CN104988140A - 一种来源于水稻的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HDT702启动子及其应用。本发明从水稻中克隆得到HDT702启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该启动子是一个组织特异性启动子，其能够启动下游基因在水稻的花药中特异性表达。将其应用于转基因工程中，可使目的基因的表达产物特异的在花药中积累，增加局部表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，因此在转基因工程中有良好的应用前景。

Description

一种来源于水稻的启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和水稻育种技术领域，具体涉及一种来源于水稻的启动子及其应用。

背景技术

启动子是指DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，通常位于编码基因的上游。在启动子片段中存在大量的顺式作用元件，转录因子通过与顺式作用元件结合从而调控基因的转录，因此启动子的分离和功能分析是基因工程研究的重要内容。

植物基因工程中常用到的启动子按其作用方式和功能分为3类：组成型、组织特异型和诱导型启动子。组成型启动子在植物体各个组织中都启动基因的表达，具有持续性和无时空特异性。目前基因工程中植物表达载体常用的是组成型启动子，如花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子、玉米的Ubiquitin启动子等。但外源基因在受体植物内持续、高效地表达往往会引起植物的形态和生理发生改变，影响植物正常的生长发育，甚至导致植物死亡。

组织特异型启动子能使目的基因的表达产物在特定器官或组织部位积累，增加目的基因的局部表达量。这样不仅避免了基因过量表达对植物体造成的伤害，同时也避免植物营养的不必要浪费，是近年来启动子研究的热点。

随着现代基因工程技术的发展，获得了很多转基因植物其中包括很多粮食作物，但是食品安全问题却制约了转基因农作物的推广和发展。转基因水稻中外源基因在胚乳中表达致使外源蛋白在其中积累，是影响一些具有好品质的转基因水稻发展受限制的主要因素。针对这种现象，利用组织特异型启动子使外源基因特异在非食用部分表达，以降低食品安全风险是促进转基因水稻和转基因农作物推广的一个重要途径。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能够启动下游基因在水稻的花药中特异性表达的HDT702启动子。

所述的HDT702启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述HDT702启动子。

本发明的第三个目的是提供一种宿主菌，其特征在于，含有上述表达载体。

所述的宿主菌优选为农杆菌EHA105。

本发明的第四个目的是提供上述HDT702启动子在启动下游目的基因在水稻中表达的应用。

优选，上述HDT702启动子启动下游基因在水稻的花药中特异性表达的应用。

本发明从水稻中克隆出HDT702启动子，该HDT702启动子能够启动下游基因在水稻的花药中特异性表达，是一个组织特异性启动子。将其应用于转基因工程中，可使目的基因的表达产物特异的在花药中积累，增加局部表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，因此在转基因工程中有良好的应用前景。

附图说明

图1是HDT702启动子转化大肠杆菌菌落PCR鉴定电泳图，M为2kb分子量标记，2、3、6、7和10泳道为阳性菌落；1、4、5、8和9为阴性菌落。

图2是HDT702启动子序列中相关顺式作用元件分析图。

图3是双元载体PCAMBIA1391Z的结构示意图。

图4是表达载体PCAMBIA1391Z-HDT702P构建完成酶切检测图，M为2kb分子量标记，1、3、5和7泳道为HindIII/Sac I酶切条带，对应为阳性质粒；2、4、6和8泳道为HindIII/PstI酶切条带，对应为阴性质粒。

图5是PCAMBIA1391Z-HDT702P载体转化水稻成熟胚愈伤各生长阶段图；

a是种子消毒后接种到诱导培养基上7天；

b是切除胚根和胚乳的种子在诱导培养基上继代培养；

c是含PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的农杆菌EHA105侵染水稻愈伤及共培养；

d是共培养后的愈伤转到筛选培养基；

e是抗性愈伤转到分化培养基；

f是抗性愈伤在分化培养基上分化成苗；

g是将分化得到的苗转到生根培养基上；

h是转基因苗移到室外土培。

图6是PCR检测阳性转基因水稻植株图，M为2kb分子量标记，以1-9泳道为9棵转基因植株叶片，第10泳道为野生型水稻叶片，转基因的1、2、4、5、6和9泳道对应的水稻都能得到399bp的GUS基因目的条带，为阳性转基因植株；野生型的作为阴性对照没有得到目的条带。

