但仍不十分透彻，一些方面仍然存在争议和未知。我国地域辽阔，海岸线绵长。不仅有大量的滨海盐碱地，还有内陆盐碱地。其中只有少部分改良利用，绝大部分仍未脱盐及不断遭受盐渍危害。在影响农作物产量的各种因素中，干旱和盐碱所造成的减产达40％。如水稻是对盐碱中度敏感的作物。研究红树植物的耐盐机制，利用耐盐基因和耐盐相关启动子培育转基因耐盐植物，对开发利用盐碱地，提高粮食产量，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供红树植物白骨壤内源启动子AMGT1P5及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该启动子含有已报道的盐诱导顺式作用元件GT1-motif(GGTTAA)，可以为后续红树植物耐盐机制研究提供新的借鉴，也能够调控转基因植物中外源基因的表达，本发明为转基因植物的外源基因表达提供了新的工具和选择，具有十分重要的意义。

本发明提供了如下方案：

本发明提供一种红树植物白骨壤的内源启动子AMGT1P5，所述内源启动子AMGT1P5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述的内源启动子AMGT1P5在制备表达外源基因的重组载体中的应用。

本发明还提供一种表达外源基因的重组载体，包括上述的内源启动子AMGT1P5。

本发明还提供一种表达外源基因的宿主细胞，包括上述的重组载体。

进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。

本发明还提供上述的内源启动子AMGT1P5、重组载体或宿主细胞在构建转基因植物中的应用，所述内源启动子AMGT1P5在所述转基因植物中驱动外源基因的表达。

进一步地，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

进一步地，所述双子叶植物包括烟草；所述单子叶植物包括洋葱。

本发明还提供一种在转基因植物中驱动外源基因表达的方法，包括利用含有上述内源启动子AMGT1P5的生物材料，构建得到转基因植物，利用所述内源启动子AMGT1P5驱动所述外源基因表达的步骤。

进一步地，所述生物材料为上述的重组载体或宿主细胞。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于红树植物白骨壤的优良耐盐性能，开发了一种白骨壤来源的启动子AMGT1P5(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，该启动子AMGT1P5能够调控转基因植物(包括双子叶植物和单子叶植物)中外源基因的表达。本发明为转基因植物的外源基因表达提供了新的工具和选择，具有十分重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的质粒图谱；

图2为启动子AMGT1P5的重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的GUS染色结果；其中，A为含重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的农杆菌转化三生烟叶盘的GUS染色结果；B为CK^-，即未转化的三生烟无菌苗叶盘的GUS染色结果；C为CK⁺，即含由CaMV35S调控GUS基因转录的pCAMBIA1304空载体的农杆菌转化三生烟叶盘的GUS染色结果；

图3为AMGT1P5转基因三生烟各生长时期图；其中，A为共培养期；B为愈伤期；C为侧芽期；D为生根期；E为成株期；

图4为AMGT1P5调控GUS基因转基因三生烟的PCR扩增检测结果；其中，M:Marker2000；A：AMGT1P5调控GUS基因转基因三生烟；B：CK^-，野生型三生烟；

图5为启动子AMGT1P5的重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的重组根癌农杆菌介导转化的洋葱鳞茎的GUS染色结果；其中，A为含有重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的农杆菌转化洋葱鳞茎的GUS染色结果；B为CK^-，即未转化的洋葱鳞茎的GUS染色结果；C为CK⁺，即含由CaMV35S调控GUS基因转录的pCAMBIA1304空载体转化洋葱鳞茎的GUS染色结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中使用的MS培养基的配方如表1所示：

表1MS培养基配方

注：pH调至5.8，121℃灭菌20min。

以下实施例中使用的GUS染色液配方为：0.25mM K₃Fe(CN)₆、0.25mM K₄Fe(CN)₆、64mM Na₂HPO₄·12H₂O、36mM KH₂PO₄、10mM Na₂EDTA、0.1％Trition X-100、10％CH₃OH和2.5mg/mL 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷(X-Gluc)。

实施例1

AMGT1P5启动子片段的PCR扩增：

使用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP360)提取白骨壤的基因组DNA，根据AMGT1P5启动子的序列(SEQ ID NO.1)，设计一对特异性扩增引物(上游引物AMGT1P5F，加限制性酶切位点HindⅢ和保护碱基；下游引物AMGT1P5R，加限制性酶切位点Nco I和保护碱基)。以上述提取的白骨壤的基因组DNA为模板，使用高保真DNA聚合酶(Vazyme，P520)进行PCR扩增。PCR扩增体系如表2所示。

