CN113755491B

CN113755491B - 水稻多组织表达启动子及其应用

Info

Publication number: CN113755491B
Application number: CN202010491126.9A
Authority: CN
Inventors: 龙湍; 吴春瑜; 唐杰; 曾翔; 吴永忠; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-02
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2040-06-02
Also published as: CN113755491A

Abstract

本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及水稻多组织表达启动子及其应用。本发明提供水稻多组织表达启动子GMS2P和GMS2P1、含有该启动子的表达盒和表达载体以及扩增该启动子的引物对。本发明的水稻多组织表达启动子GMS2P和GMS2P1为水稻内源序列，对水稻基因工程十分有利，可驱动目的基因在根、茎、叶、花药、花粉、雌蕊、颖壳及桨片中表达，为驱动基因在水稻多种组织中广泛表达提供了新方法。

Description

水稻多组织表达启动子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及水稻多组织表达启动子GMS2P、GMS2P1及其应用。

背景技术

转录调控是植物基因表达调控的主要形式之一，由顺式作用元件和反式作用因子协调完成。启动子是植物基因转录调控中最重要的顺式作用元件之一，一般位于基因5′端上游区，是RNA聚合酶及一些反式作用因子的识别与结合位点。启动子主要包含核心启动子区与转录调控区两个功能区。核心启动子区是启动转录的最短启动子片段，一般为40nt，是一段被RNA聚合酶家族I、II和III识别和结合的DNA序列。此区域包含一些重要的功能元件，能够准确的定位转录起点及方向，是基因表达调控的基础。转录调控区域位于核心启动子的上游(或下游)，可与特异的转录因子相结合从而对转录的时空和强弱起调控作用，如增强子和沉默子等。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于控制外源基因的表达。

启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子等三类。组成型启动子能在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达量恒定性。烟草花叶病毒的35S启动子，水稻的Actin启动子以及玉米的Ubiquitin启动子都属于组成型启动子。组成型启动子广泛应用于植物的基因工程研究中，用于目标基因(如抗虫和抗除草剂基因)的超表达。诱导型启动子能在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达。它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并有明显的专一性。诱导型启动子根据诱导信号的不同可以分为光诱导启动子、热诱导启动子、低温诱导启动子、干旱诱导启动子、创伤诱导启动子、激素诱导启动子等。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。组织特异性启动子是时空特异型启动子的一种，只在特定细胞、组织或器官中启动表达。在植物的遗传转化中运用组织特异表达的启动子控制目标基因的表达能够更有效地避免使用组成型启动子带来的潜在负作用，如能减少组成型表达增加的代谢负担，降低转基因食品安全风险及对与环境的不良影响，以及重复使用相同启动子引发的基因沉默等。目前已开发的水稻组织特异启动子的种类多种多样，在根、茎、叶、种子和果实等几乎各种组织中都发现了组织特异性表达的启动子。

稻穗是水稻的生殖器官，稻穗的发育决定了水稻的结实率、千粒重、穗粒数、粒型、垩白粒率、垩白度、胶稠度、糊化温度、直链淀粉含量、蛋白质含量等产量和品质等农艺性状。茎是水稻地上部的支撑结构，控制着稻穗和根之间空气、水分、养分的运输。而茎节是节间分生组织的所在部位，是节间的连接点，是茎发育的调控节点。水稻根的顶端是生长点，根尖和根毛是根系吸收水分和养分主要的地方，寻找在穗和幼根幼茎节同时特异性表达的启动子，将有助于高产、优质、抗倒、营养高效水稻品种的选育。

发明内容

本发明的目的是提供一种属于组成型启动子的水稻多组织表达启动子GMS2P与GMS2P1、其应用以及利用该启动子在植物中表达目的基因的方法。

本发明首先提供了一种可以在水稻根、茎、叶、花药、花粉、子房、柱头、颖壳及桨片等组织中广泛驱动DNA表达的启动子GMS2P，其具有以下任一的核苷酸序列：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等的驱动DNA在包括根、茎、叶、花药、花粉、子房、柱头、颖壳和桨片在内的植物组织中表达的启动子功能、由1)衍生的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，为与1)相比具有70％以上同源性、80％以上同源性、85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、98％以上同源性或99％以上同源性，且具有同等的驱动DNA在根、茎、叶、花药、花粉、子房、柱头、颖壳和桨片等植物组织中表达的启动子功能的核苷酸序列。