图7是含PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的阳性转基因植株GUS染色结果图，其只在花药中表达，a是去内颖壳的水稻小花；b是花药；c是花粉。

图8是阳性转基因水稻花药半薄切片结果图，a是花药纵切图；b是单个花粉细胞。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用水稻中花11(Oryza Sativa L.)种子购于广东省农科院；pGEM-T载体购自Promega公司，其货号为：A1360；标准营养液为国际水稻所标准营养液；LB、YM、AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1：OsHDT702基因的启动子的克隆

以水稻粳稻品种“中花11”为实验材料，通过CTAB法提取基因组DNA。

根据NCBI上已知的水稻基因OsHDT702(Genebank登录号为AK072845)的序列，取起始密码子ATG上游1776bp序列设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增引物为HDT702P-F：ATAAGCTTGTGCTCGTGCCGTCGTCCTT(下划线部分为Hind III酶切位点)；HDT702P-R：ATCTGCAGTCTCCTCGCCGTGCTCCTCT(下划线部分为Pst I酶切位点)。PCR反应按50ul体系进行，反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化，然后克隆入载体pGEM-T中，在16℃连接过夜。

连接产物采用热激法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落PCR结果如图1所示。选取转入了连有目的片段的pGEM-T的阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序，得到扩增片段的序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列命名为HDT702启动子(HDT702P)，该HDT702启动子含有1776bp的碱基。

实施例2：HDT702P序列上顺式作用元件分析

将HDT702P序列放在PLACE启动子分析网站(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)上做了顺式作用元件分析。结果如图2所示，HDT702P序列上含有多个花药特异性表达顺式作用元件和多种激素响应元件。

实施例3：转PCAMBIA1391Z-HDT702P载体水稻的获得和鉴定

1.PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的构建

将实施例1中测序正确的阳性克隆提取质粒，提取的质粒和PCAMBIA1391Z载体(其结构如图3所示)同时用Hind III和Pst I进行酶切，回收目的片段，用T4连接酶连接目的DNA片段和Hind III和Pst I酶切的PCAMBIA1391Z载体，即可得到含有HDT702P且其下游基因为GUS基因的表达载体PCAMBIA1391Z-HDT702P。在靠近HDT702P片段上游约900bp处有一个Sac I酶切位点，而PCAMBIA1391Z没有Sac I酶切位点，因此用Hind III和Sac I酶切融合载体鉴定阳性质粒会得到900bp的小片段；如图4所示，其中1、3、5和7泳道对应的为阳性质粒，再也经测序验证，确认HDT702P转入了PCAMBIA1391Z载体。阳性质粒通过冻融法转入农杆菌EHA105，菌落PCR鉴定转入表达载体PCAMBIA1391Z-HDT702P的阳性克隆用于水稻成熟胚愈伤转化。

2.重组质粒PCAMBIA1391Z-HDT702P转化到农杆菌EHA105

取1μl重组质粒PCAMBIA1391Z-HDT702P与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃放置5min。加800μl无抗生素的YM培养基，于28℃摇床，100rpm转速中培养2-4h。将培养物涂到25mL YM平板，YM培养基中含卡那霉素(Kan)和硫酸链霉素(Str)，浓度都为50mg/L。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为HDT702P-F和HDT702P-R。选取转入了重组质粒PCAMBIA1391Z-HDT702P的农杆菌EHA105克隆作为阳性克隆。

3.农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤遗传转化

转化过程各阶段水稻成熟胚愈伤及水稻植株情况如图5所示。

(1)水稻成熟胚的诱导

水稻成熟种子去壳后，用70％乙醇浸泡1min，0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水清洗4次，每次4min。种子转到无菌滤纸上晾干后，接种在诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，切去胚根和胚乳，转接到继代培养基上，26℃暗培养。两周后继代培养一次，挑选适合大小、紧密和色泽淡黄的愈伤组织预培养3天。

