KR20070085421A

KR20070085421A - 식물들의 해충들 및 병원균들에 대한 내성을 제공하기 위한방법들 및 물질들

Info

Publication number: KR20070085421A
Application number: KR20077011558A
Authority: KR
Inventors: 찰리스 엘. 니블리트
Original assignee: 벤간자 아이엔씨
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-08-27
Also published as: ZA200702967B; US8772572B2; US8581039B2; EP2336333A1; US20170121732A1; WO2006047495A2; CA2584960A1; BRPI0517462A; US8461416B2; AU2005299492A1; CR9076A; US20110289626A1; EP1807522B1; US9121034B2; JP2008517604A; JP2013116107A; ES2444001T3; US20140130207A1; US20120023618A1; EP1807522A2

Abstract

식물들에게 해충 내성을 제공하는 방법들과 물질들이 제공된다. 식물들은 해충의 생장, 발육, 또는 병원성을 위하여 필수적인 식물 해충의 유전자와 상동인 침묵 컨스트럭트를 갖고서 형질전환된다. 이는 선택된 유전자에 대한 RNAi를 생성하는 식물로 귀결되고, 이는 해충이 섭취시에, 유전자의 침묵과 식물에 해를 끼치는 해충의 능력의 뒤따르는 감소로 귀결된다. 다른 실시예들에서, 식물에 해를 끼치는 해충의 감소된 능력은 해충 후대에게 전달된다. 해충들의 탈병인을 위한 방법들과 물질들이 또한 제공된다.

식물, 해충, 내성, 상동(homology), 침묵(silencing)

Description

식물들의 해충들 및 병원균들에 대한 내성을 제공하기 위한 방법들 및 물질들{Methods and materials for conferring resistance to pests and pathogens of plants}

관련출원들의 상호참조

본 출원은 그들의 전체가 여기에서 참조로서 결합된, 2004년 10월 21일에 제출된 미국가출원번호 60/621,542와 2005년 3월 1일에 제출된 미국가출원번호 60/657,821에 대한 우선권을 주장한다.

식물 해충들(예를 들어, 곰팡이 병원균들, 박테리아, 선충들, 곤충들, 바이러스들 등)은 전세계적, 특히 개발도상국들에서 식량과 섬유의 중대한 손실들을 야기한다. 손실들은 직접 생산 또는 수확전 손실들, 수확후 및 저장 손실들, 식량 품질과 안정성의 저하(예를 들어, 마코톡신들의 생성에 의한)를 포함한다. 식물 해충들로부터의 다른 결과적인 손실들은 심미적, 후각적, 또는 생태학적 성질들에 대하여 가치있는 식물들에서 관찰된다.

식물 해충들은 때때로 화학약품들의 적용(예를 들어, 살균제, 살충제, 선충제거제, 기생충 구제제들), 미소환경의 조작 또는 관리 또는 병원균에 대한 저항성을 위한 유전자들에 의하여 제어될 수 있다.

내성을 위한 "새로운" 유전자의 발견 및 도입은 종종 그 "새로운" 유전자를 포함하는 식물들을 감염시킬 수 있는 병원균의 새로운 종족의 발전 또는 선택을 종종 야기한다. 이는 곡류 작물들의 녹병들 및 깜부기병들에 의하여 가장 잘 나타났지만, 역병균들인 Phytophthora nicotianae와 P. sojae에 의하여 각각 야기되는 담배의 검은 몸통썩음과 콩의 뿌리 및 줄기 썩음과 같은 토양 전염병과 함께 일어난다. P. nicotianae의 적어도 두 종들과 P. sojae의 70종 이상이 있는데, 이들은 질병 내성을 위하여 다른 유전자들 또는 유전자들의 조합을 요구한다.

진균의 속인 Phytophthora는 심각한 식물들의 질병들을 야기하는 매우 파괴적인 병원균들의 많은 종들을 포함한다. 이들은 고사병, 잘록병, 줄기마름병들, 과일썩음, 뿌리썩음, 위조병, 그리고 아보카도(avocado), 카카오, 캐놀라(canola), 감귤류(citrus), 후추, 감자, 콩, 담배, 토마토, 파인, 고무, 오크 나무 등을 포함하는 매우 다양한 음식, 섬유 및 유료작물들(oil crops)에 영향을 미치는 많은 다른 징후들을 포함한다.

과거 수십년 동안, 유전자 침묵화 현상 또는 RNA 또는(RNAi)은 식물들, 진균들, 선충들, 히드라(hydra) 그리고 인간들 만큼이나 다양한 미생물들에서 설명되어 왔고 특징으로 되었다 (Zamore 및 Haley, 2005). 숙주 미생물이 이중가닥 RNA 분자를 침입자로서 인식하여 그것을 가수분해하는 것은 고대의 방어 메카니즘인 것으로 이해된다. 결과적인 가수분해 생성물들은 길이가 21-30 뉴클레오티드들이고, 작은 간섭 RNA들 (siRNAs)로 불리우는 작은 RNA 단편들이다. 이후 siRNA들은 확산하거나 숙주를 통하여 전달되고, 이들은 특정 유전자를 위한 mRNA로 잡종 번식하여 그의 가수분해가 더 많은 siRNA들을 생성하도록 한다. 이 과정은 siRNA가 그와 상동인 mRNA로 잡종번식할때마다 반복되어 mRNA가 번연되는 것을 방지하고 그리하여 그 특정 유전자의 발현을 "침묵화시킨다".

Fire 등(2003)은 RNA를 숙주에게 투여하는 방법을 설명하는데, 여기서 RNA는 숙주 세표의 유전자를 침묵화시키기 위하여 그 숙주 세포의 유전자와 상동인 센스 및 안티센스 서열들로 구성된다. 미국특허번호 6,506,559.

van Wet 등 (1999)에 의한 결과들은 Phytophothora infestans에서 세포핵간 유전자 침묵화를 보여주었다. 그들은 센스 및 안티센스 양 방행들에서 P. infestans를 infl elicitin으로 형질전환되었다. 이는 내재 유전자뿐만 아니라 이식유전자들 양자의 침묵화로 귀결되었다. 침묵된 형질전환종과 와일드-타입종(wild-type strain)의 체세포 융합에 의하여, 그들은 두 가지 필수적인 사항들을 보여주었는데; 첫 번째는 이식유전자 자체의 존재가 침묵된 상태를 유지하기 위하여 필요치 않다는 것이고, 두 번째는 나중에 siRNA들인 것으로 발견된, 핵들 사이에서 침묵화 신호를 전송할 수 있는 해결인자의 참여이다.

Waterhouse 등(WO9953050A1)은 식물 바이러스 유전자쪽으로 향하는 유전자 침묵 컨스트럭트로서 식물을 형질전환하므로써 식물에게 바이러스 저항성을 제공하는 방법들을 설명하였다.

Wang 등(US20030180945A1)은 진균에게 진균의 유전자로 향하는 유전자 침묵 컨스트럭트를 제공하므로써 상기 진균에서 유전자 침묵화의 방법을 설명한다.

이 기술에서 필요한 것은 새롭고 심각하 식물 질병과 같은 생물학적 환경에서의 변화들에 쉽게 적응될 수 있는 식물 저항 방법이다. 예를 들어, 2004년 11월 까지 미국에서는 대두 녹두균(Asian rust in soybean)의 발병은 없었다. 대두 녹두균은 2005-2006년에 십억 내지 7십억 달러(USDA)로 추정되는 손실들을 야기한 것으로 예견된다.

진균들, 곤충들, 선충들, 박테리아들 드으이 스펙트럼에 대항하여 식무에게 저항성을 제공하는 다목적의 유전적 방법이 존재하였다면 이 기술은 또한 실질적으로 진보될 수 있을 것이다.

발명의 요약

본 발명은 식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법과 컨스트럭트들을 제공하는데, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고, 여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중-가닥 영역을 형성할 수 있고;

여기서 상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고;

상기 안티센스 서열은 다른 종들로부터 적어도 두 가지 해충들의 상기 병원성 유전자와 상동이고, 그리하여 상기 식물은 상기 이종의 폴리뉴클레오티드가 부족한 실질적으로 동일한 식물에 비하여 상기 두 가지 해충들에게 저항한다.

또 다흔 실시예에서, 본 발명은 식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법과 컨스트럭트들을 제공하는데, 싱가 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 제1 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 제1 안티센스 서열;

(b) 제2 해충 병원성 유전자와 상동을 갖는 제2 안티센스 서열;

(c) 상기 제1 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 제1 센스 서열; 그리고

(d) 상기 제2 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 제2 센스 서열을 포함하고,

여기서 상기 이종의 폴리뉴클레오티드의 트랜스트립트는 교잡하여 상기 제1 안티센스 서열과 상기 제1 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고,

여기서 상기 이종의 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 제2 안티센스 서열과 사익 제2 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고,

여기서 상기 제1, 제2 센스 서열들 및 상기 제1, 제2 안티센스 서열들은 가가 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이다.

따라서, 이제 식물은 곤충들, 박테리아들, 진균들, 식물들, 그리고 선충들로 구성되는 그룹으로부터 선택된 동일하거나 다른 맴버들에 속하는 다수의 해충들에 대한 저항성을 가질 수 있게 된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법과 컨스트럭트들을 제공하는데, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 해충 병원균 유전자와 상동이고 종결자에 구동적으로 연결되는 안티센스 서열에 구동적으로 연결된 제1 프로모터;

(b) 상기 안티센스 서열에 대하여 실질적으로 상보적이고 종결자에 구동적으로 연결되는 센스 서열에 구동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하고,

여기서 상기 제2 프로모터는 상기 제1 프로모터에 비하여 강한 프로모터이고,

여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 서열들 사이에서 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고;

여기서 상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법과 컨스트럭트들을 제공하는데, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

여기서 상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

여기서 상기 해충은 곤충들, 박테리아들, 진균들, 그리고 선충들로 구성되는 그룹으로부터 선택되고,

여기서 상기 병원균 유전자와 상기 해충은 여기서 교시된 것들로부터 선택된다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 본 가르침을 통한 예로서 사용되고, pVZA100, pVZA200, pVZA300, 그리고 pVZA400의 골격인 pCAMBIA1201 식물 형질전환 플라스미드(plasmid)의 유전자 지도이다.

도 2는 중간 플라스미드 pVZA1에서 인서트의 도면이다.

도 3은 플라시미드 pVZA3에서 복제되어 pCAMBIA1201로 전사할 준비가 된 pVZA100 침묵 카세트이다.

도 4는 유전자 도입 담배와 유전자 도입 Phytophthora nicotianae로부터 분리된 siRNA들을 보여주는 자가방사선상들(autoradiograms)이다. 도 4A와 4B는 각각 와일드 타입과 유전자 도입 담배 식물들 및 P.nicotianae로부터 siRNA들로의 큐티나아제(cutinase) 유전자 프로브(probe)의 교잡의 결과들을 보여준다.

도 5는 온실에서 Peronospora tabacina에 의하여 야기된 담배의 푸른 곰팡이 병의 자연적 만연에 대한 식물 반응들을 보여준다.

도 6은 유전자 도입 콩 배아들로부터 나오는 싹을 보여준다.

도 7은 pVZA100으로 형질전환된 콩의 결과들을 보여준다. 도 7A는 형질전환된 옥수수의 캘러스들(calli)을 보여준다. 도 7B는 형질전환된 콩 캘러스에서 검출된 GUS와 하이그로마이신 포스포트란스페라아제(hygromycin phosphotransferase) 유전자들을 보여준다.

도 8은 pVAZ100으로 형질전환된 감자 세포들의 배양 판들에서 생성된 뿌리들과 씨감자들을 보여준다.

도 9는 콘들의 심각한 질병들을 야기하는 세 가지 균의 종들에서 필수적인 유전자들을 침묵화시킬 수 있는 폴리시스트로닉(polycistronic) 유전자 침묵 컨스트럭트를 보여준다.

도 10은 rDNA를 기본으로 하고 Phytophthora와 Phakopsora 양 종들에서 이들 필수적인 유전자들을 침묵화시킬 수 있는 유전자 침묵 컨스트럭트들을 보여준다.

도 11은 Phytophthora nicotianae에 감염되기 쉬운 와일드 타입 담배 식물(A)과 Phytophthora nicotianae에 저항성이 있는 ppVAZ100 유전자 도입 담배 식물(B)를 각각 보여준다.

도 12는 유전자 도입 담배 식물(3)로부터 그리고 침묵된 유전자 도입 담배 식물(4)에서 성장하는 Phytophthora nicotianae로부터 분리된 siRNA들을 보여주는 자가방사선상이다.

도 13은 Phytophthora sojae에 저항성이 있는 유전자 도입 콩 식물들을 보여준다.

도 14는 유전자 도입 Phytophthora nicotianae와 Phytophthora sojae의 성장과 발육에 대한 pVZA300과 pVZA400의 효과들을 보여준다.

[서열들의 간단한 설명]

SEQ ID NO : 1은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 1F이다.

SEQ ID NO : 2는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 2R이다.

SEQ ID NO : 3은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 3F이다.

SEQ ID NO : 4는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 4R이다.

SEQ ID NO : 5는 본 발명에 따라서 사용된 침묵 컨스트럭트 pVZA100이다.

SEQ ID NO : 6은 본 발명에 따라서 사용된 침묵 컨스트럭트 pVZA200이다.

SEQ ID NO : 7은 본 발명에 따라서 사용된 침묵 컨스트럭트 pVZA300이다.

SEQ ID NO : 8은 본 발명에 따라서 사용된 침묵 컨스트럭트 pVZA400이다.

SEQ ID NO : 9는 본 발명에 따라서 사용된 forward PCR primer GUS이다.

SEQ ID NO : 10은 본 발명에 따라서 사용된 reverse PCR primer GUS이다.

SEQ ID NO : 11은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer pVZA100과 하이그로마이신 포스포트라스페라아제(hygromycin phosphotrasferase)이다.

SEQ ID NO : 12는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer pVZA100과 하이그로마이신 포스포트라스페라아제(hygromycin phosphotrasferase)이다.

SEQ ID NO : 13은 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 1 65R이다.

SEQ ID NO : 14는 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 2 69F이다.

SEQ ID NO : 15는 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 3 73F이다.

SEQ ID NO : 16은 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 3 73F이다.

SEQ ID NO : 17은 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 1 65이다.

SEQ ID NO : 18은 본 발명에 따라서 사용될 때 primer VZA 6 70F이다.

SEQ ID NO : 19는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 7 72F이다.

SEQ ID NO : 20은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 8 79F이다.

SEQ ID NO : 21은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 9 84F이다.

SEQ ID NO : 22는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 10 87F이다.

SEQ ID NO : 23은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 11 89F이다.

SEQ ID NO : 24는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 12 90F이다.

SEQ ID NO : 25는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 13 91F이다.

SEQ ID NO : 26은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 14 81F이다.

SEQ ID NO : 27은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 15 82F이다.

SEQ ID NO : 28은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 6 83F이다.

SEQ ID NO : 29는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 17 85F이다.

SEQ ID NO : 30은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 18 86F이다.

SEQ ID NO : 31은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 19 64R이다.

SEQ ID NO : 32는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 20 77F이다.

SEQ ID NO : 33은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 21 63F이다.

SEQ ID NO : 34는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 22 66R이다.

SEQ ID NO : 35는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 23 80F이다.

SEQ ID NO : 36은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR VZA 24 92F이다.

SEQ ID NO : 37은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 25 93F이다.

SEQ ID NO : 38은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer VZA 2R이다.

SEQ ID NO : 39는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer cathepsin이다.

SEQ ID NO : 40은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer elicitin이다.

SEQ ID NO : 41은 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer rDNA FP이다.

SEQ ID NO : 42는 본 발명에 따라서 사용될 때 PCR primer rDNA RP이다.

SEQ ID NO : 43은 본 발명에 따라서 사용될 때 표지 Phialophora gregata 리보솜의 RNA 유전자 (rDNA)이다.

SEQ ID NO : 44는 본 발명에 따라서 사용될 때 유전자형 BDNA 표지 Phialophora gregata 리보솜의 RNA 유전자 (rDNA)이다.

SEQ ID NO : 45는 본 발명에 따라서 사용될 때 RNA를 위한 폴리머라제 II 아단위 Sclerotinia sclerotiorum 부분 rpb2 유전자이다.

SEQ ID NO : 46은 본 발명에 따라서 사용될 때 리보솜의 RNA 유전자 Puccinia hordei 18S이다.

SEQ ID NO : 47은 본 발명에 따라서 사용될 때 hexose transporter (hxt2) 유전자 Sclerotinia sclerotiorum이다.

SEQ ID NO : 48은 본 발명에 따라서 사용될 때 Fusarium solani pisi 큐티나아제(cutinase) mRNA이다.

SEQ ID NO : 49는 본 발명에 따라서 사용될 때 Phytophthora nicotianae의 지놈 또는 보존된 단백질 모티프이다.

SEQ ID NO : 50은 본 발명에 따라서 사용될 때 Phakopsora pachyrhizi 지놈에서 발견되는 리보솜의 DNA 서열이다.

SEQ ID NO : 51은 본 발명에 따라서 사용될 때 Fusarium sambucinum 번역 신장 인자 1 알파이다.

SEQ ID NO : 52는 본 발명에 따라서 사용될 때 Phytophthora infestans 지놈에서 발견되는 elicitin 유전자 서열이다.

SEQ ID NO : 53은 본 발명에 따라서 사용될 때 RNA 폴리머라제 II 아단위 Sclerotinia sclerotiorum을 위한 부분 rpb2 유전자이다.

SEQ ID NO : 54는 본 발명에 따라서 사용될 때 rRNA Stenocarpella maydis이다.

SEQ ID NO : 55는 본 발명에 따라서 사용될 때 Cercospora zeae-maydis Group II로부터의 18S 리보솜의 RNA이다.

SEQ ID NO : 56은 본 발명에 따라서 사용될 때 Myzus persicae로부터의 Cathepsin B 프로테아제(protease)이다.

SEQ ID NO : 57은 본 발명에 따라서 사용될 때 Leptinotarsa decemlineata로부터의 cysteine 프로테아제이다.

SEQ ID NO : 58은 본 발명에 따라서 사용될 때 Verticillium dahliae rDNA이다.

SEQ ID NO : 59는 본 발명에 따라서 사용될 때 JPeronospora berteroae 지놈에서 발견되는 5.8S 리보솜의 RNA의 부분 서열이다.

SEQ ID NO : 60은 본 발명에 따라서 사용될 때 cytochrome oxidase Meloidogyne chitwoodi의 지놈 아단위이다.

SEQ ID NO : 61은 본 발명에 따라서 사용될 때 리보솜의 RNA P. scribneri이다.

SEQ ID NO : 62는 본 발명에 따라서 사용될 때 리보솜의 RNA Heterodera glycines이다.

SEQ ID NO : 63은 본 발명에 따라서 사용될 때 RNA 폴리머라제 II 서열 Magnaporthe grisea이다.

SEQ ID NO : 64는 본 발명에 따라서 사용될 때 rRNA Puccinia hordei 18S이다.

SEQ ID NO : 65는 본 발명에 따라서 사용될 때 부분 서열 5.8S 리보솜의 RNA Pseudoperonospora humuli이다.

SEQ ID NO : 66은 본 발명에 따라서 사용될 때 Botrytis cinerea cytochrome P450 monoxygenase이다.

SEQ ID NO : 67은 본 발명에 따라서 사용될 때 rRNA Pseudomonas syingae이다.

SEQ ID NO : 68은 본 발명에 따라서 사용될 때 Clavibacter michiganense michiganense CeI A 유전자이다.

SEQ ID NO : 69는 본 발명에 따라서 사용될 때 Clavibacter michiganense endo B-glucosidase이다.

정의들

여기에서 사용된 것으로서, 다음의 정의들이 적용된다:

세포 (또는 숙주 식물 세포)는 세포 또는 식물 세포의 원형질체를 의미하고, 분리된 세포들 그리고 전체 식물, 식물 조직 내의 세포들, 또는 식물의 단편을 포함한다. 세포는 또한 분리되지 않은 세포들을 포함한다.

이중 가닥 영역은 폴리뉴클레오티드의 영역을 의미하는데, 여기서 상기 뉴클레오티드들은 서로 수소 결합할 수 있다. 그러한 수소 결합은 분자내 또는 분자사이(예를 들어, 소위 헤어핀을 갖는 이중가닥 영역을 형성하는 단일 전사 단위 또는 수소 결합에 대하여 상보적 서열들을 위하여 적합하게 정렬하는 두 개의 전사 단위들)에서 일어날 수 있따. 이중가닥이기 위해서는, 본 발명에 따르면, 뉴클레오티드들의 100%가 상보적이고 소정 역역 내에서 수소 결합될 필요는 없다. 단지 충분한 염기쌍 RNA에게 실질적인 이중가닥 캐릭터(예를 들어, 지시 용융점)를 제공하는 일이 생기는 것이 필요하다.

외인성 유전자는 주어진 숙주 지놈에 현재의 형태로 정상적으로 제공받지 않은 유전자이다. 이러한 면에서, 유전자 자체는 숙주 지놈에 대하여 선천적일 수 있지만, 외인성 유전자는 하나 이상의 다른 조절 요소들 또는 추가적인 유전자들의 첨가 또는 제거에 의하여 변경된 선천적 유전자를 포함할 것이다.

유전자 혹은 유전자들은 전체 RNA, 전체 단백질, 또는 원하는 특성을 소유하기 위하여 충분한 그러한 전체 RNA 또는 전체 단백질의 임의의 기능적 부분의 합성을 위한 유전적 정보를 암호화하는 (RNA 또는 DNA 양자를 포함하는) 핵산 서열들을 의미한다.

이종의 폴리뉴클레오티드는 형질전환되지 않은 숙주 식물에서 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 어떤 폴리뉴클레오티드는 내인성의 폴리뉴클레오티드 서열들의 존재에 의하여 이종의 폴리뉴클레오티드인 것으로부터 배제되지 않는다.

안티센스 서열과 해충 병원균 유전자(즉, RNA 폴리머라제를 결합하고 안티센스 가닥인 해충 병원균 유전자 mRNA의 전사를 지시하는) 사이의 관계의 문맥에서 "상동의"라는 용어는 생체내, 생체외의 혼성교배, 그리고/또는 상기 안티센스 서열과 상기 해충 병원성 유전자 mRNA 사이의 엄중함이 약한 조건들 하에서 생체외 혼성교배를 허용하는데 충분한 서열 유사성을 갖는 것을 의미한다.

숙주 식물 세포 내성은 상기 컨스트럭트로서 형질전환되지 않은 숙주 식물 세포와 비교할 때 식물이 해로운 효과들에 영향을 덜 받기 쉽다는 것을 의미한다.

유전자 발현의 억제는 표적 유전자로부터 단백질 및/또는 mRNA 생성물 수치의 감소를 의미한다. 억제의 결과들은 (예들에서 아래의 제공되는 것처럼) 세포 또는 유기체의 외면적인 성질들의 조사에 의하여 또는 RNA 솔류션 하이브리다이제이션(solution hybridization), 뉴클레아제 프로텍션(nulease protection), 노던 하이브리다이제이션(Nothern hybridization), 폴리머라제 사슬 반응(polymerase chain reation, PCR), 역전사(reverse transcription, RT), 역전사 PCR (RT/PCR), 마이크로어레이로서 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting), radioimmunoassay (RIA), 기타 면역학적 검사들, 그리고 형광 활성된 세포 분석 (FACS)과 같은 생화학적 기술에 의하여 확인될 수 있다.

표지(marker) 유전자는 상기 표지 유전자를 발현하는 세포에게 눈에 띄는 표현형을 나누어주는 유전자를 의미하지만 그리하여 변형된 세포들이 상기 유전자를 함유하지 않은 세포들과 구분될 수 있도록 한다.

"구동적으로 연결된(operably linked)"란 용어는 프로모터로부터 시작될 전사를 위하여 적절하게 위치되고 배향된 동일한 핵산 분자의 일부로서 결합되는 것을 의미한다.

해충 병원성 유전자는 숙주 식물에 대하여 그러한 해충의 유해한 효과들에서 어떤 역할을 하는 임의의 해충 유전자를 의미한다. 유해한 효과들이란 것은, 예를 들어, 식물 성장(식물의 숙자들 그리고/또는 크리), 발육, 질, 그리고/또는 재생에 대한 부정적인 효과를 의미한다. 단지 예로서, 해충 병원성 유전자는 해충 성장, 발육, 복제 및/또는 재생 중 어느 하나, 또는 해충 침해 또는 숙주 식물의 감염에서 어떤 역할을 수행하는 것을 말한다.

"병원성의"란 용어는, 해충을 참고하면, 식물에 대하여 해로운 효과들을 야기하는 해충의 능력을 의미한다. 병원성은 임의의 해충 병원성 유전자들에 의하여 증진된다.

식물 해충은 식물 성장(식물의 수 그리고/또는 크기), 발육, 질, 수확율, 그리고/또는 재생에 해로운 살아있는 유기체를 의미한다.

질(quality)은 바람직한 것으로 여겨질 수 있는 식물의 어떤 측면을 의미한다. 비제한적인 예에 의하여, 질은 식물의 외형, 수확, 향, 영양가, 방향, 또는 콘텐트를 말할 수 있다.

"실질적으로 상보적인"이란 용어는, 센스 및 안티센스 서열들에 대하여, 이중가닥 분자의 형성을 허용하기 위하여 충분히 상보적이라는 것을 의미한다.

형질전환(transformation)은 외인성의 DNA 서열(예를 들어, 벡터, 재조합 DNA 분자)을 세포 또는 프로토플라스트(protoplast)로 도입하는 과정을 의미하고, 여기서 상기 외인성의 DNA는 염색체에게로 결합되거나 이종 RNA가 전사되는 그러한 식으로 자가복제될 수 있다.

전사체(transcript)는 DNA에 의하여 암호화된 RJNA를 의미한다. 본 발명의 센스 및 안티센스 전사들의 문맥에서, 그러한 센스 및 안티센스 전사체들은 동일한 폴리뉴클레오티드의 일부일 수 있거나 그들은 2개의 분리된 폴리뉴클레오티드들(즉, 각각이 자신의 5'와 3' 말단을 갖는)일 수 있다.

"식물 해충을 처리하는"이란 용어는 식물에 대한 식물 해충의 해로운 효과들을 감소, 제거, 뒤바꾸거나, 혹은 예방하는 방법을 의미한다.

벡터(vector)는 숙주 세포에서 복제할 수 있는 D]SfA 분자 그리고/또는 다른 DNA 절편이 부착된 절편의 복제를 일으키도록 구동적으로 연결될 수 있는 D]SfA 분자를 의미한다. 플라스미드는 예시적인 벡터이다.

아래에 있는 본 발명의 다양한 실시예들은 이종의 폴리뉴클레오티드로서 숙주 식물을 형질전환하므로써 해충 저항성을 제공하는 식물을 다루고 있는데, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 해충 병원성 유전자와 상동을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고, 여기서 상기 센스 및 안티센스 서열은 서로에게 교잡하여 이중가닥 영역을 형성할 수 있고, 안티센스 서열들 각각은 길이가 적어도 약 19 뉴클레오티드들이다.

이론에 억매이지 않고서, 본 발명에 따라서 형질전환된 식물들은 해충 병원성 유전자와 상동이자 상보적인 영역으로서 RNA 분자(들)을 전사하고, 여기서 상기 전사(들)는 이중가닥 RNA (dsRNA) 분자를 형성한다. 상기 식물은 dsRNA를 잠재적인 외부 물질(예를 들어, 바이러스 기원의 물질)로서 인식한다. 식물의 다이서(dicer) 효소는 이중가닥 RNA를 작은 간섭 RNA들(siRNA들)이라고 불리우는 길이가 약 23 뉴클레오티드들로 된 단일가닥 RNA의 조각들로 자른다. 이들 siRNA들은 식물 세포들의 소화(예를 들어, cutin)를 통하여 식물에 들어간 해충들을 침범하므로써 소모된다. 일단 흡수되면, 상기 siRNA들은 해충의 RNA-유도 침묵화 복합체들(RISC)에게로 결합될 수 있다. RISC 복합체는 이후 식물에 해를 끼치는 해충의 능력을 제한하는 해충의 상동 유전자의 mRNA를 소화할 수 있다.

일 실시예에서, 해충 저항성은 이종의 뉴클레오티드로서 숙주 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하여, 식물에게 제공되고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들 각각은 길이가 적어도 약 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 큐티나아제들, 키나아제들, 리보솜 RNA들, 어드히신들, 엘리시틴들, 및 G-단백질로 구성되는 그룹들로부터 선택되고; 그리고

일 실시예에서, 해충 저항성은 이종의 폴리뉴클레오티드로서 숙주 식불 세포를 형질전환하는 단계를 포함하여, 식물에게 제공되고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는,

(b) 상기 안틴센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 센스 및 안티 센스 서열은 각각 길이가 적어도 약 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 키나아제들(kinases), 리보솜 RNA들, G-단백질 들, 탈피 인자들(moulting factors), 세린 프로테아제들(serin proteases), 시스타인 프로테아제들(cysteine proteases), 그리고 유충 호르몬 에스테라제들(juvenile hormone esterases)로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

여기서 상기 해충은 곤충이다.