对于3)所述的与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与GMS2P的核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下能与本发明启动子序列或其片段杂交的DNA序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与GMS2P杂交。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因实验其它条件的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度不超过1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na⁺，典型地大约0.01-1.0M Na⁺浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal Biochem，1984，138：267-284)的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化，并应用此方程计算杂交和洗涤组合物和所需的Tm。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本发明还提供了一种可以在水稻根、茎、花粉、子房、桨片及颖壳等组织中广泛驱动DNA表达的启动子GMS2P1，其具有以下任一的核苷酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等的驱动DNA在包括根、茎、花粉、子房、桨片及颖壳在内的植物组织中表达的启动子功能、由1)衍生的核苷酸序列；

3)与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列从5’到3’方向缺失490bp得到。

其中，2)所述的由1)衍生的核苷酸序列，为与1)相比具有70％以上同源性、80％以上同源性、85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、98％以上同源性或99％以上同源性，且具有同等的驱动DNA在穗和幼根茎节特异性表达的启动子功能的核苷酸序列。

对于3)所述的与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列，本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与GMS2P1的核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下能与本发明启动子序列或其片段杂交的DNA序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与GMS2P1杂交。

本发明进一步提供含有所述水稻多组织表达启动子GMS2P或GMS2P1的表达盒、含有所述水稻多组织表达启动子GMS2P或GMS2P1或所述表达盒的载体、含有所述表达盒或所述载体的宿主细胞。

所述表达盒为在启动子GMS2P和/或GMS2P1的下游可操作地连接有结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或能够干扰内源基因表达的小RNA基因的表达盒。

所述载体为表达载体或基因编辑载体。

所述宿主细胞为微生物细胞、植物细胞或转基因植物细胞系。

本发明还提供含有所述表达盒或所述载体的植物或植物组织。

本发明提供用于扩增所述水稻多组织表达启动子GMS2P或GMS2P1的引物对。

作为本发明的一种实施方式，扩增GMS2P的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5，扩增GMS2P1的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

SEQ ID NO.3:CGACGGCCAGTGCCAGTAGTTGAGCTCAGGAC；

SEQ ID NO.4:CGACGGCCAGTGCCACAATTTCTATTGGATTTGGCAC；

SEQ ID NO.5:TACCCTCAGATCTACCATGGCGGCGGTGGTGGTGTTG。

本发明提供一种试剂盒，其包含水稻多组织表达启动子GMS2P、GMS2P1、含有该启动子的表达盒或含有该启动子、该表达盒的载体、含有该表达盒或该载体的宿主细胞以及用于扩增启动子GMS2P、GMS2P1的引物对中的一种或多种。

本发明进一步提供所述水稻多组织表达启动子GMS2P和/或GMS2P1、或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞或所述引物对或所述试剂盒在驱动DNA在植物多种组织中表达的应用。

具体地，所述应用为利用GMS2P驱动DNA在植物的根、茎、叶、花药、花粉、子房、柱头、颖壳及桨片等组织中表达，或者为利用GMS2P1驱动DNA在植物的根、茎、花粉、子房、桨片及颖壳等组织中表达。

本发明提供所述水稻多组织表达启动子GMS2P和/或GMS2P1、或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞或所述引物对或所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。

所述转基因植物为目的DNA在多种组织中表达的转基因植物。

所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

本发明提供所述水稻多组织表达启动子GMS2P和/或GMS2P1、或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞或所述引物对或所述试剂盒在制备转基因水稻中的应用。

本发明还提供所述水稻多组织表达启动子GMS2P和/或GMS2P1、或所述表达盒或所述载体或所述宿主细胞或所述引物对或所述试剂盒在植物种质资源改良中的应用。

所述改良可为如下农学性状中的一种或多种的改良：产量、营养品质、氮利用效率性状、水分利用效率性状、除草剂抗性性状，杀虫剂抗性性状等。

本发明还提供在植物多组织中表达目的DNA的方法，包括：向植物中引入可操作地连接于所述水稻多组织表达启动子GMS2P或GMS2P1的目的DNA。

具体地，上述方法可为：将水稻多组织表达启动子GMS2P或GMS2P1和目的基因克隆到载体中得到含有GMS2P或GMS2P1以及目的基因的表达盒的重组表达载体，并将其引入植物基因组，得到目的基因在多种组织中表达的转基因植物。

