CN101230348B

CN101230348B - 水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSPⅠ)及其应用

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Publication number: CN101230348B
Application number: CN2007101900074A
Authority: CN
Inventors: 杨剑波; 吕玉萍; 吴影; 王妹梅; 陆徐忠; 李莉; 宋丰顺; 张毅; 汪秀峰; 倪大虎
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-11-19
Filing date: 2007-11-19
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2027-11-19
Also published as: AR069378A1; CN101230348A; CN102016040A; WO2009065301A1; US20110119794A1; WO2009066256A1

Abstract

本发明涉及水稻非胚乳组织表达启动子及其应用，该启动子长1785bp，以其取代植物表达载体pCAMBI01305.1上的组成型CaMV35S启动子，构建成为一个新的植物表达载体，命名为pOsTSP I-GUS。用转基因的方法验证该启动子的启动活性，GUS组织染色结果显示该启动子具有组织表达特异性，即只在水稻非胚乳组织(根、茎、叶等)中表达，在胚乳中不表达。该启动子的获得，为水稻及其它作物胚乳组织基因表达调控研究提供了一个有力的工具，特别是为水稻等转基因食品的安全性研究和开发创造了有利条件。因此，该启动子的获得，具有重要理论和实践意义。

Description

水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSPⅠ)及其应用

【技术领域】

本发明涉及水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其应用。

【背景技术】

尽管应用现代基因工程技术获得了许多转基因植物，但一些不容忽视的问题却制约了这些转基因植物向商品化、实用化方向发展。在转基因水稻中尤以外源蛋白在胚乳中的积累及其可能造成的食用安全风险，成为制约商业化进程的重要因素。针对这一问题，利用基因启动子策略(即选用诱导型、组织特异性及时间依赖型启动子)，使外源基因只在非食用部分表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，是促进转基因水稻的商业化进程的一条有效途径。

启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因编码区的上游。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，它与RNA聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是基因表达调控模式的实质。在启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。因此启动子是基因表达所必需的，从某种意义上讲其序列特征和一些特异转录因子的相互作用决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度等。深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。已发现的组织特异性启动子主要包括：种子特异性启动子、果实特异性启动子、茎特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子等。已经应用于分子育种的一些组织特异性启动子见表1。

表1应用于分子育种的部分组织特异性启动子

【发明内容】

利用非胚乳组织表达启动子，使外源基因在水稻叶、茎等非胚乳组织中正常表达，而在胚乳中不表达，降低其对人类健康带来的潜在风险，是促进转基因水稻的商业化进程的一条有效途径。如在该启动子下游接上BT毒蛋白基因，便可使水稻营养体具有抗螟虫的能力，而在胚乳中又避免毒蛋白的积累，降低了转BT基因水稻的食用风险。本发明的目的是提供一个在水稻非胚乳组织中表达，而在胚乳组织中不表达的启动子及其应用。

本发明的技术方案为：一种水稻非胚乳组织表达启动子OsTSP I及其应用，其特征在于具有SEQ ID NO：1的序列。

根据我们在水稻基因芯片上的研究结果，用RT-PCR技术进行验证，对水稻根、茎、叶、花、颖壳和灌浆期胚乳(花后10～15天)等组织中启动子引导基因表达情况进行分析，初步发现一个水稻非胚乳组织表达启动子，并利用PCR技术对候选启动子进行克隆，经测序其长度为1785bp(启动子和引物序列见图1)，命名为OsTSP I(Oryza sativa Tissue SpecificPromoter I)。对获得的OsTSP I启动子的核心序列和转录起始位点进行预测分析，结果表明：在OsTSP I启动子45bp～95bp、849bp～899bp、920bp～970bp和1423bp～1473bp的位置存在核心序列，其可能性分别为0.80、0.86、0.97和0.99；可能的转录起始位点(即帽结构)在ATG前面的第85位的A。利用该启动子与植物表达载体pCAMBIO1305.1构建成一个由OsTSP I启动子引导的GUS基因表达载体pOsTSP I-GUS，经农杆菌介导转化水稻品种日本晴(Nipponbare)证明：该启动子引导的GUS基因可以在转基因水稻的根、叶、茎等非胚乳组织中正常表达，而在胚乳中不表达。