表2AMGT1P5启动子的PCR扩增体系

PCR扩增程序为：98℃预变性30s；然后以98℃变性10s，54.5℃退火5s，72℃延伸5s，进行35个反应循环；最后72℃延伸1min。

其中，上游引物AMGT1P5F：CCCAAGCTTGAGTTTGTTTTGTAGAATTATAGAA(SEQ IDNO.2)，其中下划线代表HindⅢ酶切位点。下游引物AMGT1P5R：CATGCCATGGTTTATATATCATTAACCAGAGGAGA(SEQ ID NO.3)，其中下划线代表Nco I酶切位点。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为300bp左右的条带，使用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，DP209-03)进行纯化回收。

SEQ ID NO.1：

gagtttgttttgtagaattatagaagattgattgcaacaatgaaaataatattttctatctcacatcacaccattcacataataatattattcttcatt atttaatattggtactaatcaccgaataaacatggctatatttattggtgatccattatgatttgaaaaaagacggtcacaacgtaggatctatcgaac aaatcattgtaatcctattattaatttcacgaaacccacagaaaaaaagggaaaaggacggaaactctcctctggttaatgatatataaa。

实施例2

pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体的构建：

将实施例1得到的PCR扩增产物用HindⅢ(NEB，R3104S)和Nco I(NEB，R3193S)限制性内切酶进行双酶切，得到的酶切产物用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN，DP209-03)进行回收，得到AMGT1P5启动子片段。

将上述得到的回收产物与经过HindⅢ和Nco I双酶切(切除部分包括调控GUS基因表达的35S启动子)后的pCAMBIA1304质粒(MIAOLING Biology，P0279)回收产物进行连接，以AMGT1P5替代35S启动子，构建AMGT1P5调控GUS基因表达的重组载体，如图1所示。然后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。

其中，连接条件如下：

T/A连接体系(10μL)：pCAMBIA1304酶切产物1μL、10×T4 DNALigase Buffer 1μL、AMGT1P33启动子片段7.5μL和T4 DNALigase(TaKa Ra，D2011A)0.5μL。

16℃连接过夜，得到pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体。

将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5α(上海唯地，DL1001)100μL，冰上融化后，加入10μL如上所得的连接产物(即pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体)，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入200μL4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃200rpm复苏120min，涂布棒涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养18h。获得含有pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-PAMGT1P5。深圳华大基因科技有限公司对pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体中的AMGT1P5进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。

测序结果表明，获得的pCAMBIA1304-AMGT1P5重组载体中AMGT1P5启动子序列正确。

实施例3

冻融法制备重组根癌农杆菌pCAMBIA1304-AMGT1P5细胞：

(1)取-80℃保存的LBA4404农杆菌感受态于室温片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)每100μL感受态加入0.01μg实施例2制备得到的pCAMBIA1304-AMGT1P5重组质粒，轻柔混匀，依次于冰上静置5分钟，液氮5分钟，37℃水浴5分钟，冰浴5分钟。

(3)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2小时。

(4)6000rpm离心1min，留取100μL上清轻轻吹打重悬菌块，之后涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2天。

以引物对AMGT1P5F/AMGT1P5R进行菌落PCR验证，同时提取质粒用HindⅢ和Nco I限制性内切酶进行双酶切验证。条带为300bp左右的即为重组根癌农杆菌LBA4404-AMGT1P5细胞。

实施例4

重组根癌农杆菌介导转化枯斑三生烟：

将实施例3构建得到的重组根癌农杆菌LBA4404-AMGT1P5，挑取单菌落转入含有50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL利福平的LB液体培养基，28℃200rpm摇菌过夜。吸取菌液转入30倍体积的含有50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL利福平的LB液体培养基，相同条件进行复摇，培养至OD₆₀₀为0.6，得到侵染菌液。

从培养3周的无菌三生烟苗上剪取较大的叶片，盛入装有ddH₂O的无菌培养皿中。用直径1cm的打孔器将烟草叶片打成叶圆盘(或者用无菌手术刀将烟草叶片切为边长约1cm的近似正方形的叶盘)，放入另一个装有ddH₂O的无菌培养皿中。

用枪镊将烟草叶盘夹出，放入装有侵染菌液的无菌50mL离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10min，期间不断摇晃几次。捞出烟草叶盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/L 6-BA和0.1mg/LNAA的MS固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4块叶盘，26℃暗培养2天。

暗培养结束的烟草叶盘转接到含有12.5μg/mL潮霉素B和1.0mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA和300μg/mL特美汀的MS固体培养基平板中，26℃光照培养。