일 실시예에서, 해충 저항성은 이종의 폴리뉴클레오티드로서 숙주 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하여, 식물에게 제공되고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는,

여기서 상기 해충 병원성 유전자는 키나아제들, 리보솜의 RNA들, G-단백질들, 큐티클 콜라겐 단백질들(cuticle collagen proteins), 그리고 카텝신 프로테아제들(cathepsin proteases)로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

여기서 상기 해충은 선충이다.

일 실시예에서, 해충 저항성은 이종의 폴리뉴클레오티드로서 숙주 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하여, 식물에게 제공되고, 상기 이종의 폴리뉴클레오 티드는,

여기서 상기 해충 병원성 유전자는

여기서 상기 해충 병원성 유전자는 큐티나아제들(cutinases), 조직해리효소들(macerating enzymes), 키나아제들, 리보솜의 RNA들, 어드헤신들(adhesins), 그리고 G-단백질들로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

여기서 상기 해충은 박테리아이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 콩이고, 상기 해충은 Fusarium solani (예를 들어, 급사), Sclerotinia sclerotiorum (예를 들어, 하얀 곰팡이), Phialophora gregata (예를 들어, 갈색 줄기 썩음병), Phakospora pachyrhizi (예를 들어, 대두 녹두균) 및 Phytophthora sojae (예를 들어, 뿌리 및 줄기 썩음병)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 하나의 멤버이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 십자화과 식물(cruciferous plant)이고, 상기 해충은 Alvcbgo (예를 들어, 흰녹가루병)이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 담배이고 상기 해충은 Phytophthora (예를 들어, 줄기 썩음, 뿌리 썩음)이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 감자이고 상기 해충은 Phytophthora (예를 들어, 역병)이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 브로콜리이고 상기 해충은 Pythum (예를 들어, 잘록병)이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 완두콩 및/또는 사탕수수이고 상기 해충은 Aphanomyces (예를 들어, 뿌리 썩음)이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 담배이고 상기 해충은 Peronospora (예를 들어, 푸른 곰팡이병)이다.

또한 본 발명에 따르는 해충에서 유전자 침묵화는 해충의 후대-형질전환된 숙주 식물과 결코 접촉되지 않은-에게 제공될 수 있다는 것이 발견되었다.

일실시예에서, 본 발명은 형질전환된 숙주 식물 세포와 함께 해충을 배양하는 단계를 더 포함한다.

일실시예에서, 본 발명의 형질전환된 숙주 식물 세포는 해충과 함께 공동배양된다.

선택적으로, 해충의 후대는 상기 형질전환된 숙주 식물 세포 이외의 식물 세포에 대하여 병원성이 덜하다.

일실시예에서, 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포로부터 재발생된 식물은 해충과 함께 오염된 토양에서 배양된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포로부터 재발생된 식물은 해충으로 오염될 위험에 있는 토양에서 배양된다.

또 다른 실시예에서, 해충은 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포로부터 재발생된 식물로서 공동배양되고, 이후 해충으로 오염된 토양에서 배양된다.

또 다른 실시예에서, 해충은 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포로부터 재발생된 식물로서 공동배양되고, 이후 해충으로 오염될 위험에 있는 토양에서 배양된다.

일실시예에서, 해충은 형질전환된 식물과 함께 공동배양되고 이후 해충으로 오염될 위험에 있는 토양에서 배양된다.

해충 병원성 유전자 상동

본 발명에 따르는 유전자 침묵화는 놀라울정도로 광범위한 해충들에 대한 저항성을 제공할 수 있고 센스 서열의 영역과 해충 감염 유전자 사이의 정확한 동일성이 효과적이도록 본 발명을 위하여 요구되지 않는다는 것이 추가로 발견되었다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 해충 병원성 유전자는 크로스(cross)-내성을 제공하는 유전자이다. 그러한 해충 유전자는 사용시 식물이 해충 문(phylum)의 다수의 멤버들에 대하여 저항성(크로스-저항성)이 있게 되도록 해충 문 내에 보존된다. 더욱이, 해충 병원성 유전자들은 종을 뛰어넘는(cross-species), 속을 뛰어넘는(cross-genus), 과를 뛰어넘는(cross-family), 또는 질서를 뛰어넘는(cross-order) 저항성인 크로스-저항성을 제공하는 것으로 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진 것처럼 바이오인포매틱(bioinformatic) 상사 분석에 의하여 본 발명에 따라서 선택될 수 있다. 예를 들어, 여기에 있는 예들로부터 명백하게 되는 것으로서, 큐티나아제 유전자는 다수의 균류 종에 대한 저항성을 제공하기 위하여 식물들에서 유용하다. rDNA를 위한 유전자는 본 발명의 해충들(즉, 곤충들, 박테리아들, 진균들, 그리고 선충들)에서 유용하다. 그러한 보존된 유전자들의 다른 비제한적인 예들은 키나아제들, 어드헤션들, G-단백질들, 엘리시틴들(elicitins), 조직해리 효소들, DNA 그리고 RNA 폴리머라제들, 신장 인자들, 탈피 인자들, 세린 프로테아제들, 시스타인 프로테아제들, 유충 호르몬 에스테라제들, 큐티클 콜라겐 단백질들, 그리고 카텝신 프로테아제들 그리고 아래에서 주장된 것들이다. 또 다른 실시예에서, 해충 병원성 유전자는 식물 유전자와의 충분한 상동을 부족하게 하여 숙주 식물에 대한 이종의 폴리뉴클레오티드의 해로운 효과들을 야기하기 위하여 선택된다 (예를 들어, 식물 유전자의 침묵화를 방지하는 것). 예를 들어, 일 실시예에서, 상기 안티센스 서열과 상기 해충 병원성 유전자 사이의 상동은 약 70% 미만이다.

일실시예에서, 상기 안티센스 서열은 적어도 약 70% 만큼 상기 해충 병원성 유전자와 상동이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 75%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 80%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 85%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 90%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 95%이다.

일실시예에서, 상기 안티센스 서열의 전사는 적어도 약 70% 만큼 상기 해충 병원성 유전자(예를 들어, 해충 병원성 유전자 mRNA)의 전사와 상동이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 75%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 80%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 85%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 90%이다.

선택적으로, 상기 상동은 적어도 약 95%이다.

상기에서 언급된 상동은 적어도 약 20 뉴클레오티드들, 또는 적어도 약 25 뉴클레오티드들, 또는 적어도 약 50 뉴클레오티드들, 또는 적어도 약 100 뉴클레오티드들의 스트레치(stretch)를 넘어서 선택적으로 연장될 수 있다.

선택적으로, 상동은 상기 안티센스 서열과 상기 해충 병원균 유전자(즉, RNA 폴리머라제를 결합하고 해충 병원성 유전자 mRNA의 전사를 지시하는 DNA 가닥) 사이에서 적어도 3가지 방법들 중 하나로 표시될 수 있다.

(1) 안티센스 서열과 상기 해충 유전자 센스 가닥의 대응 영역 사이의 교잡.

(2) 안티센스 전사와 상기 해충 병원성 유전자의 대응 영역 사이의 교잡.

(3) 안티센스 서열에 상보적인 DNA(즉, 안티센스 cDNA)의 전사와 해충 병원성 유전자 mRNA의 대응 영역 사이의 교잡.

여기에서 주장된 것으로서, 교잡은 낮은 엄격성의 조건들 하에서 표시될 수 있다. 선택적으로, 상기 조건들은, 예를 들어, Keller, G.H., M.M. Manak (1 987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, pp. 169-170에서 설명된 것처럼, 이 기술에서 잘 알려진 기술들에 의한 중간부터 높은정도까지의 엄격성의 조건들이다.

중간부터 높은정도까지의 엄격성 조건들의 예들은 여기에서 제공된다. 구체적으로, 32P-라벨로 된 유전자-특정 프로브들을 가진 Northern blots 위에 고정된 DNA의 교잡은 표준 방법들을 이용하여 수행된다 (Maniatis 등). 일반적으로, 교잡과 후속의 세정들은 여기에서 예시된 서열들과 상동을 갖는 표적 서열들의 검출을 허용한 중간 내지 높은 정도의 엄격성 조건들 하에서 수행된다. 이중가닥으로 된 DNA 유전자 프로브들의 경우, 교잡은 6X SSPE, 5X Denhardt의 용액, 0.1% SDS, 0.1 mg/ml denatured DNA에서 DNA 하이브리드의 융점(Tm)미만인 20-25 ℃에서 밤새 수행되었다. 상기 융점은 Beltz 등 (1983)으로부터의 다음의 식에 의하여 설명된다: Tm = 81.5 ℃ + 16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(% formamide)- 600/염기쌍에서 듀플렉스의 길이.

세정은 다음과 같이 전형적으로 수행된다:

(1) IX SSPE, 0.1% SDS에서 15분 동안 상온에서 2회 (낮은 엄격함 세정).

(2) 0.2X SSPE, 0.1% SDS에서 15분 동안 Tm-20 ℃에서 1회 (보통의 엄격함 세정).

올리고뉴클레오티드 프로브들의 경우, 교잡은 6X SSPE, 5X Denhardt의 용액, 0.1% SDS, 0.1 mg/ml denatured DNA에서 하이브리드의 융점(Tm) 미만의 10-20 ℃에서 밤새 수행되었다. 올리뉴클레오티드 프로브들을 위한 Tm은 Suggs 등 (1981)으로부터의 다음의 식에 의하여 판단되었다: Tm (℃) = 2(number T/A 염기쌍들) + 4(numbeτ G/C 염기쌍들).

세정은 다음과 같이 전형적으로 수행된다:

(2) IX SSPE, 0.1% SDS에서 15분 동안 교잡온도에서 1회 (보통의 엄격함 세정).

일반적으로, 염(salt) 및/또는 온도는 엄격함을 변경하기 위하여 변화될 수 있다. 길이가 약 70 정도의 염기들보다 더 큰 라벨이 붙은 DNA 절편을 갖고서, 다음의 조건들이 사용될 수 있다:

낮음: 1 또는 2X SSPE, 상온

낮음: 1 또는 2X SSPE, 42℃

보통: 0.2X 또는 IX SSPE, 65℃ High: 0.1 X SSPE, 65℃.

듀플렉스 형성 및 안정성은 하이브리드의 두 가닥들 사이의 실질적인 상보성에 의존하고, 위에서 언급된 것처럼, 소정의 미스매치는 허용될 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 유용한 폴리뉴클레오티드 서열들은 설명된 서열들에서의 돌연변이들 (단일 및 다수 양측), 삭제들, 그리고 삽입들, 그리고 이들의 조합들을 포함하고, 여기서 상기 돌연변이들, 삽입들, 그리고 삭제들은 관심있는 표적 뉴클레오티드를 갖는 안정한 하이브리드들의 형성을 허용한다. 돌연변이들, 삽입들, 그리고 삭제들은 이 기술에서 알려진 표준 방법들을 이용하여 주어진 폴리뉴클레오티드 서열에서 생성될 수 있다. 다른 방법들이 미래에 알려질 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열들의 돌연변이의, 삽입의, 그리고 삭제의 변수들은 원래의 서열과 실질적인 서열 유사성을 갖기만 한다면 예시된 폴리뉴클레 오티드 서열들과 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 여기에서 사용된 것처럼, 실질적인 서열 유사성은 이형 폴리뉴클레오티드가 원래의 서열과 동일한 캐패시티로 기능하도록 하기에 충분한 뉴클레오티드 유사성의 정도를 말한다. 바람직하게는, 이 유사성은 75% 이상; 더 바람직하게는, 이 유사성은 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 95% 이상이다. 상기 이형이 그의 의도된 커패시티로 기능하기 위하여 필요한 유사성의 정도는 서열의 의도된 사용에 의존할 것이다. 서열의 기능을 개선하거나 그렇지 않으면 방법론적인 장점을 제공하기 위하여 고안된 돌연변이의, 삽입의, 그리고 삭제의 돌연변이들을 만드는 것은 이 기술에서 훈련도니 사람의 기술 내에 있다.

벡터들

이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들은 (naked DNA를 기본으로 하는 것들을 포함하는) 본 발명의 벡터들을 잘 구축할 수 있고 재조합 유전자 발현을 위한 프로토콜들을 잘 설계할 수 있다. 더 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어, 핵산 컨스트럭트들의 제조, 돌연변이생성, 서열화, DNA를 세포들과 유전자 발현으로 도입하는 것, 그리고 단백질들의 분석에서 핵산의 조작을 위한 그러한 적용가능한 기술들과 프로토콜들은 Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, 1992에서 상세히 설명되어 있다.

식물들에 대한 넓은 성공을 갖고서 이전에 사용된 특정 절차들과 벡터들은 Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711-8721), 그리고 Guerineau and Mullineaux, (1993), Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed). Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148.

본 발명에 따르는 벡터들은 실질적으로 순수하거나 균질한 형태, 또는 다른 핵산이 없거나 실질적으로 없이 분리되고 그리고/또는 정제되어 (예를 들어, 그들의 천연 환경으로부터) 제공될 수도 있다. 본 발명에 따르는 핵산은 전체 또는 부분적으로 합성일 수 있다.

숙주 식물들

본 발명은, 이들에 제한되지는 않지만, 옥수수 (Zea mays), 캐놀라 (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), 알팔파(alfalfa) (Adedicago sativa), 쌀 (Oryza satzv[alpha]), 호밀 (Secale cereale), 수수 (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 해바라기 (Helianthus annuus), 밀 (Triticum aestivum), 콩 (Glycine max), 담배 (Nicotiana tabacum), 감자 (Solanum tuberosum), 땅콩 (Arachis hypogaed), 면 (Gossypium hirsutum), 고구마 (Ipomoea batatus), 카사바(cassava) (Manihot esculentd), 커피 (Cofea ssp.), 코코넛 (Cocos nucifera), 파인애플 (Ananas comosus), 감귤 나무 (Citrus spp.), 코코아 (Theobroma cacao), 차 (Camellia sinensis), 바나나 (Musa spp.), 아보카도 (Persea americana), 무화과 (JFicus casica), 구아바 (Psidium guajava), 망고 (Mangifera indica), 올리브 (Olea europae[alpha]), 파파야 (Carica papaya), 캐슈 (Anacardium occidental), 마카다미아 (Macadamia integrifoli[alpha]), 아몬드 (Primus amygdalus), 사탕 수수 (Beta vulgaris), 귀리, 보리, 채소, 관상식물, 그리고 침엽수들을 포함하는 ㅇ 임의 식물의 형질전환을 위하여 사용될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 식물들은 작물들(예를 들어, 곡물류 및 콩류, 옥수수, 밀, 감자, 타피오카(tapioca), 쌀, 수수, 기장, 카사바, 보리, 완두, 그리고 기타 뿌리, 덩이줄기, 또는 종자 작물들)이다. 본 발명을 위한 중요한 종자 작물들은 기름씨 평지(oil-seed rape), 사탕 수수, 옥수수, 해바라기, 콩, 그리고 수수이다. 본 발명이 적용될 수 있는 원예작물들은 양상치, 꽃상추, 그리고 양배추, 브로콜리, 및 꽃양배추를 포함하는 배추들을 포함할 수도 있다. 본 발명은 담배, 호리병박, 당근, 딸기, 해바라기, 토마토, 후추, 국화, 포플러, 유칼립투스, 그리고 소나무에 적용될 수도 있다.

선택적으로, 본 발명의 식물들은 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수, 호밀 등과 같은 종자들을 포함한다.

선택적으로, 본 발명의 식물들은 기름씨 식물들을 포함한다. 기름씨 식물들은 캐놀라, 면, 콩, 잇꽃, 해바라기, 평지, 유채속, 옥수수, 알팔파(alfalfa), 팜(palm), 코코넛 등을 포함한다.

선택적으로, 본 발명의 식물들은 콩과 식물들을 포함한다. 콩과 식물들은 콩들과 완두콩들을 포함한다. 콩들은 구아(guar), 메뚜기 콩, 호로파, 콩, 강남콩, 광저기, 녹두, 리마콩, 잠두, 렌즈콩, 이집트콩 등을 포함한다.

본 발명에 유용한 숙주 식물들은 열 작물들(row crops)과 브로드캐스트 작물들(broadcast crops)이다. 유용한 열 작물들의 비제한적인 예들은 옥수수, 콩, 면, 아마란스(amaranth), 채소, 쌀, 수수, 밀, 마일로(milo), 보리, 해바라기, 듀럼밀, 그리고 귀리들이다.

유용한 브로드캐스트 작물들의 비제한적인 예들은 해바라기, 기장, 쌀, 수수, 밀, 마일로, 보리, 듀럼밀, 그리고 귀리들이다.

본 발명에 유용한 숙주 식물들은 단자옆식물들과 쌍자옆식물들이다.

유용한 단자옆식물들의 비제한적인 예들은 쌀, 옥수수, 밀, 야자나무, 터프 그라스(turf grasses), 보리, 그리고 귀리들이다.

유용한 쌍자옆식물들의 비제한적인 예들은 콩, 면, 알팔파, 캐놀라, 아마(flax), 토마토, 사탕수수, 해바라기, 감자, 옥수수, 밀, 쌀, 양상추, 셀러리, 오이, 당근, 꽃양배추, 포도, 그리고 터프 그라스이다.

본 발명에 유용한 숙주 식물들은 심미적 또는 후각적 이익들을 위하여 배양되는 식물들을 포함한다. 비제한적인 예들은 꽃 식물, 나무들, 잔디들, 음지 식물들, 그리고 꽃이 피고 그리고 꽃이 피지않는 관상 식물들을 포함한다.

본 발명에 유용한 숙주 식물들은 영양가를 위하여 배양된 식물들을 포함한다.

숙주 세포 타입들

이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 따르는 이종 뉴클레오티드들과 접촉할 수 있는 매우 다양한 숙주 세포들을 인식할 것이다. 그러한 세포들의 비제한적인 예들은 배아 조직들, 캘러스 조직 타입들 I, II, 그리고 III, 배축, 분열조직, 체관부에서 발현을 위한 조직들 등에 있는 것들이다.

숙주 식물 세포들은 형질전환될 더 높은 잠재성 그리고/또는 완전히 자란 식 물들을 재생하는 더 높은 잠재성을 갖고서 세포들을 위하여 선택적으로 영양을 공급받을 수 있다. 예를 들어, 타입 II 캘러스의 표면으로부터 배아 세포들을 선택하는 것에 의한 숙주 식물 세포들의 손수 선택은 (고상 배지 또는 현탁액에서 배양되던지) 배양에 앞서 숙주 식물 세포들에 대한 영양가를 높이기 위하여 사용될 수도 있는 한 가지 수단이다. 선택적으로, 세포들은 세포 클러스터의 표면에 위치도니 것들로부터 선택될 수 있고, 그들의 분화의 부족, 그들의 크기 및 조밀한 세포질에 의하여 더욱 식별가능할 수 있다. 일실시예에서, 숙주 식물 세포들은 덜 분화되거나 분화되지 않는다. 그러므로, 일실시예에서, 세포들은 세포질적으로 조밀하고, 세포질 비에 대하여 높은 핵을 갖고서 상대적으로 액포가 없고(예를 들어, 세포학적 관찰에 의하여 판단된다), 크기가 작고(예를 들어, 10-20 ㎛), 그리고 지속된 분할들 및 체강의 전배 형성을 할 수 있는 그러한 세포들로부터 선택된다.

선택적으로, 숙주 식물 세포들은 배아 세포들과 같은 상대적으로 비투과성의 막들을 가진 세포들에 의하여 배제되고 뿌리-유사 세포들 및 스네이크(snake) 세포들(소위 그들의 뱀 유사 형상으로 인한)과 같은 상대적으로 분화된 세포들에 의하여 흡수되는, Evan의 블루와 같은 염료들의 사용을 통하여 구분된다.

선택적으로, 숙주 식물 세포들은 세포화학적 착색들에 의하여 검출될 수 있는, 글루타메이트 디하이드로게나제(glutamate dehydrogenase)와 같은, 배아 세포들의 동질효소 표지들의 사용을 통하여 식별된다 (Fransz 등, 1989). 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 글루타메이트 디하이드로게나제와 같은 동질효소 표지들은 그럼에도 불구하고 비교적 높은 신진대사 활동도를 갖는 뿌리모양의 세포들과 같은 비배아 세포들로부터 일부 정도의 폴스 포지티브스(false positives)로 이끌릴 수 있다는 것을 인식할 것이다.

거의 모든 식물 조직들은 여기에서 설명된 적절한 기술들을 이용하여 탈분화동안에 형질전환될 수도 있다. 수여자 세포 표적들은, 이들에 제한되지는 않지만, 분열조직 세포들, 타입 I, 타입 II, 그리고 타입 III 캘러스, 미숙 배아들 그리고 소포자, 꽃가루, 정액 및 난자들과 같은 배우자의 세포들을 포함한다. 번식능력이 있는 식물이 재생될 수 있는 임의 세포는 수여자 세포로서 유용하다고 생각된다. 타입 I, 타입 II, 그리고 타입 III 캘러스는, 이들에 제한되지는 않지만, 미성숙 배아들, 미성숙 개화, 종묘 생장점들, 소포자들 등을 포함하는 조직원들로부터 시작될 수도 있다.

캘러스로서 증식할 수 있는 그러한 세포들은 또한 유전 정보를 위한 수여자 세포들이다. 본 발명은 미성숙 배아들을 형질전환하고 번식 능력이 있는 이식 유전자 식물들의 후속의 재생을 위한 기술들을 제공한다. 미성숙 배아들의 직접 형질전환은 수여자 세포 배양체들의 장기간 발육을 위한 필요를 회피한다. 그의 전구 세포들, 소포자들 뿐만 아니라 꽃가루는 유전 정보를 위한 수여자 세포들로서, 혹은 번식능력이 있는 동안 결합을 위한 외부 DNA를 나르기 위한 벡터들로서 기능할 수도 있다. 직접적인 꽃가루 변태는 세포 배양을 위한 필요를 없앨 것이다.

분열 조직의 세포들(즉, 연속적인 세포분열을 할 수 있고 분화되지 않은 세포학적 외관을 특징으로 하고, 보통 뿌리 정점들, 줄기 정점들, 측생의 눈들 등과 같이 식물들에서 성장점들 또는 조직들에서 발견되는 식물 세포들)은 또 다른 유형 의 수여자 식물 세포를 표시할 수 있다. 그들의 미분화된 성장과 기관 분화 및 분화전능성을 위한 커패시티 때문에, 단일 형질전환된 분열조직의 세포는 전체 형질전환된 식물로서 회복될 수 있다. 사실상, 배아의 현탁 배양체들은 미분화된 상태로 계속되는 세포 분열을 위한 능력을 보유하고, 배지 환경에 의하여 제어되는 체외 분열조직의 세포 시스템일 수 있다.

해충들

본 발명에서 유용한 식물 해충들(즉, 본 발명에 따라서 비병원성이 될 수 있는)은 진균류, 선충류, 곤충류, 박테리아류, 그리고 스트리가(striga), 다더(dodder) 및 미슬토(mistletoe)와 같은 기생 식물들을 포함한다.

유용한 진균류의 비제한적인 예들은 표 4에 제시된 것들을 포함한다.

그러한 유용한 선충들의 비제한적인 예들은 표 3에 제시된 것들을 포함한다.

그러한 유용한 곤충들의 비제한적인 예들은 에이피드(aphids), 리프호퍼(leafhoppers), 플랜트호퍼(planthoppers), 밀리 버그(mealy bugs), 그리고 Lepidoptera larvae를 포함한다.

본 발명에 의하여 유용하게 처리되는 식물 해충들은 박테리아를 포함한다. 그러한 박테리아의 비제한적인 예들은 표 1에 제시되어 있다.

본 발명에 의하여 유용하게 처리되는 식물 해충들은 녹병균을 포함한다. 그러한 녹병균의 비제한적인 예들은 표 5에 제시되어 있다.

본 발명에 의하여 유용하게 처리되는 식물 해충들은 노균병균을 포함한다. 그러한 노균병균의 비제한적인 예들은 표 2에 제시되어 있다.

[표 1]

해충들-박테리아
질병	감염원
Bacterial leaf blight and stalk rot	Pseudomonas avenae subsp . avenae
Bacterial leaf spot	Xanthomonas campestris pv . holcicola
Bacterial stalk rot	Enterobacter dissolvens = Erwinia dissolvens
Bacteiral stalk and top rot	Erwinia carotovora subsp . carotovora , Erwinia chrysanthemi pv . Zeae
Bacteiral stripe	Pseudomonas andropogonis
Chocolate spot	Pseudomonas andropogonis
Goss's bacterial wilt and blight (leaf freckles and wilt)	Clavibacter mischiganensis subsp . nebraskensis = Cornebacterium michiganesnse pv . Nebraskense
Holcus spot	Pseudomonas syringae pv . Syringae
Pruple leaf sheath	Hemiparasitic bacteria + ( See under Fungi )
See rot-seedling blight	Bacillus subtilis
Stewart's disease (bacteiral wilt)	Pantoea stewartii = Erwinia stewartii
Corn stunt (Mesa Central or Rio Grande stunt)	achapparramiento , stunt , Spiroplasma kunkelii

[표 2]

해충들 - 노균병균( Downy Mildews )
질병	감염원
Brown stripe downy mildew	Sclerophthora rayssiae var . zeae
Crazy top downy mildew	Sclerophthora macrospora = S. mcrospore
Green ear downy mildw	Sclerospora graminicola
Java downy mildew	Peronosclerospora maydis = Sclerospora maydis
Philippine downy mildew	Peronosclerospora philippinensis = Sclerospora philippinensis
Sorghum downy mildew	Peronosclerospora sorghi = Sclerospora sorghi
Spontaneum downy mildew	Peronosclerospora spontanea = Sclerospora spotanea
Sugarcane downy mildew	Peronosclerospora sacchari = Sclerospora sacchari
Dry ear rot (cob, kernel and stalk rot)	Nigrospora oryzae ( teleomorph : Khuskia oryzae )
Ear rots, minor	Aspergillus glaucus , A. niger , Aspergillus spp ., Cunninghamella sp ., Curvularia pallescens , Doratomyces stemonitis = Cephalotrichum stemonitis , Fusarium culmorum , Gonatobotrys simplex , Pithomyces maydicus , Rhizopus microsporus , R. stolonifer = R. nigricans , Scopulariopsis brumptii
Ergot( horse's tooth , diente del caballo )	Claviceps gigantea ( anamorph : Sphacelia sp .)
Eyespot	Aureobasidium zeae = Kabatiella zeae
Fusarium ear and satlk rot	Fusarium subglutinans = F. moniliforme var . subglutinans
Fusarium kernel, root and stalk rot, seed rot and seedling blight	Fusarium moniliforme teleomorph : Gibberella fujikuroi )
Fusarium stalk rot, seedling root rot	Fusarium avenaceum ( teleomorph : Gibberella avenacea )
Gibberella ear and stalk rot	Gibberella zeae ( anamorph : Fusarium graminearum )
Gray ear rot	Botryosphaeria zeae = Physalospora zeae ( anamorph : Macrophoma zeae )
Gray leaf spot	Cercospora leaf spot ) Cercospora sorghi = C. sorghi var . maydis , C. zeae - maydis
Helminthosporium root rot	Exserohilum pedicellatum = Helminthosporium pedicellatum ( teleomorph : Setosphaeria
Hormodendrum ear rot	( Caldosporium Cladosporium cladosporidies = Hormodendrum caldosporioides , rot ), C. herbarum ( teleomorph : Mycosphaerella tassiana )
Hyalothyridium leaf spot	Hyalothyridium maydis
Late wilt	Cephalosporium maydis
Leaf spots, minor	Alternaria alternata . Ascochyta maydis , A. tritici , A. zeicola , bipolaris victoriae = Helminthosporium victoriae ( teleomorph : Cochliobolus victoriae ), C. sativus ( anamorph : Bipolaris sorokiniana = H. sorokinianum = H. sativum ), Epicoccum nigrum , Exserohilum prolatum = Drechslera prolata ( teleomorph : Setosphaeria prolata ) Graphium penicillioides , Leptosphaeria maydis , Leptothyrium zease , Ophosphaerella herpotricha , ( anamorph : Scolecosporiella sp .), Paraphaeosphaeria michotii , Phoma sp ., Septoria zeae , S. zeicola , S. zeina
Northern corn leaf blight	Exserohilum turcicum = Helminthosporium turcicum , Setosphaeria turcica
Northern corn leaf spot	Cochliobolus carbonum
Helminthosporium ear rot (race1)	Bipolaris zeicola = Helminthosporium carbonum
Penicillium ear rot (blue eye, blue mold)	Penicillium spp ., P. chrysogenum , P. expansum , P. oxalicum .
Phaeocytostroma stalk rot and root rot	Phaeocytostroma ambiguum , Phaeocytosporella zeae
Phaeoshaeria leaf spot	Phaeosphaeria maydis , Sphaerulina maydis
Physalospora ear rot	Botryosphaeria Botryosphaeria festucae = Physlospora zeicola, (anamorph: Diplodia frumenti)
Purple leaf sheath	Hemiparasitic bacteria and fungi
Pyrenochaeta stalk rot and root rot	Phoma terrestris , Pyrenochaeta terrestirs
Pythium root rot	Pythium spp ., P. arrhenomanes , P. graminicola
Pythium stalk rot	Pythium aphanidermatum = P. butleri L.
Red Kernel disease (ear mold, leaf and seed rot)	Epicoccum nigrum
Rhizoctonia ear rot	Rhizoctonia zeae ( teleomorph : Waitea circinata )
Rhizoctonia root rot and stalk rot	Rhizoctonia solani , Rhizoctonia zeae
Root rots, minor	Alternaria alternata , Cercospora sorghi , Dictochaeta fertilis , Fusarium acuminatum ( teleomorph : Fibberella acuminata ), F. equiseti pallidoroseum , F. poae , F. roseum , F. cyanogena , ( anamorph : F. sulphureum ), Microdochium bozleyi , Mucor sp ., Periconia circinata , Phytophthora cactorum , P. drechsleri , P. nicotianae var . parasitica , Rhizopus arrhizus
Rosratum leaf spot (leaf disease, ear and stalk rot)	Setosphaeria rostrata , Helminthosporium ( anamorph : Exserohilum rostratum = Helminthosporium rostratum )
Rust,common corn	Puccinia sorghi
Rust,southern corn	Puccinia polysora
Rust, tropical corn	Physopella pallescens , P. zeae = Angiopsora zeae