本发明还提供了一种可与SEQ ID NO：1杂交的严格条件，该等严格条件可以是低严格条件或高严格条件。低严格条件包括：于42℃在2X SSC，0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。高严格条件包括：于65℃在2X SSC，0.5％(w/v)SDS溶液中洗涤30分钟并且接着重复所述洗涤。

本发明还提供了一种水稻非胚乳组织表达载体，其特征在于转入了前述的水稻非胚乳组织表达启动子。具体的水稻非胚乳组织表达载体例子是，用前述的水稻非胚乳组织表达启动子置换植物表达载体pCAMBIO1305.1上的CaMV35S启动子，构建成在该启动子下游含有GUS基因的水稻非胚乳组织特异表达载体，命名为pOsTSP I-GUS。

以下详细介绍我们的发明内容，本发明的技术路线见图2。

一、OsTSP I启动子的分离及序列分析

根据我们在水稻基因芯片上的研究结果，用RT-PCR技术进行验证，对水稻根、茎、叶、花、颖壳和灌浆期胚乳(花后10～15天)等组织中启动子表达情况进行分析(图3)，初步发现一个水稻非胚乳组织表达启动子，利用PCR技术对OsTSP I启动子进行扩增(图4)，产物克隆到pGEM-T(购自promega)，经测序其长度为1785bp，命名为OsTSP I，阳性克隆命名为pGEM-OsTSP I。用在线软件Neural Network Promoter Prediction对获得的水稻OsTSP I启动子的核心序列和转录起始位点进行预测分析，结果发现在OsTSP I启动子45bp～95bp、849bp～899bp、920bp～970bp和1423bp～1473bp的位置存在核心序列，其可能性分别为0.80、0.86、0.97和0.99。根据真核细胞基因启动子的基本特征，推测出OsTSP I启动子转录起始位点(即帽结构)在ATG前面的第85位的A。再采用启动子预测软件PLACE对该序列进行分析，结果表明水稻OsTSP I启动子区域含有丰富的顺式作用元件序列。表2列出了OsTSP I启动子中主要调控元件。

表2OsTSP I启动子序列结构分析

二、水稻非胚乳组织表达载体pOsTSP I-GUS的构建

对pCAMBIO1305.1载体进行改造，利用HindIII和NcoI两个限制性内切酶将pCAMBIO1305.1上引导GUS的CaMV35S启动子切除、补平末端之后用连接酶连接形成中间载体pCAMBIO1305.1(-)。然后利用EcoRI和BamHI对pGEM-OsTSP I进行双酶切，将回收目的片段OsTSP I与同样经过EcoRI和BamHI双酶切pCAMBIO1305.1(-)载体进行重组，得到表达载体pOsTSP I-GUS，载体的T-DNA区结构见图5。

三、根癌农杆菌介导的水稻转化

取水稻品种日本晴开花后12d左右的未成熟胚诱导初生愈伤组织，再经过两次继代之后作为转化的受体材料。将上述构建好的重组载体pOsTSP I-GUS经过冻融法导入农杆菌AGL1中，与受体材料共培养，筛选转化子。同时，用载体pCAMBIO1305.1(35S-GUS)一同转化水稻，作为阳性对照，没有转基因的日本晴作为阴性对照。

四、转基因植株的PCR鉴定

提取再生植株叶片DNA作为GUS基因检测的模板，进行PCR鉴定(图6)。

五、OsTSP I启动子的功能鉴定

经PCR鉴定的阳性转基因植株移栽于大田，取15株样品在不同生育时期和不同组织器官进行GUS活性的组织化学染色分析，用于鉴定OsTSP I启动报导基因表达的组织特异性(表3、图7)。

表3转基因水稻GUS组织染色结果汇总表

注：1.各组织或器官取样数为15株；

2.GUS活性中(+)表示组织能染成蓝色；(-)表示组织不能染成蓝色。

【附图说明】

图1中，OsTSP I启动子及其PCR扩增引物序列，图1A为具有PCR引物的OsTSP I启动子，1811个碱基对，EcoRI位点：8-13，BamHI位点：1799-1804；图1B为OsTSP I启动子PCR上游引物OsTSP I-F(含EcoRI酶切位点)；图1C为OsTSP I启动子PCR下游引物OsTSP I-R(含BamHI酶切位点)。

