CN102851294A - 一种维管组织特异表达启动子vsp1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种维管组织特异表达启动子VSPl及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：1）序列表的序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）中所述DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明提供一种新型的维管组织特异表达的启动子VSPl，将VSPl启动子与报告基因GUS相连，用带有该融合基因的载体转化拟南芥，水稻及棉花，该启动子能够在拟南芥、棉花、水稻等植物的维管组织中特异地启动基因表达。

Description

一种维管组织特异表达启动子VSP1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种维管组织特异表达启动子VSPl及其应用。

背景技术

组织或器官特异性启动子，即在此类启动子的调控下，基因的表达仅限于某些特定的部位或者器官。这种特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为存在基础。用组织特异性启动子调控基因表达时，可使外源基因产物更有效地发挥作用，并降低对植物的负面影响。

目前已经分离并得到了一些能在不同组织部位或者器官中特异表达的启动子。比如能够在叶肉细胞特异启动的水稻来源的RbcS启动子；还有能够在根部特异启动的烟草的TobRB7基因启动子；能够在胚乳特异性启动表达的水稻中GluB-1基因启动子；能够在花药中特异启动表达的烟草TA29启动子、水稻Osg6B启动子等；能够在维管组织木质部特异启动表达的法国菜豆富含甘氨酸结构基因Grpl.8启动子；能够在维管组织韧皮部特异启动表达的拟南芥H+-ATP酶基因3（Ha3）启动子等。

发明内容

本发明的目的是提供一种维管组织特异表达启动子VSPl及其应用。

本发明提供的一种DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列1自5’末端第7-4753位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）所示DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）中所示DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

扩增上述DNA片段全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA片段在使目的基因在植物组织中表达中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述植物组织为植物叶、茎和/或根的维管组织。在本发明的实施例中目的基因为GUS基因，其核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第4760-6567位核苷酸。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥或棉花，所述单子叶植物为水稻或者小麦。

上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物进一步具体为拟南芥或棉花，所述单子叶植物进一步具体为水稻。

本发明的实验证明，本发明提供一种新型的维管组织特异表达的启动子VSPl，将VSPl启动子与报告基因GUS相连，用带有该融合基因的载体转化拟南芥、水稻及棉花，该启动子能够在拟南芥、棉花、水稻等植物根、茎、叶的维管组织中特异地启动基因表达，证明在转基因植株中该启动子能够特异性地在维管组织中启动GUS基因表达。

附图说明

图1为pBin19-VSPl-GUS植物表达载体结构示意图

图2为T0代转基因拟南芥PCR鉴定结果

图3为T0代转基因水稻的PCR鉴定结果

图4为T0代转基因棉花的PCR鉴定结果

图5为T0代转基因拟南芥中GUS基因的维管组织特异性表达

图6为T0代转基因水稻中GUS基因的维微管组织特异性表达

图7为T0代转基因棉花中GUS基因的维管组织特异性表达

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、VSPl启动子的克隆

VSPl启动子来源于C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶（GDC）P-蛋白亚基（gdcsP)基因的上游调控序列。将F.anomala基因文库构建于Lambda GEM11。限制性酶切分析以及C-末端和N-端特异性探针杂交结果显示基因库中所得的所有克隆均具有类似的杂交图谱,推断F.anomala中gdcsP基因很可能仅仅含有一个拷贝。Southern Blot以及以后的RT-PCR实验结果的确证明gdcsP基因为单拷贝。在所有克隆中，克隆PFAG7含有全长基因,全片段(大约17kb)被直接克隆进质粒载体pBluescript SK^-之中。通过亚克隆XhoI获得约4.7kb上游启动子片段，经过测序，确定该片段具有序列表中序列1自5’末端第7-4753位核苷酸，该片段命名为Vascular specific promoter-1(VSP1)。

实施例2、VSPl启动子的功能验证

一、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体的构建

1、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体构建

序列1为GUS的表达框（VSPl-GUS-CaMV），包括启动子VSPl、基因GUS和终止子CaMV（35S-ter），其中自5’末端第1-6bp为BamHI酶切位点；7-4753bp为VSPl启动子；4754-4759bp为NcoI酶切位点；4760-6567bp为GUS基因；6568-6802bp为35S终止子ocs序列（CaMV）；6803-6808bp为NcoI酶切位点；6809-6814bp为BamHI酶切位点。