本发明还提供一种分离多组织表达启动子GMS2P和GMS2P1的方法，其为分别使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对PCR扩增多组织表达启动子GMS2P和GMS2P1。

本发明的有益效果在于：本发明提供的多组织表达启动子GMS2P和GMS2P1具有如下优点：

1)GMS2P和GMS2P1为水稻内源DNA序列，转基因安全风险极低；

2)GMS2P能驱动目的基因在根、茎、叶、花药、花粉、子房、柱头、颖壳及桨片等组织中表达，GMS2P1能驱动目的基因在根、茎、花粉、子房、桨片及颖壳等组织中表达，表达水平精确。

3)本发明提供了一种驱动目的基因在多种植物组织中表达的新方法。

附图说明

图1是本发明实施例1中顺式调控元件分布图，其中，P和P1分代表GMS2P和GMS2P1，1代表TATA-box，2代表ARE，3代表CAAT-box，4代表TAAGAGAGGAA，5代表GATA-motif，6代表Box 4，7代表ABRE，8代表P-box，9代表ATTAAT，10代表CAT-box，11代表TGACG-motif，12代表MRE，13代表GT1-motif。

图2是本发明实施例2中多组织表达启动子GMS2P的重组表达载体pC1300gus-GMS2P的图谱。

图3是本发明实施例2中多组织表达启动子GMS2P1的重组表达载体pC1300gus-GMS2P1的图谱。

图4是本发明实施例3中转基因植株的PCR检测琼脂糖胶电泳图。泳道从左至右依次是：中花11基因组DNA；pC1300gus-GMS2P质粒DNA；30株T0代转基因植株；M为2000DNAMarker。

图5是本发明实施例3中转基因植株的PCR检测琼脂糖胶电泳图。泳道从左至右依次是：M为2000DNA Marker；中花11基因组DNA；pC1300gus-GMS2P1质粒DNA；22株T0代转基因植株。

图6是本发明实施例4中pC1300gus-GMS2P和pC1300gus-GMS2P1载体转中花11的T0代转基因阳性植株的根、茎、叶、颖壳、花药、桨片、柱头、子房、花粉的GUS染色结果。

图7是本发明实施例5中用实时荧光定量PCR检测GMS2基因在水稻不同组织中的表达量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1水稻多组织表达启动子GMS2P、GMS2P1的获取

1、水稻基因组DNA的提取

使用植物DNA分离试剂盒(成都福际生物技术有限公司)提取水稻基因组DNA。基因组来源于水稻品种9311的新鲜叶子。提取的基因组DNA分装后于-20℃保存备用。

2、GMS2基因启动子区功能元件分析

使用PLACE数据库(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace)对基因GMS2(登录号LOC_Os04g48490)的启动子区域，即始密码子ATG上游的2000bp的序列进行顺式调控元件分析(图1)。如图1所示，在-1984bp到-1500bp区域内密集分布着大量TATA-box和CAAT-box。分别选择-1984bp到-1bp，以及-1494bp到-1bp的区域进行启动子活性分析，两个区域的序列分别命名为GMS2P和GMS2P1。

3、GMS2P、GMS2P1的PCR引物设计与扩增

引物设计使用Gibson Assembly方法，扩增产物插入到pC1300GUSplus载体(将GUSplus元件插入pCAMBIA1300多克隆位点获得)的Nco I和Pst I酶切位点之间。以9311基因组DNA为模板，分别使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物扩增GMS2P、GMS2P1两个启动子。其中正反向引物的5’端均有15个核苷酸序列与载体相应连接位置重叠，以便Gibson Assembly连接。PCR反应体系(100μL)：DNA模板：3μL(50ng)，KOD聚合酶(购自东洋坊公司)：2μL，10×buffer：10μL，10μM正向引物：3μL，10μM反向引物：3μL，10μM dNTP：10μL，MgSO4：4μL，1/10DMSO：20μL，ddH₂O：45μL。