图2中，归纳了OsTSP I启动子克隆和功能验证技术路线图

图3中，水稻不同组织RT-PCR扩增产物电泳图谱，(a)水稻不同组织总RNA提取结果，由图可见提取的总RNA满足试验要求，有清晰的28S和18S条带存在；(b)水稻不同组织RNA经DNase I处理后的β-actin内标基因PCR扩增结果，供试的6个组织中均未见β-actin(158bp)基因扩增条带出现，说明RNA样品中的DNA已经完全去除；(c)水稻不同组织β-actin内标基因RT-PCR扩增结果，表明内标基因在所有组织中均有存在；(d)候选启动子引导的基因(gi55770435)在水稻不同组织中RT-PCR扩增产物(143bp)，结果显示该启动子引导的基因在灌浆期胚乳中不表达，而在其它组织中表达。泳道标注：M：100bp DNAMarker；1：根；2：茎；3：叶；4：花；5：颖壳；6：灌浆期胚乳(15～20天)；7：DNA对照。

图4中，OsTSP I启动子PCR扩增产物电泳图谱，以提取的日本晴水稻DNA为模板，用图1B、图1C给出的引物扩增出的候选启动子。泳道标注：M：DL2000 DNA marker；1：PCR扩增产物约1800bp。

图5中，非胚乳组织组织特异性表达载体pOsTSP I-GUS的T-DNA区结构图，利用HindIII和NcoI两个限制性内切酶将pCAMBIO1305.1上引导GUS的CaMV35S启动子切除、补平末端之后用连接酶连接形成中间载体pCAMBIO1305.1(-)。然后利用EcoRI和BamHI对pGEM-OsTSP I进行双酶切，将回收目的片段OsTSP I与同样经过EcoRI和BamHI双酶切pCAMBIO1305.1(-)载体进行重组，得到表达载体pOsTSP I-GUS，图示为pOsTSP I-GUS上T-DNA区的结构。P_35S：CaMV35S启动子；T_35S：CaMV终止子；Hyg：潮霉素抗性基因；T_NOS：NOS终止子。

图6中，转基因水稻植株PCR鉴定，转基因水稻植株PCR检测结果。A：转35S-GUS基因水稻植株能扩增出35S片段，非转基因植株则不能扩增出相应片段；B：转35S-GUS基因水稻植株能同时扩增出GUS片段，非转基因植株则不能扩增出相应片段；C：转OsTSP I-GUS基因植株能扩增出GUS片段，非转基因植株则不能扩增出该片段。泳道标注：M1：50bp DNAMarker；M2：DL2000 DNA marker；P1：pCAMBIO1305.1(35S-GUS)；P2：pOsTSP I-GUS；CK(-)：非转基因对照；1-20：为不同转基因单株。

图7中，转基因水稻植株GUS组织化学染色，转基因阳性水稻植株T₀代叶片及产生的子代种子胚乳部分的GUS组织化学染色结果。转35S-GUS基因叶片和胚乳有蓝色反应；转OsTSP I-GUS基因叶片有蓝色反应，而胚乳则没有蓝色反应，说明OsTSP I引导的GUS基因表达有组织特异性，即在胚乳中不表达。A：35S-GUS转基因水稻T₀代植株叶片和产生的种子胚乳GUS组织化学染色结果；B：OsTSP I-GUS转基因水稻T₀代植株叶片和产生的种子胚乳GUS组织化学染色结果；C：阴性对照，即非转基因对照。I：叶片；II：成熟种子胚乳；

【具体实施方法】

以下结合实例应用(用OsTSP I启动子引导的GUS基因转化水稻)对本发明进行详细说明。

1.组织特异性表达启动子的筛选

1.1引物设计：采用引物设计软件Primer premier 5.0设计的试验引物及扩增条件如表4，引物由上海生物工程公司合成。

表4引物序列和扩增条件

1.2水稻各组织总RNA的提取

取正常生长的水稻根、茎、叶、花、颖壳、灌浆期胚乳，采用UNIQ-10柱式总RNA抽提纯化试剂盒提取总RNA；

1)样品在液氮中研磨，在液氮未挥发完前将粉末转移到1.5mL离心管中，保证样品未融解；

2)加450μL RLT Solution到样品中(最多100mg)，剧烈振荡混匀。56℃下放置1-3min，有利于样品的裂解，但淀粉含量高的样品不能在高温下裂解，否则会出现团状物；