Sclerotium ear rot (southern blight)	Sclerotium rolfsii( teleomorph : Athelia rolfsii )
Seed rot-seedling blight	Bipolaris sorokiniana , B. zeicola = Helminthosporium carbonum , Diplodia maydis , Exserohilum pedicillatum , Exserohilum turcicunz = Helminthosprorium turcicum , Fusarium avenaceum , F. culmorum , F. moniliforme , Gibberella zeae ( anamorph :f. graminearum ), Macrophomina phaseolina , Penicillium spp ., Phomopsis sp ., Pythium spp ., Thizoctonia solani , R. zeae , Sclerotium rolfsii , Spicaria sp .
Selenophoma leaf spot	Selenophoma sp .
Sheath rot	Gaeumannomyces grminis
Shuck rot	Myrothecium gramineum
Silage mold	Monascus purpureus , M. rubber
Smut, common	Ustilage zeae = U. maydis
Smut, false	Ustilaginodiea virens
Smut, head	Sphacelotheca reiliana = Sporisorium holci - sorghi
Southern corn leaf blight and stalk rot	Cochliobolus heterostrophus( anamorph : Bipolaris maydis = Helminthorsporium maydis )
Southern leaf spot	Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospora
Stalk rots, minor	Cercosproa sorghi , Fusarium episphaeria , F. merismoides , F. oxysporum , F. poae , F. roseum , F. solani ( teleomorph : Nectria Haematococca ), F. tricinctum , Mariannaea elegans , Mucor sp ., Rhopographus zeae , Spicartia sp .
Storage rots	Aspergillus spp ., Penicillium spp . and other fungi
Tar spot	Phyllachora maydis
Trichoderma ear rot and root rot	Trichoderma viride = T. lignorun teleomorph : Hypocrea sp .
White ear rot, rood and stalk rot	Stenocarpella maydis = Diplodia zeae

Yellow leaf blight	Ascochyta ischaeami , Phyllostita maydis ( teleomorph : Mycosphaerella zeae - maydis )
Zonate leaf spot	Gloeccercospora sorghi

[표 3]

*해충들 - 기생* *선충들*
질병	병원균
Awl	Dolicliodorus spp ., D. heterocephahis
Bulb and stem (Europe)	Ditylenchus dipsaci
Burrowing	Radopholus similes
Cyst	Heterodera avenae , H. zeae , Punctodera chalcoensis
Dagger	Xiphinema spp ., X. americanum , X. Mediterraneum
False root-knot	Nacobbus dorsalis
Lance, Columbia	Hoplolaiimus Columbus
Lance	Hoplolaimus spp ., H. galeatus
Lesion	Pratylenchus spp ., P. brachyurus , P. crenatus , P. hexinci 년 P. neglectus , P. penetrans , P. scribneri , P. thornei , P. zeae
Needle	Longidorus spp ., L. breviannulatus
Ring	Criconemella spp ., C. ornata
Root-know	Meloidogyne spp ., M. chitwodi ,M. incognita , M. javanica
Spiral	Helicotylenchus spp
Sting	Belonolaiums spp ., B. longicaudatus
Stubby-root	Paratrichodorus spp ., P. christiei , P. minor , quinisulcius acutus , Trichodorus spp .
Stunt	Tylenchorhynchus dubius

[표 4]

해충들-균
질병	균 해충
Anthracnose leaf blight and anthracnose stalk rot	Collectotrichum graminicola ( teleomorph : Glomerella graminicola ), Glomerella tucumanensis ( anamorph : Glomerella falcatum )
Aspergillus ear and kernel rot	Aspergillus flavus
Banded leaf and sheath spot	Rhizoctonia solani = Rhizoctonia microsclerotia ( teleomorph : Thanatephorus cucumeris )
Black bundle disease	Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium
Black kernel rot	Lasiodiplodia theobromace = Botryodiplodia theobromae
Borde blanco	Marasmiellus sp .
Brwon spot (black spot, stalk rot)	Physoderma maydis
Cephalosporium kernel rot	Acremonium strictum = Cephalosporium acremonium
Charcoal rot	Macrophomina Phaseolina
Corticium ear rot	Thanatephorus cucumeris = Corticium sasakii
Curvularia leaf spot	Curvularia clavata , C. eragrostidis , = C. maculans ( teleomorph : Cochliobolus eragrostidis ), Curvularia inaequalis , C. intermedia ( teleomorph : Cochliobolus intermedius ), Curvularia lunata ( teleomorph : Cochliobolus lunatus ), Curvularia pallescens ( teleomorph : Cochliobolus pallescens ), Curvularia senegalensis , C. tuberculata ( teleomorph : Cochliobolus tuberculatus )
Didymella leaf spot	Didymella exitalis
Diplodia ear ort and stalk rot	Diplodia frumenti ( teleomorph : Botryosphaeria festucae )
Diplodia ear rot, stalk rot, seed rot and seedling blight	Diplodia maydis = Stenocarpella maydis
Diplodia leaf spot or leaf stalk	Stenocarpella macrospora = Diplodia macrospore

[표 5]

해충들 - 녹병균
숙주 식물	일반적 질병명	녹병균 종
Barley	Crown rust	Puccinia coronate
	Leaf rust	Puccinia hordei
	Stem rust	Puccinia graminis
	Stripe(yellow)rust	Puccinia striiformis
Corn	Common rust	Puccinia sorghi
	Southern rust	Puccinia polysora
	Tropical rust	Physopella pallexcens , P zeae = Angiopsora zeae
Oats	Crown rust	Puccinia coronata
	Stem rust	Puccinia graminis
Rye	Stem rust	Puccinia graminis = P. graminis f. sp . secalis
	Leaf(brown)rust	Puccinia recondita ( anamorph : Aecidium clematidis )
Sorghum	Rust	Puccinia purpurea
Sugarcane	Common Rust	Puccinia melanocephola = P. erianthi
	Orange Rust	Puccinia kuehnii
Wheat	Leaf(brown) rust	Puccinia triticina = P. Reconditaf . Sp . tritici = P. tritici - duri
	stem(black) rust	Puccinia gramminis = P. graminis f. sp . tritici
	Stripe(yellow) rust	Puccinia striiformis ( anamorph : P. uredoglumarum )
Apple	American hawthrone rust	Gymnosporangium globosum
	Cedar apple rust	Gymnosporangium juniperi - virginianae
	Japanese apple rust	Gymnosporangium yamadae miyabe ex yamada
	Pacific Coast pear rust	Gymnosporangium libocedri
	Quince rust	Gymnosporangium clavipes
Asparagus	Rust	Puccinia asparagi
Banana	Leaf rust	Uredo musae , uromyces musae
Bean	Rust	Uromyces appendicu Zatus
Beet	Seedling rust	Puccinia subnitens
Carrot	Rust	Aecidium foeniculiuromy - ces graminis , Uromyces Lineolatus subsp . nearcticus
Chickpea	Rust	Uromyces ciceris arientini , Uromyces striatus
Coffee	Rust(orange or leaf rsut)	Hemileia vastatrix
	Rust(powdery or grey rust)	Hemileia coffeicola
Cotton	Cotton rust	Puccinia schedonnardi
	Southewestern rust	Puccinia cacabata
	Tropical rust	Phakopsora gossypii
Eucalyptus	rust	Puccini apsidii
Flax	Rust	Melampsora lini
Crape	Rust	Physopella ampelopsidis
Lettuce	Rust	puccinia dioicae = P. extensicola var . hieraciata
Asparagus	Asparagus rust	Puccinia asparagi
Onion	Onion rust	Puccinia allii
Pea	Rust	Uromyces fabae
peanut	Rust	Puccinia arachidis
Pear	American hawthorne rust	Gymnosporangium globosum
	Kern's pear rust	Gymnosporangium kernianum
	Pacific Coast Pear rust	Gymnosporangium libocedri
	Pear trellis rust	Gymnosporangium fuscum
	Rocky Mountain pear rust	Gymnosporangium nelsonii
Poplar	European Poplar rust	Melampsora larici - populinakle
	American leaf rust	Melampsora medusae
Potato	Common rust	Puccinia pittierianap
	Deforming rust	Aedidium cantensis
Red clover	Rust	Uromyces trifolii - repentis
Soybean	Rust	Phakospora pachyrhizi
Strawberry	Leaf rust	Phragmidium potentillae = Frommea obtusa
Sunflower	Rust	Puccinia helianthi ,P xanthii , Uromycesjunci
Sweet potato	Red rust	Coleosporium ipomoeae

해충 병원성 유전자들

통상의 지식을 가진 자들은 본 발명에서 표적에 대한 해충 유전자들을 쉽게 식별할 수 있다.

그러한 유전자는 숙주 식물에 대한 그러한 해충의 해로운 효과들에서 직접 또는 간접적인 역할을 하는 어떤 해충 유전자일 수 있을 것이다. 단지 예로서, 그러한 유전자는 해충 성장, 발육, 복제 및 재생, 그리고 침입 또는 감염에서 어떤 역할을 하는 것일 수 있다.

일실시예에서, 숙주 식물은 해충 병원성 유전자와 약 70% 이상 상동인 유전자를 포함하지 않는다.

선택적으로, 상기 상동은 약 60% 미만이다.

선택적으로, 상기 상동은 약 50% 미만이다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 70% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 유전자를 포함하지 않는다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 60% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 유전자를 포함하지 않는다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 50% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 유전자를 포함하지 않는다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 70% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 하나를 초과하는 유전자를 포함하지 않는다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 60% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 하나를 초과하는 유전자를 포함하지 않는다.

일실시예에서, 상기 숙주 식물은 상기 해충 병원성 유전자와 약 50% 이상 상동인 25 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 하나를 초과하는 유전자를 포함하지 않는다.

[표 6]

해충들, 해충 병원성 유전자들, 그리고 숙주 식물들
해충 또는 병원균 그룹	해충 병원성 유전자	숙주 식물들
Fungi	Cutinases	A11
	Kinases	A11
	Ribosomal RNAs	A11
	Adhesins	A11
	G-proteins	A11
	Elicitins	A11
Bacteria	Cutinases	A11
	Mascerating enzymes	A11
	Kinases	A11
	Ribosomal RNAs	A11
	Adhesins	A11
	G-proteins	A11
Insects	Kinases	A11
	Ribosomal RNAs	A11
	G-proteins	A11
	Moulting factors	A11
	Serine proteases	A11
	Cysteine proteases	A11
	Juvenile hormone esterase	A11
Nematodes	Kinases	A11
	Ribosomal RNAs	A11
	G-proteins	A11
	Cuticle collagen proteins	A11
	Cathepsin proteases	A11

예로서, 큐티나아제는 본 발명에 따르는 유용한 유전자이다.

균사가 식물 세포에 침입하여 영양분들을 흡수할 때, 그것은 식물로부터 siRNA들을 흡수하여 균들의 필수적이고 구성 요소인 큐티나아제를 침묵화시킨다.

단지 예로서, 그러한 유전자는 해충 성장, 발육, 복사 및 재생, 그리고 침입 또는 감염에 어떤 역할을 하는 유전자일 수 있다. 다른 비제한적인 예들은 표 6에 있는 것들을 포함한다.

센스 (그리고 안티센스 ) 서열들

본 발명에 따르는 센스 및 안티센스 서열들은 (각각) 해충 병원성 유전자의 센스 및 안티센스 가닥과 상동을 갖는 임의 서열일 수 있다.

상기 센스 및 안티센스 서열들은 동일한 DNA 가닥 또는 다른 DNA 가닥들 상에 있을 수 있다. 센스 및 안티센스 서열들이 동일한 DNA 가닥 위에 있을 때, 이들 서열들의 전사는 동일한 프로모터(promoter) 또는 다른 프로모터(예를 들어, 동일한 프로모터 또는 다른 프로모터의 복사체들)로부터 추진될 수 있다. 센스 및 안티센스 서열들이 다른 DNA 가닥들 상에 있을 때, 이들 서열들의 전사는 다른 프로모터들로부터 추진될 수 있다.

센스 및 안티센스 서열들은 DNA에 상보적이고 듀플렉스 DNA로서 배열될 수 있고, 혹은 상기 서열들은 DNA의 다른 영역들에 있을 수 있다(즉, 서로 듀플렉스 DNA를 형성하지 않는다).

센스 및 안티센스 서열들 각각은 적어도 약 19 뉴클레오티드들을 포함한다. 선택적으로, 각 서열은 적어도 약 50 뉴클레오티드들, 선택적으로 적어도 약 100 뉴클레오티드들, 선택적으로 적어도 약 150 뉴클레오티드들, 선택적으로 적어도 약 250 뉴클레오티드들, 선택적으로 적어도 약 500 뉴클레오티드들, 선택적으로 적어도 약 600 뉴클레오티드들을 포함한다.

일실시예에서, 상기 서열들은 해충 병원성 유전자로부터 형질전환되어 하나 이상의 해충의 병원성 유전자와의 상동을 생성하거나 증가시킨다.

다른 실시예에서, 상기 서열들은 해충 병원성 유전자로부터 형질전환되어 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 길이를 짧게 한다.

또 다른 실시예에서, 상기 서열들은 상기 해충 병원성 유전자로부터 형질전 환되어 식물, 동물, 또는 사람 유전자와의 상동이 감소하게 된다.

또 다른 실시예에서, 센스 및 안티센스 서열들은 해충 병원성 유전자의 복제 영역들을 포함한다. 그러한 영역들의 선택은 여기에 있는 본 발명의 가름침들에 따라서 만들어진다 (예를 들어, 고도로 보존된 영역).

다른 실시예들에서, 해충 병원성 유전자의 영역들 또는 해충 병원성 유전자의 전체 코딩 영역조차도 센스 및 안티센스 서열들을 포함하도록 복제되어 상기 센스 및 안티센스 서열들에 의하여 형성되는 이중가닥 영역의 길이를 증가시킬 수 있다. 이론에 억매이지는 않지만, 본 발명의 일부 실시예들에서, siRNA의 문턱 레벨은 해충에서 유용한 유전자 침묵화를 이끌어내고 식물에게 해충 저항성을 제공하도록 형성되어야만 한다. 유전자 서열들의 복제는 이중 가닥 영역의 길이를 증가시키고 siRNA의 수를 증가시키는 한 가지 유용한 방법이다.

이러한 (유전자 복제) 접근법은 여기에 있는 예들에서 Phytophthora infestans (GenBank locus AY766229)의 엘리시틴 INF1을 포함하는 이종의 폴리뉴클레오티드 pVZA300 (SEQ ID 7)을 이용하여 보여진다. 이 서열은 많은 다른 엘리시틴 유전자들을 침묵화시킬 것이고 그리하여 Phytophthora의 많은 종들에 대한 저항성을 제공할 수 있다는 것을 제시한다는 점에서, 속 Phytophthora에 의하여 표현되는 많은 다른 엘리시틴 유전자들과의 그것의 높은 상동때문에 선택된다. 상기 선택된 서열은 282 nt만큼 길고, 그러므로 두드러지게 성공적이었던 pVZAlOO (SEQ ID 5), pVZA.200 (SEQ ID 6) 그리고 pVZA400 (SEQ ID 8)의 센스 및 안티센스 부분들의 길이들에 접근시키기 위하여 센스 및 안티센스 방향들 모두에서 반복된다 (=564 nt).

p CAMBIAl 201, pVZAlOO, 또는 pVZA200으로서의 형질전환들의 효과들과 비교할 때 이러한 접근법의 성공은 성장을 감소시키고 형질전환된 Phytophthora nicotinae와 Phytophthora sojae (도 14D, F)의 균사의 기형을 야기하는데 있어서 pVAZ300의 극적인 효과에 의하여 나타났다. 플라스미드들 pVZA 200과 pVZA300은 둘다 cathepsin gerxe를 포함한다는 점에서 부분적으로 동일하지만, pVZA300은 또한 반복된 엘리시틴 유전자를 포함한다. 그러므로, 균들에 대한 pVZA300의 유해한 충격은 엘리시틴 유전자에 기인하여야만 한다. 이는 매우 Phytophthora 저항 식물들을 개발하고 Phytophthora 오염된 토양들의 탈병원성에 대한 이러한 접근의 적용을 발전시키기 위한 매우 긍정적인 암시들을 가진다.

형질전환하는 방법들

폴리뉴클레오티드의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건들 하에서 본 발명의 이종 뉴클레오티드들을 표적 숙주로 도입하기 위한 매우 다양한 방법들이 이용가능하다. 형질전환 기술의 특별한 선택은 선택의 특별한 방법학을 갖고서 본 발명을 실시하는 사람의 경험과 선호도 뿐만 아니라 어떤 식물 종들을 형질전환하는 그것의 효율에 의하여 결정될 것이다. 핵산을 식물 세포들로 도입하는 형질전환 시스템의 특별한 선택은 본 발명의 한정에 대하여 필수적이지도 않고 식물 재생을 위한 기술의 선택도 아니라는 것이 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 명백할 것이다.

다양한 형질전환 방법들이 여기에서 별개의 방법들로서 교육되지만, 통상의 지식을 가진 자들은 어떤 방법들이 병형 과정의 효율을 향상시키기 위하여 조합하 여 사용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 그러한 방법들의 비제한적인 예들은 아그로박테리아(agrobacterium)가 코팅된 미소입자들과의 충돌 (EP-A-486234) 또는 아그로박테리아의 공동배양이 뒤따르는 와운딩(wounding)을 유도하는 유전자총 충돌(EP-A-486233)을 포함한다.

직접 전달은 본 발명에 따라서 식물 숙주들을 형질전환하기 위하여 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 그러한 직접 전달 방법들은 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공법, 리포솜 중재된 DNA 흡수(예를 들어, Freeman 등, Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), 또는 보텍싱(vortexing) 방법(예를 들어, Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (199O))을 포함한다. 직접 DNA 전달의 한 가지 형태는, 예를 들어, 배아 세포 현탁 배양물들로부터 원형질체들로의 직접 유전자 이송이다 (Lazzeri and Lorz (1988) Advances in Cell Culture, Vol. 6, Academic press, p. 291; OziasAkins and Lorz (1984) Trends in Biotechnology 2: 1 19).

수분 경로( Pollination pathway )

통상의 지식을 가진 자는 곡물들의 낮은 재생 잠재성으로부터 생기는 유전자형-의존 형질전환의 어떤 도전들을 인식하고 있다. 따라서, 본 발명의 일실시예에서, 형질전환은 수분 경로를 근거로 유전자형에 무관한 형질전환 접근법에 의하여 달성된다 (Ohta Y., 1986). 옥수수에서, 높은 효율의 유전자 형질전환은 꽃가루와 외인성 DNA의 혼합물에 의하여 달성될 수 있다 (Liao Z. X. and Wu R., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:715-719). 옥수수는 자가 수분 및 타가 수분 모두에 의하여 재배할 수 있다. 옥수수는 각각 수염과 귀 위에 위치되어 있는, 동일 식 물 위의 분리된 암수 꽃들을 가진다. 옥수수에서 자연 수분은 바람이 수염으로부터 귀의 정점들로부터 돌출된 실크들(silks)까지 꽃가루를 날릴 때 일어난다.

본 발명에 따르는 쌀의 형질전환은 또한 꽃가루관 경로를 통하여 이루어질 수 있다 (Plant Molecular Biology Reporter 6:165-174). 꽃가루관 경로 접근법의 주요한 잠재적 장점들은 (a) 유전자형 의존성; (b) 모자이크 현상의 부족; (c) 복잡한 세포 및 조직 배양 기술들을 위한 필요가 없음을 포함한다. 본 발명에 따르는 이종 폴리뉴클레오티드들을 이용한 토마토와 멜론의 형질전환은 수분 경로를 통하여 손상되지 않은 식물들로 달성될 수 있다 (Chesnokov, Yu. V., 등, 1992, USSR Patent No. 1708849; Bulletin of the USSR Patents, No. 4; Chesnokov Yu. V. & Klorol A. B. 1993; Genetika USSR, 29:1345-1355). 수분-수정 경로에 근거한 유전자 형질전환의 과정들은 (i) 꽃가루와 형질전환하는 DNA의 혼합물(paste)의 채용; (ii) 외부 DNA를 꽃가루 관으로 전달하는 것; 그리고 (iii) 소포자들 또는 꽃가루 입자들의 미소입자 충돌을 포함한다.

아그로박테리아 기술

본 발명의 일실시예에서, 숙주 식물들은 아그로박테리아 기술을 이용하여 형질전환된다. DNA가 전체 식물 조직으로 도입되어 원형질체로부터 손상되지 않은 식물의 재생을 위한 필요를 지나칠 수 있기 때문에, 아그로박테리아-중재 이식은 유전자들을 식물 세포들로 도입하기 위한 널리 적용가능한 시스템이다. DNA를 식물 세포들 내로 도입하기 위한 벡터들을 통합하는 아그로박테리아-중재 식물의 사용은 이 기술에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Fraley 등 (1985), Rogers 등 (1987)에 의하여 설명된 방법들 그리고 구체적으로는 여기에 그의 전체가 참조로서 결합된 미국특허번호 5,563,055를 보라.

아그로박테리아-중재된 형질전환은 비제한적인 예로서, Arabidopsis, 옥수수(corn), 콩, 면, 캐놀라, 담배, 토마토, 그리고 감자를 포함하는 본 발명의 쌍자엽 숙주 식물들을 갖고서 효율적으로 사용될 수 있다.

아그로박테리아-중재된 형질전환은 본 발명의 거의 모든 외떡잎 식물들에게 적용가능하다. 비제한적인 예로서, 그러한 외떡잎 식물 기술들은 쌀 (Hiei 등, 1997; Zhang 등, 1997; (Ishida 등, 1996); 구체적으로는 여기에 그의 전체가 참조로서 결합된 미국특허번호 5,591,616), 밀 (McCormac 등, 1998), 그리고 보리 (Tingay 등, 1997; McCormac 등, 1998)에 적용가능하다.

본 발명에 따르는 아그로박테리아-중재된 형질전환은 배양되어 분리된 원형질체를 갖고서 손상되지 않은 세포들 또는 조직들의 형질전환에 의하여 달성될 수 있다.

쌍자엽식물들에서 아그로박테리아-중재된 형질전환은 입자 충돌, 전기천공법, 폴리에틸렌 글리콜-중재된 형질전환 방법들과 같은 다른 형질전환 방법들과 비교할 때 이종 핵산의 더 큰 조각들의 송달을 손쉽게 한다. 아울러, 아그로박테리아-중재된 형질전환은 상대적으로 아주 적은 유전자 재배열이 생기는 것으로 나타나고 보다 전형적으로는 식물 염색체로의 유전자 복사체들의 통합되는 수가 작게 되는 결과를 얻는다.

현대의 아그로박테리아 형질전환 벡터들은 아그로박테리아에서뿐만 아니라 대장균에서 복제할 수 있고, 설명된 것처럼 편리한 조작을 허용한다 (Klee 등, 1985). 더욱이, 아그로박테리아-중재된 유전자 전이를 위한 벡터들에서 최근의 기술적인 진보들은 유전자들의 배열과 벡터들에서 제한 자리들을 개선하여 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자들을 발현할 수 있는 벡터들의 구성을 손쉽게 하였다. 설명된(Rogers 등, 1987) 벡터들은 프로모터에 의하여 측면에 배치된 편리한 멀티-링커 영역들과, 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자들의 직접 발현을 위한 폴리아데닐화 자리를 가지고 현재의 목적들을 위하여 적합하다. 아울러, 무장한 Ti 유전자와 무장해제된 Ti 유전자 모두를 포함하는 아그로박테리아는 형질전환들을 위하여 사용될 수 있다. 아그로박테리아-중재된 형질전환이 유효한 그러한 식물 변종들에서, 그것은 유전자 전이의 쉽게 얻을 수 있고 정의된 성질 때문에 선택의 방법이다.

아그로박테리아(예를 들어, A. tumefac[iota]ens and A. rhizogenes)이 본 발명에 따라서 식물 세포들을 형질전환하기 위하여 사용될 때, 삽입될 DNA는 특별한 플라스미드들로, 즉 중간벡터 또는 2진 벡터 중 하나로 복제될 수 있다. 상기 중간 벡터들은 T-DNA의 서열들과 상동인 서열들 때문에 상동의 재조합에 의하여 Ti 또는 Ri 플라스미드로 통합될 수 있다. 상기 Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전이를 위한 vir 영역을 포함한다. 중간 섹터들은 Agroh actena에서 자신들을 복제할 수 없다. 상기 중간 벡터들은 도움자 플라스미드 (conjugation)에 의하여 Agrobacterium tumefaciens로 전이될 수 있다.

2진 벡터들은 대장균과 아그로박테리아 모두에서 그들 자신들을 복제할 수 있다. 그러한 벡터들은 좌우 T-DNA 경계 영역들에 의하여 골격화되는 선택 표지 유 전자와 링커 또는 폴리링커를 포함할 수 있다. 상기 2진 벡터들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters 등 [1978] MoI. Gen. Genet. 163: 181-187). 숙주 세포로서 사용된 아그로박테리아는 vir 영역을 나르는 플라스미드를 포함하기 위한 것이다. 상기 vir 영역은 T-DNA를 식물 세포로 전이하기 위하여 필요하다. 추가적인 T-DNA가 포함될 수도 있다. 그렇게 형질전환된 박테리아는 식물 세포들의 형질전환을 위하여 사용된다. 식물 이식체들은 유리하게는 DNA를 상기 식물 세포로 이식하기 위하여 Agrobacteriurn tumefaciens ox Agrobacterium rhizogenes를 갖고서 배양될 수 있다. 이후 전체 식물들은 선택을 위한 항생물질 또는 살생물제들을 포함할 수 있는 적절한 배지에서 감염된 식물 물질(예를 들어, 잎의 조각들, 줄기의 단편들, 뿌리들, 원형질체 또는 현탁액-배양된 세포들)로부터 재생될 수 있다. 그렇게 얻어진 식물들은 이후 삽입된 이종의 폴리뉴클레오티드들의 존재를 위하여 시험될 수 있다. 주입과 전기 천공법의 경우 플라스미드들의 특별한 요구들은 없다. 예를 들어, pUC 유도체들과 같은 보통의 플라스미드들을 사용하는 것이 가능하다.

다른 형질전환 기술은 휘스커스(whiskers) 기술을 포함한다. Zeneca에게 허여된 미국특허번호들 5,302,523과 5,464,765를 보라.

