CN105087589B - 一种启动子元件OsEmb2及利用其培育转基因水稻的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种启动子元件OsEmb2及利用其培育转基因水稻的方法和应用。本发明的启动子元件OsEmb2特别适合驱动外源基因在水稻胚中特异性表达，而在水稻的其它组织中不表达。所述启动子的表达特异性和专一性很高。本发明还提供了具有所述启动子的构建物、表达盒和载体等。此外，本发明提供了利用该启动子元件获得相应宿主菌细胞的方法。含本发明启动子的转基因水稻可以特异性地改善水稻的农艺性状，有效避免外源基因导入对水稻其它组织的影响，还能在胚中特异性表达外源基因，从而获得各种相关产物。

Description

一种启动子元件OsEmb2及利用其培育转基因水稻的方法和 应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻胚特异表达启动子OsEmb22及利用其培育转基因水稻的方法和应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的表达。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有一半人口以大米为主食，我国稻谷年消耗量和产量占世界总量的三分之一。我国是人口大国，提高粮食产量一直是重大的社会问题。可耕地面积的减少和人口的增加，加剧了对水稻产量和品质的要求，高产、优质日益成为水稻研究的重点问题。水稻的基因组相对较小，是禾本科作物功能基因组研究的模式植物。

胚是被子植物有性生殖过程中形成的，在植物发育中具有重要的生物学意义。胚的发育始于合子，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成熟。融合形成的二倍体合子，既保持了物种遗传的相对稳定性，以为后代中可能出现新的遗传性状、新变异提供了基础，为研究植物遗传和育种学提供了重要的理论依据。

基因通过表达来体现其功能，维持生物体的有序生长发育和各项活动。基因的表达调控一直是分子生物学研究的热点和中心课题之一，分为转录水平的调控，转录后水平的调控(mRNA的加工、成熟等)，翻译水平的调控等不同层面。启动子是精确启动基因表达的“开关”，在转录水平的调控过程中扮演着重要的角色，是基因在转录水平的调控过程中，影响基因表达水平的最直接和最有力的顺式调控原件。借助基因工程的方法，利用组织特异性的启动子，对特定基因进行的表达研究进行调控，或者对作物进行针对性的育种改造，都具有十分重要的应用价值。因此，研究组织特异性启动子的功能序列，对于基因的表达调控机制的研究具有重要的意义。但是，有些基因，例如非结构基因会发生基因的转移，从而很难找到在特定的组织中特异性表达的相应启动子，再例如，有一些miRNA在组织中特异性存在，但与结构基因相比，由于miRNA太短、匹配区域太多，真正据此找到的具备组织特异性的miRNA启动子寥寥无几。

因而，分离、获得种子胚特异性表达的启动子，既有助于更细致地理解植物胚胎发育中形态发生与细胞分化的分子机理，又能广泛应用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的组织中高效表达，以实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控，在改良作物品质的同时又可减少对植物的不利影响。胚特异性高强度表达启动子，可以定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常的生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。同时，利用胚特异启动子可提高外源基因在植物胚中的表达和累积水平，也可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。因此，胚特异启动子及其应用为揭示整个植物胚胎发育的过程和机理的研究，利用生物技术改良种子品质，分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

但是，目前人们所发现并验证的胚特异性启动子的数目还很有限，并且也缺乏分离鉴定本底信号低、特异性高的优质启动子。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、特异性高的新型启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种启动子元件，其特征在于，所述启动子元件选自下组：

(a)核苷酸序列包含SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO:1所示序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1～60个，较佳地1～30，更佳地1～6个核苷酸，且具有水稻胚中特异启动功能的启动子活性的多核苷酸。

本领域技术人员可以预期b)和c)中的启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物胚中表达。

另一方面，本发明提供一种构建物，其特征在于，所述构建物含有目标基因以及与目标基因可操作连接的所述启动子元件。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：所述启动子元件、基因ORF序列和终止子。

另一方面，本发明提供一种载体，其特征在于，所述载体含有所述的启动子元件、或所述的表达盒。优选地，该载体为重组表达载体，在所述重组表达载体中，所述启动子元件OsEmb2连接于目标基因的上游。在一种实现方式中，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即OsEmb2或启动子OsEmb2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsEmb2。

另一方面，本发明提供一种获得宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括，将所述的载体转入目的细胞、或者在目的细胞的染色体上整合带有目标基因的所述的启动子元件、或者在目的细胞的染色体上整合所述的表达盒。

另一方面，本发明提供所述的启动子元件、所述的构建物、权利要求3所述的表达盒的用途，用于特异性调控目标基因在水稻胚中的表达，所述用途将所述的启动子元件与所述目标基因相连接，将连接产物转入水稻细胞，并且利用转入连接产物的水稻细胞培育转基因水稻。

另一方面，本发明提供一种在水稻胚中特异性表达目标基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有目标基因以及与该目标基因可操作连接的所述的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；

(c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述目标基因在水稻胚中特异性表达。

一种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有所述载体、或其染色体整合有所述启动子、或其染色体整合有所述表达盒；

(b)将(a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。

另一方面，本发明提供一种获得水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎的方法，其特征在于，所述水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎包括下述水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有所述的载体、或其染色体整合有所述的启动子元件、或其染色体整合有所述的表达盒。

本发明的启动子元件OsEmb2可以用作水稻胚特异表达启动子。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)，本文中称为OsEmb2或启动子OsEmb2。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的2024bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻胚中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

再一方面，本发明提供上述水稻胚特异表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻胚特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：

TCTCAAATCGTTTTTATGATGATTTAATAATTTCAAACATAAATACAGTAAAGTGCTCAGTTTCTAATCTGAAATATAATATAATGATTCTAATCTTTAAATTAATAAATACCAAGTTGATATTGATAAATTAAAATATATAGCATGTGCAGCACTGCTTGATGCCTAGTCTAGAATCTTTAATCGCGGTAAGCTGGGTTAACTACGGTGCGGGCCACGTACCCAAATTTCTTTCACAGTTGGATTGACTAGTGTAGTCAAACGAGGGCATGTGACGAAGGCTAGCTATTTTAAATTTTCCGATTGTCCCTACATAAATCAGGCTATAATAGCCCCCAGACTACACGCAGGGACTACAAAATCGGTGGTACCCCCATCCTCCTCCCCCTTCTTTCTCCCCTCCTCTCCCTTCTCTTATTTCTCAATCCGGTTTTTCTTGAAGTGGCAGCGGCGTGGAGTTCTCAACGGCGCGCGGCGGTGCTGCGGTGCGACGGCTCGACGCAGCGGTGAGGAGGCGAGGAGGAGGTGAACGGCGGCGCCGCGGCCTCCATCCCCGACCGCCGGGGGCCACCTCCATCCCCCAACTGACGGGCGCCACCTCCGACCGCCTGGCGCTAGATCCGTCCTCCACAAGGTCAGGGGACGCGGATCCGGCCACCGGGCGTCGTCTCCTCCGTCCGCCGGCTGCGTCCCCAACTGACGAGTGCAGAACTGCAGATTCCCCCGTCGGCTGCTTCCGGGTGCAGAAGGCGAAGAGGGCGGCGTCGAGGAGCAGTAATAGGGACGAGGTCATCCGCAAGGAGGAGGAGCAAGGTCGCCTCCAGGCCGAGCTCAAGAAGGTCTAGTGCGCCAAGGAGTTCAAGCCCACCGTGGTATGAAGAAGCCCTGCCCGGCAAAACCCACAACCATTTATTCCCTTCGTTTTTGTTGCTCGTCAGGTGATTGATGAATTGCTTGCTTGCCATGGCTGTTTTATGTGTGATGAAATGTTCGTGAAGACTTTTCTGTGTGATGAAATGTTGTGTGTGATGAATGCGATGGCAACTACCCAGAAGCACTTTTTTTTTGTTTTTTTTTATCGAAATCTACATCAGTGACGGGTGTTGAGCTGTGGTTGTGGCTCTTTTTTCCTTTTTTTTTTGGGTGATTTTTCTCATCTGTGACGGGTCACATGACACAACCCGTCAAAGGTGTTTGTCACCTCTGACGGACCTACACCCGTCAAAGGTGAGTTAAGTCATCAGTGACCATTGATCTGTGACGAGGGAGTCTATCCGTCACAGAAGAGGGTTTGAGCCCGTCACTGCTAGCTTGTTCTGCTGTAGTGTGTGCGTTATGTCCTTTCTGAGGAACCGATTTAGTTTATGACTCATCAATTCCACTTTACATATCAAAAGGTTTATTATGGGGGCAATGCTTTTGTGAAATTGAATTTGTATTTTGTGTCACGTTGTGGACATACATATCTTCAATTTATAAATAATATTACAAATAGGTGGAACTGAAGTAACTTCGTTTGTAAGGATCAAAATCTGATAGTGGCATGAGCTTGGAGTTTCAAAAACTTTTTGGTCAAATCCGTTTTTATAAGGCTGGTGTATTGCTACAGAAGTAAGGAAGAATGTCATCTCGTGTTCCAAAGCCCAAAATGACAAACTAAAGCTTGGAGTTGATCCATACTTAAGTGTCAGAAAATCTTTTGAGTGTACAACAGATATGTGTATTCTGAAGTTAAACACTACCTACCTAACGTTACAAAACGTCATTTCACAAAACAATGTATCTAGATAAAAAAATATGACATGTAAAGTGAGTAATGACTCATATTTATAATCAAAAACTGATAACAATAAGATGAGATAGTTACTAAAGTACCTTTGACGATGGCATGTCCAAGTATGTGTACCTCCACCTAGCACAACATCCCAAATGATCATATTAAAAGGCATATGAATACAAGCAACCCCAAGATGCACACAA

需要说明的是：上述启动子元件的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“ATGCGTTGTACTTGATCTAGAG”为获得启动子元件过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“GAAACAACACAAATTGCACAAA”为获得启动子元件过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)OsEmb2基因上游包括转录起始位点在内的2024bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsEmb2。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达检测发现，转基因植株的胚部位有Gus基因表达，从而证明该2024bp的序列具有驱动基因在胚部位特异性表达的活性。

本发明所述的水稻胚特异表达启动子OsEmb2可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的胚部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsEmb2能够调控基因在水稻胚中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsEmb2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsEmb2示意图，其中示出了利用OsEmb2启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为成熟植株(90天)的组织染色图。依次为根(a)、茎(b)、叶(c)、鞘(d)及成熟种子的纵截面(e)和横截面(f)。代表报告基因Gus活性的蓝色仅在成熟种子胚细胞中出现，而在根、茎、叶等营养组织中均没有出现，这表明Gus仅在胚细胞细胞内有表达，而在包括胚乳的其他组织细胞中没有明显表达。因此OsEmb2启动子是一种胚细胞特异型表达启动子(标尺＝2.5mm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的OsEmb2启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsEmb2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACATGCGTTGTACTTGATCTAGAG SalI

反向引物：GAATTCTTTGTGCAATTTGTGTTGTTTC EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsEmb2的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsEmb2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2024bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsEmb2，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsEmb2的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI酶切，回收启动子OsEmb2片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsEmb2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsEmb2与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsEmb2，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsEmb2驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsEmb2::Gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,etal.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

将转化OsEmb2启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、鞘和成熟种子分别进行Gus染色：将各组织分别浸于Gus染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录Gus染色的结果。结果如图3所示，代表报告基因Gus活性的蓝色仅在成熟种子胚细胞中出现(由于专利文本中不支持彩色，但是即便如此通过图像中的灰度依然可以分辨出染色部分)，而在根、茎、叶等营养组织中均没有出现，这表明Gus仅在胚细胞细胞内有表达，而在包括胚乳的其他组织细胞中没有明显表达。因此OsEmb2启动子是一种胚细胞特异型表达启动子，能够驱动目标基因在植物的胚部位特异性强表达。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种启动子元件，其特征在于，所述启动子元件由下述序列构成：

序列表中SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸。

2.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有目标基因以及与目标基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：权利要求1所述的启动子元件、基因ORF序列和终止子。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的启动子元件、或权利要求3所述的表达盒。

5.一种获得宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括，将权利要求4所述的载体转入目的细胞、或者在目的细胞的染色体上整合带有目标基因的权利要求1所述的启动子元件、或者在目的细胞的染色体上整合权利要求3所述的表达盒。

6.权利要求1所述的启动子元件、权利要求2所述的构建物、权利要求3所述的表达盒的用途，用于特异性调控目标基因在水稻胚中的表达，在所述用途中，将权利要求1中所述的启动子元件与所述目标基因相连接，将连接产物转入水稻细胞，并且利用转入连接产物的水稻细胞培育转基因水稻。

7.一种在水稻胚中特异性表达目标基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一构建物，所述构建物含有目标基因以及与该目标基因可操作连接的权利要求1所述的启动子元件；

(b)将步骤(a)得到的构建物导入水稻细胞，获得转化的水稻细胞；

(c)将步骤(b)中转化的水稻细胞再生成水稻植株，从而使所述目标基因在水稻胚中特异性表达。

8.一种制备转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)提供下述水稻细胞，所述水稻细胞含有权利要求4所述载体、或其染色体整合有权利要求1所述启动子、或其染色体整合有权利要求3所述表达盒；

(b)将(a)的水稻细胞再生为水稻植株，从而获得转基因水稻。

9.一种获得水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎的方法，其特征在于，所述水稻愈伤组织或水稻体细胞胚胎包括下述水稻细胞或由下述水稻细胞构成：所述水稻细胞含有权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的启动子元件、或其染色体整合有权利要求3所述的表达盒。