3)加0.5倍体积的无水乙醇，用枪头混匀；

4)将700μL的样品及其可能出现的沉淀一起加到套放于2mL收集管的UNIQ-10柱中，8000×g离心1min；

5)倒去收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，加500μL RW Solution到柱中，室温下放置1min，10000×g离心30s；

6)倒掉收集管中的废液，将柱放回收集管。加500μL RPE Solution到柱中，10000×g离心30s；

7)重复步骤6一次；

8)倒掉收集管中的废液，将柱放回收集管，10000×g离心15s，以除去残留的RPESolution；

9)将柱放到一个无菌RNase-free的1.5mL的离心管中，吸取30-50μL DEPE-H₂O加到柱膜中央，50℃下放置2min(此温度下有利于RNA的洗脱)，8000×g离心1min。洗脱得到的RNA可立即使用，也可-20℃或-70℃保存备用；

10)对所提RNA进行电泳检测，以确定RNA的质量。

1.3DNase I消化去除DNA污染

反应体系：

置于冰上反应10～30分钟。

1.4cDNA第一链的合成

在无RNA酶的0.5mL EP管中加入提取的总RNA 5μL，10mmol/L dNTPs 1μL，0.5μg/μLOligo(dT)161μL，DEPE-H₂O补足10μL，65℃5min，冰浴1min。加入2μL 10×buffer，4μL25mmol/L MgCL₂，2μL 0.1mol/L DTT和4μL无RNA酶的重组RNA酶抑制物，混匀离心后42℃水浴2min，加入A-MLV(200Unit/μL)1μL，混匀后42℃水浴50min，70℃水浴15min，-20℃保存备用。

1.5反转录产物的PCR扩增

以水稻肌动蛋白基因β-actin为内参，对得到的cDNA进行PCR扩增。

在0.2mL EP管中依次加入：

混匀后盖紧管盖，放入PCR仪中进行扩增，扩增程序见表4。

取10μL PCR产物，2μL上样缓冲液混匀，在2.0％的琼脂糖凝胶上以5v/cm电压进行电泳。40min后，在凝胶成像系统上观察电泳结果，与标准分子量进行比较判断扩增片段的大小，然后分析水稻各组织中启动子的表达情况。

2.OsTSP I启动子的克隆和测序

2.1水稻基因组的提取与检测

(1)水稻基因组DNA提取

采用SDS法，稍有修改，具体步骤如下：

①称取100mg左右叶片放入2.0mL的离心管中，加入液氮用玻璃棒研磨成粉末

②加入700μL SDS提取缓冲液，60℃水浴1hr；

③加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，室温静置30min；

④4℃12000×g离心10min；

⑤将上清转移到1.5mL干净的离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀后静置30min；

⑥4℃12000×g离心10min，弃上清；

⑦加70％乙醇，4℃10000×g离心5min，洗涤沉淀；

⑧重复步骤⑦；

⑨加TE溶解沉淀；

⑩加2μL RNase，37℃水浴30min后，-20℃保存备用。

(2)水稻基因组DNA提取质量和浓度的检测

取2μL DNA溶液，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测，判断提取的质量。经核酸蛋白定量仪测定，提取的DNA的OD260/OD280约为1.8，DNA浓度为300ng/μL。

2.2 OsTSP I启动子基因的PCR扩增、检测与回收

(1)PCR扩增与检测

在0.2mL薄壁管中依次加入，反应体系为：

扩增程序见表4。电泳检测扩增产物，与标准分子量进行比较估测扩增片段的大小，若与预计大小相符，则可进行切胶回收。

(2)PCR扩增产物回收

从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，采用上海生工UNIQ-10柱式DNA回收方法：

①用手术刀切下含有所要回收DNA琼脂块，放在1.5mL离心管中；

②每100mg琼脂凝胶中或100μL的DNA溶液中加入400μL Binding Buffer，置于50～60℃水浴中10min，间歇振荡，直到胶彻底溶解；

③将融化的胶溶液转移到2mL收集管的UNIQ-10柱中，-20℃放置2min，8000×g室温离心1min；

④取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中废液加入500μL Wash Solution，8000×g室温离心1min；

⑤重复步骤4一次；

⑥取下UNIQ-10柱，将UNIQ-10柱放回回收收集管中，12000×g离心15s；

⑦将UNIQ-10柱放入新的洁净的1.5mL离心管中，在柱膜中央加30μL Elution Buffer或双蒸水(pH＞7.0)，室温放置2min后，12000×g离心1min，-20℃冰箱贮存。