将序列1插入双元载体pBin19（购自Clontech公司；该载体的构建方法的文章如下：Bevan M.(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.NucleicAcids Res.12:871-18721，该载体上没有启动子和终止子。）的BamHI酶切位点，得到重组载体，经过测序验证正确。将该重组载体命名为pBin19-VSPl-GUS，其结构示意图如图1所示。

2、pBin19-GUS表达载体（对照重组载体）构建

将序列1自5’末端第4760-6802位核苷酸（GUS-CaMV）插入双元载体pBin19的BamHI酶切位点，得到对照重组载体，经过测序验证正确。将该对照重组载体命名为pBin19-GUS。

二、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体转化植物

1、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体对农杆菌的转化

1）、农杆菌感受态的制备：接种农杆菌GV3101（购自Biovector中国质粒载体菌株基因库，货号为Biovector-375）单菌落于50ml YEP培养基中，28℃振荡培养，至OD₆₀₀为0.5，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，收集菌体，重悬于10ml 0.5M NaCl中；再次离心，菌体重悬于1ml 20mM CaCl₂溶液中；取50μl菌液分装到1.5ml离心管中，-80℃保存。

2）、质粒对农杆菌的转化：取2μl的上述质粒pBin19-VSPl-GUS，加到50μl上述感受态菌（GV3101）中，混匀后冰浴30分钟，在液氮中速冻5分钟，37℃热激5分钟，加入1mlYEP培养液，28℃培养4小时，将菌液涂布在含有50μg/ml利福霉素、50μg/ml卡那霉素的平板上，28℃培养2天。待长出菌落后，取单菌落进行PCR检测，引物为GUS-F TACCCGTCCGCAAGTGCACG（序列2）、GUS-R GCGAGGTCGCAAAATCGGCG（序列3）；扩增出450bp片段即为阳性，将该阳性菌命名为GV3101/pBin19-VSPl-GUS。

2、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体农杆菌介导法转化植物

1）pBin19-VSPl-GUS融合表达载体农杆菌介导法转化拟南芥

浸花法转化拟南芥：取200μl GV3101/pBin19-VSPl-GUS加入到5mlYEP液体培养基（含有50μg/ml利福平、50μg/ml卡那霉素）中，28℃过夜培养。取过夜培养的菌液2ml，加入到装有250mlYEP液体培养基（含有50μg/ml利福平、50μg/ml卡那霉素）的500ml三角瓶中，28℃过夜培养，直到菌液OD₆₀₀为0.8时，5000r/min离心10分钟，弃去上清液，将菌体在50ml5%蔗糖水溶液中悬起，在转化植株之前向悬液中加入0.05%含量（V/V）的silwet表面活性剂。将野生型拟南芥（Arabidopsis，col-0，购自TheEuropean Arabidopsis Stock Centre（NASC），N1092）植株的花浸入到上述农杆菌悬浮液中约10秒，随后将浸花后的植株用塑料盖子盖上，温室（20℃，16小时日照）培养24小时后取下盖子。培养植物直到收集种子，得到T0代转基因拟南芥种子。

将收集到的T0代转基因拟南芥种子烘干，保存于4℃条件。在无菌工作台上进行以下操作，取适量种子放于EP管中，加入75%乙醇，涡旋1分钟，弃去75%乙醇，用无菌水洗一遍，加入含有10%次氯酸钠的溶液，充分涡旋5分钟，旋转EP管20分钟以便充分灭菌。静置后弃去上清液，用无菌水洗4遍。将洗过的种子在无菌水中悬起，均匀铺在含有50μg/ml卡那霉素的1/2MS固体培养基上，在无菌工作台中吹干表面水分，使用封口膜将平板封闭，放入温室（20℃，16小时日照）培养。

在培养数天后，阳性植株会逐渐长出真叶并有较发达的根系，而阴性植株会呈矮小状态并最终死亡。这样就可以达到初步筛选的目的，随后，将初步筛选的苗子移栽到营养土中，温室培养，得到抗性阳性T0代转基因拟南芥。

2）、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体农杆菌介导法转化棉花

（1）、挑取GV3101/pBin19-VSPl-GUS单菌落，接种于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28°C、280rpm过夜培养至OD600为0.7～0.8。5000rpm离心，用MS液体培养基重新悬浮，与野生型棉花（中棉24，购自中国农科院棉花研究所科技贸易公司）愈伤组织共侵染10分钟。

（2）、将愈伤组织用无菌吸水纸吸干，放置于MS培养基上，暗培养2～3天后，用无菌水将外植体洗净，转到含有100μg/ml头孢霉素，75μg/ml卡那霉素的分化培养基中，在12小时光照，12小时黑暗的条件下，继续培养至分化出小芽。

