CN105602955A - 一种水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和重组表达载体。具体而言，本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。本发明的水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2能够调控基因在植株中的雄蕊部位集中表达，而在其他部位基本不表达。本发明提供的启动子可以改善雄蕊性状，用于水稻的育性研究，丰富了育性研究的可用遗传资源。此外，可以通过该启动子对农作物品种进行基因改造，例如，用该启动子与雄性不育基因相结合，构建在重组表达载体中，能够培育出雄性不育的水稻品种，而这种水稻品种所引入的雄性不育基因仅在雄蕊中表达，而不会在其他部位有任何表达，针对性强，而且可以降低生物代谢成本，更容易保证转基因品种的稳定。

Description

一种水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻雄蕊特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在雄蕊中特异表达，从而可在不影响其他组织部位生理活动的情况下达到通过改变雄蕊结构特性改良水稻育性的目的。

背景技术

启动子是一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因编码区的上游。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，它与RNA聚合酶以及其它蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是基因表达调控模式的实质。在启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。因此启动子是基因表达所必需的，从某种意义上讲其序列特征和一些特异转录因子的相互作用决定了外源基因表达的空间、时间和表达的强度等。深入研究这些启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。

此外，利用高效的组织特异型启动子代替组成型启动子，改良水稻的抗性或品质，使一些表达毒性蛋白的目的基因尽量在水稻的营养器官表达，而不在生殖器官表达，从而增加转基因水稻的食用安全性和环境安全性，降低组成型启动子表达所造成的能量损失，以及对环境和水稻本身带来的不良影响，是水稻转基因工作今后将要解决的一个重要问题，也是转基因水稻从实验室走向大田生产的必要前提。

水稻的雄蕊是水稻的生殖器官，是雄性配子体产生的器官，与水稻穗的发育、育种及水稻的产量等密切相关。因此在水稻组织特异型启动子的研究领域中，雄蕊特异型启动子是人们最为关注的启动子之一。但是目前所发现的雄蕊特异型启动子的遗传资源并不是十分丰富，限制了人们对雄蕊性状改良能力的提升。因此，本发明希望提供一种水稻雄蕊特异表达启动子，用于驱动目标基因在雄蕊中特异性表达，达到改良育性的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻雄蕊特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻雄蕊特异表达启动子，其DNA序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列有80％或90％以上的同源性；或者，所述水稻雄蕊特异表达启动子为在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述水稻雄蕊特异表达启动子具有与SEQIDNo:1所示的DNA序列杂交的产物。这些水稻雄蕊特异表达启动子序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在水稻雄蕊中表达。

优选地，所述水稻雄蕊特异表达启动子包含序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsAnth2或启动子OsAnth2。具体而言，本申请的发明人从日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)分离克隆得到了序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列，并发现这段1907bp的DNA序列具有驱动目标基因在水稻雄蕊特异表达的作用。

优选地，本发明提供的水稻雄蕊特异表达启动子的DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列，即OsAnth2或启动子OsAnth2。

另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻雄蕊特异表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻雄蕊特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻雄蕊特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsAnth2，该重组表达载体为将SEQIDNo:1所示的序列即OsAnth2或启动子OsAnth2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsAnth2。

或者待表达基因可以为任何对水稻的雄蕊性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在雄蕊中特异性地集中表达，从而实现针对性改善作物雄蕊相应性状的功能，而不会对植物体内其他组织或器官带来任何不利影响。

再一方面，本发明提供上述水稻雄蕊特异表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻雄蕊特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。

再一方面，所述应用可以改良作物生长特性，所述作物为禾谷类作物：水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等；优选为水稻。

优选地，所述应用包括：

A)、以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2；

B)、将所扩增的目的片段与目标基因相连，进而获得相应重组载体；

C)、利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌中；

D)、通过农杆菌介导方法利用所获得的根癌农杆菌对成熟水稻种子进行遗传转化；

E)、利用转化后的水稻种子培育相应的水稻植株。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQIDNo：1中相同)：