2.3OsTSP I启动子基因TA克隆载体的构建及序列测定和分析

(1)回收的OsTSP I启动子基因PCR产物与T载体的连接反应反应体系(10μL)：

4000rpm离心5s，室温放置5min后，冰上放置5min，-20℃冰箱贮存。

(2)大肠杆菌感受态细胞的制备

①挑取单菌落于100mL LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养过夜；

②按1∶10接种量接种于100mL LB液体培养液上，37℃，200rpm培养2-3hr至OD600为0.3～0.4；

③菌液置冰浴20min，4℃下4000×g离心5min，弃上清；

④菌体重悬于30mL冰预冷的0.1M CaCl₂中，冰浴30min；

⑤4℃下4000×g离心5min收集菌体；

⑥重悬于3mL 0.1mol/L CaCl₂中，冰浴4-10h，分装成200μL，-70℃保存备用或4℃一周内用完。

(3)转化与筛选

①取100μL感受态细胞悬液加10μL连接反应产物，混匀，冰上放置30min；

②42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3～5分钟；

③向管中加入1ml LB液体培养基(不含Kan)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Kan^r)；

④将上述菌液10000×g离心1min后，弃去上清，留100μL涂布于含Kan(50μg/mL)的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24小时；

(4)重组质粒的鉴定

①菌落PCR检测

取0.2mL PCR薄壁管，按照2.2中PCR反应体系配制混合液，用无菌牙签分别挑取单菌落混合到PCR反应液中，对OsTSP I启动子基因进行PCR扩增检测。

②酶切鉴定重组质粒

用EcoRI和BamHI限制性内切酶对筛选出来的阳性克隆DNA进行进一步的酶切鉴定。37℃过夜酶切，4℃保存。0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。将重组质粒载体命名为pGEM-OsTSP I。

反应体系(50μL)：

③序列测定

将筛选得到的阳性克隆进行测序。

(5)序列的同源性搜索和顺式作用元件分析

序列的同源性比对分析由网上BLASTn软件(网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blash)和DNAsisst2.0软件完成。在Plant CARE(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)中分析OsTSP I启动子片段所包含的顺式作用元件。

3.GUS植物表达载体的构建

3.1重组质粒的获得

利用HindIII和NcoI两个限制性内切酶将pCAMBIO1305.1上GUS的CaMV35S启动子切除、补平末端之后用连接酶连接环化得到，然后利用EcoRI和BamHI对pCAMBIO1305.1(-)和pGEM-OsTSP I进行双酶切，目的片段分别回收后经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌JM109。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化参照2.3方法进行。

酶切反应体系I，37℃酶切过夜：

补平反应体系，12℃反应20分钟，75℃灭活：

酶切反应体系II，37℃酶切过夜：

连接反应反应体系，16℃过夜：

3.2重组质粒的鉴定

菌落PCR参照2.2，将菌落PCR得到的阳性克隆转接到LB(Kan 50μg/ml)液体培养基中，37℃过夜振荡培养后，提取质粒进行酶切鉴定和测序确认。正确的重组质粒命名为pOsTSP I-GUS。

3.3重组质粒转化农杆菌

3.3.1制备农杆菌AGL1感受态细胞

(1)挑取农杆菌AGL1单菌落接种于5mL含相应抗生素的YEP培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜；

(2)转移2ml菌液于50ml YEP液体培养基中，28℃、200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.5-1.0

(3)将菌液转入无菌离心管中，冰浴30min；

(3)4℃、4000rpm离心5min，去除上清；

(5)加入1mL预冷的20mmol的CaCl₂重悬菌体；

(6)制备好的感受态细胞可以马上试用，也可以按每管200μl分装于无菌Eppendorf管中，于4℃保存48hr内使用。

3.3.2转化农杆菌AGL1

(1)取出农杆菌AGL1感受态细胞，短暂离心后于冰上静置；

(2)加入1ng重组质粒pOsTSP I-GUS于上述100μl的感受态细胞中；

(3)轻弹管底，混匀，冰浴30min；

(4)迅速置于液氮中速冻5min；37℃水浴中融化5min；

(5)加入900μl LB液体培养基，28℃，200rpm，震荡培养4～5h；

(6)6000rpm离心1min，弃900μl上清，保留100μl；

(7)用此100μl培养液混匀农杆菌后涂布于LB平板(Kan 40μg/ml，Rif 25μg/ml)，28℃培养2天后长出合适大小的单克隆，挑取单克隆，在YEB液体培养基中28℃振荡培养至OD₆₀₀0.4～0.6，即可用于水稻转化共培养。

4.农杆菌介导的表达载体转化水稻

4.1愈伤组织的诱导及继代培养

选择饱满的成熟或未成熟种子，用70％酒精表面消毒1.5min后，用加有一滴Tween-20的20％次氯酸钠于28℃的摇床上深层消毒45min。然后用ddH₂O彻底清洗至澄清。将经彻底消毒后的种子于诱导培养基上，25℃暗培养3周左右。将诱导3周长出的愈伤组织转接到新的诱导培养基上进行第一次继代培养。接下来每3～4周继代培养一次。取两次继代培养之后的胚性愈伤组织(质地松脆、颜色鲜黄的3～5mm的胚性愈伤)用于下一步共培养。

表5水稻遗传转化所用培养基

4.2愈伤组织与根癌农杆菌的共培养

取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织置于无菌培养皿中，加入新鲜的农杆菌菌液(OD₆₀₀0.4～0.6)，中间轻缓晃动数次，1hr后将愈伤组织取出，置于无菌滤纸上，吸除残余的菌液，随即转移到共培养培养基上，于25℃暗培养2～3天。

4.3洗除农杆菌

共培养2～3天后，即农杆菌生长至可见愈伤下有少量菌斑时，挑取共培养的愈伤置于无菌三角瓶中，用含有250mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗10多次，每次摇动数次，直至水中看不到丝状菌体。最后一次清洗时静止1hr，让黏附于愈伤上的农杆菌充分扩散到水中。最后，加入含500mg/L的羧苄青霉素的无菌水于25℃的摇床上120rpm摇2hr，之后倒掉液体，置愈伤于无菌滤纸上吸干多余水分。

4.4抗性愈伤的筛选

将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤，置25℃培养箱内暗培养，其间注意定时检查是否有农杆菌污染。每两周转接1次。培养4～8周，多数愈伤褐化死亡，有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。挑选这些抗性愈伤继续在筛选培养基上继代生长，挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。

4.5抗性愈伤的分化培养

经抗生素筛选长出的抗性愈伤，转入分化培养基中继续培养，26℃暗培养1周，然后转入25℃光照培养(16h光照，8h黑暗)。

4.6转基因植株的再生及幼苗移栽

转移到分化培养基上的愈伤组织，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。再生的小苗长至2～3cm左右时，将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，继续光照培养，待苗高7～10cm时，打开瓶盖于温室中炼苗5～7天，待小苗生长健壮后，移出培养瓶，洗净根上的培养基，移至温室盆栽。注意保湿，以提高移栽成活率。

5.转基因植株的PCR鉴定

提取再生植株叶片DNA作为PCR检测模板，进行PCR鉴定，反应体系参见2.2，引物序列、扩增条件及电泳琼脂糖凝胶浓度等见表6。

表6检测引物序列和扩增条件

6.GUS组织化学染色定位方法：

经PCR鉴定的阳性转基因植株(T₀)移栽于大田，取15株样品，在苗期，取根、茎、叶器官进行GUS活性的组织化学染色分析。在开花后16天取幼嫩胚乳和30天取成熟胚乳进行GUS活性分析，以未转基因的水稻为阴性对照。

GUS活性染色程序：

(1)取上述材料于反应液(见表7)中37℃，温育2～6hr；

(2)对绿色组织可用70％乙醇脱叶绿色素，室温5hr，重复几次，直到绿色完全去除。

(3)观察记录。

表7反应液组成：X-Gluc溶液

反应液配制过程：将N，N-二甲基甲酰胺加入到X-Gluc中，搅拌，直至溶解，再将0.1mol/L磷酸盐缓冲液，5mmol/L铁氰化钾和5mmol/L亚铁氰化钾加入到X-Gluc溶液中，搅拌，最后加入Triton X-100。用前现配。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其应用

<140>2007101900074

<141>2007-10-19

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1785

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1785)