PCR程序：预变性95℃，4min。变性94℃，30s；退火50℃，30s；延伸68℃，2min；35个循环。延伸68℃，10min。

扩增产物包含1984bp的多组织表达启动子GMS2P(序列如SEQ ID NO.1)和1494bp的缺失片段GMS2P1(序列如SEQ ID NO.2)。

实施例2构建启动子GMS2P和GMS2P1的重组表达载体pC1300gus-GMS2P和pC1300gus-GMS2P1

将实施例1中获得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，回收1984bp与1494bp大小的条带。用Nco I及Hind III双酶切载体pC1300GUSplus，回收线性酶切载体。

用Lightening Cloning Kit(金福塞(北京)生物科技有限公司)对PCR回收产物和线性化pC1300GUSplus空载体进行连接，10μL体系如下：2.5μL回收产物(50ng/μL)，0.5μL酶切载体(100ng/μL)，2.5μL Ligation Mix。连接程序：50℃，60min。

取上述连接产物5μL电击转化大肠杆菌感受态细胞。使用引物SEQ ID NO.6和SEQID NO.7进行菌落PCR，挑选阳性克隆测序验证。测序正确的载体分别命名为pC1300gus-GMS2P(图2)和pC1300gus-GMS2P1(图3)。pC1300GUSplus载体含有GUS基因，表达GUS基因的组织经染色后呈现蓝色，可用于指示启动子的表达部位和强度。

实施例3 pC1300gus-GMS2P和pC1300gus-GMS2P1的转基因水稻的获得

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/mL利福平平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于50mL YEP液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16hr。取2mL菌液转接于100mL(含有抗生素)YEB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm离心10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10mL)，10％甘油洗1次溶于3mL 10％甘油中。取100μL感受态细胞加1μL实施例2得到的pC1300gus-GMS2P与pC1300gus-GMS2P1质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素和利福平的YEP培养板上28℃培养，挑选阳性克隆，用pC1300GUSplus载体特异性引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7进行PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(Hiei Y OhtaS,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T0代转基因幼苗。提取转化植株的叶片总DNA，使用引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9进行PCR阳性检测，pC1300gus-GMS2P和pC1300gus-GMS2P1转基因植株PCR产物的电泳图分别如图4和图5所示。选取经PCR验证的阳性植株种植，自交结实获得T1代。取T0或T1代植株进行后续分析。

实施例4转基因水稻GUS染色分析

配制GUS染色液X-Gluc反应液(50mM磷酸纳缓冲液，pH值7.0，0.5mM铁氰化钾，0.5mM亚铁氰化钾，0.5mg/ml X-Gluc，体积百分含量20％甲醇，0.1％Triton X-100)，随机选取5个以上在实施例3中获得的pC1300gus-GMS2P和pC1300gus-GMS2P1转基因阳性株系采集花药、雌蕊、颖壳、根、叶、茎等组织样品，浸泡在X-Gluc反应液中37℃2h或过夜，然后用体积百分含量75％乙醇脱去组织的叶绿体颜色后观察照相。结果如图6所示，GMS2P转基因植株的根、茎、叶、颖壳、花药、桨片、柱头、子房、花粉等组织或器官被染成了蓝色。而比GMS2P短490bp的GMS2P1的转基因植株，叶片、花药、柱头不能被染色，颖壳上只有微小的斑点状的蓝色区域分别，根和茎可以被染成蓝色但染色区域比GMS2P转基因植株的小，桨片、子房、花粉可以染上蓝色且染色水平与GMS2P转基因植株的相当。上述结果表明GMS2P启动子可驱动GUS基因在水稻根、茎、叶、颖壳、花药、桨片、柱头、子房、花粉中表达，GMS2P1启动子可驱动GUS基因在水稻根、茎、花粉、子房、桨片及颖壳等组织或器官中表达。

