CN107760681B - 启动子wy195及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于橡胶树白粉菌的启动子及其用途。本发明提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子，所述启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的变体。本发明还涉及含有所述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞、转基因植物、外植体和愈伤组织，本发明还涉及所述启动子用于调控真菌中目的基因表达的用途。所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。

Description

启动子WY195及其用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种来源于橡胶树白粉菌的启动子WY195及其用途。
背景技术
启动子是基因中能与RNA聚合酶和其他转录因子结合，准确起始转录的一段DNA序列，通常位于结构基因5’端上游区。启动子能指导RNA聚合酶与DNA模版正确结合，活化RNA聚合酶，与相应的转录因子形成特异性的转录起始复合体，进而决定转录的方向及效率，是理解转录调控机制和表达模式的关键。可以说，启动子是转录的调控中心。
启动子按照转录模式及功能可以分为四类：组成型启动子、组织器官特异型启动子、诱导型启动子、特殊启动子。组成型启动子就是在所有组织器官和发育阶段都能够启动基因表达的启动子。其调控基因持续表达，且RNA和蛋白质表达量也相对恒定。组织器官特异性启动子调控基因只在叶片、果实及种子、根、维管束、花药花粉等特定的器官或组织部位表达。诱导型启动子是在某些物理或化学信号刺激下调控目的基因转录水平显著提高的启动子。这些诱导信号主要包括激素、非生物逆境胁迫、生物逆境胁迫及其他理化因子。特殊启动子包括双向启动子(Bidirectional promoter)、可变启动子(Alternativepromoter)等比较特殊的启动子。
现今，植物表达载体中应用最广的是组成型启动子，所谓组成型启动子是指在其调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异的启动子。CaMV35S组成型启动子被应用于绝大多数双子叶转基因植物，但在单子叶植物中，CaMV35S启动子的表达显著降低，甚至低至100倍。在单子叶转基因植物中主要使用来自玉米多聚泛素蛋白基因(maizepolyubigene)的Ubiquitin启动子和来自水稻肌动蛋白基因的Actin1启动子。在单子叶转基因植物中Ubiquitin和Actin1启动子编码的外源基因的表达强度大大强于CaMV35S启动子编码的外源基因。双子叶植物中的强启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子及白藜芦醇合酶基因Vst1启动子等陆续被发现并验证，单子叶植物中也有较强的调控作用，但目前也未广泛应用。
组成型启动子在转基因植物乃至整个基因工程中发挥了巨大作用，但是在某些方面也存在一些弊端。其调控的基因在植物中恒定而持续表达，会过度消耗细胞内的能量和物质，且无法在时间和空间方面有效的调控外源基因表达。诱导型启动子和组织器官特异型启动子却能在时间和空间上有效的调控目的基因的表达，很好的弥补了这个缺点，并且在转基因食品的安全方面也有很大的应用价值，于是成为了现阶段启动子研究的热点。但是，组成型启动子在研究未知基因的功能方面如基因的过表达等仍然有巨大的作用。
CaMV35S启动子尽管对基因工程贡献巨大，但也存在一些弊端和非议。有研究证实CaMV35S启动子在细菌、真菌、酵母内具有活性，在人类和哺乳动物细胞中也有发挥作用。导致基因不稳定的可能性及启动潜伏病毒的可能性使得CaMV35S启动子在转基因作物领域备受质疑。
丝状真菌在工业上的应用比较广泛，许多生物产品如抗生素类以及很多商业酶制剂都是以丝状真菌作为宿主生产的。丝状真菌在表达内源基因时表达量常常非常惊人，这无疑是由强大的启动子来调控的，暗示了丝状真菌可能有很好的潜在启动子资源可以开发。但在表达外源基因时，丝状真菌的表达量并不是很突出。因此，需要更多的开发丝状真菌的启动子资源。丝状真菌表达外源基因的诱导型启动子目前主要有里氏木霉cbh1启动子，曲霉属的glaA启动子，构巢曲霉alcA启动子等。组成型启动子主要有gpdA启动子，木霉属pki1启动子等。而在专性寄生菌方面，由于无法进行离体培养，其遗传转化及分子生物学各方面的研究都严重滞后，专性寄生菌的启动子目前未见报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足之处，本研究通过对橡胶树白粉菌基因组的深入研究，提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子WY195，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
启动子WY195，所述启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：
a、SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
b、与SEQ ID NO：1互补的核苷酸序列；
c、能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；
e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
优选的，所述启动子的制备方法包括：以橡胶树白粉菌基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在橡胶树白粉菌基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。
进一步的，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明的启动子，与该启动子可操作连接的基因序列。
进一步的，本发明还涉及一种重组载体，所述载体为本发明的启动子与pGEM-Teasy或PBI121质粒经重组所得。
进一步的，本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体。
优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。
进一步的，本发明还涉及一组引物对，所述引物对的两条引物分别含有SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的序列；所述引物对的两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。
进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本发明的重组细胞。
进一步的，本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本发明的重组细胞。
进一步的，本发明还涉及该启动子或核酸构建体或重组载体或重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种来源于橡胶树白粉菌的新的启动子，所述启动子能够用于调控双子叶植物和单子叶植物中的外源目的基因的表达，为转基因植物的基因表达提供了一种全新的工具和选择。
附图说明：
图1：重组载体PBI121-WY195的质粒图谱
图2：启动子WY195的重组载体PBI121-WY195的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘的GUS染色结果
图中WY195为含重组载体PBI121-WY195的农杆菌转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK+(CaMV35S)为含由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体的农杆菌转化三生烟叶盘的GUS染色结果；CK-(无菌苗)为未转化的三生烟无菌苗叶盘的GUS染色结果。
图3：WY195转基因三生烟各生长时期图
图中由左至右依次为共培养期、愈伤期、侧芽期、生根期、成株期。
图4：WY195调控GUS基因转基因三生烟的PCR扩增检测结果
图中，M:Marker2000；1-5：WY195调控GUS基因转基因三生烟；CK+：转PBI121空载体的转基因三生烟；CK-：野生型三生烟。
图5启动子WY195的重组载体PBI121-WY195的重组根癌农杆菌介导转化的水稻(日本晴)愈伤的GUS染色结果
图中，WY195为含有重组载体PBI121-WY195的农杆菌转化日本晴水稻愈伤的GUS染色结果；CK+(CaMV35S)为含由CaMV35S调控GUS基因转录的PBI121空载体转化日本晴水稻愈伤的GUS染色结果；CK-为未转化的日本晴水稻愈伤的GUS染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例1：WY195启动子片段的PCR扩增
使用真菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA，D3390-01)提取橡胶树白粉菌的基因组DNA，根据WY195启动子的序列，设计一对特异性扩增引物(上游引物WY195F，加限制性酶切位点HindⅢ和保护碱基，下游引物WY195R，加限制性酶切位点BamHⅠ和保护碱基)。以上述提取的橡胶树白粉菌的基因组DNA为模板，使用高保真Ex Taq聚合酶(TRANSGEN,`AP122)进行PCR扩增。如表1所示。
表1基因启动子扩增的PCR体系
Figure GDA0001704449030000051
PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性60s，55℃退火50s，72℃延伸60s，进行35个反应循环，最后72℃延伸5min。
其中，上游引物WY195F：CCCAAGCTTAACCAATAATTTTCACGAGGG，其中下划线代表HindⅢ酶切位点。
下游引物WY195R：CGGGATCCTCTGCATGCTAGTGATTTGTT，其中下划线代表BamHⅠ酶切位点。
PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为260bp左右的条带，使用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：D2500-01)进行纯化回收。
实施例2：pGEM-T easy-WY195重组载体的构建
将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pGEM-T easy质粒，PROMEGA，A1360)转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。