培养4天后，取没有变白的叶盘进行GUS染色。37℃染色过夜后，以体积分数为75％的乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。结果如图2所示，经含有启动子AMGT1P5的重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘经GUS染色后变蓝，而不含重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的野生型烟草叶盘经GUS染色后不变色。结果表明本发明的AMGT1P5启动子在双子叶模式植物三生烟中对GUS基因具有调控作用。

检测转基因烟草中GUS基因的表达：

取转化过的三生烟叶盘继续光照培养，两周后继代，四周后出现丛生芽。当丛生芽生长到2cm时，用灭菌过的手术刀切下，接种到含有12.5μg/mL潮霉素B和300μg/mL特美汀的1/2MS培养基中，每瓶1株。26℃光照培养约2周。取生根状况良好的烟草小苗，在培养箱里打开组培瓶的盖子，炼苗3天。

剪除转基因烟草小苗的大部分叶片，小心洗掉根部大部分培养基，移栽到灭过菌的土壤里，进行盆栽，转基因烟草植株形成的全过程如图3所示。生长约2周，取长出的新叶提取DNA进行PCR扩增验证。扩增引物对为AMGT1P5F/AMGT1P5R。扩增产物经1％琼脂糖电泳，结果如图4显示，得到了一条约300bp的条带，与AMGT1P5启动子大小一致，转pCAMBIA1304空载体的阳性对照和三生烟野生型无菌苗则无条带。

实施例5

洋葱鳞茎的诱导和转化：

用实施例3构建得到的重组根癌农杆菌pCAMBIA1304-AMGT1P5转化葱洋幼嫩鳞茎，共培养48h后进行GUS染色。

(1)农杆菌LBA4404-AMGT1P5的活化及转化菌液制备

挑取重组根癌农杆菌LBA4404-AMGT1P5的单菌落，接种于含50μg/mL的卡那霉素和100μg/mL利福平的液体YM/YEP/LB培养基，28℃，250rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.8。

吸取1mL培养好的菌液加入50mL含50μg/mL的卡那霉素的YM/YEP/LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀＝0.8，之后4℃，4000rpm离心，沉淀菌体，然后用MS重悬菌液至OD₆₀₀＝0.5，得到侵染菌液，备用。

(2)侵染

用无菌打孔器将5％的次氯酸钠溶液灭菌过的葱洋幼嫩幼鳞茎切为直径1cm的圆形茎盘，放入另一个装有ddH₂O的无菌培养皿中。用枪镊将洋葱茎盘夹出，放入装有侵染菌液的无菌50mL离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10min，期间不断摇晃几次。捞出洋葱茎盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/L 6-BA和0.1mg/LNAA的MS固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4块茎盘，26℃暗培养2天。

(3)筛选

暗培养结束后的洋葱茎盘，转接到含有12.5μg/mL潮霉素B、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LNAA和300μg/mL特美汀的MS固体培养基平板中，26℃光照培养。

(4)检测洋葱鳞茎中的GUS基因的表达

光照培养4天后，取没有变白的茎盘进行GUS染色。37℃染色过夜后以体积分数为75％的乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。结果如图5所示，经含有启动子AMGT1P5的重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的重组根癌农杆菌介导转化的洋葱茎盘，经GUS染色后变蓝，不含重组载体pCAMBIA1304-AMGT1P5的根癌农杆菌介导转化的野生型洋葱茎盘经GUS染色后颜色不变。结果表明，本发明的AMGT1P5启动子在单子叶植物洋葱中对GUS基因具有调控表达作用。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种红树植物白骨壤的内源启动子AMGT1P5，其特征在于，所述内源启动子AMGT1P5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述的内源启动子AMGT1P5在制备表达外源基因的重组载体中的应用。

3.一种表达外源基因的重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的内源启动子AMGT1P5。

4.一种表达外源基因的宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。

6.一种如权利要求1所述的内源启动子AMGT1P5、权利要求3所述的重组载体或权利要求4或5所述的宿主细胞在构建转基因植物中的应用，其特征在于，所述启动子AMGT1P5在所述转基因植物中驱动外源基因的表达。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述双子叶植物包括烟草；所述单子叶植物包括洋葱。

9.一种在转基因植物中驱动外源基因表达的方法，其特征在于，包括利用含有权利要求1所述的内源启动子AMGT1P5的生物材料，构建得到转基因植物，利用所述内源启动子AMGT1P5驱动所述外源基因表达的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物材料为权利要求3所述的重组载体或权利要求4或5所述的宿主细胞。