유전자총 충돌법

선택적으로, 숙주 식물 세포들은 유전자총 충돌법에 의하여 본 발명에 따라서 형질전환된다 (미국특허번호 5,550,318; 미국특허번호 5,538,880; 미국특허번호 5,610,042; 그리고 미국특허번호 5,590,390; 이들 각각은 전체가 여기에 참조로서 결합되어 있다). 본 실시예에서, 입자들은 핵산들로 코팅되고 추진력에 의하여 세포들에게로 전달된다. 예시적인 입자들은 텅스텐, 백금, 그리고 바람직하게는 금으로 구성되는 것들을 포함한다. 일부 예들에서 금속 입자들 위로의 DNA 석출은 유전자총 충돌법을 이용하여 수여자 세포에게로의 DNA 전달을 위하여 필요하지 않을 것이라는 것이 고려된다. 그러나, 입자들은 DNA로 코팅되기보다는 오히려 DNA를 포함할 수도 있다는 사실이 고려된다. 그러므로, DNA-코팅된 입자들은 입자 충돌을 통한 DNA 전달의 레벨을 증가시킬 수도 있지만, 그들 스스로 그리고 원래는 필요치않다.

충돌을 위하여, 현탁액 내의 세포들은 필터들 또는 고체 배양 배지 상에서 농축된다. 선택적으로, 미성숙 배아들 또는 다른 표적 세포들은 고체 배양 배지 상에 배열된다. 충돌될 세포들은 유전자총 멈춤판 아래의 적절한 거리에 위치된다.

대상 벡터들을 식물 세포들에게로 전달하기 위한 형질전환 방법의 예시적인 실시예는 Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, Calif.)로서, 이는 DNA 또는 세포들로 코팅된 입자들을 스테인리스 강 또는 니텍스(Nytex) 스크린과 같은 스크린을 통하여 현탁액에서 배양된 식물 세포들로 덮여진 필터 표면 위로 추진하기 위하여 사용된다. 상기 스크린은 입자들이 큰 응집체들로서 상기 수여자 세포들에게 전달되지 않도록 상기 입자들을 분산한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 유전자총 투사체 장치와 충돌될 세포들 사이의 스크린 개재는 투사체들 군체의 크기를 감소시키고 너무 큰 투사체들에 의한 수여자 세포들에 대하여 가해지는 손상을 감소시키므로써 더 높은 횟수의 형질 전환에 기여할 수 있다고 믿는다.

충돌을 위하여, 현탁액 내의 세포들은 필터들 또는 고체 배양 배지 상에서 농축된다. 선택적으로, 미성숙 배아들 또는 다른 표적 세포들은 고체 배양 배지 상에 배열된다. 충돌될 세포들은 유전자총 멈춤판 아래의 적절한 거리에 위치된다. 바람직하게는, 하나 이상의 스크린들이 가속 장치와 충돌될 세포들 사이에 위치될 수도 있다. 여기에서 주장된 기술들의 사용을 통하여, 일시적으로 표지 유전자를 발현하는 1000개 이상에 이르는 세포들의 초점들을 얻을 수도 있다. 48시간 후-충돌에서 외인성의 유전자 생성물을 발현하는 초점에서의 세포들의 수는 종종 1 내지 10개 범위이고 평균적으로는 1 내지 3개이다.

이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 안정한 형질전환 개체들의 최대 수를 얻기 위하여 충돌전 배양 조건들과 충돌 변수들을 최적화할 수 있다. 충돌을 위한 물리학적 그리고 생물학적 변수들 모두가 이 기술에서 중요하다. 물리적 인자들은 DNA/미소투사체 석출물을 조작하는 것을 포함하는 것들 또는 거대투사체 또는 미소투사체들 중 어느 하나의 비행 및 속도에 영향을 주는 것들이다. 생물학적인 인자들은 충돌 전과 충돌후 즉시 세포들의 조작에 포함된 모든 단계들, 충돌과 관련된 외상을 경감하는 것을 돕는 표적 세포들의 삼투압 조절, 그리고 선형화된 DNA 또는 손상되지 않은 슈퍼코일된(supercoiled) 플라스미드들과 같은 형질전환 DNA의 성질을 포함한다. 충돌전 조작들은 특히 미성숙 배아들의 성공적인 형질전환을 위하여 특히 중요하다고 믿어진다.

따라서, 통상의 지식을 가진 자는 상기 조건들을 충분히 최적화시키기 위하여 작은 스케일 연구들로 충돌 변수들을 조절할 수 있다. 어떤 이는 특히 갭 거리, 비행 거리, 조직 거리, 그리고 헬륨 압력과 같은 물리적인 변수들을 조절하기를 원할 수도 있다. 어떤 이는 또한 수여자 세포들의 생리학적 상태들에 영향을 주고 그러므로 형질전환 및 통합 효율들에 영향을 주는 조건들을 변경하므로써 손상 감소 인자들(TFRs)을 최소화할 수 있다. 예를 들어, 삼투압 상태, 조직 수화 및 2차 배양 단계 또는 수여자 세포들의 세포 주기가 최적의 형질전환을 위하여 조절될 수도 있다. 그러한 작은 스케일의 최적화 연구들로부터의 결과들은 여기에서 개시되고 다른 통상적인 조절들의 실행은 본 개시에 비추어서 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려질 것이다.

미소투사체 충돌에 의한 형질전환은 널리 적용가능하고, 실제로 임의 식물 종들을 형질전환하기 위하여 사용될 수 있다. 단자옆식물들, 예를 들어, 옥수수 (미국특허번호 5,590,390), 보리 (Ritala 등, 1994; Hensgens 등, 1993), 밀 (전체가 여기에 참조로서 결합된 미국특허번호 5,563,055), 쌀 (Hensgens 등, 1993), 귀리 (Torbet 등, 1995; Torbet 등, 1998), 호밀 (Hensgens 등, 1993), 사탕수수 (Bower 등, 1992), 그리고 수수 (Casa 등, 1993; Hagio 등, 1991)은 본 발명에 따르는 충돌에 의하여 선택적으로 형질전환된다.

쌍자옆식물들, 예를 들어, 담배 (Tomes 등, 1990; Buising and Benbow, 1994), 콩 (특히 전체가 여기에 참조로서 결합된 미국특허번호 5,322,783), 해바라기 (Knittel 등 1994), 땅콩 (Singsit 등, 1997), 면 (McCabe and Martinell, 1993), 토마토 (Van Eck 등 1995), 그리고 일반적인 콩과식물들 (특히 전체가 여기에 참조로서 결합된 미국특허번호 5,563,055)은 본 발명에 따르는 충돌에 의하여 선택적으로 형질전환된다.

전기천공법

일실시예에서, 식물 세포들은 전기천공의 방법을 이용하여 형질전환된다. 예를 들어, Boyce Thompson Institute의 WO 87/06614; Dekalb에게 허여된 미국특허번호들 5,472,869과 5,384,253; 그리고 Plant Genetic Systems의 WO 92/09696와 WO 93/21335를 보라.

Krzyzek 등의 방법 (전체가 여기에 참조로서 결합된 미국특허번호 5,384,253)은 본 발명에 아주 적합하다. 이 방법에서, 펙틴-분해 효소들과 같은 소정의 세포벽-분해 효소들은 표적 수여자 세포들이 처치되지 않은 세포들보다 전기 천공법에 의한 형질전환에 더 민감하게 될 수 있게 하기 위하여 채용된다. 선택적으로, 수여자 세포들은 기계적인 와운딩(wounding)에 의한 형질전환에 더 민감하게 만들어진다.

예를 들어, Tada, Y., 등 (Efficient gene introduction to rice by electroporation and analysis of transgenic plants: Use of electroporation buffer lacking chloride ions, Theor Appl Genet, Vol. 80: 475-480, 1990)의 방법이 쌀을 형질전환하기 위하여 적합하다.

일실시예에서, 전자 천공법에 의한 형질전환을 유효화하기 위하여, 세포들의 현탁액 배양체 또는 배아 캘러스와 같은 부서지기 쉬운 조직들이 사용된다.

선택적으로, 미성숙 배아들 또는 다른 기관화된 조직이 직접 형질전환된다. 이 기술에서, 세포벽들을 펙틴-분해 효소들에게 노출하거나 제어된 방법으로 기계 적으로 감아주므로써 세포 벽들은 부분적으로 분해된다.

본 발명에 따르는 손상되지 않은 세포들의 전기 천공법에 의하여 형질전환될 수 있는 비제한적인 예들의 식물 세포 숙주들은 밀(예를 들어, Zhou 등, 1993에 따르면), 토마토 (예를 들어, Hou and Lin, 1996에 따르면), 콩 (예를 들어, Christou 등, 1987에 따르면) 그리고 담배 (Lee 등, 1989)이다. 또한 미국특허번호 5,384,253; Rhodes 등, 1995; 그리고 D'Halluin 등, 1992을 보라.

일실시예에서, 식물들은 원형질체들의 전기천공을 위하여 형질전환된다(예를 들어, Bates, 1994; Lazzeri, 1995에 따르면). 본 발명에 따르는 원형질체 세포들의 전기 천공에 의하여 형질전환될 수 있는 식물 세포 숙주들의 비제한적 예들은 콩과 식물들 (예를 들어, 특히 여기에 결합되어 있는 Dhir and ^idholm의 PCT 공개 번호 WO 92/17598), 보리 (예를 들어, Lazerri, 1995), 수수 (예를 들어, Battraw 등, 1991), (예를 들어, Bhattacharjee 등, 1997), 밀 (예를 들어, He 등, 1994) 그리고 토마토 (예를 들어, Tsukada, 1989)이다.

바이러스 벡터들

또한, 바이러스 벡터들이 본 발명에 따르는 식물들을 형질전환하기 위하여 사용될 수도 있다. 예를 들어, 단자옆식물들은 지금은 Novartis인 Mycogen Plant Science and Ciba-Giegy에게 양도된 미국특허번호 5,569,597에 설명된 방법들을 이용하여 바이러스 벡터를 갖고서 형질전환될 수 있다.

미국특허번호 5,589,367는 또한 바이러스 벡터를 이용한 식물 형질전환을 설명한다.

미국특허번호 5,316,931은 바이러스 벡터를 이용한 식물 형질전환을 설명한다.

본 발명에 따르는 (외자옆식물들과 쌍자옆식물들을 포함하는) 더 고도의 식물들을 위하여 유용한 수많은 복제 벡터들은 대장균 내의 복제 시스템과 형질전환된 세포들의 선택을 허용하는 표지를 포함한다. 이들 벡터들은, 예를 들어, pBR322, pUC 시리즈, M13mρ 시리즈, pACYC184, 등, 그리고 pCAMBIA 120 1을 포함한다. 따라서, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 서열은 적합한 제한 자리에서 사익 벡터로 삽입될 수 있다. 결과적인 플라스미드는 대장균으로의 형질전환을 위하여 사용된다. 상기 대장균 세포들은 적합한 영양 배지에서 배양되고, 이후 수집되고 용해된다. 상기 플라스미드는 회수된다. 서열 분석, 제한 분석, 전기이동, 그리고 다른 생화학적-분자 생물학적 방법들이 일반적으로 분석의 방법들로서 수행된다. 각 조작후, 사용된 DNA 서열은 갈라지고 다음 DNA 서열에 결합될 수 있다. 원하는 유전자들을 식물에게로 삽입하는 방법에 따라서, 다른 DNA 서열들이 필요할 수도 있다. 예를 들어, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질전환을 위하여 사용되면, 적어도 우측 경계, 그러나 종종 Ti 또는 Ri 플라스미드의 우측 및 좌측 경계들이 삽입될 유전자들의 측면배치 영역으로서 결합된다.

식물 세포들의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용이 EP 120 516; Hoekema (1985) In: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij KLanters B. V., Alblasserdam, Chapter 5; Fraley 등, Crit. Rev. Plant ScL 4:1-46; An 등 (1985) EMBO J. 4:277-287; 그리고 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려지 고 이용가능한 많은 후속의 참고문헌들에 설명되어 있다.

표지 유전자들

형질전환체들을 식별하는 능력을 개선하기 위하여, 어떤 이는 하나 이상의 마커 유전자들을 본 발명의 이종의 폴리뉴클레오티드로 채용하는 것을 원할 수도 있다.

본 발명에 따르는 표지 유전자들은, 표지가 화학적 수단에 의하여, 즉, 선택적 시약(예를 들어, 제초제, 항생물질 등)의 사용을 통하여 "선택"할 수 있는 특징을 제공하는지 여부, 또는 그것이 시험의 관찰을 통하여, 즉, "스크리닝(screening)"에 의하여 식별할 수 있는 단순한 "리포터(reporter)" 특징인지 여부에 따라서, 표지를 암호화하는 것들과 차단가능한 표지를 암호화하는 것들을 포함한다. 물론, 적합한 표지 유전자들 또는 리포터 유전자들의 많은 예들이 이 기술에서 알려져 있고 본 발명의 실시에 채용될 수 있다.

선택가능한 또는 차단가능한 표지 유전자들이라는 용어들에 포함된 것들은 그의 분비가 검출될 수 있는 "분비가능한 표지"를 형질전환된 세포들을 위하여 식별하거나 선택하는 수단으로서 암호화하는 유전자들이다. 예들은 항체 상호작용에 의하여 식별될 수 있거나, 심지어는 그들의 촉매 활성도에 의하여 검출될 수 있는 분비가능한 효소들에 의하여 식별될 수 있는 분비가능한 항체를 암호화하는 표지들을 포함한다. 분비가능한 단백질들은 예를 들어 ELISA에 의하여 검출될 수 있는 작고, 확산가능한 단백질들, 그리고 세포벽에 삽입되거나 포획되는 단백질들(예를 들어, extensin의 발현 단위 또는 담배 PR-S에서 발견되는 것과 같은 리더 서열을 포 함하는 단백질들)을 포함하는 수 많은 류들로 분류된다.

선택가능하고 분비가능한 표지들에 관하여, 세포벽 내에 격리되고 독특한 에피토프(epitope)를 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자의 사용은 특히 유리한 것으로 생각된다. 그러한 분비된 항체 표지는 식물 조직에서 낮은 배경을 제공하려고 하는 에피토프 서열, 혈장 막을 거쳐서 효율적인 발현 및 표적화를 제공하려고 하고 세포벽에 결합되는 단백질을 생성하려고 하고 아직은 항체들에게 접근할 수 있는 프로모터-리더(leader) 서열을 이상적으로는 채용하려고 할 것이다.

이러한 방법에서 변형을 위하여 적합한 단백질의 한 예는 extensin, 또는 하이드록시프롤린(hydroxyproline)이 풍부한 글리코프로틴(HPRG)이다. HPRG의 사용(Stiefel 등, 1990)은 분자 생물학, 발현, 그리고 단백질 구조의 관점에서 잘 특징화되어 있다. 그러나, 다양한 extensin들 및/또는 글리신이 풍부한 벽 단백질들(Keller 등, 1989) 중 어느 하나는 차단가능한 표지를 생성하는 유전자 이식 자리의 추가에 의하여 변경될 수 있을 것이다.

본 개시의 요소들은 특별한 표지 유전자들의 사용을 통하여 상세하게 예시되어 있다. 그러나, 이 개시에 비추어, 수많은 다른 선택가능하고 그리고/또는 차단가능한 표지 유전자들은 아래에서 주장된 것 외에도 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들에게 명백할 것이다. 그러므로, 다음의 논의는 총망라한다기 보다는 예시적이다는 것이 이해될 것이다.

선택가능한 표지들

본 발명과 관련하여 사용을 위한 선택가능한 표지들은, 이들에 제한되지는 않지만, 카나마이신(kanamycin) 내성을 위한 유전암호를 지정하고 카나마이신, G418 등을 이용하여 선택될 수 있는 네오(neo) 유전자 (Potrykus 등, 1985); bialaphos 내성을 위한 유전암호를 지정하는 바(bar) 유전자; 변경된 EPSP 신타아제(synthase) 단백질(Hinchee 등, 1988)을 암호화하여 glyphosate 내성을 제공하는 유전자; bromoxynil에 대한 내성을 제공하는 Klebsiella ozaenae로부터의 bxn과 같은 니트릴라제(nitrilase) 유전자 (Stalker 등, 1988); 이미다졸리논(imidazolinone), 술포닐우레아(sulfonylurea), 또는 다른 ALS-억제 케미컬들에 대한 내성을 제공하는 돌연변이 아세톨락테이트 신타아제 유전자(acetolactate synthase gene (ALS)) (유럽특허출원 154,204); methotrexate-resistant DHFR 유전자 (Thillet 등, 1988); 제초제 달라폰(dalapon)에 대한 내성을 제공하는 dalapon dehalogenase 유전자 (미국특허번호 5,780,708); 또는 5-메틸 트립토판(5-methyl tryptophan)에 대한 내성을 제공하는 돌연변이된 안트라닐레이트 신타아제 유전자(anthranilate synthase gene) (PCT 공개번호 WO 97/26366)를 포함한다. 돌연변이 EPSP 신타아제 유전자가 채용되는 곳에서는, 적절한 엽록체 트랜시트 펩티드, CTP의 결합을 통하여 실현될 수도 있다 (미국특허번호 4,940,835). 또한 Lundquist 등에게 허여된 미국특허번호 5,508,468를 보라.

형질전환체들을 선택하기 위한 본 발명의 실시예들에서 사용될 수 있는 선택가능한 표지 유전자의 예시적 실시예는 Streptomyces hygroscopicus으로부터의 bar 유전자 또는 Streptomyces viridochromogenes로부터의 pat 유전자와 같은 효소 phosphinothricin acetyltransferase를 암호화하는 것들이다 (여기에서 참조로서 결합된 미국특허번호 5,550,318). 상기 효소 phosphinothricin acetyltransferase (PAT)는 제초제 bialaphos, phosphinothricin (PPT) 내의 활성 성분을 불활성화시킨다. PPT는 암모니아의 빠른 축적과 세포 괴사를 야기하는 글루타민 신세타제(glutamine synthetase)를 억제한다 (Murakami 등, 1986; Twell 등, 1989).

여기에서 심사숙고된 적합한 선택가능한 표지 유전자들은 아미노글리코시드 포스포트란스페라아제 유전자(aminoglycoside phosphotransferase gene), 네오마이신(neomycin) 포스포트란스페라아제 유전자, G418 내성 유전자, 글리포세이트(glyphosate) 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 메토트렉세이트(methotrexate) 내성 유전자, 이미다졸리논(imidazolinones) 내성 유전자, 술포닐우레아(sulfonylureas) 내성 유전자, 트리아졸피릴리딘(triazolopyrirnridine) 제초제 내성 유전자, 암피실린(ampicillin) 내성 유전자, 테트라시클린(tetracycline) 내성 유전자, 박테리아 카나마이신(bacterial kanamycin) 내성 유전자, 포스피노스리신(phosphinothricin) 내성 유전자, 클로람페니콜 아세틸트란스페라아제(chloramphenicol acetyltransferase (CAT)) 유전자 및 루시페라아제(luciferase) 유전자를 포함한다.

차단가능한 표지들

채용될 수 있는 차단가능한 표지들은, 이들에 제한되지는 않지만, 다양한 발색성 기질들이 알려지는 효소를 암호화하는 베타-글루쿠로니다제(beta- glucuronidase) 또는 uidA 유전자 (GUS); 식물 조직들에서 안토시아닌(anthocyanin) 색소들(적색)의 생성을 조절하는 생성물을 암화화하는 R-locus 유 전자 (Dellaporta 등, 1988); 다양한 발색성 기질들이 알려지는 효소를 암호화하는 베타-락타마제(beta-lactamase) 유전자 (Sutcliffe, 1978) (예를 들어, PADAC, a chromogenic cephalosporin); 발색성 카테콜(catechols)들을 변환할 수 있는 카테콜 디옥시게나제(catechol dioxygenase)를 암호화하는 자일(xyle) 유전자 (Zukowsky 등, 1983); 알파-아밀라제(amylase) 유전자 (Tkuta 등, 1990); 티로신을 DOPA와 도파퀴논(dopaquinone)으로 산화시킬 수 있는 효소를 암호화하고, 연이어 농축되어 쉽게 검출할 수 있는 화합물인 멜라닌을 형성하는 티로신(tyrosinase) 유전자 (Katz 등, 1983); 발색성 기질들이 있는 효소를 암호화하는 베타-갈락토시다제(galactosidase) 유전자; 생물발광 검출을 허용하는 루시페라아제(luciferase) (lux) 유전자 (Ow 등, 1986); 또는 칼슘에 민감한 생물발광 검출에서 채용될 수 있는 애쿠오린(aequorin) 유전자 (Prastier 등, 1985), 또는 녹색 발광 단백질 유전자 (Niedz 등, 1995)를 포함한다.

R 유전자 복합물로부터의 유전자들은 유용한 차단가능한 표지들로서 고려된다. R 유전자 복합물은 대부분의 종자와 식물 조직들에서 안토시아닌 안료들의 생산을 조절하도록 작용하는 단백질을 암호화한다. 옥수수 라인들은 발육의 그리고 조직 특정 방법으로 안료화를 조절하도록 결합되는 하나 또는 네 개만큼 많은 R 대립형질 유전자들을 가질 수 있다. 그러므로, 그러한 세포들로 도입된 R 유전자는 붉은 안료의 발현을 야기할 것이고, 안정적으로 결합되면, 시각적으로 붉은 섹터로서 기록될 수 있다. 어떤 라인이 안토시아닌 생합성 경로(C2, A1, A2, Bz1, Bz2)에서 효소의 중간물질들을 암호화하는 유전자들을 위한 지배적인 대립형질 유전자들 을 나르지만 R 유전자 자리에서 열성의 대립형질 유전자를 나르면, R을 갖는 라인으로부터 임의 세포의 형질전환은 붉은 안료 형성으로 귀결될 것이다. 예시적인 라인들은 rg-Stadler 대립형질 유전자 그리고 TRl 12, r-g, b, Pl인 K55 유도체를 함유하는 Wisconsin 22를 포함한다. 대안적으로, 옥수수의 임의 유전자형은 C1과 R 대립형질 유전자들이 함께 도입되면 이용될 수 있다.

그러한 이종의 폴리뉴클레오티드들의 발현을 조절하기 위한 메커니즘들을 제공하기 위하여, R 유전자 조절 영역들이 본 발명의 이종 뉴클레오티드들에서 채용될 수 있다는 것이 더 고려된다. 표현형의 발현의 더 많은 다양성은 어떤 다른 유전자 자리에서보다 R 유전자 자리에서 알려진다 (Coe 등, 1988). 영역들 5'로부터 구조적인 R 유전자까지에서 얻어진 조절 영역들은 유전자들의 발현들, 예를 들어, 곤충 저항성, 가뭄 저항성, 제초제 내성 또는 다른 단백질 복제 영역들을 지시하는데 가치가 있을 것이라는 것이 고려된다. 본 발명의 목적들을 위하여, 다양한 R 유전자 과 멤버들 중 어느 것이 성공적으로 채용될 수 있다고 믿어진다 (예를 들어, P, S, Lc, 등). 그러나, 가장 바람직한 것은 일반적으로 Sn (특히 Sn:bol3)일 것이다. Sn은 R 유전자 복합체의 지배적인 멤버이고 Sn이 소정의 종자 및 식물 세포들에서 안토시아닌 안료들의 조직 특정 증착을 제어한다는 점에서 기능적으로는 R 및 B 유전자 자리와 유사하고, 그러므로 그의 표현형은 R과 유사하다.

본 발명에서의 사용을 위하여 고려된 또 다른 차단가능한 표지는 lux 유전자에 의하여 암호화된 반딧불이 루시페라아제(luciferase)이다. 형질전환된 세포들에서 lux 유전자의 존재는, 예를 들어, X-선 필름, 섬광 계수, 형광 분광광도측정, 로우-라이트 비디오 카메라들, 광양자 계수 카메라들 또는 멀티웰 발광도측정을 이용하여 검출될 수도 있다. 또한 이 시스템은 조직 배양판들 상에서와 같은 생물학적 발광을 위한 개체수의 차단, 또는 심지어 전체의 식물 차단을 dnlgdku 개발될 수도 있다는 것이 상상된다.

표지 유전자 가닥화

본 발명에 따르면, 표지 유전자들은 양의 또는 부의 표지로 되기 위하여 이종 폴리뉴클레오티드 내에서 서열과 위치의 선택에 의하여 설계될 수 있다. 이종폴리뉴클레오티드가 표지 유전자의 서열들을 포함하지만 상기 표지 유전자에 대하여 충분한 상보적 서열들을 포함하지 않으면, 상기 이종폴리뉴클레오티드의 전사는 단일 가닥 영역에서 표지 유전자를 포함할 것이고 발현될 수 있다. 이처럼 발현은 이종폴리뉴클레오티드가 숙주 식물로 통합되는 것과 상호관련된다. 이종폴리뉴클레오티드가 표지 유전자의 서열들 그리고 상기 표지 유전자에 대하여 충분한 상보적 서열들을 포함할 때, 이종폴리뉴클레오티드의 전사는 이중가닥 영역에서 표시 유전자를 포함할 것이고, 그것은 침묵될 것이다. 이처럼, 그러한 표지 유전자의 발현은 이종폴리뉴클레오티드가 숙주 식물에서 침묵되지 않을 것이라는 것을 나타낼 것이다 (즉, "부의 표지"). 식물 세포가 정의 표지 유전자와 부의 표지 유전자 모두를 포함하는 이종폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환될 때, 상기 정의 표지 유전자를 발현하지만 상기 부의 표지 유전자를 발현하지 않는데, 이는 식물이 상기 이종폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 전사하고 있고 침묵시키고 있다는 것을 나타낸다. 이처럼, 발현은 이종폴리뉴클레오티드가 숙주 식물로 통합되는 것과 상호관련 된다(즉, 정의 서열들이 선택될 수 있다).

표지 유전자 서열의 선택

통상의 지식을 가진 자는 이제는 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드 내의 다른 위치들에서 표지들의 조합들이 어떻게 유효할 수 있는 지를 쉽게 인식할 것이다. 그러한 위치에서의 차이들은 상기 표지가 침묵되던지 아니면 수소 결합에 의하여 이중 가닥 구조를 형성하는 영역 내의 Ce-g-a 유전자가 식물의 내부 방어 메커니즘들에 의하여 외부의 것으로 인식되어 siRNA(즉, "침묵된")로 가수분해된다.

예를 들어, 일 실시예에서, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 영역의 가상적인 A 유전자 (즉, 본 발명의 임의 표지 유전자) 업스트림과 상기 이중 가닥 영역 내 가상적인 B 유전자를 포함한다. 형질전환되지 않은 세포는 A 발현이 부족하다 ("A-). 그것은 또한 B- 그리고 C-이다. (예를 들어, B 유전자가 놓인 영역의 유전자 침묵화에 의하여) B 영역을 기능적으로 불활성화시키는 형질전환 세포는 A+ 그리고 B-이다. 상기 B 영역을 활성화시키지 못하는 형질전환 세포는 A+ 그리고 B+이다.

이제 통상의 지식을 가진 자는 상기 표지 유전자의 센스 서열들의 대략 다운스트림에 놓인 표지 유전자의 안티센스 서열의 존재가 그러한 표지 유전자의 유전자 침묵화(예를 들어, 이중가닥 형성)를 더 손쉽게 할 것이라는 것을 인식할 것이다.

또한, 이중가닥 영역의 다운스트림으로 국소화된 표지는 프로모터가 그러한 이중가닥 영역과 그러한 표지 사이에 놓이지 않으면 침묵될 것이라는 것이 이제는 쉽게 인식되어야만 한다.

일실시예에서, 본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드들은 표 7에 제시된 구조들을 갖는 그러한 것들을 포함한다.

[표 7]

이종 폴리뉴클레오티드들

[표 7A]

이종 폴리뉴클레오티드들

[표 7B]

이종 폴리뉴클레오티드들

[표 7C]

이종 폴리뉴클레오티드들

[표 7D]

이종 폴리뉴클레오티드들

[표 7E]

이종 폴리뉴클레오티드들

프로모터 및 조절 요소들( Promoter and Regulatory Elements )

본 발명에 따르면, 이종의 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 일부는 식물에 전사될 수 있다. 식물들에서, 그러한 전사는 상기 이종의 폴리뉴클레오티드에 구동적으로 연결된 프로모터를 요구한다. 그러한 프로모터는 그 식물에 대하여 내인성일 수 있다. 예로서, 이종의 폴리뉴클레오티드는 구성요소이거나 유도가능한 식물 프로모터에 인접하게 삽입될 수 있다.

본 발명의 이종 폴리펩티드는 프로모터를 선택적으로 포함할 수 있다. 그러한 프로모터는 식물에서 기능하는 식물 프로모터이거나 비식물 프로모터일 수 있다.

식물 프로모터들은, 이들에 제한되지는 않지만, 리불로스-1,6-비스포스페이트(ribulose-1,6-bisphosphate (RUBP)) 카복시라제 작은 아단위 (ssu), 베타-콩글리신(conglycinin) 프로모터, 베타-파서린(phaseolin) 프로모터, ADH 프로모터, 열-충격(heat-shock) 프로모터들, 그리고 모든 세포 타입들에서 그리고 항상 연속적인 유전자 발현을 지시하는 것이 바람직한 곳에서의 구성요소인 프로모터와 같은 조직 특정 프로모터들을 포함한다 (예를 들어, actin, ubiquitin, CaMV 35S 등).

