CN105567695B - 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用 - Google Patents

一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105567695B
CN105567695B CN201610131246.1A CN201610131246A CN105567695B CN 105567695 B CN105567695 B CN 105567695B CN 201610131246 A CN201610131246 A CN 201610131246A CN 105567695 B CN105567695 B CN 105567695B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
promoter
safes3
endosperm
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610131246.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105567695A (zh
Inventor
秦瑞英
杨剑波
李莉
魏鹏程
李�浩
李娟�
杨亚春
许蓉芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences filed Critical Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610131246.1A priority Critical patent/CN105567695B/zh
Publication of CN105567695A publication Critical patent/CN105567695A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105567695B publication Critical patent/CN105567695B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8226—Stem-specific, e.g. including tubers, beets
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种水稻非胚乳表达启动子SAFES3及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和作物表达载体。具体而言，本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。本发明提供的启动子可以特异地驱动外源基因在水稻非胚乳组织中表达，并利用非胚乳表达启动子的特性，充分发挥转基因育种的优势，培育出更多更好的新品种。经实验验证，本发明的启动子能够驱动外源基因在水稻的非食用部位(非胚乳)表达，而不会引起食用部位表达。这种启动子一旦得到广泛应用，非常便于推广，而且会尽可能地保证稻米的质量不受转基因的影响，更有利于消除民众对转基因产品的疑虑。

Description

一种水稻非胚乳表达启动子SAFES3及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻非胚乳表达启动子及其应用，该启动子能够驱动目标基因在水稻胚乳以外组织中特异表达，从而可在不影响胚乳食用安全情况下，达到通过改变非胚乳结构特性改良水稻性状的目的。
背景技术
水稻是最重要的农作物之一，全世界有三分之一以上的人口以稻米为主粮。在我国，水稻的生产面积约占农作物种植面积的40％，水稻生产在国民经济中占有非常重要的地位。由于自然环境的不断变化和经济发展的需要，常规育种技术很难解决的一些生产实际问题，如虫害、病害和逆境胁迫等，需要寻求现代生物技术解决。转基因技术因可在基因水平上改造植物的遗传物质，定向改变植物的遗传性状，打破导入外源基因在物种间的生殖隔离，实现了基因资源的优势互补。因此，转基因技术是实现水稻品种改良的一种重要手段。
水稻作为主要的粮食之一，水稻食用部位精米即胚乳。在转基因水稻中尤以外源蛋白在胚乳中的积累及其可能造成的食用安全风险，成为制约商业化进程的重要因素。针对这一问题，利用启动子策略即选用诱导型、组织特异性及时间依赖型启动子，使外源基因只在非食用部分表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，是促进转基因水稻的商业化进程的一条有效途径。目前国内研究中，非胚乳表达启动子的发明鲜有报道，仅见于杨剑波等发明的水稻非胚乳表达启动子OsTSP I即只在水稻非胚乳组织(根、茎、叶等)中表达，在胚乳中不表达。以及Meng Cai等发现的仅在水稻绿色组织部位表达的启动子PD540。
如果转基因水稻不能最终实现商品化应用于生产，那么再好的研究成果也没有任何应用价值。针对以上问题，目前需要大力开展功能基因组的研究，大量挖掘和分离具有实用价值的非胚乳表达启动子，消除公众对转基因水稻的偏见和顾虑，并利用非胚乳表达启动子的特性，充分发挥转基因育种的优势，培育出更多更好的新品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种在水稻非胚乳表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻非胚乳表达启动子SAFES3，其特征在于，所述水稻非胚乳表达启动子SAFES3包含：
(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列；或者
(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(f)与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者
(g)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(h)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(i)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(j)SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(k)与带有SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列；或者
(l)与带有SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应核苷酸序列。
优选地，所述水稻非胚乳表达启动子由序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列或SEQ ID NO:2中所示的DNA序列构成。序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为SAFES3或启动子SAFES3。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因组中一段2069bp的具有转录调控的DNA序列具有驱动目标基因在水稻非胚乳组织表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。
需要说明的是：SEQ ID No:1的启动子的DNA序列中，序列开头的序列“TCACAATCCCAGTTAGCCCTCA”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾的序列“GCTAAGCCTACGTACGGTGGTC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列，去除头尾部分则为SEQ ID No:2所示序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻非胚乳表达启动子的表达盒。
又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻非胚乳表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻非胚乳表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES3，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即SAFES3或启动子SAFES3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-SAFES3。
或者待表达基因可以为任何对水稻的非胚乳组织性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在非胚乳组织中特异性地集中表达，从而实现改善水稻非胚乳组织相应性状的功能，而不会对胚乳带来任何改变或不利影响。
再一方面，本发明提供上述水稻非胚乳表达启动子在培育转基因水稻中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻非胚乳表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的2069bp的DNA序列，并将其命名为SAFES3(序列表中的SEQ ID No:1或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在水稻非胚乳组织中特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在根、茎、叶鞘、叶、胚等非胚乳组织中有蓝色出现，在胚乳中没有着色，从而证明该2069bp的序列具有驱动基因特异的在非胚乳组织中表达的活性。
本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在非胚乳组织中特异的驱动靶标基因的表达。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子SAFES3能够调控基因在植株中非胚乳部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。如通过该启动子调控目标基因在绿色组织和根中表达活性，而在胚乳中不表达，改善水稻的生长性能，同时降低了水稻的食用安全风险，有助转基因水稻的商业推广。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将SAFES3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFES3示意图，其中示出了利用SAFES3启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为利用SAFES3启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，其中示出了SAFES3：：gus转基因水稻植株，其中a表示根，b表示茎，c表示叶鞘，d表示叶，e表示种子纵切图；从图中可以看出，除e以外各组织均有蓝色出现，e仅在胚部位出现蓝色。图中标尺＝1cm。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的SAFES3启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻SAFES3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：
正向引物：GTCGACTCACAATCCCAGTTAGCCCTCA SalI
反向引物：GAATTCGACCACCGTACGTAGGCTTAGC EcoRI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子SAFES3的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子SAFES3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2069bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
作物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子SAFES3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子SAFES3片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的SAFES3片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子SAFES3与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-SAFES3(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子SAFES3驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
共获得45株SAFES3-pCAMBIA1391植株(SAFES3：：gus转基因水稻植株)。
步骤2、GUS组织化学染色
参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色，结果见图3，蓝色在根、茎、叶鞘、叶及胚等非胚乳组织中出现。
实施例2
为了验证本发明的SEQ ID No：2中的序列也具有同样功能，本发明采用实施例1中的类似方案，只是改变引物序列，进行了与实施例1相同的实验。
经实验验证，虽然转化低于实施例1，但是，仍然可以诱导Gus基因在非胚乳部位特异性表达。证实SEQ ID No：2中所示序列具有与SEQ ID No：1类似的启动子功能。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种水稻非胚乳表达启动子SAFES3，其特征在于，所述水稻非胚乳表达启动子SAFES3由：
(a)SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列；或者
(b)SEQ ID NO.2中所示的核苷酸序列构成，
SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列为：
SEQ ID NO.2中所示的核苷酸序列为：
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES3。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻非胚乳表达启动子SAFES3连接于载体中待表达的基因序列的上游。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES3，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善非胚乳组织性状功能的基因。
5.一种根据权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES3在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
利用序列表SEQ ID No.3和4中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES3；
回收目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES3；
从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子SAFES3片段；
并利用SEQ ID No.3和4中所示引物对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的SAFES3片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到启动子SAFES3与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；
利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目标基因为具有改善水稻植株中非胚乳部位性能的基因。
CN201610131246.1A 2016-03-08 2016-03-08 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用 Active CN105567695B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610131246.1A CN105567695B (zh) 2016-03-08 2016-03-08 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610131246.1A CN105567695B (zh) 2016-03-08 2016-03-08 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105567695A CN105567695A (zh) 2016-05-11
CN105567695B true CN105567695B (zh) 2019-08-13