TTTGTACTGTTTAGGTGGGGAGCCAGGTAAACATAAAATTCAGGGAATAGGGCCAGGACTCATACCTGATATGTTGGACACCTCGGTCATCGATGAAGTCGTCACGGTAAACACTGATGAAGCAATGGTGAATGCAAGGAGGCTGGCAATGGAAGAGGGCCTCCTTATGGGCATTTCTTCTGGGGCAAACCTGGCAGCTTGCTTGAAGGTTCAAAATCTCCTAGCAACTCATCTGTCTGAATGTTTATTCCTTTTCTTATCTCTAGTAATCTTCTCCTATCGAAAATTTTTGCACATCCTTTCCTCTAATAACATTGAAATCTCAAATGCATATTTAGGTCGCGTCGAGAGAGGAAAACAAGGGGAAGATGATTGTCACCATGTTCCCAAGCGGGGGTGAGAGGTACATGAACTCTGACCTCTTTGCAGCTGTGAGAGAGGAATGCAATGCCATGACATTTTAATCTCACTGGTTGTTCAGAAGAATCAAGAACAGTTATGTGTAAAACTATAGGAGGGTAACTTGTACCACAATGTACACATAGCACGATCTTGCAAAGGGATTTATCGGCAAGGAGCCAAAGAATTTGTACGAATTGTATATTTGTACTAGTCATTAGTCAATAAATAAATGAAATAATTTGCTCACTTCGTGTGAGTAAATTTCGGAAAACTACATATACTTGTCATAAACTACAGATCAAATGATATTATCATAAAACTACCAATTTAGAGCCCTTTTGAATTGGAGGATTGCCATAAGAATTTTAGAGAATTCAATTTCCTAAGGAATTTTGCATATGAAACCCTTTGATTCATAGAAAAGTATAGGAAATTTTTCATAGGATTACATTCCTATAGCTCAATTTCACATGAAAATAAGCAAGAGGTTTAACCTCTTGAAAACTTTTATTTGCTTTATTTGTTTCCTATGGTACTACCAAAGGGACTCTTTATATTTTTTTTTGTGTCTTCCATTCCTATAGAATTAGGAAAACATGTCAATTCGATTCCTACGTTTTTCCTATTCCTATGTGTTTTTCTACCCTGCGTTCCAAATGGACTTAGAATCGAGTTACCAGATAACTGCATATACAAGTCACTACAGATTTAACACTAGCGCTATTTATTTAAGGTTCATTTCTCAATGGAACGATCCGTTATCATTTTTGGCCCTTTTTGGGATGCATAAAATACATCATTTTCTTGTGTGCTTTTCAGCTTATTACATGCTAATTAGGACACAAATGTATCAGCAAATAATTCATATTTTCCATCTGAGAAATTGGTTGGCACGAGCAACAAATTGACCATGCAATTGCAGCCGCACTTTTGAGTAAAAATGGCAGGTGAAAGTGAAACAACAGAAAGATTAAGCCGTTTATGGCACGAGCATTTCTACCGCTTCACTGTCGCCAACTTACGAGCTCCGTTGCAACAGCCTCCAGCTGCAGTTAATCACTTAATTAGGCGCACTTAATTTGGGATTAACAACGCTAACCTTAACTTAGACCGGCGCCTCTCCTTTATTAATCAAGGCGGGCCCACGACGGCAGCACAAACTCACACACACACCAAAGTCAAAAACGAGGGGGATTGGCCGTCGTGGGCCGTCCGATCAGAATCCAACGGCTGAGATCTCAGCCGTTGACCGGACGGCGCCGACGGTGTAAGCCGCCTCCTCCTCCGCCCCGCTGCTGCTCGCGCCAAGATCGGCGGCGGCGGCGAGCATGGCGTTTCCACGGGAGGGAGGCGGCGGTAATGGCGGCGACGGCGAGGCGAGGGAGGAGAGGGTGTCGTCGGGCTACTACTCGTCGTCGTCGGCGGCGAGGCAGCACGGGAGCGAGCAGCCGCCGCCGACGC