다양한 소스들로부터의 프로모터들은 식물 세포들에서 외부 유전자들을 발현하기 위하여 효율적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 옥토핀 신타아제 프로모터(octopine synthase promoter), 노파린 신타아제 프로모터(nopaline synthase promoter), 르나노핀 신타아제 프로모터(rnannopine synthase promoter)와 같은 박테리아 기원; 꽃양배추 모자이크 바이러스 (35S와 19S), 35T (이는 재가공된 35S 프로모터, 미국특허번호 6,166,302, 특히 예 7E를 보라)와 같은 바이러스 기원의 프로모터들 등의 프로모터 조절 요소들이 사용될 수 있다. ;

물리적 자극 (열충격 유전자들), 빛 (RUBP 카복시라제), 호르몬 (Em), 대사산물들, 케미컬, 그리고 응력과 같이, 특정 신호에 반응하여 유전자들의 발현에 책임이 있는 유도가능한 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 식물들에서 기능하는 다른 바람직한 전사 및 번역 요소들이 사용될 수도 있다. 수 많은 식물 특정 유전자 전이 벡터들이 이 기술에서 알려져 있다.

식물 조직들 및 기관들에서 활성일 뿐만 아니라 식물의 발육의 소정 단계동안 활성인 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 그러한 프로모터들의 예들은 이들에 제한되지는 않지만 꽃가루-특정, 배아-특정, 옥수수-실크-특정, 면-섬유-특정, 뿌리-특정, 종자-배젖 특정 프로모터들 등을 포함한다. 조직 특정 프로모터 조절 요소들은 잎들 또는 종자들과 같은 조직들에서 전사를 촉진시키는 것이 바람직한 곳에서 사용될 수 있다 (예를 들어, zein, oleosin, napin, ACP, globulin 등)

식물 세포에서 기능하는(즉, 이종 폴리뉴클레오티드의 전사를 지원하는) 임의 프로모터는 본 발명에서 유용하지만, 상대적으로 더 강하거나 더 약한 프로모터를 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 일실시예는 해충 병원성 유전자의 센스 서열을 구동하는 강한 프로모터와 상기 해충 병원성 유전자의 안티센스 서열을 구동하는 더 약한 프로모터를 사용한다. 이 기술에 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 실시예들에서 실험적으로 프로모터 강도를 쉽게 판단할 수 있다. 어떤 실시예가 두 개의 프로모터들을 포함할 때(두 개의 다른 전사들을 구동하는), 상대적인 전사율은 전사를 양론화하므로써 판단될 수 있다 (예를 들어, 양론적 PCR).

상대적으로 강한 프로모터들의 예들은 현삼(figwort) 모자이크 바이러스 프로모터와 향상된 CaMV 35S 프로모터이다. 상대적으로 더 약한 프로모터의 예는 CaMV 35 S 프로모터이다. 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 "더약한(weaker)", 그리고 "더강한(stronger)"이라는 용어는 상대적인 용어이고 이들은 예를 들어 프로모터들에 의하여 구동되는 전사에 대항하는 적절한 프라이머들을 이용한 양론적 PCR에 의하여 실험적으로 식별될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.

매트릭스 부착 영역들, 골격 부착 영역들, 인트론들(introns), 인핸서들(enhancers), 폴리아데닐화 서열 등과 같은 다른 요소들이 제공될 수 있고 그리하여 전사 효율 또는 DNA 통합을 개선할 수도 있다. 그러한 요소들은 더 나은 발현 또는 DNA의 기능화를 제공하지만, 그들은 DNA 기능을 위하여 필요할 수도 필요하지 않을 수도 있다. 그러한 요소들은 원할 때 DNA에 포함되어 식물에서 형질전환된 DNA의 최적의 성능을 얻을 수 있다. 전형적인 요소들은 이들에 제한되지는 않지만, Adh-intron 1 , Adh-intron 6, 알팔파 모자이크 바이러스 코트 단백질 리더 서열, 옥수수 스트릭 바이러스 코트 단백질 리더 서열과, 통상의 기술자들에게 이용가능한 다른 것들도 포함한다.

종결자( Terminator )

본 발명의 이종 폴리뉴클레오티드들은 종결자를 선택적으로 포함할 수 있다. "종결자"란 용어는 전사의 종결을 신호로 보내는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열을 말한다. 진핵생물의 종결자들은 폴리 (A) 서열들을 1차 전사의 3'-말단에 첨 가하는 것을 손쉽게하는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3'-번역되지않은 DNA 서열들이다.

바이러스들, 효모들, 곰팡이들, 박테리아, 곤충들, 새들, 포유동물들 그리고 식물들로부터 유래된 세포들에서 활성인 종결자들은 문헌에서 알려지고 설명되되며 본 발명에서 유용하다. 그 종결자들은 박테리아, 진균들, 바이러스들, 동물들 그리고/또는 식물들로부터 분리될 수 있다.

본 발명에서의 사용을 위하여 적합한 종결자들의 예들은 Agrobacterium tumefaciens의 노파린 신타아제(nopaline synthase (NOS)) 유전자 종결자, 꽃가루 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 유전자의 종결자, Zea mays로부터의 제인(zein) 유전자 종결자, Rubisco 작은 아단위 (SSU) 유전자 종결자 서열들, 서브클로버 스턴트 바이러스(Subclover stunt virus (SCSV)) 유전자 서열 종결자들 (국제특허출원번호 PCT/AU95/00552), 그리고 Flaveriu bidents 말릭 효소 유전자(malic enzyme gene) NSEA3의 종결자 (PCT/AU95/00552)를 포함한다.

이 기술에서 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명을 수행하는데 있어서 사용을 위하여 적합한 추가적인 프로모터 서열들과 종결자 서열들을 인식할 것이다. 그러한 서열들은 어떠한 부당한 실험없이 쉽게 사용될 수도 있다.

본 발명의 실시예들은 하나 이상의 종결자를 갖는 것이 바람직한 경우에 여기에서 배워진다. 그러한 예들은 센스 및 안티센스 서열들이 별도의 전사들 상에 포함되게 될 경우들이다(즉, 각각은 자신의 3' 및 5' 말단을 가진다).

식물 재생 및 전파

형질전환 다음에 식물은, 예를 들어, 이 기술에서 표준인 것으로서, 단일 세포들, 캘러스 조직, 또는 잎 디스크들로부터 재생될 수도 있다. 이용가능한 기술들은 Vasil 등 (1984) in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, VoIs. I, II, and III, Laboratory Procedures and Their Applications (Academic press); 그리고 Weissbach 등 (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989에서 검토된다.

현탁액 배양 발육동안, 작은 세포 집합체들 (10-100 세포들)이 분명히 더 큰 세포 클러스터들로부터 형성되어 상기 배양에게 분산된 외형을 제공한다. 이들 세포들을 고체 배지에게 플레이팅(plating)할 때, 체배아 발육이 유도될 수 있고, 이들 배아들은 성숙되고, 발아되어 번식능력이 있는 종자를 가진 식물들로 성장된다. 대안적으로, 고체 배양 배지 상에서 성장하는 캘러스 세포들 유도되어 번식능력이 있는 종자를 가진 식물들이 발육할 수 있는 체배를 형성할 수 있다. 배형성도, 재생능력, 그리고 식물 번식능력의 특징들은 현탁액 배양에서 시간의 함수로서 점차적으로 잃게 된다. 현탁액 세포들의 냉동보존은 배양체의 발육을 억제하고 냉동 보존 기간동안 이들 특징들의 손실을 방지한다.

형질전환된 식물들은 이후 성장될 수 있고, 동일한 형질전환된 염색 또는 다른 염색들 중 어느 하나로 수분될 수 있고, 원하는 표현형의 특징의 발현을 갖는 결과적인 라인이 식별된다. 원하는 표현형의 특징의 발현이 안정적으로 유지되고 상속되는 것을 확실하게 하기 위하여 둘 이상의 세대들이 성장될 수도 있고, 이후 원하는 표현형의 특징의 발현이 달성되었는지를 확실히 하기 위하여 종자들이 수확 되었다.

식물 외에도, 본 발명은 그러한 식물, 종자, 자신 또는 혼성의 후손들의 임의 복제, 그리고 커팅, 꽃가루, 또는 씨앗과 같이, 이들중 어느 것의 일부의 복제를 제공한다. 본 발명은 재생 또는 전파, 커팅, 씨앗 등을 포함하는 유성생식 또는 무성생식에서 사용될 수도 있는 임의 부분인 식물 프로파귤(propagule)을 제공한다. 또한, 본 발명에 포함되는 것은 봄에 유성생식 또는 무성생식으로 전파되는 식물, 클론, 또는 그러한 식물의 후손; 또는 상기 식물의 임의 부분 또는 프로파귤, 오프-스프링, 클론, 또는 후손이다. 식물 추출물들과 유도체들이 또한 제공된다.

유전자 적층

본 발명에 따르는 이종의 뉴클레오티드는 다수의 센스 서열들과 다수의 안티센스 서열들(즉, "polycistronic heterologous polynucleotide")을 포함할 수 있다. 그러므로, 이종 폴리뉴클레오티드는 다수의 해충들에 대항하여 식물을 보호할 수 있다.

유전자 적층을 이용하므로써, 이 기술에서 통상의 숙련자는 식물이 다수의 해충들에 대한 내성을 갖도록 생산될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 식물은 다수의 균 해충들에 대한 내성을 갖도록 제조될 수 있다. 본 발명에 따르는 유전자 적응의 하나의 비제한적인 예로서, 콩들은 갈색 줄기썩음병(Phialophora gregata), 줄기 및 뿌리 썩음병(Phytophthora sojae), 하얀 곰팡이병 (Sclerotinia sclerotiorum), 급사 징후 (Fusarium solani pisi), 그리고 녹두병 (Phakopsora pachyrhizi)에 대한 내성을 갖고서 제조될 수 있다.

선택적으로, 식물은 다수의 곤충 해충들에 대한 내성을 갖고서 제조될 수 있다. 본 발명에 따르는 유전자 적층의 한 가지 비제한적인 예로서, 감자들은 감자 멸구(Empoasca filament), 콜로라도 감자 딱정벌레(Leptinotarsa decemlineata), 그리고 복숭아혹진딧물 (Myzus persicae)에 대한 내성을 갖고서 제조될 수 있다.

선택적으로, 식물은 다수의 균류 및 비균류 해충들에 대한 내성을 갖고서 제조될 수 있다. 본 발명에 따르는 유전자 적층의 한 가지 비제한적인 예로서, 감자들은 감자 시스토 선충(Globodera rostochiensis), 콜로라도 감자 딱정벌레(Leptinotarsa decemlineata), 그리고 감자 역병 (Phytophthora infestans)에 대한 내성을 갖고서 제조될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 두 가지 다른 센스 서열들과 두 가지 다른 안티센스 서열들을 포함한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는 적어도 세 가지 다른 센스 서열들과 적어도 세 가지 다른 안티센스 서열들을 포함한다.

식물 해충들은 종종 감염된 식물들이 황색 또는 갈색이 되도록 하고, 크기가 감소되도록 하고, 뿌리 삼출액들을 덜 생산하도록 하고, 그리고 더 빨리 성숙하도록 한다. 그러므로, 식물의 한 가지 주요한 해충을 조절하는 것은 해충들에게 더 영향을 받기 쉬운 식물을 만들수 도 있다. 식물의 균 질병이 조절되면, 건강한 식물은 더 오랜기간동안 크고 녹색으로 있을 것이고, 그러므로 곤충들 및 공기로 운반되는 균 질병들에게 매력적이고 감염되기 쉬울 것이다. 녹색 식물은 또한 더 많은 선충들과 뿌리 감염 균들을 끌어들일 더 많은 뿌리 삼출액들을 생산할 수 있다. 놀랍게도 다수의 해충 유전자들과 상동인 서열들을 포함하는 이종의 폴리뉴클레오티드로서 식물을 형질전환하는 것이 유리할 수 있다는 것이 여기에서 발견되었는데, 여기서 그러한 유전자들은 다른 분류군들(예를 들어, 아종, 종, 속, 과, 목, 강)의 해충들로부터 온 것이다.

탈병인 ( Depathogenesis )

해충이 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포를 감염시킬 때, 상기 해충은 상기 형질전환된 숙주 식물 세포와 형질전환되지 않은 숙주 식물 세포들에 대하여 덜 병원성이 된다는 것이 발견되었다. 더욱이, 일실시예에서, 해충은 본 발명에 따라서 형질전환된 숙주 식물 세포를 감염시키고 이후 먹이공급에 의하여 상기 식물로부터 유래된 유전자 침묵화 분자들이 메이팅(mating)(예를 들어, 세포질내 전송, 접합, 균사융합 등에 의하여)을 통하여 이후 해충의 집단들로 전송되고 덜 병원성인 해충을 생성한다. 이런 식으로, 해충들의 집단들은, 예를 들어, 번식할 수 없는 해충에 의하여 비병원성(즉, 병원성이 덜한)으로 만들어질 수 있고, 해충으로 오염된 거대환경(예를 들어, 토양, 식물 잎, 식물 잔해, 빌딩들)은 그것으로부터 보호되거나 오염으로부터 벗어날 수 있다.

선택적으로, 해충의 자손들은 형질전환된 숙주 식물 세포와 형질전환되지 않은 숙주 식물 세포들에 대하여 덜 병원성이다.

따라서, 본 발명의 일실시예는 생물학적 조절을 위한 메커니즘이고, 그것이 균들의 병원성 해충 고립자들의 중요한 밭들을 고갈시키고 제초제들의 적용을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다는 점에서 상당한 경제적인 가치를 가진다. 본 실시 예에서, 유전자 도입 식물은 해충 먹이공급 거동을 통하여 해충에게 siRNA들을 전송하고, 상기 해충은 자신의 병원성 유전자의 후속적인 침묵화로 인하여 그의 병원성을 잃어버린다. 더욱이, 해충 자손들은 순차적으로 비병원성(예를 들어, 세포질내 전송, 메이팅, 접합, 균사융합에 의하여)이 되고, 그것에 의하여 그 해충의 국소적 환경을 정화하고 해충의 식물 파괴 거동을 예방하거나 혹은 상당히 감소시킬 것이다.

일실시예에서, 탈병인은 비병원성의(직접 형질전환되거나 혹은 얻어진 siRNA들을 가지는) 해충들을 병원성의 해충들과 공동배양하므로써 달성된다. 그러한 공동 배양은, 비제한적인 예로서, 성장하여 토양을 감염시키는 유전자 도입 해충의 브로드캐스트에 의하여 달성되는데, 여기서 상기 비병원성 해충들은 이후 유사종과 교잡한다. 그러한 브로드캐스트는, 비제한적인 예로서, 형질전환된 균들을 보리 또는 밀 종자들 상에서 공동배양하고 이후 그러한 종자들을 탈병인화 또는 병원성 해충들로부터 보호될 필요가 있는 토양에 뿌려주므로써 균들을 위하여 달성될 수 있다.

본 실시예는 나무들(예를 들어, 아메리카삼나무, 오크, 야자나무, 단풍나무 등)과 같은 가치있는 식물들을 보호하기 위하여 적합하다.

이전의 논의가 예로서 균사 식물 병원체들을 사용하지만, 통상의 지식을 가진 자들에게 쉽게 분명해지듯이, 탈병인을 위한 전략은 "침묵된" 특징을 그들의 후손에게 전달하려고 하는 다른 식물 해충들에게도 적합하게 될 수 있다.

첫 번째로, 해충 병원성 유전자를 침묵시키므로써 해충을 "탈병원균화하는" 것이 가능하다. 이후 상기 해충은 환경(예를 들어, 토양)에서 생존할 수 있고 군체들을 통하여 siRNA들을 전파하고 더 이상 식물들을 공격하지 않을 것이다. 두 번째로, 리보솜 RNA 또는 엘리시틴 유전자들과 같은 주요한 구조적 유전자들 또는 필수 영양분 유전자들을 각각 침묵시키므로써, 해충을 쇠약하게 하거나 죽여서 작물 재배 지역들로부터 해충을 제거하거나 그의 존재를 경제적인 분기점들 아래로 낮추는 것이 가능하다.

예들( Examples )

예 1. 복제 전략

플라스미드 pVZA1OO, pVZA200, pVZA300, 및 pVZA400은 담배 (Nicotiana tobacum, cv. Xanthi), 콩(Glycine max cv. Williams 82), 감자(Solanum tuberosm cv. Alpha) 및 옥수수(Zea mays cv. Hi II x B73)를 포함하지만, 그에 국한되지는 않는 다양한 식물 종의 형질전환을 위해 계획된 실시예이다. pVZA1OO은 dGUS로 불리는 E. coli β-글루쿠로니다아제 유전자(GUS)의 부위(817 bp)를 포함하는 스페이서 영역에 의해 분리된 센스(S) 및 안티센스(AS) 방향(orientation) 내 Phytophthora nicotianae로부터의 전장(full-length) 큐티나아제 유전자를 포함한다. 식물에서 pVZA1OO 발현은 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터와 오이 모자이크 바이러스(CMV) 캡시드 단백질 유전자 5' 미번역 영역(5' UTR)의 제어 하에 있다. 종결 신호도 CaMV 35S 유전자로부터 나온다. pVZA1OO 플라스미드의 백본(backbone)은 플라스미드 pCAMBIA1201(도 1)이다(Roberts 등, 2000). 그 식 물 선택성 마커는 항생 하이그로마이신(antibiotic hygromycin)이다. pCAMBIA 1201에서 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(phosphotransferase)의 발현도 CaMV 35S 프로모터와 종결자에 의해 제어된다. pCAMBIA 1201에서 리포터 유전자는 카탈라아제 인트론과 CaMV 35S 프로모터도 가지지만, 노팔린 신타아제(nopaline synthase: NOS) 종결자를 가지는 GUS이다.

예 2. 중간 플라스미드 pVZA1 의 구성

그 다목적성으로 인해, 유전자 발현 플라스미드 pUC18cpexp(Slightom, 1991)이 유전자 침묵 카세트(gene silencing cassette)를 포함하도록 선택되었다. 이 플라스미드는 pUC18이며, CaMV 35S 프로모터를 포함하고, CMV 캡시드 단백질 유전자 5' TJTR 및 CaMV 35S 유전자 종결 신호가 후속한다. Bgl II 위치가 CMV 5' UTR과 CaMV 35S 종결자 사이의 다중 링커(polylinker)로 처리되었다. dGUS를 얻기 위해, 플라스미드 pCAMBIA1201(도 1)가 Nco I 및 Hinc II로 이중 소화되었다. pCAMBIA1201의 뉴클레오티드 9540 내지 10361에 해당하는 길이 821 bp GUS 단편은 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 격리되고 정제되었다. 상기 단편은 그 후 3' Nco I 위치에서 녹두 뉴클리아제(mung bean nuclease)를 이용하여 소화(둔화)되어 817 bp로 감소되었다. 이러한 둔화-말단(blunt-ended) dGUS는 그 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 재정화되고 pUC18cpexp의 Bgl II 위치로 결찰(ligation)되어 중간 플라스미드 pVZA1(도 2)을 만들어냈다.

예 3. pVZA2 , pVZA3 , pVZA100 , pVZA200 , pVZA300 및 pVZA4O0 플라스미드의 구성

P. nicotianae로부터의 전장 큐티나아제 유전자는 각각 Not I 및 Nco I 제한 위치를 가지는 프라이머 VZA 1F (SEQ ID NO: 1) 및 VZA 2R (SEQ ID NO: 2)을 이용하여 플라스미드 pZErO-2.1 (Munoz 및 Bailey, 1998) 내의 큐티나아제 클론(clone)으로부터 PCR에 의해 안티센스 방향으로 증폭되었다. 그 후 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제되고 플라스미드 pVZA1의 Not I 및 Nco I 위치로 결찰되었다. 결과 플라스미드, pVZA2는 E. coli (대장균)에서 복제되고 정제되었다. 센스 방향의 큐티나아제 유전자 복사체(copy)는 각각 Apa I and Xho I 제한 위치를 포함하는 프라이머 VZA 3F 및 VZA 4R (각각 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4)을 이용하여 플라스미드 pZErO-2.1 내의 동일한 큐티나아제 클론으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 상기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제되고, 플라스미드 pVZA2 내의 Apa I 및 Xho I 제한 위치로 결찰되어 최종 중간 플라스미드 pVZA3(도 3)을 생산하였다. dGUS를 포함하고 센스 및 안티센스 방향 내 큐티나아제 유전자를 분리하는 부위는 침묵 컨스트럭트(silencing construct)로 불린다. 상기 침묵 컨스트럭트와 그 컨스트럭트를 위한 조절 요소(35S 프로모터, 5' UTR 및 35S 종결자)를 포함하는 부위는 침묵 카세트(도 3)라고 불린다.

상기 침묵 카세트는 EcoR I 및 Hind III를 가지는 이중 제한 소화에 의해 플라스미드 pVZA3으로부터 절개되고 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제된다. 상기 플라스미드 pCAMBIA1201는 EcoR I 및 Hind III로 이중 소화되고 상기 침묵 카세트는 그러한 위치로 결찰되어 최종 식물 형질전환 플라스미드 pVZA1OO을 생산한다. 상기 전체 침묵 카세트의 존재는 PstI에 의한 pVZA1OO의 제한 소화(전체 삽입물을 방출)와 그 어셈블리에 사용되는 다양한 제한 효소에 의한 소화에 의해 확인된다. 소화 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었고 공지의 분자 표준(standard)들과 비교되었다. 상기 침묵화 구조체의 상기 서열, 2201 nt는 DNA의 서열화(sequencing)에 의해 확인되고, 이는 SEQ ID NO:5이다. pVZA100 내와 유전자 도입 식물 내에서 각 유전자들의 존재를 검출하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 쌍들이 PCR 프라이머로서 사용되었다: 큐티나아제(SEQ ID NOs: 1 및 2, 또는 SEQ ID NOs: 3 및 4); GUS(SEQ ID NOs: 9 및 10) 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(SEQ ID NOs: 11 및 12).

식물 형질전환 플라스미드 pVZA200, pVZA300 및 pVZA400은 pVZA1OO과 동일한 원리에 기초한다. 침묵 컨스트럭트는 dGUS 단편에 의해 분리된, 센스 및 안티센스 방향 모두에서 선택된 해충 발병성 유전자(pest pathogenicity gene)의 역위 반복(inverted repeat)이다. 그러나, pVZA200, pVZA3O0, 및 pVZA400의 상기 침묵 컨스트럭트는 각각 5' 및 3' 말단에서 ApaI 및 Not I 제한 위치로 GenScript Corporation (Piscataway, NJ)에 의해 상업적으로 합성되고 pUC57 벡터에 복제되었다.

pVZA200의 침묵 컨스트럭트는 진디 Myzus persicae의 카텝신(cathepsin) B 유전자(GenBank locus AY702822)의 뉴클레오티드 221 내지 820을 포함하였다. 이 진디(aphid)는 주요 해충이고 많은 식물 바이러스의 가장 효율적인 벡터(vector)이다. 카텝신 B는 Myzus persicae의 생존과 발전에 필요한 소화 효소, 시스테인 프로테아제(cysteine protease)이다. pVZA200의 침묵 컨스트럭트의 2031 nt 서열이 SEQ ID NO: 6으로서 나타나 있다.

그 후 조절 요소가 상기 pVZA200 침묵 컨스트럭트에 첨가되어 pVZA200 침묵 카세트를 만들었다. 이를 위해, 전체 pVZA1OO 침묵 카세트가 EcoR I 및 Hind III를 이용한 소화에 의해 pVZA1OO으로부터 절개되고 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 상기는 유사하게 소화된 pUC19로 복제되었다. 이 플라스미드는 그 후 ApaI 및 Not I를 이용하여 소화되었다. pVZA1OO으로부터의 조절 요소를 포함하는 상기 pUC19 부위는 정제되고 ApaI 및 Not I를 이용한 소화에 의해 pUC57로부터 방출된 pVZA200 침묵 컨스트럭트로 결찰되었다. 이제 pVZA1OO으로부터의 조절 요소에 의해 플랭크(flank)된 상기 pVZA200 침묵 카세트는 pUC19에서 증식되었다. 전체 pVZA200 침묵 카세트는 EcoR I 및 Hind III를 이용한 소화에 의해 pUC19로부터 절개되고 그 후 pCAMBIA1201의 EcoR I 및 Hind III 위치로 결찰되어 pVZA200 식물 형질전환 플라스미드를 완성하였다. pVZA100을 이용한 경우와 마찬가지로, 전체 침묵 카세트의 존재가 PstI을 가지는 pVZA200의 제한 소화와 그 어셈블리에 사용된 다양한 제한 효소를 이용한 소화에 의해 확인되었다. 상기 소화 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되고 공지의 분자 표준들과 비교되었다.

pVZA200 내와 유전자 도입 식물 내에서 각 유전자들의 존재를 검출하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 쌍들이 PCR 프라이머로서 사용되었다: 카텝신 (SEQ ID NOs: 38 및 39); GUS (SEQ ID NOs: 9 및 10) 그리고 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (SEQ ID NOs: 11 및 12).

식물 형질전환 플라스미드 pVZA300과 pVZA400은 유사하게 계획되고 합성되었 다. pVZA300의 침묵 컨스트럭트는 두 개의 서로 다른 식물 해충들로부터의 유전 서열을 포함하는 이중 유전 컨스트럭트였다. 상기는 pVZA200의 침묵 컨스트럭트와 동일한 카텝신 B 유전자 역위 반복을 dGUS 단편 주위에 포함하도록 설계되었다. 그러나 또한, 상기는 각 말단에 Phytophthora infestans (GenBank locus AY766228)의 엘리시틴(elicitin) INF1의 부분적 코딩 서열을 포함하였다. Phytophthora spp .는 그 성장과 발달에 필수적인 스테롤을 합성하지 않기 때문에, 이 엘리시틴 유전자는 병원성(pathogenicity)의 Phytophthora infestans에 의해 그리고 스테롤 수용체로서 요구된다. 상기 엘리시틴 서열은 282 nt 길이이다. 따라서, 600 nt에 가까운 서열을 얻기 위해서는, 상기 서열이 564 nt를 얻도록 반복되어야 한다.

Apal 제한 위치가 엘리시틴 센스 서열의 5' 말단에 포함되었고, NotI 제한 위치는 엘리시틴 안티센스 서열의 3' 말단에 포함되었다. 엘리시틴 센스 서열은 pVZA200 서열의 5' 말단에 첨가되었고, 엘리시틴 안티센스 서열은 pVZA200 서열의 5' 말단에 첨가되어 pVZA300의 침묵 컨스트럭트를 완성하였다. 상기는 3159 nt 길이이며, 엘리시틴 유전자와 카텝신 유전자로 구성되고, 이 둘은 모두 센스 방향에 위치하고, dGUS가 후속하고, 카텝신 유전자와 엘리시틴 유전자가 각각 후속하며, 이 둘은 모두 안티센스 방향에 위치한다.

pVZA300의 침묵 컨스트럭트의 서열은 SEQ ID NO: 7로서 나타나 있다. 이 서열은 GenScript Corporation에 의해 합성되었고 pUC57 벡터에 복제되었다. 그 후 상기 조절 요소는 pVZA200에 대해 설명된 바와 같이 첨가되어 pVZA300의 침묵 카세트를 완성하고, pCAMBIA1201의 EcoR I 및 Hind III 위치로 복제되었다. 상기와 같 이, 전체 침묵 카세트의 존재는 PstI를 가지는 pVZA300의 제한 소화와 이 어셈블리에 사용되는 다양한 제한 효소를 이용한 소화에 의해 확인되었다. 소화 생성물은 아가로스 전기영동에 의해 분리되었고 공지의 분자 표준들과 비교되었다. pVZA300 내 및 유전자 도입 식물 내에서 각 유전자의 존재를 검출하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 쌍들이 PCR 프라이머로서 사용되었다: 엘리시틴과 카텝신 오버랩(overlap) (SEQ ID NOs: 40 및 39) 카텝신 (SEQ ID NOs: 38 및 39); GUS (SEQ ID NOs: 9 및 10) 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (SEQ ID NOs: 11 및 12).