Family

ID=55878323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610131246.1A Active CN105567695B (zh) 2016-03-08 2016-03-08 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567695B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148346B (zh) * 2016-07-15 2019-10-08 安徽省农业科学院水稻研究所 一种分离出的胚乳不表达启动子safes6及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230348A (zh) * 2007-11-19 2008-07-30 安徽省农业科学院水稻研究所 水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其应用
CN103074342A (zh) * 2013-01-24 2013-05-01 山东农业大学 一种水稻病原菌诱导启动子
CN104342441A (zh) * 2014-11-04 2015-02-11 安徽省农业科学院水稻研究所 一种植物非胚乳表达启动子safe s1及其获取方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101230348A (zh) * 2007-11-19 2008-07-30 安徽省农业科学院水稻研究所 水稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其应用
CN103074342A (zh) * 2013-01-24 2013-05-01 山东农业大学 一种水稻病原菌诱导启动子
CN104342441A (zh) * 2014-11-04 2015-02-11 安徽省农业科学院水稻研究所 一种植物非胚乳表达启动子safe s1及其获取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105567695A (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946649B (zh) 一种水稻花药特异表达启动子OsAnth1
CN105695466B (zh) 一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3及其应用
CN103740717B (zh) 一种水稻胚特异性表达启动子及其应用
CN105838718B (zh) 一种水稻茎叶强表达启动子safes7及其应用
CN105602955B (zh) 一种水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2及其应用
CN105063047B (zh) 植物种子特异表达启动子OsSee1
CN105567695B (zh) 一种水稻非胚乳表达启动子safes3及其应用
CN105567694B (zh) 一种强表达活性的水稻非种子表达启动子safes4及其应用
CN104087588B (zh) 响应环境水分胁迫的水稻干旱诱导型启动子POsDro4
CN104046629B (zh) 一种植物盐诱导表达启动子POsSalt1及其应用
CN103740720B (zh) 一种水稻根特异强启动子POsRo2的鉴定和应用
CN105861506B (zh) 一种水稻胚乳不表达启动子safes2及其分离方法与应用
CN103540592A (zh) 一种水稻胚乳特异性表达启动子及其应用
CN103740719B (zh) 水稻维管束特异表达启动子POsvas 1的分离和应用
CN105087589B (zh) 一种启动子元件OsEmb2及利用其培育转基因水稻的方法和应用
CN105602956B (zh) 一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4及其应用
CN103773766B (zh) 一种水稻根特异性表达启动子POsRo1及其应用
CN103882021B (zh) 一种植物干旱诱导表达启动子PosDro1及其应用
CN103710344B (zh) 一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用
CN105779451B (zh) 一种作物种子不表达启动子safes5及其应用
CN104845974B (zh) 能够响应长期冷胁迫的DNA片段POscold5
CN105695464B (zh) 一种水稻花粉特异表达启动子OsPoll2及其应用
CN104073492B (zh) 一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用
CN104946652B (zh) 植物雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物
CN104845973B (zh) 水稻低温强诱导启动子POscold6的克隆及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant