CN105602956B - 一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、作物表达载体以及利用其驱动目标基因表达的方法。具体而言，本发明的发明人发现并提取了日本晴水稻中一段1864bp的DNA序列，发明人发现该序列具有驱动基因在花粉中强表达的能力，并且对上述能力进行了鉴定，将其命名为OsPoll4。本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。由于本发明提供的启动子可以特异地驱动外源基因在花粉中强表达，其具有分析花粉发育过程中重要基因的功能，对水稻花粉发育及相关的基础生物学研究具有重要的理论意义，而且对杂交稻及水稻转基因育种具有重要的实际意义。

Description

一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻花粉强表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在花粉中强表达，分析和研究目标基因的功能。

背景技术

水稻是最重要的农作物之一，全世界有三分之一以上的人口以稻米为主粮。在我国，水稻的生产面积约占农作物种植面积的40％，水稻生产在国民经济中占有非常重要的地位。由于自然环境的不断变化和经济发展的需要，常规育种技术很难解决的一些生产实际问题，如虫害、病害和逆境胁迫等，需要寻求现代生物技术解决。

转基因技术因可在基因水平上改造植物的遗传物质，定向改变植物的遗传性状，打破导入外源基因在物种间的生殖隔离，实现了基因资源的优势互补。因此，转基因技术是实现水稻品种改良的一种重要手段。

转基因技术将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有优良遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出人类所需要的生物制品，用于医药、食品等方面。

由于转基因技术打破了物种界限，突破了常规育种中种质资源的限制，实现了有利基因在不同物种之间的重组转移，加快了对农作物品种抗性、品质、产量等多种性状的协调改良，从而为解决上述农业发展中的诸多制约因素提供了一条有效的技术途径。

然而由于转基因的遗传及表达的不稳定性和不可预知性，转基因引起的水稻雌雄配子体发育问题使许多转基因水稻株系在育种上无法利用。雄配子体发育是水稻生殖发育最重要的过程之一，它从造孢细胞发育成成熟的雄配子(花粉)涉及大量基因的表达，克隆及分析花粉发育过程中重要基因的功能对水稻花粉发育及相关的基础生物学研究具有重要的理论意义，而且对杂交稻及水稻转基因育种具有重要的实际意义。这些研究都离不开启动子的引导。启动子直接控制目的基因的转录，是调控目的基因表达最为经济有效的手段，也是控制表达风险的可行路径。因此，充分了解启动子，尤其是花粉中特异性表达的启动子的功能和特点，对构建转基因表达系统非常重要。

在此过程中，首要的任务则是分离或者构建出大量的在花粉中表达的启动子，进而后续才能对其进行研究。然而，当前人们对花粉中特异表达启动子的了解有限，因此，找到更多的花粉特异表达启动子对后续的进一步研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因特异的在水稻花粉强表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花粉强表达启动子OsPoll4，其特征在于，所述水稻花粉强表达启动子OsPoll4包含序列：

所述水稻花粉强表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsPoll4或启动子OsPoll4。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段1864bp的DNA序列具有驱动目标基因在水稻花粉强表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。

优选地，本发明提供的水稻花粉强表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即OsPoll4或启动子OsPoll4。

另一方面，本发明提供一组用于扩增权利要求1中所述启动子的引物序列，其特征在于，所述引物序列包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列为：

ctgcagagcg actactgcta cagcccgt 28

所述第二引物的核苷酸序列为：

ctgcagagcg actactgcta cagcccgt 28。

另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻花粉强表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻花粉强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花粉强表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsPoll4，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即OsPoll4或启动子OsPoll4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsPoll4。

或者待表达基因可以为任何对作物的花粉性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在花粉中强表达，从而实现改变作物花粉相应性状的功能。

再一方面，本发明提供上述水稻花粉强表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花粉强表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。

另一方面，本发明提供一种在植物的花粉中驱动特定待表达基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

A)、将权利要求1中所述的水稻花粉特异表达启动子OsPoll4连接于待表达基因的上游；

B)、将所述水稻花粉特异表达启动子OsPoll4与待表达基因的结合产物转入到根癌农杆菌中；

C)、利用转入了所述结合产物的根癌农杆菌对目标植物的种子进行农杆菌转化；

D)、利用转化后的种子培育相应植株，在所述植株中，权利要求1中所述的水稻花粉特异表达启动子OsPoll4能够驱动待表达基因表达。

优选地在所述方法和所述应用中，所述待表达基因为结构基因、调节基因、结构基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，优选为具有改变花粉活性功能的基因。

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的“agcgactact gctacagcccgt”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾的“gaagcagttgccgccgca aacc”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的1864bp的DNA序列，并将其命名为OsPoll4(序列表中的SEQ ID No:1)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在花粉中强表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，GUS强烈着色于转基因植株花粉中，而不在花药壁上出现，同时在颖壳有不显著染色。从而证明该1864bp的序列具有驱动基因在花粉中强表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在花粉中特异的驱动靶标基因的表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsPoll4能够调控基因在花粉中强表达，可分析和研究花粉发育过程中重要基因的功能，对水稻花粉发育及相关的基础生物学研究具有重要的理论意义，而且对杂交稻及水稻转基因育种具有重要的实际意义。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsPoll4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-OsPoll4示意图，其中示出了利用OsPoll4启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为10周龄OsPoll4-GUS转基因植物各组织GUS染色图。(A)根；(B)茎；(C)成熟叶片；(D)小花；(E)雄蕊；(F)花药。标尺为1mm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的OsPoll4启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsPoll4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带PstI，酶切位点(CTGCAG)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：

正向引物：CTGCAGAGCGACTACTGCTACAGCCCGT PstI

反向引物：GGATCCGGTTTGCGGCGGCAACTGCTTC BamHI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsPoll4的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsPoll4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1864bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用PstI和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsPoll4，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

作物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsPoll4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用PstI和BamHI双酶切，回收启动子OsPoll4片段。同时利用PstI和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsPoll4片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsPoll4与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-OsPoll4(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsPoll4驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色。脱色时在37℃条件下用75％乙醇处理，至叶绿素完全脱掉。结果见图3，各组织于GUS染液中染色12h后，在雄蕊组织有代表GUS活性的蓝色出现，而在根、茎、叶等营养组织中无表达。组织放大后表明GUS强烈着色于花粉中，而不在花药壁上出现，同时在颖壳有不显著染色。实验表明OsPoll4启动子具有花粉强表达活性，同时在植物其他组织中表达极微弱。

实施例2

为了验证本发明的序列表SEQ ID No.1中的序列在去除前端的22bp以及后端的22bp之后仍然具有启动子功能，本发明对该序列利用其他引物也进行了类似于上面实施例1的实验，即：以水稻品种日本晴DNA为模板，利用新的正向引物、反向引物进行启动子扩增；回收PCR扩增的目的片段，连接到PGEM-T-Easy载体，转入到激活的感受态细胞；然后，将其和pCAMBIA1391片段用T4连接酶进行连接获得相应作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；对成熟水稻种子进行农杆菌介导的水稻遗传转化，培育再生植株培养；最后进行染色验证。

经实验验证，序列表SEQ ID No.1中的序列在去除前端的22bp以及后端的22bp之后也具有驱动Gus基因在花粉中强表达的作用。由于实验方法和结果与实施例1类似，这里不再详述。

虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (3)

1.一种在水稻的花粉中驱动特定待表达基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

A)、将序列表中SEQ No.1中所述的水稻花粉特异表达启动子OsPoll4连接于待表达基因的上游；

B)、将所述水稻花粉特异表达启动子OsPoll4与待表达基因的结合产物转入到根癌农杆菌中；

C)、利用转入了所述结合产物的根癌农杆菌对目标水稻的种子进行农杆菌转化；

D)、利用转化后的种子培育相应植株，在所述植株中，所述的水稻花粉特异表达启动子OsPoll4能够驱动待表达基因表达，

序列表中SEQ No.1所述的水稻花粉强表达启动子OsPoll4由下述序列构成：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待表达基因为结构基因、调节基因、结构基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待表达基因为具有改变花粉活性功能的基因。