（3）、待芽长到2cm后，用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下，插到生根培养基中，继续培养4周左右，移栽到土壤中，得到T0代转基因棉花。

在T0代转基因棉花单株幼苗长出3～4片真叶时，对其进行了卡那霉素叶片涂抹初筛实验。卡那霉素的浓度分别为1.0%（W/V）。涂抹5天后进行观察，淘汰显症（叶片涂抹点变黄）单株后进行第二轮筛选，如此连续涂抹三次，选出三次不显症单株，进入下一步筛选，得到抗性阳性T0代转基因棉花。

3）、pBin19-VSPl-GUS融合表达载体农杆菌介导法转化水稻

（1）挑取GV3101/pBin19-VSPl-GUS单菌落，接种于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28°C、280rpm过夜培养至OD600为0.7～0.8。把菌液倒入1.5ml的离心管中7,000rpm离心5分钟。弃掉上清，加入N6-AS液体培养基重悬菌细胞。用N6-AS液体培养基调节细胞浓度，用分光光度计测浓度，最适OD₆₀₀值随农杆菌菌株和载体（有时）变化很大，最适值是指三天内共培养，农杆菌细胞不会过多生长。

（2）野生型水稻（日本晴，学名是Oryza．Sativa L.spp．japonica，varnipponbare，记载在蒋云洪，日本晴水稻高产栽培技术，山东农业科学，1981年第2期中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。）愈伤组织和细菌细胞（可在50ml的消毒锥形管中进行）混合，用手轻摇3分钟，愈伤组织与细菌溶液的比值不是影响转化效率的关键因素，15毫升的细菌悬浮液中可有几克愈伤组织。

（3）倒出细菌溶液，把愈伤组织转移到无菌试纸上以去除多余的液体。把含有愈伤组织的试纸放在N6-AS半固体培养基上。每100x20mm的培养皿含20ml的N6-AS，然后用医用胶带封口。22℃暗中共培养愈伤组织和细菌细胞6天，在N6培养基（添加250ug/ml羧苄青霉素或头孢噻肟和3ug/ml双丙氨膦）上次继代培养愈伤组织16天，抗双丙氨膦的愈伤组织在第二次抗性选择的后期应该能清楚的分辨出来，非转化的野生型愈伤组织被筛选剂杀死，如果第二次选择分不清楚抗性愈伤组织需要进行第三次选择。

（4）转基因植物的再生

把独立的抗性愈伤组织转移到N6-R植物再生培养基中，每100x20mm的培养皿包含30ml的N6-R培养基，每培养皿10个愈伤组织，培养皿用医用胶带封口。在冷荧光灯下28℃培养愈伤组织直到看到芽和根的形成，两周之内应该形成芽。把小苗转移到含30mlMS-F培养基的盒子中，在冷荧光灯下28℃培养小苗14天。把幼苗转移到盆里，在温室中培养，得到抗性阳性T0代转基因水稻。

三、转基因植株PCR鉴定

1、转基因植株总DNA提取

抗性阳性T0代转基因水稻和抗性阳性T0代转基因拟南芥用普通CTAB法进行总DNA提取；而抗性阳性T0代转基因棉花的总DNA提取方法如下：

（1）试剂配制：

表1为提取缓冲液（buffer I）的配方

原液	10ml	100ml	1000ml	终浓度
					1.75M Glucose	2	20	200	0.35M
1M Tris	1	10	100	0.1M
					0.25M Na2-EDTA	0.2	2	20	0.005M
20%PVP40	1	10	100	2%
					抗坏血酸	0.01g	0.1g	1g	0.1%
巯基乙醇	0.1	1	10	1.0%
					1%DIECA	1	10	100	0.1%

双蒸水

4.7

47

470

表2为裂解缓冲液（buffer II）配方

原液	10ml	100ml	1000ml	终浓度
					1M Tris	1	10	100	0.1M
2.8M NaCl	5	50	500	1.4M
					0.25M Na2-EDTA	0.8	8	80	0.02M
20%CTAB	1	10	100	2%
					20%PVP40	1	10	100	2%
抗坏血酸	0.01g	0.1g	1g	0.1%
					巯基乙醇	0.1	1	10	1.0%
1%DIECA	1	10	100	0.1%
					双蒸水	0.1	1.0	10

（2）棉花总DNA提取方法（改良CTAB法）

a.取新鲜棉花样品，放入冰冻过的陶瓷研钵中，液氮下快速研磨，将粉末转移到2ml离心管中，暂放冰上。

b.向离心管加入1ml冰冷的BufferI(附录A)，在震荡弃上混匀。

c.12000rpm离心20分钟。

d.弃去上清液，向离心管中加入800μl Buffer II（附录B），充分振荡。

e.在水浴锅中60～65℃温浴30分钟；

f.加等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻反转30～50次，混匀；

g.15℃12000rpm离心10分钟，上清液转移到干净的2ml离心管中。

h.重复6～7步骤。

i.加0.6倍体积的异丙醇，缓慢翻转30次以上，至到DNA絮状沉积。

j.-20℃冰箱中静置30分钟。

k.12000rpm离心，离下DNA，弃去上清液。

l.用1ml70%酒精清洗两次，待酒精挥发干净后，加入200微升TE缓冲液或重蒸水溶解DNA（10～30分钟，65℃）。

m.棉花总DNA存在于上清液中，于-20℃长期保存。

2、转基因植株PCR检测

分别将上述抗性阳性T0代转基因水稻、抗性阳性T0代转基因拟南芥和抗性阳性T0代转基因棉花的总DNA为模板，用Gus基因特异的一对引物（GUS-F和GUS-R），进行PCR扩增，阳性对照为质粒pBin19-VSPl-GUS，阴性对照为非转基因的相应野生型植物总DNA。

扩增体系：20μl体系：Taq酶10XBuffer 2μl；GUS前端引物：1μl；GUS后端引物：1μl；dNTP（2.5mM）0.4μl；Taq酶0.2μl；植物总DNA：1μl；重蒸水：14.4μl。PCR程序：95℃：3分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃：10分钟。

结果如图2-4所示，图2、3、4分别为抗性阳性T0代转基因拟南芥、抗性阳性T0代转基因水稻和抗性阳性T0代转基因棉花的PCR鉴定结果，扩增出了特异的450bp左右条带的为阳性转基因植物。经过鉴定，共得到3株阳性T0代转基因拟南芥、4株阳性T0代转基因水稻和3株阳性T0代转基因棉花。

采用同样的方法，将对照重组载体pBin19-GUS分别转入水稻、拟南芥和棉花中，得到T0代转GUS水稻（对照）、T0代转GUS拟南芥（对照）、T0代转GUS棉花（对照），鉴定方法同上。

四、转基因植物的功能研究

1、GUS报告基因染色试剂配制：

GUS缓冲液：50mmol/L磷酸氢钠缓冲液（pH7.0）、10mmol/L EDTA、0.1%（V/V）TritonX-100、2mmol/L铁氰化钾和2mmol/L亚铁氰化钾，4℃保存备用。

GUS染液：用N,N—二甲基甲酰胺溶解X-Gluc粉剂，配制成20mmol/L的溶液，于-20℃下保存备用。

2、转基因拟南芥和转基因水稻的GUS染色

将各株系的转基因植物的根、茎、叶等组织器官置于1.5ml离心管中，加入适量的GUS缓冲液浸没植物组织，再加入5%（V/V）用量的GUS染液，混匀后置于37℃保温16-24小时（时间以染色充分为准），用70%乙醇脱色及保存；上述各株系的转基因植物为阳性T0代转基因拟南芥、阳性T0代转基因水稻、T0代转GUS拟南芥（对照）、T0代转GUS水稻（对照）、野生型拟南芥和野生型水稻；且各株系均用10株检测，实验重复三次。

阳性T0代转基因拟南芥GUS染色结果如图5所示，其中，a-b为阳性T0代转基因拟南芥幼苗、c为野生型拟南芥幼苗；可以看出，阳性T0代转基因拟南芥幼苗叶片和根系微管组织均染色（蓝色），而野生型拟南芥幼苗没有颜色，证明了VSPl启动子在拟南芥叶片和根系的微管组织中的特异表达。

T0代转GUS拟南芥（对照）与野生型拟南芥的结果无显著差异。

阳性T0代转基因水稻GUS染色结果如图6所示，可以看出，阳性T0代转基因水稻的叶、茎、根中GUS基因仅在微管组织表达（蓝色），说明该启动子在水稻中的表达也是非常特异的。而野生型拟南芥叶、茎、根没有颜色。T0代转GUS水稻与野生型水稻的结果无显著差异。