상기 식물 형질전환 플라스미드 pVZA400의 침묵 컨스트럭트는 dGUS에 의해 분리된, 센스 및 안티센스 방향에 각각 Phytophthora infestans (GenBank locus AJ854293)의 리보솜 RNA 유전자(rDNA) nt 1-600을 포함한다. ApaI 및 NotI 제한 위치는 5' 및 3' 말단에 각각 포함되어 있다. pVZA400의 침묵 컨스트럭트의 서열은 SEQ ID NO: 8로서 나타나 있다. 상기는 GenScript Corporation에 의해 합성되었고 pUC57 벡터에 복제되었다. 그 후 조절 요소는 pVZA200에 대해 설명된 것처럼 첨가되어 pVZA400의 침묵 카세트를 완성하고, pCAMBIA1201의 EcoR I 및 Hind III 위치로 복제되었다. 상기와 같이, 전체 침묵 카세트의 존재는 PstI를 가지는 pVZA400의 제한 소화와 그 어셈블리에 사용되는 다양한 제한 효소를 이용한 소화에 의해 확인되었다. 상기 소화 생성물은 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었고 공지의 분자 표준들과 비교되었다.

pVZA400 내와 유전자 도입 식물 내에서 각 유전자들의 존재를 검출하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드 쌍들이 PCR 프라이머로서 사용되었다: 리보솜(ribosomal) DNA (SEQ ID NOs: 41 및 42); GUS (SEQ ID NOs: 9 및 10) 및 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (SEQ ID NOs: 11 및 12).

예 4. 형질전환 방법

식물 세포들(담배, 콩, 감자 및 옥수수 포함)이 Agrobacterium tumefaciens의 품종 PGV 2260을 사용하여 pVZA100에 의해, 또는 바이오리스틱(biolistic)을 사용하여 pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300, 및 pVZA400 형질전환 플라스미드에 의해 형질전환되었다. 균 배양체(culture)들은 pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300, 및 pVZA400 형질전환 플라스미드로 바이오리스틱에 의해서만 형질전환되었다.

헬륨-구동 바이오리스틱 장치에 의한 포격(bombardment)을 위한 텅스텐 또는 금 마이크로 발사체의 조제는 Shark 등, 1991의 프로토콜에 따라 이루어졌다. 상기 마이크로 발사체는 pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300, 또는 pVZA400로 코팅되거나, 또는 아무런 DNA 코팅이 이루어지지 않는다. 식물 조직과 균류 배양체 형질전환을 위해, 스톱 플레이트(stopping plate)로부터 8 내지 12 cm의 조직을 이용하여 진공(23 mm Hg) 및 1200 PSI에서 Dupont PDS-1000 장치가 사용되었다. 묘목과 작은 식물 형질전환을 위해, 손바닥 크기의 수제 입자 총이 200 PSI에서 사용되었고, 발달 중인 분열 조직에 가능한 한 근접하게 유지되었다.

Agrobacterium tumefaciens에 의한 형질전환은 Rogers 등(1987)에 의해 설명된 것과 같이 본질적으로 실시되었다. 본 발명의 이러한 부분을 예시하기 위해 바이오리스틱과 Agrobacterium tumefaciens 형질전환이 사용되었지만, 형질전환의 목 적으로 이종 기원(heterologous) DNA를 목표 세포로 유도하는, 본 발명 관련 기술 분야에서 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있고, 이는 통상의 숙련 기술자에 의해 용이하게 인식될 수 있고, 목표 종에 따라 최적화될 수 있을 것이다.

예 5. pVZA1OO 및 재생에 의한 담배 형질전환

Nicotiana tabacum cv Xanthi의 기관형성 캘러스(callus) 배양체가 실험실 내 교반 배양체(shake culture) 내에 유지되었고 매달 신선한 MS 배지(Murashige 및 Skoog, 1962)로 옮겨졌다. 캘러스(calli)는 플라스크로부터 무균적으로 제거되었고, 물이 없게 여과되었으며, 무균 페트리(Petri) 접시에서 무균 여과지 위에 퍼뜨려졌다. 전술한 방법에 따라 pVZA100로 포격되었고, 여과지는 식물 호르몬-제거 MS 배지로 밤새 옮겨졌다. 후속일에, 상기 여과지는 유전자 도입 세포의 선택을 위해 1 mg/l 6-벤질아데닌, 0.1 mg/l 납탈린(napthaline) 아세트산, 1 mg/l 티아민-HCl, 100 mg/l 이노시톨(inositol), 30 g/l 수크로오스(sucrose), 6 g/l 파이타가(phytagar) 및 30ug/ml 하이그로마이신을 포함하는 MS 배지로 옮겨졌다. 재생을 위해, 확장 중인 캘러스를 매 2주마다 신선한 MS 배지로 옮겼다. 그 후 나타나는 가지(shoot)는 식물 호르몬이 뿌리를 형성함이 없이 MS 배지로 옮겨졌다. 뿌리 내린 묘목(plantlet)들은 토양으로 옮겨지거나 P. nicotianae에 대한 저항성이 직접 측정되었다. 식물들은 토양에서 성숙기까지 성장되었고 씨앗은 후속 분석을 위해 모아졌다.

예 6. 균류 형질전환 및 선택 프로토콜

Phytophthora nicotianae , P. sojae 및 P. infestans의 5 mm의 균사 상(mycelial) 디스크가 예 3과 5에서 설명된 방법 및 컨스트럭트에 따라 포격되었다. 포격된 배양체는 V-8 한천(agar)의 플레이트에 놓여졌고 27 ℃에서 밤새 배양되었다. 그것들은 후속일에 400 μg/ml 하이그로마이신을 포함하는 V-8 한천 플레이트로 옮겨졌고 27 ℃에서 3-4일간 배양되었다. 디스크(5 mm)는 새로운 성장으로부터 절단되었고 15 ml의 V-8 배양액(broth)을 포함하는 페트리 접시로 옮겨졌으며, 27 ℃에서 2일간 배양되었다. 상기 균사상 매트는 살균수로 세척되었고, 압착 건조되었으며, 10 ml의 토양 추출물로 2일간 배양되어 포자낭(sporangia) 형성을 유도하였다. 정포자(zoospore) 방출을 유도하기 위해, 상기 매트는 무균 탈염수에 놓여져 4 ℃에서 30-60 분간 식혀졌다. 정포자는 5,000 g, 4 ℃에서 5 분간 원심분리에 의해 모아졌다. 선택을 위해, 상기 정포자 농도는 약 1,000/ml로 조정되었고, 400 μg/ml 하이그로마이신과 X-gluc (Jefferson 등, 1986)을 포함하는 V-8 한천에서 평판 배양되었으며 27 ℃에서 수일간 배양되었다.

pCAMBIA1201에서 GUS 유전자에 의해 안정적으로 형질전환된 상기 격리체들(isolates)은 X-gluc 한천에서 단일 정포자로부터 비롯하는 소형 청색 콜로니들로서 나타났다. 그들은 400 μg/ml 하이그로마이신을 포함하는 V-8 한천의 개별 플레이트로 옮겨졌고, 다수 이동 후에 상기 배양체는 시종일관 GUS에 대해 양성, 청색 착색되었다. 상기 격리체들은 단일 정포자로부터 비롯하는 소형 청색 콜로니로서 역시 초기에 나타났던 pVZA100, pVZA200, pVZA300, and pVZA400 침묵화 플라스미드에 의해 형질전환되었다. 그들은 400 μg/ml 하이그로마이신과 X-gluc을 포함하는 V-8 한천의 플레이트로 옮겨졌다. 이 배지 상의 2-3회 이동 후에, 상기 살아 남은 콜로니들은 백색이 되어 GUS 유전자가 침묵하게 되었음을 나타내었다. 모든 배양체들은 27 ℃에 유지되었고 매달 신선한 배지로 옮겨졌다.

예 7. 옥수수, 콩 및 감자의 형질전환

옥수수는 두 개의 플라스미드, pVZA100 및 pBAR184 (Frame 등, 2000)로 코팅된 금 입자에 의해 Hi II 생식질(germplasm)로부터 유형 II 캘러스를 포격함으로써 형질전환되었다. 상기 pBAR184는 공동 형질전환체들(co-transformants)이 하이그로마이신보다는 제초제 바이알라포스(bialaphos)를 포함하는 배지 상에서 선택되고 재생될 수 있도록 포함되었다. 캘러스는 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)과 바이알라포스 각 2 mg/l를 포함하는 N6-계 배지 상에서 성장하고 선택되었다. 재생과 뿌리 내림을 위해, 싹(embryo)들이 2 mg/l의 바이알라포스를 포함하고 식물 호르몬을 포함하지 않는 MS 배지로 옮겨졌다. 뿌리 내린 묘목들은 PCR에 의해 분석되었다.

콩은 Agrobacterium tumefaciens와 바이오리스틱의 양자 모두에 의해 형질전환되었다. 성숙한 싹들은 윌리엄 콩(Williams soybean)의 수화된 씨로부터 무균적으로 절개되었다. 그 후, 상기 싹들은 28 ℃에서 밤새 교반기 상에서 성장된 수 밀리미터의 Agrobacterium tumefaciens 배양체 내에 15분간 적셔졌고 pCAMBIA1201 또는 pVZA100을 함유했다. 처리된 싹들은 15 mg/L의 하이그로마이신과 식물 호르몬(BAP 및 NAA)를 포함하는 MS 배지에 놓여졌고, 그 후 뿌리 내리기 위한 식물 호르몬이 없는 MS 배지에 놓여졌다. 싹-유사 구조들이 형성되고 발아되었으며, 잎들이 생성되었으나(도 6), 많은 배지가 테스트 되었음에도 불구하고, 식물이 재생성 되거나 뿌리 내리지는 않았다. 손바닥 크기의 수제 입자 총을 사용하여 콩의 바이오리스틱 형질전환이 실시되었다. 생후 8-10일, 6-10 cm 길이의 묘목들이 pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 또는 pVZA400로 코팅되거나, 또는 아무런 DNA 코팅을 하지 않은 금 입자에 의해 포격되었다. 상기 식물은 온실에서 성장되었고 PCR에 의해 분석되었다. 성숙한 씨앗이 모아졌고 P. sojae에 대한 저항성이 테스트 되었다.

감자는 Agrobacterium tumefaciens와 바이오리스틱의 양자 모두에 의해 형질전환되었다. Russett Burbank 및 Alpha 감자들이 Agrobacterium tumefaciens에 의해 형질전환되었다. 덩이줄기 작물(tuber)들이 표면 해충 구제되었고(surface disinfested), 감자 "눈들"은 절개되어 식물 호르몬 없이 고체 MS 배지 상에 평판 배양되었다. 상기 눈들이 발아했고, 하나의 잎을 포함하는 마디 부분을 자르고 그 줄기를 신선한 MS 배지에 둠으로써 묘목들이 만들어졌다. 5-7 cm 키의 뿌리 내린 묘목들이 10-15일 내에 만들어졌다. 잎들은 상기 식물들로부터 제거되었고, 줄기들은 1 cm 길이의 조각들로 절단되었다. 상기 조각들은 그 후 상기와 같이 28 ℃에서 밤새 교반기 상에서 성장되고 pCAMBIA1201 또는 pVZA100을 포함하는 수 밀리미터의 Agrobacterium tumefaciens 배양체에 15 분간 적셔졌다. 상기 조각들은 멸균 여과지에 블로팅(blotting)되었고 Cearley 및 Bolyard(1997)의 조직 배양 공정이 후속되었다. 구근 덩이줄기-유사 및 뿌리-유사 구조들이 만들어졌으나(도 8), 많은 배지를 테스트했음에도 불구하고, 식물이 재생되거나 뿌리 내리지는 않았다. 바이오리스틱 형질전환을 위해, 3-5 cm 키의 감자 묘목들이 토양으로 이식되었다. 2-3일 후에, 그들은 손바닥 크기의 수제 입자 총과, pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300 또는 pVZA400로 코팅되거나 아무런 DNA 코팅이 없는 금 입자를 이용하여 포격되었다. 상기 식물들은 온실에서 재배되었고 PCR에 의해 그리고 진디와 P. infestans에 대한 반응에 대해 분석되었다.

예 8. 식물과 균류 조직으로부터의 DNA 및 RNA 추출과 PCR 및 RT / PCR 프로토콜들

전체 DNA가 Dellaporta 등, 1983의 방법에 의해 담뱃잎 조직과 Phytophthora nicotianae의 균사상으로부터 추출되었다. 통상 100 mg의 동결 조직 샘플이 액체 질소를 포함하는 미세원침관(microfuge tube) 내에서 미세 분말로 분쇄되었고, 그 후 모터-구동 스테인레스강 절굿공이에 의해 500 μl의 추출 버퍼 내에서 균질화되었다.

RT/PCR 반응을 위한 전체 RNA가 Invitrogen의 TRIzol 방법에 의해 잎사귀 조직과 균류 균사상으로부터 추출되었다. 통상 100 mg의 조직이 1.8 ml 미세원침관 내의 액체 질소 내에서 동결되었다. 상기는 미세 분말로 분쇄된 후 모터-구동 절굿공이에 의해 1.0 ml의 TRIzol 내에서 균질화되었다. 상기 혼합물은 실온에서 5분간 배양되었다. 그 후, 200 μl의 클로로포름이 첨가되어 와류교반에 의해 혼합되었다. 상기 현탁액은 실온에서 5분간 배양되었다. 상기 관들은 4 ℃에서 5분간 14,000 rpm으로 원심분리되었다. 상기 수성상은 깨끗한 관으로 옮겨졌고, 500 μl의 이소프로판올(isopropanol)이 첨가되었으며 상기 샘플들은 실온에서 10분간 혼합 및 배양되었다. 상기 관들은 다시 4 ℃에서 10분간 원심분리되었고, 상청액은 버려졌다. 상기 펠릿은 4 ℃에서 5분간의 와류교반 및 원심분리를 통해 250 μl의 75% 에탄올로 한 차례 세척되었다. 상기 RNA 펠릿은 잠시 동안 공기 건조되었고, 20 μl의 RNase-제거수(RNase-free water)에 용해되었으며, 사용시까지 -70 ℃에 저장되었다.

siRNA 검출을 위한 전체 RNA의 대형 조제를 위해 유사한 방법이 사용되었다. 통상 1 그램의 동결 잎사귀 또는 균류 균사상이 액체 질소 내에서 미세 분말로 분쇄되었으며 15 ml의 TRIzol 시약에 의해 균질화되었다. 그 후, 3 ml의 클로로포름이 첨가되었으며, 상기와 같이 배양되었다. 상청액은 원심분리에 의해 회수되었고 RNA는 1/2 부피의 이소프로판올에 의해 침전되었다. 상기 펠릿은 75% 에탄올에 의해 세척되었으며, 공기 건조되었고 80 μl의 RNase-제거수 내에 재현탁되었다.

식물과 균류 조직의 양자 모두를 위한 PCR 반응들이 반응 부피가 총 50 μl인 것을 제외하고는 Munoz 및 Bailey, 1998에 의해 설명된 것처럼 본질적으로 수행되었다. 상기 반응들은 1X PCR 버퍼(10X 용액: 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 9.0, 및 1% Triton X-100), 2.5 mM MgCl₂, 200 μM의 각 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 2.5 유닛의 Taq DNA 폴리머라아제(Invitrogen or Promega), 100 pmol의 순방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머(SEQ ID NOs: 참조), 1-10 μl의 템플릿 및 50 μl와 동일해지는 충분한 탈이온수를 포함하였다. 템플릿으로 사용되는 DNA 조제물들은 통상 마이크로리터당 50 ng에 희석되었으며, 1 마이크로리터가 템플릿으로서 사용되었다.

PCR 반응 조건들은 어닐링(annealing) 온도를 제외하고는 표준화되었는데, 상기 어닐링 온도는 증폭된 유전자의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 Tm에 따라 변화했다. 상기 표준화된 조건들은 용융을 위해서 94 ℃에서 2분간, 이어서 연신(elongation)을 위해서 94 ℃ 1분, 어닐링 온도에서 1분, 및 72 ℃에서 2분을 40 사이클이 진행되었다. 40 사이클 후에, 72 ℃에서 10분간의 연신이 진행되었고, 상기 반응물들은 분석될 때까지 4 ℃에서 유지되었다.

RT/PCR 반응들은 Invitrogen에 의해 추천된 바와 같이 3 개의 개별 단계들, DNase 처리, 역전사 및 PCR로 실시되었다. 상기 DNAse 처리는 RNA 정제에서 연기된 임의의 DNA를 제거하여 게놈 DNA가 아니라 메신저 RNA만 전사되도록 보장하기 위해 실시되었다. 상기 DNase 혼합물은 반응마다: 3 μg의 RNA, 1 μl　 10X DNAse I buffer, 2 μl DNAse I, 0.5 μl RNase OUT 및 물(RNase-제거)을 최종 부피 10μl로 포함했다. 이것은 26 ℃에서 30분간 배양되었다. 그 후, 6.5 μl의 25mM EDTA가 관마다 첨가되었고, 65 ℃에서 15분간 배양되었다.

역전사 효소(reverse transcriptase: RT) 반응들을 위해 Mix I과 Mix II가 조제되었다. Mix I은 반응당: 1 μl dNTPs, 4 μl 5X RT 버퍼, 및 2 μl 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 포함하였다. Mix II는 반응마다: 0.5 μl RNase OUT, 1 μl 역전사 효소 및 1 μl 물을 포함하였다. 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머(1 μl 각각 또는 물)가 적절한 관들 내에 놓여졌고, Mix I과 II가 적절하게 첨가되었다. Mix I이 각 튜브에 놓여졌고, Mix II는 홀수 관에, 그리고 2.5 μl 물은 짝수 관에 놓여졌고; 그 후 10 μl의 DNase 처리 RNA는 각 관에 첨가되었다. 상기 RT 반응물은 42 ℃에서 60분간, 그리고 이어서 70 ℃에서 15분간 배양되었다.

예 9. 식물 및 균류 조직들 내의 siRNA 들의 검출

공정은 본질적으로 Hutvagner 등, 2000에서 설명된 바와 같다. 전체 RNA가 상기와 같이 담뱃잎 또는 균류 균사상으로부터 추출되었다. 분광 광도계에서 260 nm에서 정량되었고, 0.025 Amp에서 2.5 시간 동안 15% 겔들 상에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 변성시킴으로써 80 μg이 분별되었다. 겔들은 에티듐 브로마이드로 착색되었고, 촬영되었으며, RNA는 4 ℃, 10 볼트에서 1시간 동안 하이본드(hybond) N+ (Amersham)로 옮겨졌다. 교배(hybridization)가 Northern 블로팅에 대하여 Sambrook 등(1989)에 의해 설명된 것과 같이 실시되었다.

탐침(probe)은 큐티나아제 유전자의 500 bp PCR 생성물로부터 전사되었고, 무작위 프라이밍(priming)에 의해 ³²P로 표지(label)되었다. 멤브레인들이 Amersham의 HYBAID 버퍼로 50 ℃에서 1시간 예비교배(prehybridization)되었고, 50 ℃에서 적어도 16시간 동안 교배되었다. 실온에서 5X SSC에 의해 세척이 2회 실시되었다. Molecular Dynamics의 Storm 860 인광 영상 스캐너를 사용하여 인광 영상화(phosphorimaging)에 의해 교배 신호가 검출되었다.

예 10. 식물 및 균류 조직들의 GUS 착색

X-GLUC 기질의 조제: 200 ml를 위해,　150 ml 증류수로 비커를 준비하고 하기 성분들을 첨가한다: 인산 나트륨 버퍼 pH 7.0 (1 M), 20 ml, EDTA pH 8.0 (500 mM), 4ml, 페로시안 칼륨(potassium ferrocyanide) K4Fe(CN)6.3H2O, 0.042g, Triton X-100 0.2 ml. 10 분간 교반한다. NaOH로 pH 7.0을 맞춘다. 100 mg의 X-GLUC을 2 ml DMSO 또는 디메틸-폼아미드(dimethyl-formamide)에 용해한다. DMSO 내 X-GLUC을 비커에 첨가한다. 상기 용액을 여과 살균하고, 10 ml 분취액(aliquots)으로 분배하며, -20 ℃에서 저장한다. 성장 배지로의 혼합을 위해, DMSO에 용해된 100 mg의 X-GLUC 분말을 냉각되어 균류 격리체를 위해 조제될 준비가 된 250 ml V8 한천 또는 식물 물질들을 위한 MS 배지에 첨가한다.

착색 절차: 충분한 X-GLUC 용액을 첨가하여 식물 조직의 작은 외식편(explant)를 덮고, 37 ℃에서 3-24 시간 동안 배양한다. X-gluc 한천 플레이트 내의 식물 물질들이나 균류 격리체를 위해, 24-27 ℃에서 3-24 시간 동안 배양한다.

상기 절차는 본질적으로 Jefferson, 등, 1986에 의해 설명된 바와 같다.

예 11. 균류에 의한 식물 접종( inoculation ) 테스트들

담배를 P. nicotianae로 접종하기 위해 세 가지 방법들이 테스트되었다. 모두 만족스러운 결과를 보였지만, 이쑤시개 방법이 더욱 정확했고 더욱 신뢰성 있었다.

1. 이쑤시개 방법: 본 방법은 Dr. A. Csinos(개인적 정보 교환)에 의해 제공되었다. 둥근 목제 이쑤시개가 절반으로 쪼개졌고 V-8 배양액에서 압력 살균(autoclave)되었다. 살균 이쑤시개들은 V-8 한천의 플레이트 내에 평평하게 놓여졌고, P. nicotianae의 6-8 균사상 디스크들(직경 5 mm)은 플레이트 위에 등거리 배열되었다. 현미경 관찰에 의해 비후막홀씨(chlamydospore)들이 명확해질 때 상기 플레이트들은 27 ℃에서 적어도 2주 동안 배양되었다. 1 또는 2 개의 이쑤시개를 식물의 부관(crown) 바로 옆의 토양에 세움으로써 식물 접종이 완성되었다. 상대습도를 100%로 유지하기 위해 상기 식물들은 플라스틱 텐트로 덮여졌고 27 ℃에서 배양되었다. 증상들은 통상 2-4일 후에 또렷이 나타났고, 민감한 식물들은 통상 5-8일 후에 죽었다. 저항성 유전자 도입 식물들의 반응들은 무증상인 것부터 1-4 cm 길이의 제한적인 줄기 손상을 일으키는 것까지 다양한데, 상기는 식물 성장과 후속하는 꽃과 씨앗의 발생을 방해하지는 않는다.

2. 균사상 담금 방법: 의 균사상이 V-8 배양액 내 27 ℃에서 밤새 성장되었다. 토양의 유전자 도입 묘목(seedling)들이나 식물들은 세척되어 배지가 제거되었고 100 ml의 살균 탈이온수에 놓여졌다. 균사상 매트들이 집게로 절단되어 물에 첨가되었다. 식물들은 플라스틱 텐트로 덮여져 상대 습도를 100%로 유지하였고 27 ℃에서 배양되었다. 증상들은 통상 2-4일 후에 또렷이 나타났고, 민감한 식물들은 통상 5-8일 후에 죽었다. 민감한 식물들의 뿌리들과 부관은 물에 완전히 불려졌다(도 11A). 저항성 유전자 도입 식물들의 뿌리들은 말단부에서 탄 것으로 나타나거나(도 11B), 부관에 한정된 손상들이 있었지만, 이것이 상기 식물들이 토양에 심겨진 후 식물의 성장 및 후속하는 꽃과 열매의 발달을 방해하지는 않는다.

3. 정포자 접종: 표면-살균 담뱃잎의 가는 조각들을 27 ℃, V-8 배양액 내에서 P. nicotianae의 성장하는 배양체에 둠으로써 풍부한 포자낭들이 만들어졌다. 매트들을 멸균 탈염수에 둠으로써 수만개의 정포자들이 방출되었고, 4 ℃에서 30-60 분간 냉장하였다. 5,000 g 및 4 ℃에서 5분간 원심분리함으로써 정포자들이 모 아졌다.

콩 식물들은 두 가지 서로 다른 방법들에 따라 P. sojae에 의해 접종되었다. 콜크 보어러(cork borer)로 V8 한천 상에서 활발하게 성장하는 배양체로부터 3 mm 원기둥을 절단하고 상기 원기둥을 하나의 배축(hypocotyl)의 엽액(axil)에 둠으로써 묘목들이 접종되었다. 상기 접종물(inoculum)은 Parafilm에 의한 공간에 수용되었고, 상기 식물들은 플라스틱 가방 내에 둘러싸여서 100% 습도가 제공되었다. 콩식물들의 잎사귀들은 잎사귀를 10 ml의 살균수를 가지는 페트리 접시에 두고 상기와 같이 1 또는 2 플러그(plug)의 접종물을 첨가함으로써 P. sojae에 의해 접종되었다.

감자 잎들은 10 ml의 살균수를 가지는 페트리 접시에 두고 상기와 같이 1 또는 2 플러그의 접종물을 첨가하거나 조각 잎마다 10 μl의 정포자 현탁액을 둠으로써 P. infestans에 의해 접종되었다.

모든 접종 테스트들에서, 식물 또는 잎사귀 반응물들은 접종된 식물들이나 잎사귀들으 사멸을 중단하거나 감염의 증거가 보여지지 않을 때까지 매일 읽히고 기록되었다.

예 12. P. nicotianae 저항성 담배 식물들의 분자 특성 부여

DNA 및 RNA가 예 27의 T0 및 T2 세대 형질전환 실물들로부터 추출되었다. 폴리머라아제 체인 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및 역전사/PCR(reverse transcription/PCR: RT/PCR) 테스트들이 DNA와 RNA 샘플들에서 각각 실시되었다. 상기 PCR 반응들은 상기 식물들에서 변환유전자(transgene)들의 존재를 결정하기 위해 실시되었다. 상기 RT/PCR 반응들은 상기 변환유전자들이 발현되었는지 아니면 침묵했는지를 결정하기 위해 실시되었다. 그 결과들은 T0와 T2 세대들 모두에 있어 동일했으며, 표 8에 요약되었다.

[표 8]

유전자 도입 및 야생 유형 담배 식물들에서의 유전자 검출 및 발현

	하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제		GUS
분석된 조직	PCR	RT - PCR	PCR	RT - PCR
야생 유형 담배	-	-	-	-
담배 + pCAMBIA1201	+	+	+	+
pVZA100 유전자도입 라인 4	+	+	+	-
pVZA100 유전자도입 라인 23	+	+	+	-
pVZA100 유전자도입 라인 26	+	+	+	-
pVZA100 유전자도입 라인 27	+	+	+	-
pVZA100 플라스미드 DNA	+	na	+	na
	큐티나아제		16S 리보솜( ribosomal ) RNA
분석된 조직	PCR	RT - PCR	PCR	RT - PCR
야생 유형 담배	-	-	+	+
담배 + pCAMBIA1201	-	-	+	+
pVZA100 유전자도입 라인 4	+	-	+	+
pVZA100 유전자도입 라인 23	+	-	+	+
pVZA100 유전자도입 라인 26	+	-	+	+
pVZA100 유전자도입 라인 27	+	-	+	+
pVZA100 플라스미드 DNA	+	na	-	na

+ = 양성(겔 밴드) - = 음성(겔 밴드 없음) na = 미적용

표 8의 상부 패널에서, 제1열의 데이터는 하이그로마이신 저항성 유전자(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제)가 야생 유형 담배 식물들에 존재하지 않지만, pCAMBIA 1201 플라스미드 단독이나 pVZA100에 의해 형질전환된 모든 식물들에는 존재한다는 것을 보여준다. 제2열의 데이터는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자는 그것이 존재하는 모든 식물들에서 발현되었다는 것을 보여준다. 제3열의 데이터는 GUS 유전자가 야생 유형 담배 식물들에는 존재하지 않지만, pCAMBIA 1201 단독이나 pVZA100에 의해 형질전환된 모든 식물들에는 존재한다는 것을 보여준다. 제4열의 데이터는 GUS 유전자가 pCAMBIA 1201 형질전환 식물들에서만 발현되었다는 것을 보여준다. 그러나, GUS는 pVZA100 침묵 컨스트럭트를 포함하는 모든 유전자 도입 식물들에서는 침묵하였다.

표 8의 하부 패널에서, 제1열의 데이터는 균류 큐티나아제 유전자가 야생 유형 담배 식물들과 pCAMBIA 1201 플라스미드만으로 형질전환된 식물들에서는 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, pVZA100으로 형질전환된 모든 식물들에서는 존재하였다. 제2열의 데이터는 균류 큐티나아제 유전자가 야생 유형 식물들 또는 pCAMBIA 1201 플라스미드 단독이나 pVZA100에 의해 형질전환된 식물들에서 발현되지 않았다는 것을 보여준다. 제3열의 데이터는 16S 리보솜(ribosomal) RNA 유전자가 야생 유형 및 모든 유전자 도입 담배 식물들에 존재하지만, 침묵 컨스트럭트에는 존재하지 않았다는 것을 보여준다. 제4열의 데이터는 16S 리보솜 RNA 유전자가 야생 유형이건 유전자 도입이건, 담배 식물들 모두에서 발현되었다는 것을 보여준다.

야생 유형 담배 식물들이나 pCAMBIA1201로 형질전환된 것들은 P. nicotianae에 의해 접종되었을 때, 그들은 항상 감염되기 쉬웠던 반면, pVZA100로 형질전환된 것들, 예컨대 유전자 도입 라인 4, 23, 26 및 27은 저항력을 가졌다(각각 도 11 A 및 B).