实施例5 GMS2基因的表达分析

取93-11孕穗期的不同组织提取总RNA，反转录成cDNA。使用引物InD48490_F：GCTCCGGCTGTTGATCT(SEQ ID NO:10)和InD48490_R：GCCTGCTCTTCCTCCTG(SEQ ID NO:11)检测GMS2基因的表达量，使用引物GAPDH-RTF：GAATGGCTTTCCGTGTT(SEQ ID NO:12)和GAPDH-RTR：CAAGGTCCTCCTCAACG(SEQ ID NO:13)检测水稻内参基因GAPDH的表达量。采取实时荧光定量PCR方法进行表达量分析。结果如图7所示，结果表明，GMS2基因在根、茎、茎节、叶、穗中均有表达，但在穗中的表达量明显高于其它组织。上述结果表明GMS2基因的启动子是一个组成型的启动子。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 水稻多组织表达启动子及其应用

<130> KHP201111611.4

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagttgagc tcaggactgg agccagtatg ttactctgaa aagaaccagc atataggaca 60

tagatggtga tttatcaaaa accatatcat ttctacacaa ccatatagcc caacatatag 120

cggatgctcc aacaagaata aatttggtag attttttatc aacccccaca agccaattct 180

caaaaatatg agatatacta taatgagtat ataaaccagt agtaaactgt agaactctcc 240

aaagaaattt tgtacagtaa cactccacga ataaatattg aatagtctta tttcgaaggc 300

catgagattt gagctcatgt tttagatcct ccaaaaaaaa agtgaaggaa aaaatggttc 360

ctatggaaaa ttttctgttc atagttttaa attctacaaa ttatctatta agatacctta 420

ctgtgaatga gcctgcacta ttcatgatgc cataagttag ctctactctt taagttatcc 480

tttgggaatt caatttctat tggatttggc actattattc atccatttga aatgatggat 540

tggaacatag taaaaggaga tctctagtat aataatagag gaaaattttc ctttgccatt 600

gattccattg cgataggaac atctactata ttttttcccc ttttctttgc taagattaat 660

gaaactgtac attaaccaaa gttgaggata ttttgaccaa cgaaattttt atcgtcgttt 720

tgtaataatc tcgtgataac tagattccta cggtccaaac tacgcacctt ctatttcatg 780

tgtttttcaa tcatctattt atttacatgt acattcttat gttggttact atgttttttt 840

ttttctattt gtgtgatttt tcattcccct tttgaaagga gccataaaca tttgtagctc 900

aaactgtgtt ctacgcataa cataatcata aattgtaaga ttcccttgga tgggtttagg 960

tcattctcta agtaacctta accattaatc ttatttaatc aaaggatttc ggatctattt 1020

gtactactgt agatctattt gtaataccgc tctataagtt aatggtagta gaaatgtgga 1080

tgagcatcat tattaaaaaa atggtgcggt ggtataatca tcatttagaa gtgactaaac 1140

ccattttctt cttttttttt tgggctttat ctacagaata taagcaatgc cactgcgatg 1200

acctagttcg attcagacgg aaaataaaac ataaatgata aagttacccc aataaattac 1260

taattaaccc ttaataataa atggtttgga ttattttttt attagtataa taatattagt 1320

agagagtacc aggtattttt gacgaacatc ataaaacaat actaccacga aaacaaacgt 1380

gtttaaactt tcaccatcct tattattggt atgactagtt caatcctcta attatagtgc 1440

aaaataaaac gctgtgcctc aatttaataa ttatagctta ccaacaaaaa cggggagtta 1500

atgtcgtacc aacataacct aaatatatgt ggccattctc atagatactc ttagaccata 1560

ctactggatt tttagcatat cgagtattcg attaaaactc tcaatcatgt gtggttaaca 1620

caaacgtgct aggcatgaaa acaccagcac tccatagtcc acagcactga gcacgcgatc 1680

caacaagagc accccaccgc cgcacagaaa atcatcacaa ccatcgaggc tgcagcacat 1740

gtccaggctt tagtgctgca cactccagta ctccatccag cacctaacca tggtcacggc 1800

acaaactcaa cttctctttt tctttgaaga ctcaacccaa cacctgaacc cctccaagac 1860

taaagtccaa caggccaaaa acccacgccc agaaaaagct aaaaccccaa cacggcgcac 1920

actactctcc ttcctctccc caacgtgtca caccacacca cacaacacca ccaccgccgc 1980

catg 1984

<210> 2

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caatttctat tggatttggc actattattc atccatttga aatgatggat tggaacatag 60