3、转基因棉花组织GUS染色

采用石蜡切片观察GUS表达的组织定位，具体如下：

（1）试剂配制：

FAA固定液（100ml）：无水乙醇50ml（50％）；冰醋酸5ml（5％）；37％甲醛10ml（10％）；水35ml。

封片剂：50%中性树胶+50%二甲苯。

（2）石蜡切片

A、第一天所需材料适量（不超过固定液体积的1/20）取到已盛有FAA固定液的青霉素小瓶中。用真空泵缓慢抽气（抽气过程10分钟），在真空状态（>20atm）放置15分钟后，缓慢放气（放气过程10分钟）。可观察到有空气小泡冒出，样品沉到瓶底。室温放置16小时（准确）后开始脱水。准备工作：将蜡（Paraplast Plus）在60C融解过夜。

B、第二天早上9：00，脱水。梯度分别为：50%乙醇（植物组织应该沉在瓶底，说明抽气是充分的），50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，100%乙醇，1/4二甲苯:3/4乙醇，1/2二甲苯:1/2乙醇，3/4二甲苯:1/4乙醇（饱和番红），室温下每级30分钟。90%二甲苯:10%氯仿，90%二甲苯:10%氯仿，90%二甲苯:10%氯仿，室温下每级60分钟。最后将90%二甲苯:10%氯仿装满青霉素小瓶体积的一半。

C、将3-5片Plus蜡片（Paraplast Plus）小心投入含1/2体积90%二甲苯10%氯仿和样品的小瓶，并将小瓶放置于已调到42的℃加热混匀器上，大约15分钟后蜡溶解，轻轻摇动小瓶，使溶解的石蜡均匀分布，再加入3-5片蜡片。几次后小瓶渐满，放置过夜，将材料用镊子迅速转入已放有融好的Plus蜡片（Paraplast Plus）（在60℃的HEAT BLOCKER上）的新青霉素小瓶中，过夜。

D、第三天，第四天，每天换蜡2-3次，每次间隔大于6-10小时。

准备工作：60℃预热Regular蜡片（Paraplast Regular）。

E、第五天，包埋。将熔好的Regular蜡片（Paraplast Regular）倒入带手套折好的小船中，用烧热的镊子将材料夹到小船内，并摆好位置。待表面的蜡稍凝，将小船迅速浸于已备好的冷水中，放置至少2小时。包埋好的蜡块可用干净容器装好置于4℃存放。

F、打开展片机42℃，预热涂有poly-lysine的处理过的载玻片上的水。先大致修块，再精细修块，切片厚度10-20微米。

G、42℃展片10分钟即可。展片后放入45℃的烘箱内的玻片架子上，用一次性手套包好，以免污染。烤片24小时以上（时间越长越好）。

H、脱蜡、脱水：100%二甲苯（20min），100%二甲苯(15min)，1/2二甲苯1/2乙醇(1-5min)，100%乙醇(2min)，100%乙醇(2min)，二甲苯(3min)，二甲苯（10～30min）。

I、将上述载玻片晾干，边缘涂上封片剂，用洗净的盖玻片沿一侧轻轻盖下，注意不要产生气泡以免影响观察。放置一段时间使封片剂干燥。

J、显微镜观察：将制好的片子用Olympus显微镜观察。

上述植物组织为阳性T0代转基因棉花、T0代转GUS棉花（对照）和野生型棉花的根、茎、叶等组织器官使用Olympus体视镜进行观察。且各株系均用10株检测，实验重复三次。

结果如图7所示，a和b均为阳性T0代转基因棉花的叶片，c为野生型棉花的叶片，d、e、f分别为阳性T0代转基因棉花的叶柄、根和幼芽，g-i分别为阳性T0代转基因棉花根、茎、叶的切片结果，j-l:野生型棉花的根、茎、叶的切片结果，可以看出，阳性T0代转基因棉花根、茎、叶有染色，而野生型棉花的根、茎、叶无染色。

T0代转GUS棉花（对照）与野生型棉花的结果无显著差异。

Claims (9)

1.一种DNA片段，为如下1）-3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列1自5’末端第7-4753位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）所示DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3）与1）中所示DNA分子具有90%以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

3.扩增权利要求1中所述DNA片段全长或其任意片段的引物对。

4.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物组织中表达中的应用。

5.根据权利要求4中所述的应用，其特征在于：所述植物组织为植物叶、茎和/或根的维管组织。

6.根据权利要求4或5中所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥或棉花，所述单子叶植物为水稻。

8.权利要求1中所述DNA片段在植物的遗传育种中的应用。

9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花，所述单子叶植物具体为水稻。

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