<223>n＝a或g或c或t

<400>1

gtccgtttcc gttcgttaat tggtactact acctacgcgt agcgtgttgc tccctaaaca 60

actcccagat caggcaaagg aagcatcgtc tcgtctgcac gtactctacc aagaaaatga 120

tcagcgccat ggaggccaga acatgcacac atgcggtgcg acccctcaca tggggcaaca 180

gggcatgctg caaactgaag agtcgaagac cacggttccc tccccatgga taaaagatct 240

ggtcttttca gttatcagtg tccggcatat gtatggggat caagtggtgg gggcaaaaaa 300

aaaaaaaaac cagtggcatg atcgggcaca gctcgcgtcg gaacaaggca tcgtgtcaca 360

tggaagaaac ccatcgcttg ttttatggac cgcgcggcgc gcgcgcgcat gcggaccgcg 420

cggtgactcc tgtccctgtg caggttgacg gcgagcacat gcctagctac gtcgtggtag 480

ccccctgcaa cgtcccacgt acgcgcatgc aaattgcagc atcacgattg gtctggaatt 540

gtacatttgt actctctgca ccagggaaaa attttgtcca gattgcaggg gagagatacg 600

gttggtgctg tgcgccgtgc tgcgaatact gcgtccagtc aggcagactc gagctcggtc 660

ggtcacacga acaggcgtgc atgcatgagg cacgcaggcc ggtcaatcgc cttgcacgca 720

cacacacatc ctcgggtcga tctggccatc tgggtcgcgt gctggtttgg gtggaatcga 780

gtttctagtt ttgtcttgcg ttacgatttc ccctgttcgg gtgtgttgta atcttgttgc 840

ggactcgcgg agtcgcggta tatactcggt acatgtatat tgcaatttgc gaggggggtt 900

tgggtttcct cgcgcaatca agtgcgtata tacttaagac gcgcgcacac atgggcgcca 960

tgtgtcggtt gagtatcctt gtcagggttt gatccagata catgatgctg tccggccttc 1020

cagcctacaa catgatcctg gaaatgatgt gatgacatga gtacacgatc tgaacctacg 1080

atttccatga ttaaactgag cttcacaacc tcgggccaca agaattttca cgtgaagccg 1140

ttcgaattgc atgcgagtat gcaacttact cctacatcac gaaaaatggt ccataccgca 1200

aagggaaaaa agaaagttcc aagtgccatg gtaaccagct cactcagtga caaaagtggt 1260

gaaagattcc taaacaccgg cacgccacag cgtccagccg gtgcccggtt gtgcgactac 1320

gatgcttgtc ccctcgcaaa atcccatgat gaacgctaac cattaaccaa cttgattaca 1380

tacggcggca tctgtgttat cacgggaacc gcagaggcat acgtaaccga cgaaaaaaac 1440

gcggacgaga tggcgaaact gcccctcgtc gtgcaccgcc tcaccgggcc gaaagccagt 1500

cgcgtgcgcg tgcagagaga cggcgcgccg cacgtactgt acacgagccg gtgcgcgcgg 1560

taggaaacgg aagcggatca gggggccatg tgaccgcacg cagggcgtgt ctcctacgag 1620

gccacgaggg cagagggagc ccatcatccg ctcagccgaa tcgccgatcg gggacacgcg 1680

tacggcggaa gatcccgtgg catttcgtgg tagtaatcga ccaaccctag gcccgtttcg 1740

ccggcagctt ggtctataag ttgctgctct gccctgctcg gcctc 1785

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<223>用于扩增OsTSP I启动子的上游引物(含EcoRI酶切位点和保护碱基)

<400>2

gatcatcgaa ttcgtccgtt tccgttcgtt aat 33

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<223>用于扩增OsTSP I启动子的下游引物(含BamHI酶切位点和保护碱基)

<400>3

agtcagtgga tccgaggccg agcagggcag agc 33

Claims

1.一种能够引导植物非胚乳组织中转录的经分离的启动子，其中所述启动子多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达盒，其包含根据权利要求1所述的启动子和可操作性地与所述启动子链接的多核苷酸序列，其中所述启动子能够引发所述多核苷酸序列在用所述表达盒转化的植物的非胚乳组织中的转录和表达。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其中该多核苷酸序列以正义方向插入该表达盒中。

4.根据权利要求2所述的表达盒，其中该多核苷酸序列以反义方向插入该表达盒中。

5.一种表达载体，其包含根据权利要求2所述的表达盒。