taaaaggaga tctctagtat aataatagag gaaaattttc ctttgccatt gattccattg 120

cgataggaac atctactata ttttttcccc ttttctttgc taagattaat gaaactgtac 180

attaaccaaa gttgaggata ttttgaccaa cgaaattttt atcgtcgttt tgtaataatc 240

tcgtgataac tagattccta cggtccaaac tacgcacctt ctatttcatg tgtttttcaa 300

tcatctattt atttacatgt acattcttat gttggttact atgttttttt ttttctattt 360

gtgtgatttt tcattcccct tttgaaagga gccataaaca tttgtagctc aaactgtgtt 420

ctacgcataa cataatcata aattgtaaga ttcccttgga tgggtttagg tcattctcta 480

agtaacctta accattaatc ttatttaatc aaaggatttc ggatctattt gtactactgt 540

agatctattt gtaataccgc tctataagtt aatggtagta gaaatgtgga tgagcatcat 600

tattaaaaaa atggtgcggt ggtataatca tcatttagaa gtgactaaac ccattttctt 660

cttttttttt tgggctttat ctacagaata taagcaatgc cactgcgatg acctagttcg 720

attcagacgg aaaataaaac ataaatgata aagttacccc aataaattac taattaaccc 780

ttaataataa atggtttgga ttattttttt attagtataa taatattagt agagagtacc 840

aggtattttt gacgaacatc ataaaacaat actaccacga aaacaaacgt gtttaaactt 900

tcaccatcct tattattggt atgactagtt caatcctcta attatagtgc aaaataaaac 960

gctgtgcctc aatttaataa ttatagctta ccaacaaaaa cggggagtta atgtcgtacc 1020

aacataacct aaatatatgt ggccattctc atagatactc ttagaccata ctactggatt 1080

tttagcatat cgagtattcg attaaaactc tcaatcatgt gtggttaaca caaacgtgct 1140

aggcatgaaa acaccagcac tccatagtcc acagcactga gcacgcgatc caacaagagc 1200

accccaccgc cgcacagaaa atcatcacaa ccatcgaggc tgcagcacat gtccaggctt 1260

tagtgctgca cactccagta ctccatccag cacctaacca tggtcacggc acaaactcaa 1320

cttctctttt tctttgaaga ctcaacccaa cacctgaacc cctccaagac taaagtccaa 1380

caggccaaaa acccacgccc agaaaaagct aaaaccccaa cacggcgcac actactctcc 1440

ttcctctccc caacgtgtca caccacacca cacaacacca ccaccgccgc catg 1494

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacggccag tgccagtagt tgagctcagg ac 32

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgacggccag tgccacaatt tctattggat ttggcac 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taccctcaga tctaccatgg cggcggtggt ggtgttg 37

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcagttta aagaaagatc aaagctc 27

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcaaggcg attaagttgg gtaac 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttagccaga cgagcgggtt c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcttctgcgg gcgatttgt 19

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctccggctg ttgatct 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcctgctctt cctcctg 17

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaatggcttt ccgtgtt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caaggtcctc ctcaacg 17

Claims

1.水稻多组织表达启动子或含有所述水稻多组织表达启动子的表达盒、载体、微生物细胞或试剂盒在驱动DNA在植物多组织中表达的应用；

所述水稻多组织表达启动子为GMS2P或GMS2P1，其中，GMS2P的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，GMS2P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.水稻多组织表达启动子或含有所述水稻多组织表达启动子的表达盒、载体、微生物细胞或试剂盒在通过驱动DNA在植物多组织中表达制备转基因植物中的应用；

3.水稻多组织表达启动子或含有所述水稻多组织表达启动子的表达盒、载体、微生物细胞或试剂盒在通过驱动DNA在植物多组织中表达进行植物种质资源改良中的应用；

4.在植物多组织中表达目的DNA的方法，其特征在于，包括：向植物中引入可操作地连接于水稻多组织表达启动子的目的DNA；