其中，T/A克隆的连接条件如下：
T/A连接体系：10ul
pGEM-T EasyVector(PROMEGA，A137A):1ul
2×Rapid ligation Buffer:5ul
PCR扩增产物(回收插入片段)：2ul
T4DNAligase:1ul
ddH2O:1ul
先置于室温1小时，然后于4℃连接过夜，得到pGEM-T easy-WY195重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：
冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgene,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pGEM-T easy-WY195重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(氨苄青霉素,IPTG,X-gal)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养12h～16h。获得含有pGEM-T easy-WY195克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-WY195。深圳华大基因科技有限公司对pGEM-T easy-WY195克隆载体中的WY195进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。
测序结果表明，获得的pGEM-T easy-WY195克隆载体中WY195启动子序列正确。
实施例3：PBI121-WY195重组载体的构建
将上述构建获得的DH5α-WY195菌株挑取单菌落进行摇菌，37℃220rpm摇菌过夜，用OMEGA质粒小提试剂盒(D6943-01)提取质粒，然后用HindⅢ(NEB,R0104S)和BamHⅠ(NEB,R0136V)限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用OMEGA回收试剂盒(D2500-01)进行回收WY195启动子片段。
将上述得到的回收产物进行T/A克隆(PBI121质粒，TIANNZ，60908-750y)转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。
其中，T/A克隆的连接条件如下：
T/A连接体系：10ul
PBI121Vector:1ul
10×T4DNALigase Buffer:1ul
回收产物(WY195启动子片段)：6ul
T4DNALigase(TaKa Ra，D2011A)：0.5ul
DdH2O:1.5ul
16℃连接过夜，得到PBI121-WY195重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：
冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(Transgen,CD201)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即PBI121-WY195重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴3min，加入600μl 4℃预冷的LB培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃200rpm复苏60min，8000rpm离心30s，去上清，留取200μl，用剩下的200μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃棒涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h～24h。获得含有PBI121-WY195克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-PWY195。深圳华大基因科技有限公司对PBI121-WY195克隆载体中的WY195进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。
测序结果表明，获得的PBI121-WY195克隆载体中WY195启动子序列正确。
实施例4：重组根癌农杆菌LBA4404-WY195细胞的制备
将重组大肠杆菌DH5α-PWY195挑取单菌落在含有50ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中摇菌，37℃200rpm，生长到OD600为0.5左右，与含有协助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101和受体农杆菌LBA4404的感受态细胞等体积混匀，用涂抹棒涂布于不含有任何抗生素固体的LB培养基平板上，28℃培养过夜。用接种针将长出的菌落转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，28℃培养3到4天。将长出的单菌落再次转接到含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的固体LB培养基平板上，挑取单菌落用含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基摇菌，37℃200rpm，以引物对WY195F、WY195R进行菌落PCR验证，同时提取质粒用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶进行双酶切验证。条带为260bp左右的即为重组根癌农杆菌LBA4404-WY195细胞。