예 13. 균류 형질전환 및 특성 부여

P. nicotianae 또는 P. sojae의 다양한 배양체들이 상기와 같이 pCAMBIA1201, pVZA100, pVZA200, pVZA300, 또는 pVZA400로 포격되었고, 생존 가능한 배양체들로부터 단일 정포자 배양체들이 만들어졌다.

pCAMBIA1201과 pVZA100에 의해 포격된 P. nicotianae 배양체들은 일반적으로 감염되기 쉬운 야생 유형 Xanthi 담배에 있어서 병원성에 대하여 테스트되었다. pCAMBIA1201에 의해 형질전환된 배양체들은 병원성이 유지되었지만, pVZA100에 의해 형질전환된 배양체들은 비병원성이었다. P. nicotianae의 야생 유형 및 유전자 도입 배양체들이 액체 V8 배지에서 성장되었고 DNA와 RNA가 상기와 같이 추출되었다. 그러한 샘플들은 상기와 같이 PCR 및 RT/PCR에 의해 분석되었다. 그 결과는 표 9에 요약되었다.

[vy 9]

유전자 도입 및 야생 유형 Phytophthora nicotianae에서의 유전자 검출 및 발현

	하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제		GUS
분석된 조직	PCR	RT - PCR	PCR	RT - PCR
P. nicotianae 야생 유형	-	-	-	-
P. nicotianae + pCAMBIA1201	+	+	+	+
P. nicotianae + pVZA100	+	+	+	-
pVZA100 플라스미드 DNA	+	na	+	na
	큐티나아제		16S 리보솜( ribosomal ) RNA
분석된 조직	PCR	RT - PCR	PCR	RT - PCR
P. nicotianae 야생 유형	+	+	+	+
P. nicotianae + pCAMBIA1201	+	+	+	+
P. nicotianae + pVZA100	+	-	+	+
pVZA100 플라스미드 DNA	+	na	-	na

+ = 양성(겔 밴드) - = 음성(겔 밴드 없음) na = 미적용

도 9의 상부 패널에서, 제1열의 데이터는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자가 야생 유형 P. nicotianae에는 존재하지 않지만, pCAMBIA 1201 플라스미드 단독이나 pVZA100에 의해 형질전환된 P. nicotianae의 배양체에는 존재한다는 것을 보여준다. 제2열의 데이터는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자가 그것이 존재하는 모든 배양체에서 발현했다는 것을 보여준다.

제3열의 데이터는 GUS 유전자가 야생 유형 P. nicotianae에서는 존재하지 않지만, pCAMBIA 1201 플라스미드 단독 또는 pVZA100에 의해 형질전환된 P. nicotianae 배양체에는 존재한다는 것을 보여준다. 제4열의 데이터는 GUS 침묵 컨스트럭트가 존재하지 않는 pCAMBIA 1201 형질전환 P. nicotianae에서만 GUS 유전자가 발현했음을 보여준다.그러나, pVZA100 침묵 컨스트럭트를 포함하는 보든 유전자 도입 P. nicotianae 배양체에서는 GUS가 침묵하였다.

표 9의 하부 패널에서, 제1열의 데이터는 균류 큐티나아제 유전자가 pCAMBIA 1201 플라스미드 단독이나 pVZA100 침묵 컨스트럭트에 의해 형질전환된 배양체들은 물론이고, 야생 유형 P. nicotianae에서도 존재한다는 것을 보여주는데, 이는 큐티나아제가 P. nicotianae의 구조성(constitutive) 유전자이기 때문이다. 제2열의 데이터는 pCAMBIA 1201 플라스미드에 의해 형질전환된 배양체는 물론이고 야생 유형P. nicotianae 에서도 균류 큐티나아제 유전자가 발현되었음을 보여준다. 그러나, pVZA100 침묵 컨스트럭트에 의해 형질전환된 P. nicotianae 배양체에서는 큐티나아제 발현이 침묵하였다.

제3열의 데이터는 16S 리보솜 RNA 유전자가 야생 유형과 모든 유전자 도입 P. nicotianae에 존재하지만, 침묵 컨스트럭트에는 존재하지 않는다는 것을 보여준다. 제4열의 데이터는 16S 리보솜 RNA 유전자가 야생 유형과 유전자 도입 P. nicotianae 배양체들 모두에서 발현되었다는 것을 보여준다.

pCAMBIA1201, pVZA100 및 pVZA200에 의해 포격된 P. nicotianae와 P. sojae의 배양체들에 대한 현미경 검사는 모두가 통상 야생 유형처럼, 그리고 시각적으로 기형이 없이 성장했다는 것을 보여주었다(도 14 A). 감염된 야생 유형 담배 또는 pVZA100에 의해 형질전환된 담배로부터 재격리된 P. nicotianae의 배양체들에 대하여 유사한 결과들이 발견되었다. 그러나, pVZA300 또는 pVZA400에 의해 포격된 P. nicotianae의 배양체들(도 14 B, C, D)과 pVZA300 또는 pVZA400에 의해서도 포격된 P.sojae의 배양체들(도 14 E, F)은 매우 느리게 성장하였으며, 그들의 균사들이 심각하게 변형되었고, 몇몇 배양체는 사멸했다.

pCAMBIA1201와 pVZA200에 의한 P. nicotianae와 P. sojae의 형질전환은 균류에 대하여 아무런 악영향이 없었는데, 이는 그러한 플라스미드들이 균류 유전자를 포함하지 않으며 그러한 균류에서 침묵을 유도할 수 없기 때문이다. 또한, P. nicotianae 큐티나아제 유전자를 포함하는 pVZA100에 의한 P. nicotianae와 P. sojae의 형질전환은 그들이 정상적으로 성장하도록 만들지만 양 종들이 비병원성이 되도록 만들었는데, 이는 병원성에 필수적인 큐티나아제 유전자가 pVZA100에 의해 침묵되었기 때문이다.

P. infestans 엘리시틴과 리보솜 RNA 유전자들을 각각 포함하는 pVZA300 또는 pVZA400에 의한 P. nicotianae과 P. sojae의 형질전환은 양자 모두, P. nicotianae와 P. sojae 양자의 성장과 발달에 현저한 악영향을 가졌다. 병원성 테스트들의 충분한 접종물을 제공하기에도 성장이 불충분했다. 이것은 엘리시틴과 리보솜 RNA 유전자들이 형질전환 균류에서 침묵되었으며, 이러한 중요한 유전자들 중 어느 것이라도 침묵시킨다는 것은 균류에 매우 해롭거나 치명적이라는 것을 시사한다. 이것은 pVZA200과 pVZA300 양자 모두가 Myzus persicae 카텝신 유전자를 포함한다는 사실에 의해 더욱 뒷받침된다. 그러나 또한, pVZA300은 P. infestans 엘리시틴 유전자를 포함한다. pVZA200은 아무런 눈에 띄는 영향을 유발하지 않고, pVZA300은 악영향을 유발하기 때문에, 엘리시틴 유전자가 pVZA300에 의해 유발되는 변형의 원인인 것으로 나타났다.

상기와 같이, P. nicotianae 큐티나아제가 Phytophthora의 다른 종들에 대한 식물 저항력을 유도하는 경우에, 이러한 결과들은 Phytophthora (P. infestans)의 한 종으로부터의 본질적인 유전자들이, 침묵 컨스트럭트에서 도입되었을 때, 감염된 토양과 들판들의 탈병인(depathogenesis)에 의해 식물들에서 직접 Phytophthora spp.를 조절하는 데 유용한 Phytophthora의 기타 종들에 대하여 매우 해로운 영향을 초래할 수 있다는 것을 보여준다.

예 14. siRNA 검출에 의한 담배에서 유전자 침묵의 표시

유전자 침묵이 발생하는 추가적인 증거는 소문에 의하면 침묵된 형질전환된 식물들(예 5와 13)과 형질전환된 균(예 13)에서 작은 간섭 RNA들 (siRNAs)의 검출이다. siRNA들은 길이가 21 내지 25 뉴클레오티드들 (nt)이고, "침묵"될 mRJSTA와 상동을 가진다.

전체 RNA는 와일드 타입 및 소문에 의하면 침묵된 유전자 도입 T0와 T1 발생 담배 식물들과 와일드 타입 및 소문에 의하면 침묵된 P. nicotianae로부터 추출된다. RNA는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 분리되고, 막에 블로팅되고 큐티나아제 유전자의 500 bp PCR 생성물로부터 복사된 프로브로서 혼성화되고 랜덤 프라이밍(random priming)에 의하여 ³²P로 라벨링된다. 혼성화 및 검출 조건들은 위의 예 9에서와 같다.

도 4A와 4B는 각각 와일드 타입과 유전자 도입 담배 식물들 및 P.nicotianae로부터 siRNA들로의 큐티나아제(cutinase) 유전자 프로브(probe)의 교잡의 결과들을 보여준다. 도 4A에서, 레인 1은 35 nt 올리고뉴클레오티드들 VZA 3F (SEQ IDㅜㅒ:3)과 VZA 4R (SEQ ID NO: 4)의 혼합물에 대한 교잡을 보여준다. 프로브의 생성 을 위한 템플릿을 합성하는 PCR 반응을 준비하는 것이 사용되었다. 그러므로, 그들은 템플릿과 완전히 상동이고, 또한 알려진 분자 크기로 되어 있다. 레인들 2와 3은 와일드 타입 담배 식물들로부터의 RNA를 포함한다. 와일드 타입 식물들에서는 큐티나아제 유전자도 침묵 컨스트럭트 둘다 존재하기 않기 때문에 교잡은 없고, 그러므로 siRNA들은 생성되지 않는다. 레인 4 내지 11은 유전자 도입 라인들 4, 23, 26 그리고 27의 T0와 T1 발생 식물들로부터의 RNA를 포함한다. 이 교잡은 각 유전자 도입 식물에서 siRNA들의 존재를 보여주고, 큐티나아제 mRNA의 퇴화 및 상기 유전자 도입 식물들에서 큐티나아제 유전자의 부수적 침묵을 나타낸다.

도 4B에서, 레인 1은 35 nt 올리고뉴클레오티드들 VZA 3F와 VZA 4R의 혼합물에 대한 교잡을 보여준다. 레인 2는 와일드 타입 P. nicotianae로부터 RNA에 대한 교잡을 보여준다. 길이가 620 nt인 진한 얼룩은 와일드 타입 P. nicotianae에서 큐티나아제 유전자의 전체 길이 전사체에 해당한다. 상기 큐티나아제 유전자는 이 배양물에서 구성 요소이고, 침묵 컨스트럭트는 존재하지 않는다. 그러므로, 전체 길이 mRNA 전사체는 생존하고 siRNA들로 소화되지 않는다. 레인들 3 내지 6은 침묵 컨스트럭트로서 형질전환된 P. nicotianae의 네 가지 배양체들로부터의 RNA를 포함한다. 교잡은 P. nicotianae의 유전자 도입 배양체들의 각각에서 siRNA들의 존재를 보여주고, 큐티나아제 mRNA의 퇴화 및 상기 유전자 도입 P. nicotianae에서 큐티나아제 유전자의 부수적 침묵을 나타낸다.

유전자 도입 P. nicotianae에서 필수 큐티나아제의 침묵에 대한 생물학적 증거는 큐티나아제 유전자 침묵 컨스트럭트, pVZA100을 갖고서 형질전환된 그러한 배 양체들은 비병원성이 되고, 반면에 pCAMBIA 1201 플라스미드 만을 갖고서 형질전환된 배양체들은 그들이 유래된 와일드 타입 배양체들과 똑같이 병원성으로 남아 있다. pVZA 100 침묵 컨스트럭트의 존재에서 유전자 침묵의 추가적인 증거는 GUS 유전자에 의하여 제공된다. GUS 반응은 pCAMBIA 1201을 갖고서 형질전환되고 병원성인 그러한 배양체들에서 항상 포지티브였다. 이는 동일한 배양체에서 큐티나아제 유전자의 활동도 또는 침묵과 직접적인 상관관계가 있다.

예 15. 여기에서 유용한 높은 상동을 가진 Phytophthora cutinase 서열들

Phytophthora 유전자 서열들의 분석은 종을 뛰어넘는 내성을 제공하는 이종의 폴리뉴클레오티드들을 설계하기 위한 토대를 제공한다. 본 발명에 따라서 유용한 해충 병원성 유전자 서열들을 선택하기 위한 생물학적정보 분석의 사용의 예시로서, Phytophthora의 25개의 다른 고립자들이 복제되어 서열화되었다. 고립자들은 9개의 종 P. capsici , P. cinnamomi , P. citricola , P. citr [ sigma ]phthora, P. hevea, P. megakarya , JP . megasperma (P. sojae ), P. nicotianae 그리고 P. pahnivora을 포함하였다. 이들 서열들 (서열 ID Nos 13 내지 37을 보라)의 각각은 본 발명의 폴리뉴클레오티드들을 위하여 유용하다.

예를 들어, 서열들의 9개는 동일하고 11개는 > P. nicotianae의 큐티나제 유전자 서열과 동일한 99%.

[표 10]

Phvtophthora의 9종들을 포함하는 25 고립자들의 큐티나아제 유전자들의 뉴클레오티드 서열들

(VZA 1 65R = Pnic Ri) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAAT^TGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTfiAGGTAGATGCACGACATGTTATCJAjCCG ABJTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTd GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACgTTACC ATTGACGAACGTCACGAACCCSCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTA (SEQ ID NO: 13)

(VZA 2 69F = Pnic 21) ACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCATCGCG TCGGCCrATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCGTCCTC CACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGCTGT GCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGTAT CTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAGCCAC TGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGCTC TGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATTGAC GAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAGCGTAGT CAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACG (SEQ ID NO: 14)

(VZA 3 73F = Pnic 23) TCATACCATCTCGACAATGjCTCi&AACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCATCAT CGCGTCGGCTATCATGTCGTCGGT^CCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCGT CCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTG^AACTTGTTCATAAT^TGCTTGCTCTTG CTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTCAGfiTAGATGCACGACTTGTTATCGCCGAG TATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCTTCACAGAGTCCACGTAGCC ACTGTAGATATCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTA CTCTGTACGTTGATCTCTTGCTTfiCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATTG ACGAACGTCACGAACCC (SEQ ID NO: 15)

(VZA 4 88F = Pnic 17) TCATACCATCiSCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAA--CGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGG (SEQ ID NO: 16)

(VZA 5 62R = Pcap Ri) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACA-GAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCG (SEQ ID NO: 17)

(VZA 6 7OF = Pcap 30) CCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCATCGCGT CGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCTAATCCGTAGCTGCTCGTCCTCC ACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGCTGTG CTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGTATCT CCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAGCCACTG TAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGCTCTG TGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATTGACGA ACGTCACGAACCCGCTAACACTCT (SEQ ID NO: 18)

(VZA 7 72F = Pcap 30) CrTAT^CGACAATGCCTCGAACT^GgCCTTCGGCAACGGCTTCGTCATCGCG TCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTACTCTGCTCGTCCTC CACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGCTGT GCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTA-TCGCCGAGTAT CTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAGCCAC TGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGCTC TGTGCGTTGATCTCCTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACA-TTGCCATTGAC GAACGTCACGAACCCGCTAACACTCT (SEQ ID NO: 19)

(VZA 8 79F = Pcap 28) ACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCATCGCG TCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCGTCCTC CACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGCTGT GCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGTAT CTCCGGAGTCGC AAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAGCCAC TGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGCTC TGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATTGAC GAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAGCGTAGT CAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCC (SEQ IP NO: 20)

(VZA 9 84F = Pcap 01) T^ATACCALCTCGACAATGCATCGAACTTG^CCTTCGGCAACG-GCTTCGTCAT CGCGTCGGCATCATGTCGTCGGTACCAACATGCCGAATCCGTAGCTGCTCGTC CTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGC TGTGCTTGCCAGGCTTGGCAf&TTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGT ATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCAC^TAGCC ACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGC AATATACTCTGCTTCCGTTGCG CTCTGTGCGTTGA^cPCTTGCTTTCTTGATCCTCACfAAACCACATTGCCA.TTG ACGAACGTjCACTAACC^C[Epsilon]CTAACACTCTTf^G^TCATAATlTCATTAGCyTA RTCA^CAM^CTCCTAJAJACftTCAGATTCACTACMTCC (SEQ IP NO: 21)

(VZA 10 87F = Pcap 32) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAvGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGC (SEQ ID NO: 22)

(VZA 11 89F = Pcap 03) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTCAGATTCACGTCGTT (SEQ ID NO: 23)

(VZA 12 9OF = Pcap 22) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 24)

(VZA 13 91F = Pcap 25) TCAAACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCA-ACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCJSAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAA-TATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGG (SEQ ID NO: 25)

(VZA 14 81F = Ppal O2) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCA-ACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACT AGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 26)

(VZA 15 82F = Ppal lO) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCG (SEQ ID NO: 27)

(VZA 16 83F = Ppal 11) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGGTTAAGGlTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGJC (SEQ ID NO: 28)

(VZA17 85F = Ppal O4) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATAVCTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 29)

(VZA 18 86F = Ppal O5) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTA-TCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCC ATTG-ACGAACGTCACGAACCCGCT AACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGG (SEQ ID NO: 30)

(vza 19 64R = Pcin Ri) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAA^CCGTKGCCTCGTC CTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTGC TGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGT ATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAGCC ACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGC TCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGATTCGGTCATCAGGGTCA TTAGCGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACG TCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 31)

(VZA 20 77F = Pern 01) ATCCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCATCGCG TCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAAyCCGTAteCLl.TCGTCCTC CACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATαCTTGCTCTTGCTGT GCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGTAT CTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGrTCCACGTAGCCAC TGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGCTC TGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCA.CATTGCCATTGAC GAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAGCGTAGT CAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 32)

(VXA. 21 63R = Pcto Ri) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAAClCCGTTGC^CTCGT CCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCTCTTG CTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGA GTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTAG CCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGT GCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATT GACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAGCG TAGTCAGCATCGGTGTAGCACG TCAGATTCACGTCGTTCCCGG (SEQ ID NO: 33)

(VZA 22 66R = Pctr Ri) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACOTGGpATCCFJGCGSiTGCTCGTCC TCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGfTCATAATAlTGCTTGCTCTTGCT GTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGT ATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAG-AGTCCACGTAGCC ACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTTGTGC TCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACATTGCCATTGA CGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAGCGTA GTCAGCATCGGTGTAGCACG (SEQ ID NO: 34)

(VZA 23 80F - Pmek Ol) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGCGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGRCTCTT GCTGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACAXTGCC ATTGACGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCGGCJAA. (SEQ ID NO: 35)

(VZA 24 92F = Pmeg 01) CAGACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGrTCATC GCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTACCAACATGGC<5>Tr]AATCCjTAGCTGCTCgTC CTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGCr CTTGC TGTGCTTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCGAGT ATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGXAGCC ACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGXTGTGC TCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCqOTACGAAACCACATTGCCATTGA CGAACGTCACGAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAgGGTCATTAGCGTA GTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGTTCCCG (SEQ ID NO: 36)

(VZA 25 93F = Phev 02) TCATACCATCTCGACAATGCCTCGAACTTGTCCTTCGGCAACGGCTTCGTCAT CGCGTCGGCGATCATGTCGTCGGTGCCAACATGACGAATCCGTAGCTGCTCG TCCTCCACTAGGTGGCGCACCAAGTGGAACTTGTTCATAATATGCTTGRCTCTT GCTGTGCγTGCCAGGCTTGGCAGTTAGATAGATGCACGACATGTTATCGCCG AGTATCTCCGGAGTCGCAAACTCCCAGCATAGTTCGTCACAGAGTCCACGTA GCCACTGTAGATCTCTGGTACCTTCATTCATAGCAATATACTCTGCTTCCGTT GTGCTCTGTGCGTTGATCTCTTGCTTTCTTGATCCGTACGAAACCACAXTGCC ATTGACGAACGTCACISAACCCGCTAACACTCTTTCGGTCATCAGGGTCATTAG CGTAGTCAGCATCGGTGTAGCACGTCAGATTCACGTCGT (SEQ ID NO : 37)

이론에 얽매이지 않고서, 이들 큐티나아제 서열들은 위에서 표시된 크로스 내성을 위한 분자 토대를 제공하고, 유사한 성과들을 가진 다른 해충 병원성 유전자들을 선택하기 위한 유전자 서열화 및 생물학적 정보 분석의 일반적 적용을 지지한다.

예 16. 담배에서 속간 내성은 Peronospora tataacina 에 의하여 야기되는 질병에 대하여 P. nieotianae 큐티나아제 유전자-침묵에 의하여 제공된다

담배의 푸른 곰팡이병의 자연적 유행병은 담배 식물들을 포함하는 온실에서 발생된 t>y Peronospora tabacina를 야기하였다. 푸른 곰팡이 심각성의 명확한 차이들이 관찰되었다. 식물들의 세 가지 유전자형들은 평가를 위하여 이용가능하였다: 큐티나제 유전자를 포함하고 P. nieotianae에 대한 내성을 위하여 이미 선택되었던 유전자 도입 식물들, P. nieotianae에 대한 내성을 위하여 아직 선택되지 않았던 큐티나아제 유전자도입 식물들, 그리고 와일드 타입 또는 비유전자 도입 Xanthi 담배 식물들. 도 5에 있는 사진들의 수는 다른 식물 라인들 또는 유전자형이 아니라, 다른 질병 평가들을 말한다.

[표 11]

온실에서 Peronospora tabacina에 의하여 야기된 담배의 푸른 곰팡이의 자연적 유행병에 대한 다른 담배 유전자형들의 반응들

담배 유전형	질병 평가 및 분석
Phytophthora resistant Unselected transgenic Wild Type Xanthi	1* 2 3 4 #식물들 1+2 #식물들 3+4
	34 U 9 12 45(68)* 21(32)
	62 20 67 26 82(47) 93(53) 0 3 12 30 3(7) 42(93)

* = 질병 평가 1 = 징후없음

** = class에서 식물들의 수 2 = 분명한 징후

*** = class에서 식물들의 % 3 = 심한 징후

4 = 사망

표 11은 P. nicotianae 내성 식물들 중에서, 68%가 Peronospora tabacina에 의하여 보통으로 영향을 받았고(질병 평가 1 + Ty), 그리고 32%가 심하게 영향을 받았다(질병 평가 3+ 4); Peronospora tabacina에 대한 내성을 선호하는 2:1 비율. 유전자 도입된 미선택 식물들의 경우, 47%가 보통으로 영향을 받았고 53%가 심하게 영향을 받았다; Veronospora tabacina에 대한 내성을 선호하는 1:1 비. 와일드 타입 식물들중, 7%가 보통으로 영향을 받았고 93%가 심하게 영향을 받았다; 영향받기 쉬움을 선호하는 13:1 비. 그러므로, 도 5와 표 11은 다른 담배 유전자형들에서 다른 레벨의 내성을 명확하게 보여주고, P. nicotianae로부터 큐티나제 유전자가 Peronospora tabacina , P. nicotianae에 관련이 약한 균사에 대하여 담배에서 넓게 분포하는 내성을 유도한다는 것을 보여준다.

표 12는 Phytophthora nicotianae 및 Peronospora tabacina가 분류학상으로 밀접하게 관련되지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, 위에서 도시된 것처럼, Phytophthora nicotianae 큐티아제 유전자는 Phytophthora nicotianae 및 Peronospora tabacina 모두에 대한 내성을 제공한다. 그러므로, hytophthora nicotianae 큐티아제 유전자는 적어도 세 가지의 다른 균의 종들과 세 가지의 균의 질병들에 대항하여 넓은 내성을 제공한다. 상기 유전자는 담배에서 Phytophthora , P. nicotianae의 두 가지 다른 종들과 콩에서 P. sojae에 대항하여 보호하고, 또한 Phytophthora nicotianae 및 Peronospora tabacina 양자에 대항하여 담배를 보호한다. 이들 두 가지 균의 종들은 동일한 목으로 분류되지만, 분명히 다른 과와 속으로 분류된다(표 12).

[표 12]

Phytophthora nicotianae와 Peronospora tabacina 사이의 분류학상 관계

	Phytophthora nicotianae	Peronospora tabacina
강(Class)	Oomycetes	Oomycetes
목(Order)	Peronosporales	Peronosporales
과(Family)	Pythiaceae	Peronosporaceae
속(Genus)	Phytophthora	Peronospora
종(Species)	Phytophthora nicotianae	Peronospora tabacina

예 17. 컨스트럭트(construct)를 침묵( silencing ) 시키는 Phytophtora 유전자에 내성을 가지도록 형질전환되어 만들어진 콩

콩 조직 배양: A. tumefaciens 와 유전자총(biolistics)사용하여 pVAZA1OO(예 7)으로 변형시킨 다수의 콩 배아에서 자란 어린싹(shoot) (도 6). 평판 배지(plate) 상의 자란 다른 캘러스들은 초록색을 유지하며 무르다 (도 7). 어린싹과 무른 캘러스들 각각의 3가지 시료에서 DNA를 추출하였고, GUS (SEQ ID 번호: 9와 10)와 하이그로마이신 포스포트란스페라아제(Phosphotransferase) 유전자를 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)를 사용하여 PCR을 실행하였다. 도 7B에서 보는 바와 같이 GUS와 하이그로마이신 포스포트란스페라아제 유전자(hygromycin phophotransgerase gene; HPT) 양쪽 모두 콩 캘러스에서 검출되었다. 도 7B의 상단에는 6개 시료(1-6 레인) 모두가 하이그로마 이신 포스포트란스페라아제로 형질전환되었음(7 레인은 플라스미드 제어)을 보이고 있다. 그 하단에는 6가지 시료중 적어도 4개(1, 2, 4, 5 레인)가 GUS 유전자로(7 레인은 프라스미드 제어를 마침) 형질전환되었음을 보인다. 이러한 자료한 숙주 식물 세포가 pVZA10O 이종성 폴리누클레오티드(heterologous polynucleotide)를 가진 형질로 형질전환 됨을 나타내는 것이다. 하이그로마이신을 15 mg/L 함유하고 있는 배지상에서 배양한 모종과 어린싹이 계속적으로 성장함은 캘러스들이 이종성 폴리누클레오티드의 형질을 표현했음을 보이는 것이다. 콩 캘러스들을 염색반응 시키면 GUS 음성을 띄는데 이는 숙주 식물 세포 속에 있는 GUS 표현형을 이종성 폴리누클레오티드가 침묵화 시킴을 드러내는 것이다. 다음으로, 캘러스를 성장시켜서 토양에 이식하여 이를 성숙시키면 꽃가루와 씨를 얻게 된다. 형질전환시킨 성숙한 식물에서 나온 꽃가루로 비형질 전환 식물을 꽃가루받이하며, 그렇게 나온 수정시킨 씨가 성체로 자라게 된다. 성숙한 식물(FO 식물), 성숙한 식물의 씨로 자란 식물 및 형질전환된 식물의 꽃가루에서 나온 씨와 형질이 전환되지 않은 식물의 꽃에서 나온 씨로 소생시킨 비형질전환 식물들 모두가 Phytophthora sojae 에 내성이 있음을 보인다.

콩 식물: 콩 조직 배양으로 자란 본 예(17)는 예 27에서 극명하게 드러나는데, 여기에는 pVZA100으로 충돌시켜 형질전환된 콩 식물은 P. sojae 에 내성을 지닌다는 사실이다. 또한 이러한 결과는 P. sojae 에 내성을 지니는 P. nicotianae의 쿠티나아제 유전자(cutinase gene)으로부터 이러한 광범위한 내성을 얻었음을 보인다.

예 18 Phytophthora infestans 에 내성을 갖도록 형질전환된 감자.

예 7에서, 배양 판(culture plate)에서 뿌리와 씨감자를 생산해 내었다(도 8). 하이그로마이신을 15 mg/L 함유하고 있는 배지상에서 모종, 뿌리, 및 씨감자가 성장하였는데, 여기에는 캘러스들이 형질전환되고 하이그로마이신 인전환효소 전환종(hygromycin phophotransferase transgene)을 표현하고 있음을 볼 수 있다. pCAMBIA1201을 이용하여 형질전환시킨 감자 캘러스들은 GUS 염색반응에 반응을 보이는 반면, pVZA100로 형질전환시킨 감자 캘러스들은 GUS 염색반응에 음성을 띄었다. 이는 pVZA100로 형질전환시킨 그러한 조직에서는 GUS가 표현되지 않음을 보이는 것이다. PCR 분석을 하면 전환유전자(transgene)가 존재함을 알 수 있다. 꺽꽃이와 덩이줄기로 자란 후대 식물은 siRNA에 시험하면 양성을 보였다.