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中的1907bp的DNA序列，并将其命名为OsAnth2(序列表中的SEQIDNo:1)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在雄蕊中特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株仅在花粉、花药壁和部分花丝组织上出现蓝色，在其他器官组织中均没有着色。由于所述着色组织均为水稻雄蕊组织的组成部分，从而证明该1907bp的序列具有驱动基因特异的在雄蕊中表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组表达载体，经转化后，可在雄蕊特异的驱动靶标基因的表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsAnth2能够调控基因在水稻中雄蕊部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。利用该启动子代替组成型启动子对农作物的雄蕊性状进行基因改造，通过该启动子调控目标基因在雄蕊中表达，为研究水稻育性提供遗传资源，可以有效地改良水稻育性。此外，可以通过本发明所克隆的水稻启动子OsAnth2启动子对农作物品种进行基因改造，例如，用该启动子与雄性不育基因相结合，构建在重组表达载体中，能够培育出雄性不育的水稻品种，而这种水稻品种所引入的雄性不育基因仅在雄蕊中表达，而不会在其他部位有任何表达，针对性强，而且可以降低生物代谢成本，更容易保证转基因品种的稳定。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsAnth2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-OsAnth2示意图，其中示出了利用OsAnth2启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为利用OsAnth2启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，12周龄OsAnth2-Gus转基因植物各组织GUS染色图，其中，(A)根；(B)茎；(C)成熟叶片；(D)小花；(E)雄蕊；(F)花药。标尺为1mm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1

含有酶切位点的OsAnth2启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsAnth2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNo:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQIDNo:3)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGACCCTGACAAACTGTTGCCTGHindIII

反向引物：GGATCCGACGACCTCCGCTCCATCTGCTBamHI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsAnth2的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsAnth2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1907bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和BamHI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsAnth2，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。

重组表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsAnth2的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和BamHI双酶切，回收启动子OsAnth2片段。同时利用HindIII和BamHI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsAnth2片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsAnth2与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-OsAnth2(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsAnth2驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“重组表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan，ChenguangZhai，etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(JeffersonRA等人.GUSfusion：β-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[J].EMBOJ.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用75％乙醇处理，至叶绿素完全脱掉。结果见图3，蓝色仅在花粉、花药壁和部分花丝组织中出现(由于专利附图中体现不出彩色，图3的D、E、F中深色部分就表示发生染色),由于所述组织均为水稻雄蕊组织的组成部分，实验表明OsAnth2启动子具有雄蕊特异表达活性。

实施例2

为了验证本发明的序列表SEQIDNo.1中的序列在去除前端的22bp以及后端的22bp之后仍然具有启动子功能，本发明对该序列利用其他引物也进行了类似于上面实施例1的实验，即：以水稻品种日本晴DNA为模板，利用新的正向引物、反向引物进行启动子扩增；回收PCR扩增的目的片段，连接到PGEM-T-Easy载体，转入到激活的感受态细胞；然后，将其和pCAMBIA1391片段用T4连接酶进行连接获得相应作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；对成熟水稻种子进行农杆菌介导的水稻遗传转化，培育再生植株培养；最后进行染色验证。

经实验验证，序列表SEQIDNo.1中的序列在去除前端的22bp以及后端的22bp之后也具有驱动Gus基因在雄蕊中强表达的作用。由于实验方法和结果与实施例1类似，这里不再详述。

虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2，其特征在于，所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2的DNA序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列有80％或90％以上同源性；或者，所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2为在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者，所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2具有与SEQIDNo:1所示的DNA序列杂交的产物。

2.根据权利要求1所述的水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2，其特征在于，所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2由SEQIDNo:1所示的DNA序列构成。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻雄蕊特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2连接于载体中待表达的基因序列的上游。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsAnth2，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达的基因是具有改善雄蕊性状功能的基因。

6.一种根据权利要求1所述的水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的水稻雄蕊特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植株。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长特性，所述作物为禾谷类作物：水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦、黑麦等。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述待表达的基因为结构基因、调节基因或者结构基因的反义基因。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

A)、以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述水稻雄蕊特异表达启动子OsAnth2；

B)、将所扩增的目的片段与待表达的基因相连，进而获得相应重组载体；

C)、利用冻融法将所获得的重组载体转入根癌农杆菌中；

D)、通过农杆菌介导方法利用所获得的根癌农杆菌对成熟水稻种子进行遗传转化；

E)、利用转化后的水稻种子培育相应的水稻植株。