实施例5：重组根癌农杆菌介导转化三生烟
1)烟草无菌苗的获得。
烟草种子浸泡：将三生烟种子装入1.5ml离心管(＜50粒/管)，加入1ml ddH2O，用移液枪反复吸打，更换ddH2O，放入4℃冰箱，浸泡2到3天进行春化。
烟草种子消毒：春化好的三生烟种子用移液枪吸出ddH2O，加入1ml 75％的无水乙醇浸泡2min，用移液枪吸出无水乙醇，用ddH2O反复洗3至5次，洗净种子，每次用ddH2O 1ml。然后再用移液枪加入3％的次氯酸钠溶液浸泡种子3min，再用ddH2O洗3至5次，最后用移液枪吸出ddH2O。
接种：用无菌滤纸吸干种子表面的水分，再用吸头将三生烟种子接种于MS固体培养基平板上进行萌发，每皿10-20粒，置于26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养一周，光照强度为2000lx(本发明的所有的光照培养均在此光照强度下进行)。
转接：三生烟长出幼苗后，转入装有新鲜MS固体培养基的组培瓶，每瓶(Φ6cm，H11cm，50ml培养基/瓶)1株烟草小苗，26℃光照培养箱(16h光8h暗)培养3-5周，获得三生烟无菌苗。
2)烟草无菌苗的继代和扩繁
剪除三生烟无菌苗的叶片和根，将茎杆剪为带有腋芽的小段，每段长约2-3cm，用枪镊夹住将其形态学下端垂直插入含有新鲜MS固体培养基的组培瓶内。每瓶接种一个带有腋芽的茎段，26℃光照培养3-5周，此即待转化材料。
3)侵染菌液的制备
将重组根癌农杆菌LBA4404-WY195挑取单菌落转入含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基摇菌，28℃200rpm摇菌过夜。吸取少量菌液转入30倍体积的含有50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的LB液体培养基，相同条件进行复摇。培养至OD600为0.6-0.8左右，即为侵染菌液。
4)侵染
从培养3-5周的无菌三生烟苗上剪取较大的叶片，盛入装有少许ddH2O的无菌培养皿中。用直径约1cm的打孔器将烟草叶片打成叶圆盘，或者用无菌手术刀将烟草叶片切为边长约1cm的近似正方形的叶盘，放入另一个装有少许ddH2O的无菌培养皿中。
用枪镊将烟草叶盘夹出，放入装有适量侵染菌液的无菌50ml离心管中。轻轻摇动离心管，确保农杆菌充分接触到叶盘边缘的伤口，浸泡10-25min，期间不断摇晃几次。捞出烟草叶盘，转移至干燥的无菌滤纸上，吸干菌液。转接到不含任何抗生素，含有1.0mg/L 6-BA和0.1mg/LNAA的MS固体培养基平板中，叶面朝上，每皿接种4-10块叶盘，26℃暗培养2天。
5)筛选
暗培养结束的烟草叶盘转接到含有5—10ug/ml卡那霉素和1.0mg/L 6-BA，0.1mg/LNAA及100ug/ml特美汀的MS固体培养基平板中，26℃光照培养。
培养2-4天后，取没有变白的叶盘进行GUS染色。GUS染色液配方：0.25mM K3Fe(CN)6,0.25mM K4Fe(CN)6,64mM Na2HPO4.12H2O,36mM KH2PO4,10mM Na2EDTA,0.1％TritionX-100,10％CH3OH,2.5mg/ml X-Gluc。
37℃染色过夜后以75％乙醇溶液进行脱色三次，除尽叶绿素，拍照。结果如图2所示，图中左侧经含有启动子WY195的重组载体PBI121-WY195的重组根癌农杆菌介导转化的三生烟叶盘经GUS染色后变蓝，且明显比图中部含空载体PBI121的农杆菌介导转化的三生烟叶盘蓝色部位更大，颜色更深，而图中右侧的阴性对照未转化的三生烟无菌苗叶盘经过GUS染色未有颜色变化。结果显示本发明的WY195启动子在双子叶模式植物三生烟中对GUS基因具有调控作用。
实施例6：转基因烟草中GUS基因的表达
取部分上述实施例5转化过的三生烟叶盘继续光照培养，约两周后继代，约四周后出现丛生芽。
当丛生芽生长到1-2cm时，用灭菌过的手术刀切下，接种到含有5—10ug/ml卡那霉素和100ug/ml特美汀的MS 1/2MS培养基中，每瓶1株。26℃光照培养约2周。取生根状况良好的烟草小苗，在培养箱里打开组培瓶的盖子，炼苗2-3天。
剪除转基因烟草小苗的大部分叶片，小心洗掉根部大部分培养基，移栽到灭过菌的土壤里，进行盆栽。生长约2-3周，取长出的新叶提取DNA进行PCR扩增验证。扩增引物为WY195F、WY195R，扩增产物经1％琼脂糖电泳，结果如图4显示，得到了一条约250bp的条带，与WY195大小一致，转PBI121空载体的阳性对照和三生烟野生型无菌苗则无条带。
实施例7：水稻愈伤组织的诱导和转化
1)水稻种子灭菌
将成熟的日本晴水稻种子手工去壳。加70％乙醇处理1-2min，倒净乙醇，用无菌水冲洗三次。加0.1％HgCl2浸泡15min，用无菌水冲洗三次。晾干，备用。
2)水稻愈伤组织的诱导和继代
将消毒后的含胚米粒接种到N6D培养基上，29℃生化培养箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生。将长出的水稻愈伤组织从种子上剥离，转接到新的N6D培养基上，继代培养。大约每两周继代一次。
3)农杆菌LBA4404-WY195的活化及转化菌液制备
挑选黄白色，干燥的活跃愈伤组织，接种到新的N6D培养基上培养三天。