(2)农杆菌EHA105的培养

将含有重组质粒PCAMBIA1391Z-HDT702P的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kan和50mg/L Str的YM平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的5ml液体YM中培养12～24h，然后以1：30的比例于同样的液体YM(30ml)中进行扩大培养4～5h，5500rpm离心10min后收集菌液，用液体AAM培养基(内含乙酰丁香酮(As)，浓度为100μmol/L)重新悬浮(OD600约为0.5)，置于28℃摇床轻微振荡培养15min，该农杆菌悬浮液即可用于转化水稻愈伤。

(3)水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好(预培养3天、色泽淡黄)的颗粒状愈伤组织放入50ml无菌三角瓶中，加入准备好的步骤(2)的农杆菌悬浮液，静置培养20min，每隔5min轻轻摇一下三角瓶。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃黑暗培养3天。

(4)抗性愈伤组织的筛选

将共培养3天后的愈伤组织转到含有500mg/L的头孢霉素(Cef)的灭菌水中清洗，每次4-5min，共4-5次。然后将愈伤组织置于灭菌过的滤纸上吸干水分。将干燥后的愈伤组织放在含有50mg/L潮霉素(Hyg)和500mg/L Cef的筛选培养基上，26℃暗培养2周后，转到新配制的筛选培养基上继续筛选2周(大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织)。

(5)抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选一定大小、乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L Hyg和500mg/L Cef的预分化培养基上暗培养7天，然后转至分化培养基上在16h光/8h黑暗的光周期条件下培养，温度为26℃，光照强度为10000lux，一般经过6-10天就会有绿点出现，20-30天后进一步分化出小苗。

(6)生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约8cm左右时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。

(7)转基因植株的分子鉴定

待转基因植株长到一定大小后，剪取叶片。采用CTAB法提取其基因组DNA后，用引物对GUS-F：GGAGTGAAGAGTATCAGTGTGC和GUS-R：GATAATCATCGCAAGACCG进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。预期PCR产物片段长为399bp。结果如图6所示，其中第1、2、4、5、6和9泳道对应的为GUS检测阳性，由此获得转入PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的阳性转基因水稻植株。

实施例4：对阳性转基因植株的GUS染色分析

将经过分子鉴定的转基因植株在整个生长时期，取转基因植株各个组织在GUS染色液中，37℃过夜染色，然后用无水乙醇脱色后拍照。如图7所示，GUS基因只在转入PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的阳性转基因水稻植株的花药中表达。由此说明，如SEQ IDNO.1所示序列的HDT702P片段是一个启动子，命名为HDT702启动子，该启动子启动GUS基因在转基因水稻的花药中特异性表达，即在转基因水稻中该启动子只启动下游基因在部分器官组织中特异表达，由此说明这个启动子具有组织特异性，是一个组织特异性启动子。

实施例5：转HDT702启动子植株花药半薄切片验证

1.溶液的配制

A液：含2.5％戊二醛和2％多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)。

B液：含1％锇酸的磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)

C液：磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.2)

2.固定与包埋

(1)固定：将剪切的转入PCAMBIA1391Z-HDT702P载体的阳性转基因水稻植株的合适大小花药组织进行染色后投入A液中，4℃固定过夜。

(2)洗涤：用C液4℃洗涤六次，每次20min。

(3)再固定：在溶液B中，4℃固定16h。

(4)洗涤：用C液4℃洗涤6次，每次20min。

(5)体积分数为30％、50％、70％、80％、90％、100％系列的预冷乙醇逐级脱水，每级15min，100％乙醇2次，每次30min。

(6)环氧丙烷过渡，Epon812常规方法包埋。包埋好的材料可以进行半薄切片，切成2μm厚的切片，Carl Zeiss显微镜观察拍照。

结果如图8所示，GUS基因主要是在花粉中表达，推测HDT702启动子也许参与花粉发育过程。

Claims (6)

1.一种HDT702启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的HDT702启动子。

3.一种宿主菌，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

4.根据权利要求3所述的宿主菌，其特征在于，所述的宿主菌为农杆菌EHA105。

5.权利要求1所述的HDT702启动子在启动下游目的基因在水稻中表达的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，HDT702启动子启动下游基因在水稻的花药中特异性表达的应用。