挑取重组根癌农杆菌LBA44O4-WY195的单菌落，在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml利福平的液体YM/YEP/LB培养基上中，28℃，250rpm/min震荡培养至OD600＝0.8-1.0。
吸取1ml培养好的菌液加入50ml含50ug/ml的卡那霉素和100umol/L的AS的YM/YEP/LB液体培养基中，继续培养至OD600＝0.8-1.0。
4℃，4000rpm/min离心，沉淀菌体，然后用含适量AAM-AS/MS-AS重悬菌液至OD600＝0.5左右，备用。
4)转化
将继代培养的水稻愈伤组织放入灭菌培养皿中，将LBA4404-WY195重悬液倒入培养皿，浸泡水稻愈伤组织15-30min。
将水稻愈伤组织移出放在灭菌滤纸上，滤掉多余液体。
N6-AS共培养基上放一张灭菌滤纸，加1ml含0.1mM AS的AAM培养基。将水稻愈伤组织放到滤纸上，密封培养，28℃暗培养48-60小时。
5)筛选
将受感染的水稻愈伤组织用1％的甘露醇溶液清洗3-4次，然后用无菌水振荡清洗3-4次，直到上清液变澄清。最後用300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的无菌水溶液清洗3-4次。将愈伤组织放在无菌滤纸上，除去多余水分。最後将愈伤组织接种到含有5—10ug/ml的卡那霉素和300mg/L的头孢霉素或者500mg/L的羧苄青霉素的N6-AS培养基上，密封，29℃暗培养，约两周继代一次。
实施例8：日本晴水稻愈伤组织中的GUS基因的表达
将用LBA4404-WY195转化的水稻愈伤组织进行GUS染色。
GUS染色液的配方(1ml)：610μl 0.2M Na2HPO4溶液(pH＝7.0)；390μl 0.2MNaH2PO4溶液和10μl 0.1MX-gluc。
用LBA4404-WY195转化的水稻愈伤组织于37℃浸泡在GUS染色液中，过夜，拍照，结果如图5所示，图中左侧含有重组载体PBI121-WY195的根癌农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤组织GUS染色后变蓝色，且明显比图中部含空载体PBI121的农杆菌介导转化的日本晴水稻愈伤蓝色部位更大，颜色更深，而图中右侧的阴性对照未转化的日本晴水稻愈伤组织经过GUS染色未有颜色变化。结果表明，本发明的WY195启动子对GUS基因的表达具有调控作用。
表2：MS培养基配方
Figure GDA0001704449030000121
Figure GDA0001704449030000131
pH调至5.8，121℃灭菌20min。
表3：N6培养基配方
Figure GDA0001704449030000132
Figure GDA0001704449030000141
pH调至5.2，121℃灭菌20min。
表4：AAM培养基配方
Figure GDA0001704449030000142
Figure GDA0001704449030000151
KOH调pH至5.2，121℃灭菌20min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 启动子WY195及其用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaccaataat tttcacgagg gatgaaattc atgtagaatc taaactgaga ggctcatttt 60
gagagcacaa cttagtgata cagtgagtat agtttgaaac tcgtggctct taagtaaaca 120
agttaagaat tataatattc ctatggtagt gtcaaaccag taacaggctt cgctttttca 180
ttacaaacta ctccactttt tatttagagt gaggccaatc aactgtataa aacaaatcac 240
tagcatgcag a 251
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaccaataat tttcacgagg g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgcatgct agtgatttgt t 21

Claims (6)

1.启动子WY195，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种核酸构建体，其特征在于，其包含权利要求1所述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列。
3.一种重组载体，其特征在于，所述载体为权利要求1所述的启动子与pGEM-T easy或PBI121质粒经重组所得。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求2的核酸构建体或权利要求3的重组载体；所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌农杆菌细胞。
5.一组引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO：2和SEQID NO：3所示。
6.权利要求1所述的启动子、权利要求2所述的核酸构建体、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途；所述植物为三生烟或水稻。
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