컨스터럭트를 침묵시키는 유전자를 이용하여 형질전환된 감자는 Phytophthora infestans 에 내성을 지닌다. 감자 식물: 감자 조직 배양으로 자란 본 예(18)은 예 27에서 극명하게 드러나는데, 여기에는 pVZA400으로 충돌시켜 형질전환된 콩 식물은 P. infestans 에 내성을 지닌다는 것이다.

예 19. 갈색 줄기 썩음병(brown stem rot)에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Phialophora gregata rDNA )

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Phialophora gregata ribosomal RNA 종(rDNA)(GenBank locus U66728, SEQ DD NO:43)에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Phialophora gregata 와 접종 시킨후에는 갈색 줄기 썩음병에 내성을 갖도록 선택한다. Phialophora gregata 에 내성을 지닌 식물은 Phakopsora pachyrhizi 와 Aspergillus nudulans 에 내성을 갖는다.

예 20. 갈색 줄기 썩음병(brown stem rot)에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Phialophora gregata B DNA 표지 유전자( marker ))

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Phialophora gregata ribosomal RNA 종(rDNA)(GenBank locus U66728, SEQ ID NO:44)에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Phialophora gregata 와 접종시킨 후에는 갈색 줄기 썩음병에 내성을 갖도록 선택한다. Phialophora gregata 에 내성을 갖는 식물은 Phakopsora pachyrhizi 와 Aspergillus nudulans 에도 내성을 갖는다.

예 21. 줄기와 뿌리 썩음병에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Phytophthora sojae 쿠티나아제 ( cutinase ))

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Phytophthora sojae cutinase (즉 SEQ ID NO:36)에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 콩 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Phytophthora sojae 와 접종시킨후에는 줄기와 뿌리 썩음병에 내성을 갖도록 선택한다.

예 22. 백색 곰팡이 병에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Sclerotinia clerotiorum RNA 폴리머라아제 아단위 ( polymerase subunit ))

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 두번째로 큰 소단위체(subunit) RNA 중합효소 II , exon-1, 변종 1-84로 쓰이는 Sclerotinia clerotiorum partial rpb2 유전자 (GenBank locus AJ745716, SEQ ID NO:45))에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 콩 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Sclerotinia clerotiorum 와 접종시킨후에는 백색 곰팡이 병에 내성을 갖도록 선택한다. Sclerotinia clerotiorum 에 내성을 갖는 식물은 Phakopsora, Aspergillus nudulans, Magnaporthae orizae , Candida sojae , Gibberella zeae , 및 Puccinia graminis 에도 내성을 갖는다. 형질전환된 식물은 보통의 성장을 하지만, S. sclerotiorum rpb2 유전자에 높은 상동성을 지닌 유전자가 부족함을 보인다. 센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Puccinia hordei 18S ribosomal RNA 유전자(부분서열이 GenBank locus AY1254 12(SEQ ID NO: 46))에 대응하는 물질을 사용해도 유사한 결과를 얻게 된다.

예 23. 백색 곰팡이 병에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Sclerotinia clerotiorum hexose 운반체( transporter ))

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Sclerotinia clerotiorum hexose 운반체(transporter)(hxt2) 유전자 (GenBank locus AY647268.1, SEQ ID NO:47)에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Sclerotinia sclerotiorum 과 접종시킨후에는 백색 곰팡이 병에 내성을 갖도록 선택한다. Sclerotinia sclerotiorum 에 내성을 가지는 식물은 또한 Botrytis cinerea 에 어느 정도 내성이 있음을 보인다.

예 24. 급사 증후군( sudden death syndrome )에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Fusarium solani pisi cutinase )

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 F. solani pisi cutinase mRNA (GenBank locus K02640.1, SEQ ED NO:48)에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 F. solani pisi glycines 와 접종시킨후에는 급사 증후군에 내성을 갖도록 선택한다. F. solani pisi glycines 에 내성을 가지는 식물은 또한 A. nidulans 에 어느 정도 내성이 있음을 보인다.

예 25. 녹두균(Asian rust)에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Phakopsora pachyrhizi cutinase homolog )

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Phytophthora nicotianae 의 Phakopsora pachyrhizi 보존 단백질(conserved protein) 공통 배열(motif)에 대응되고 Phakopsora pachyrhizi 유전체(genome) (GenBank locus AC149367.2, SEQ ID NO:49)에서 발견되는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. Phytophthora nicotianae 큐틴 분해 효소(cutinase)와의 상동성(homologue)에 근거하여, 이 보존 단백질이 큐틴 분해 효소 상동성을 이루는 것 같으며, 콩 큐틴질의 침투에 관여한다. 콩 식물을 형질전 환시킨 세포에서 발생시키고 Phakopsora pachyrhizi 와 접종시킨후에는 녹두균에 내성을 갖도록 선택한다.

예 25. 녹두균(Asian rust)에 내성을 갖도록 형질전환된 콩( Phakopsora pachyrhizi rDNA )

센스(sense)와 안티센스(antisense) 서열이 Phakopsora pachyrhizi 유전체(genome) (GenBank locus AF333491, SEQ ID NO:50)에서 발견되는 리보솜 DNA 서열에 대응하는 것을 제외하고는, pVZA100 (예 3)과 유사한 이종성 뉴클레이티드를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킨다. 콩 식물을 형질전환시킨 세포에서 발생시키고 Phakopsora pachyrhizi 와 접종시킨후에는 녹두균에 내성을 갖도록 선택한다.

예 27. 담배, 콩, 감자, 옥수수에 대한 형질전환, Phytophthora spp .에 대한내성 및 aphids 에 대한 내성 시험.

담배

pVZAl00을 이용한 형질전환에 의해 예 5에서 생성된 성숙한 담배식물은 P. nicotianae 에 대해 내성을 가지는지 시험되었다. 세가지 방법이 P. nicotianae을 이용한 접종을 통해 시험되었다. 세가지 경우 모두 만족스러운 결과를 나타내었지만, 전술한 바와 같이, 이쑤시게(tookpick) 방법은 보다 정밀하고 보다 신뢰할 만한 방법이었다. pVZAlOO을 이용하여 형질전환된 TO 식물들은 일반적으로 약 20% 정도가 P. nicotianae을 이용한 감염에서 생존하였지만, 야생의 식물들과 pCAMBIA 1201을 이용하여 형질전환된 식물들은 모두 생존하지 못했다.

p VZAl00을 이용하여 형질전환된 생존한 식물들은 토양에서 성숙하게 배양되 었고, 그 종자가 후속하는 분석을 위해 수집되었다. 종자 자손(=T1 세대)은 30ug/ml 의 하이그로마이신을 함유한 MS 배지에서 배양되었고, 생존한 식물은 P. nicotianae 에 대한 내성을 검사하기 위해 다시 시험되었다.

형질전환된 생존한 식물들은 또한 토양에서 성숙하게 배양되었고, 그 종자가 후속하는 분석을 위해 수집되었다. 이러한 식물에 있어서, 4가지 상이한 라인 (라인 #4, #23, #26 및 #27; = 상이한 형질전환 이벤트들)의 종자 자손(=T2 세대) 그룹은 어떠한 생존한 식물도 P. nicotianae에 대한 내성을 가진다는 사실을 확증하기 위해 순차적으로 두차례 접종된다. 1차 접종에서 442의 식물 중 192 식물이 내성을 나타내었다(43%). 2차 접종에서 192의 식물에서 150의 식물이 내성을 나타내었다(= 78%). 요약하면, 442의 식물 중에서 150의 식물이 내성을 나타냈다고 볼 수 있다(34%). 150의 내성을 나타내는 식물들 모두는 또한 GUS 활성에 대해서 평가되었고 음성을 나타냈다.

담배 식물에 의한 반응들은 도 11에 도시되어 있다. 식물 A는 야생의 담배 식물 또는 pCAMBIA1201을 이용하여 형질전환된 담배 식물에 일반적인 반응들을 보여준다. 식물들은 감염되기 쉬우며, 주요 줄기에 손상이 있으며, 뿌리계는 본질적으로 파괴된다. 이러한 식물들은 통상 접종후 5일 내지 8일이 지나면 죽는다. 식물 B는 유전자 도입 라인 26으로부터 나온 것이다 (아래 참조). 식물 B는 pVZAlOO을 이용하여 형질전환된 일반적인 식물들이다. 이러한 식물들은 P. nicotianae에 대해 매우 큰 내성을 나타내었으며 상부 뿌리의 끝부분에 나타난 작은 손상외에는 다른 아무런 손상도 나타내지 않았다. 이러한 식물들은 성체로 성장하고 번식가능한 종 자를 뿌린다.

콩에 있어서 pVZAlOO

pVZAlOO을 이용하여 콩식물에 충격을 가한다(bombarded). 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 32개의 충격 식물 중 15개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 배양되어 종자를 생산하였고 종자 식물들은 P. sojae에 대한 내성을 나타내는지 시험되었다. 도 13에 도시된 바와 같이, 시험된 495 개의 종자 식물들 중 43개의 종자 식물들이 P. sojae에 대해 내성을 나타내었다 (도 13). 반면, 비슷한 숫자의 야생 및 pCAMBIA1201 형질전환된 식물들(즉, "형질전환 대조식물군")은 죽었다.

감자에 있어서 pVZAIOO

pVZAlOO을 이용하여 감자 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 18개의 충격 식물 중 15개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 종자 식물들은 P. infestans에 대한 내성을 나타내는지 시험되었다. 이러한 식물들은 100% 모두 내성을 나타낸 반면, 야생 또는 형질전환 대조식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

옥수수에 있어서 pVZA100

pVZAlOO을 이용하여 옥수수 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 44개의 충격 식물 중 33개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 배양되어 종자를 생산하였고 종자 식물들은 Pythium graminicola에 대한 내성을 나타내는지 시험되었다. F1 식물들 중 25%가 내성을 나 타낸 반면, 야생 또는 형질전환 대조식물군에서는 전혀 내성을 나타내지 않았다.

전술한 결과들은 본 발명에 유용한 식물들은 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물을 포함한다는 사실을 보여준다.

유사하게, 옥수수 식물은 pVZAlOO을 이용하여 형질전환되고 시험되고 Phytophthora 및 Peronospora에 대해서 교차내성(cross resistance)을 나타낸다.

감자에 있어서 VVZA2O0

pVZA200 (Myzvis persicae Cathepsin B)을 이용하여 감자 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 12개의 충격 식물 중 7개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 aphids (Myzus persicae)에 대해서 내성을 가지는지 시험되었고, 80%의 식물들이 내성을 나타낸 반면, 대조식물군이나 야생의 식물들은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

형질전환된 식물들에서 배양한 후 Aphids를 조사한다. 본 발명에 따른 aphids에 포함된 침묵(silencing) cathespin B는 식물을 보호할 뿐만 아니라(즉, 식물이 aphid 내성을 갖게함) aphid의 개체수를 감소시킨다.

본 발명에 따른 실시예 및 본 예에 따르면, 해충에 대한 내성은 Cathepsin B와 같은 해충 유전자를 포함하는 비활동성 구조체를 이용한 형질전환을 통해 식물에 부여된다.

감자에 있어서 DVZA3O0

Myzus persicae부터의 Cathepsin B 및 Phytophthora infestans의 elicitin DNEF1에 동족(homologous)이며 상보적인(complementary) 지각 및 반지각 서열들을 포함하는 구조체인 pVZA300을 이용하여 감자 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 18개의 충격 식물 중 15개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 그러한 식물들은 aphids (Myzus persicae ) 및 Phytophthora infestans 대한 내성을 가지는지 시험되었다.

일련의 실험예에서, 형질전환된 한 감자식물군은 aphids에 대해서만 시험하였고, 또 다른 형질전환 감자식물군은 Phytophthora irifestans 에 대해서만 시험하였다.

aphid에 대해서만 시험한 식물들 중 80%는 내성을 나타낸 반면 야생 또는 형질전환대조 식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

Phytophthora infestans에 대해서만 시험한 식물들 중 75%는 내성을 나타낸 반면, 형질전환되지 않았거나 대조식물군에 속한 식물들은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

또 다른 일련의 실험예에서, 유사하게 형질전환되었거나 형질전환되지 않은 감자 식물들을 aphids와 Phytophthora infestans에 대해 동시에 시험하였다. 시험된 형질전환 식물들 중 60%는 두가지 해충에 대해 모두 내성을 나타낸 반면, 야생 또는 형질전환대조 식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

형질전환된 식물들에서 배양한 후 Phytophthora infestans을 격리하여 배양한다. 이러한 배양은 매우 서서히 진행되거나 진행을 멈춘다. 미시적으로 조사하면 균사가 매우 기형적으로 변화되었음을 알 수 있다.

게다가, 본 발명에 따른 비활동성 rRNA는 토양에 있어서 병원균의 개체수가 극적으로 감소되는 실시예를 더 보여준다.

콩에 있어서 ZAJOO

VZA300 (Myziis persicae부터의 Cathepsin B 및 Phytophthora infestans의 elicitin INFl에 동족(homologous)이며 상보적인(complementary) 지각 및 반지각 서열들을 포함하는 구조체)를 이용하여 감자 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머(primer)를 구비한 PCR은 충격 식물 중 60%의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 배양되어 종자를 생산하였고 종자 식물들은 배양되었다. 그러한 F1 식물들은 aphids (Myziis persicae) 와 Phytophthora sojae에 대해 내성을 가지는지 시험되었다.

일련의 실험예에서, 형질전환된 한 콩식물군은 aphids에 대해서만 시험하였고, 또 다른 형질전환 콩식물군은 Myzus pers icae에 대해서만 시험하였다.

aphid에 대해서만 시험한 식물들 F1 중 70%는 내성을 나타낸 반면 야생 또는 형질전환대조 식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

Phytophthora sojae에 대해서만 시험한 식물들 F1 중 15%는 내성을 나타낸 반면, 형질전환되지 않았거나 대조식물군에 속한 식물들은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

또 다른 일련의 실험예에서, 유사하게 형질전환되었거나 형질전환되지 않은 콩식물들을 aphids와 Phytophthora sojae에 대해 동시에 시험하였다. 시험된 식물들 F1 중 10%는 두가지 해충에 대해 모두 내성을 나타낸 반면, 야생 또는 형질전환 대조식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

본 발명 및 이러한 예들에 따르면, 해충 내성 및 진균류에 대한 내성은 복수개의 유전자(즉, 유전자 적층(stacking)에 의한)로 구성된 단일 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 식물에 부여된다. 또한, 놀랄만한 수준의 해충 내성은 하나 이상의 해충으로부터 추출된 비활동성 유전자에 의해 식물에 부여된다.

형질전환된 식물들에서 배양된 후, Phytophthora sojae는 격리되어 배양된다. 이러한 배양은 매우 서서히 진행되거나 진행을 멈춘다. 미시적으로 조사하면 균사가 매우 기형적으로 변화되었음을 알 수 있다.

콩에 있어서 ZA400

Phytophthora infestans이 rRNA 유전자에 대해 동종(homologous)이고 상보적인 반지각 및 지각 서열들로 구성되는 pVZA40O을 이용하여 콩 식물에 충격을 가한다. 적절한 프리머들을 구비한 PCR은 18개의 충격 식물 중 12개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 배양되어 종자를 생산하였고 종자 식물들은 Phytophthora sojae에 대해서 내성을 가지는지 시험되었다. 시험된 식물 F1 중 15%는 내성을 나타낸 반면 형질전환되지 않거나 형질전환된 대조 식물군은 전혀 내성을 나타내지 않았다.

다음으로, 야생의 콩들을 pVZA400-형질전환된 식물들에서 추출된 Phytophthora sojae 배양균이 이용하여 시험한다. 이러한 P. sojae 배양균은 병원 균은 야생의 콩 또는 형질전환된 대조콩 식물군에서 추출한 sojae 배양균에 비해 병원성이 없다.

전술한 결과들은 해충(예를 들면, 진균류)에 있는 rRNA의 비활동성의 유용성을 보여주며 또한 해충 병원성 유전자가 생성되는 해충이 아닌 해충 종에 대한 교차 내성을 보여준다.

감자에 있어서 pVZA400

Phytophthora infestans의 rRNA 유전자에 동종이며 상보적인 반지각 및 지각 서열들로 구성되는 pVZA400을 이용하여 감자 식물들에 충격을 가한다. 적절한 프리머들을 구비한 PCR은 12개의 충격 식물 중 6개의 식물이 형질전환된 사실을 보여주었다. 형질전환된 식물들은 배양되어 Phytophthora infestans에 대해서 내성을 가지는지 시험되었다. 시험된 식물들 모두 내성을 나타내었고 야생 또는 형질전환 제어식물군은 내성을 전혀 나타내지 않았다.

형질전환된 식물들에서 배양된 후, Phytophthora infestans는 격리되어 배양된다. 이러한 배양은 매우 서서히 진행되거나 진행을 멈춘다. 미시적으로 조사하면 균사가 매우 기형적으로 변화되었음을 알 수 있다.

전술한 결과들은 해충(예를 들어, 진균류)에 대한 해충 내성을 복수개의 식물들에 부여하는데 있어서 단일한 비활동성 rRNA 구조체의 유용성을 보여준다.

예 28. 덩이줄기 썩음병에 대해 내성을 가진 감자 제조( Fusarium sambucinum 번역 신장 인자 1 알파)

Fusarium sambucinum 번역 신장 인자 1 알파 DNA 서열(GenBank locus 　AJ543605, SEQ ID NO: 51)에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 감자 숙주 세포는 형질전환된다. 감자 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 감자 식물은 성공적으로 Fusarium sambucinum 덩이줄기 썩음병에 대해 내성을 가지게 된다.

예 29. 역병 내성을 가진 토마토 제조( Phytohpthora infestans elicitin 유전자)

Phytohpthora infestans 지놈(GenBank locus AY766228, SEQ ID NO: 52)에서 발견되는 엘리시틴(elicitin) 유전자 서열에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 감자 숙주 세포는 형질전환된다. 토마토 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 토마토 식물을 Phytohpthora infestans로 예방접종한 후 성공적으로 토마토의 역병에 내성을 가지게 된다.

예 30. 줄기썩음병에 내성을 가진 캐놀라 제조( Sclerotinia sclerotiorum RNA 폴리머라제 서브유닛)

RNA 폴리머라제 Ⅱ 두 번째로 큰 서브유닛, exon 1, strain 484 1096 bp (GenBank locus AJ745716, SEQ ID NO: 53)에 대한 Sclerotinia sclerotiorum 부분 rpb2 유전자에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 캐놀라 숙주 세포는 형질전환된다. 캐놀라 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 캐놀라 식물을 Sclerotinia sclerotiorum로 예방접종한 후 성공적으로 줄기썩음병에 부여된 내성을 가지게 된다.

예 31. 목화시드름병에 내성을 가진 목화 제조( Fusarium solani pisi cutinase homolog )

F. solani pisi(GenBank locus K02640.1, SEQ ID NO: 48)에서 나온 cutinase 유전자에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 목화 숙주 세포는 형질전환된다. 상기 배열은 Fusarium 속의 유전자 상동성때문에 여기에서 선택된다. 목화 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 목화 식물을 Fusarium oxysporum로 예방접종한 후 성공적으로 목화시드름병에 부여된 내성을 가지게 된다.

예 32. 마이코톡신 내성을 가진 옥수수 제조(F. solani pisi cutinase )

F. solani pisi(GenBank locus K02640.1, SEQ ID NO: 48)에서 나온 cutinase 유전자에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 옥수수 숙주 세포는 형질전환된다. 상기 배열은 Fusarium 속의 유전자 상동때문에 여기에서 선택된다. 옥수수 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 옥수수 식물을 Fusarium oxysporum로 예방접종한 후 성공적으로 마이코톡신에 대해 증가된 내성을 가지게 된다.

예 33. 잎자루썩음병에 내성을 가진 옥수수 제조( Stenocarpella maydis rDNA )

Stenocarpella maydis rDNA(GenBank locus AY332489, SEQ ID NO: 54)에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 옥수수 숙주 세포는 형질전환된다. 상기 배열은 Stenocarpella 및 Fusarium 속의 유전자 상동성때문에 여기에서 선택된다. 옥수수 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 옥수수 식물을 Stenocarpella maydis 및 몇몇 Fusarium 종으로 예방접종한 후 성공적으로 잎자루썩음병에 대해 증가된 내성을 가지게 된다.

예 34. 잎마름병 내성을 가진 옥수수 제조( Cercospora zeae - maydis 18s rDNA )

Cercospora zeae - maydis Group II (GenBank locus AF291710, SEQ ID NO: 55)에서 나온 18S 리보솜 RNA 에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 옥수수 숙주 세포는 형질전환된다. 옥수수 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 옥수수 식물을 Cercospora zeae - maydis로 예방접종한 후 성공적으로 잎마름병에 대해 내성을 가지게 된다.

예 35. 복숭아혹진딧물에 대한 내성을 가진 감자 제조( Myzus persicae 카텝신 B 프로테아제)

Myzus persicae(GenBank locus AY702822, SEQ ID NO: 56)에서 나온 카텝신 B 에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 감자 숙주 세포는 형질전환된다. 감자 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 감자 식물을 Myzus persicae로 예방접종한 후 성공적으로 복숭아혹진딧물에 대해 내성을 가지게 된다.

예 36. 콜로라도 감자잎벌레에 대한 내성을 가진 감자 제조( Leptinotarsa decemlineata 시스테인 프로테아제)

Myzus persicae(GenBank locus AY159377, SEQ ID NO: 51)에서 나온 시스테인 프로테아제에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100(예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 감자 숙주 세포는 형질전환된다. 감자 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 감자 식물을 Leptinotarsa decemlineata로 예방접종한 후 성공적으로 콜로라도 감자잎벌레에 대한 내성을 가지게 된다. 이러한 재생된 감자는 하기의 각각에 대해 내성이 증가되었음을 보여준다: Callosobruchus maculates , Diabrotica virgifera virgifera , Acanthoscelides obtectus, Helicoverpa armigera , Leptinotarsa decemlineata , Anthonomus grandis, Triatoma infestans , Tenebrio molitor , Toxoptera citricida , Aphis gossypii, Pandalus borealis , Myzus persicae , Delia radicum , Sarcophaga peregrine, Sitophilus zeamais , Boophilus microplus , Hypera postica , Frankliniella occidentalis , H. americanus .

예 37. 버티실리움시들음병에 대한 내성을 가진 감자 제조(V. dahliae rDNA )

verticillium dahliae rDNA(GenBank locus AF108478 , SEQ ID NO : 58J)에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100 (예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 감자 숙주 세포는 형질전환된다. 감자 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 감자 식물을 verticillium dahliae 로 예방접종을 한 후 성공적으로 버티실리움시들음병에 대해 내성을 가지게 된다.

예 38. 노균병에 대한 내성을 가진 콩 제조( Peronospora berteroae rDNA )

Peronospora berteroae 지놈 ( GenBank locus AY531450 , SEQ ID NO : 59)에서 발견된 5.8S 리보솜 RNA 의 내부 전사된 스페이서 ( spacer ) 1 부분 서열에 대응하는 센스 및 안티센스 서열을 제외하고 pVZA100 (예 3)와 유사한 이종성 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 콩 숙주 세포는 형질전환된다. 콩 식물은 형질전환된 세포로부터 생성되고 선택한 콩 식물을 Peronospora manchur - ica 로 예방접종한 후 성공적으로 노균병에 대해 내성을 가지게 된다. 이러한 선택된 콩은 Hyaloperonospora 종(예를 들어, H. camelinae , H. niessleana , H. parasitica , H. thlaspeos - perfoliati ) 및 Peronospora 종(예를 들어, P. arabidopsidis , P. arabis - alpinae , P. buniadis , P. cardaminopsidis , P. cochleczariae , P. dentariae , P. galligena , P. hesperidis, P. iberidis , P. isatidis , P. nesleae , P. sisymbrii - loeselii , P. sisymbrii-officinalis, P. sisymbrii - sophiae , P. thlaspeos - alpestris , P. thlaspeos-ui'vensis )에 대한 내성이 증가된다 .

예 39. 감자뿌리혹선충에 대한 내성을 가진 감자 제조 ( Meloidogynechitowoo 야c ytochro me oxidase H)

감자 숙주세포들은 센스 및 안티센스 서열이 Meloidogyne chitwoodi 지놈(즉, 시토크롬 옥시다아제 서브유닛 IT 유전자 ( GenBank locus AY757882 , SEQ ID NO:60)에서 발견된 서열에 해당하는 것을 제외하고 pVZZ100 (예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 감자 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Meloidogyne chitwoo 야접종 이후에 감자 뿌리혹에 부여된 내성을 위하여 성공적으로 선택된다. 이와 같이 선택된 감자 식물들 또한 Bombyx mandarina , Bombyx mori , Chilo tumidicistalis , Hemileuca , Hydrotaea aenescens , MEloidogyne gapla , Meloidogyne partityla , Oecetis avara , Papilio aegeus , Papilio demoleus , Papilio erithonioides , papilio hipponous , papilio oribazus , papilio protenor , papilio troilus , papilio xuthus , Sabethes cyaneus , and Samia cynthia ricini 에 내성이 있다는 것이 발견된다.

예 40. 선충 감염에 대한 내성을 가진 콩들의 제조 ( Pratylenchus scribneri and Heterodera glycines ribosomal RNA genes )

본 발명은 추가적인 선충에 대해 증가된 내성을 가지는 숙주식물들을 생산하는 데 사용될 수 있다. 알려져 있으며 NCB8 / NIH GenBank 와 같은 일반 데이터베이스에서 검색가능한 선충 폴리뉴클레오티드 서열들은 서로다른 선충 속들 중 보존된 뉴클레오티드된 모티프들을 보여준다. 보존된 뉴클레오티드 모티프들은 이러한 서열들은 생존력 및/또는 기생과 관련되어 있으며 Meloidogyne incognita (뿌리혹 선충 ) 및 Globodera rostochiensis 및 Globdera pallids (감자 낭포 선충( cystnematode )), 및 또한 잘 연구된 Heterodera glycines 및 Caenorhabditis elegans에서 기능적으로 보존되고 발현된다는 것을 강력하게 제시한다. 따라서, 이러한 서열들 및 그의 변형들의 사용은, 이와 같은 RNAi 가 넓은 RNAi 특이성을 가지도록 설계될 수 있기 때문에 많은 수의 식물 기생 선충들을 in planta 로 제어하는데 유용하기 때문에 장점이 있다. 여기서 확인된 유전자들은, 선충 생존 미/또는 기생과 관련되어 있기 때문에, (예를 들어, 선충들이 상술한 바와 같이 형질전환된 식물들을 먹이로 하게 함으로써 RNAi 분자들로 이루어진 합성물과 접촉하는 선충들로부터 야기되는) 이러한 유전자들의 RNAi 억제는 기생 선충의 생장, 진화, 및/또는 기생을 방지 및/또는 감소시킨다.

선충의 먹이공급( nematode feeding )은 본 발명에 따른 방법의 유효성에 대한 유용한 지시자이다. Pratylenchus scribneri in vitro 영양 분석시험은 옥수수 뿌리 삼출물을 영양 자극으로써 사용하며 적색 염료 Amarantfci , 또는 비산칼륨을 영양지시자로 사용한다. 영양은 아마란스에 노출된 살아있는 벌레에 적색으로 착색된 장세포의 존제 또는 비산염에 노출된 벌레들의 죽음으로 7일 후에 확인된다. P.scribneri는 옥수수, 쌀 및 Arabidopsis 의 와일드 타입의 뿌리 및 사탕수수와 토마토의 Agrobacterium rhizogenes -유도된 털이 많은 뿌리 위에서 재배될 수 있다. P.scribneri는 이러한 벌레들의 비특이성 영양때문에 (본 기술분야에서 형질전환벡터로 알려진 Agrobacterium rhizogenes 변종의 사용에 의해 이상적으로 진화된) 유전자 이식된 털이 많은 뿌리들을 평가하는데 매우 유용하다.

옥수수, 쌀, 토마토, 및 사탕수수는 P. scribneri ribosomal RNA ( GenBank locus SEQ ID NO :61)의 상보적인 센스 및 안티센스 서열들을 포함하는 이종 폴리뉴 클레오티드로 형질전환된다. P. scribneri 는, 형질전환된 그리고 와일드 타입의 옥수수, 쌀, 토마토, 및 사탕수수를 이용한 영양 분석시험에서 테스트된다 . 형질전환된 식물들은 P. scribneri 에 대해 증가된 내성을 보여준다.

콩은 Heterodera glycines ribosomal RNA ( GenBank locus AY667456 , SEQ ID NO: 62)의 상보적인 센스 및 안티센스 서열들을 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된다. Heterodera glycines 은 형질전환된 그리고 와일드 타입의 콩을 이용한 영양 분석시험에서 테스트된다 . 형질전환된 콩은 Heterodera glycines 에 대해 증가된 내성을 보여준다.

예 41. 다양한 Phytophthora spp . ( Phytophthora nicotianae cutinase )에 의한 감염에 대한 내성을 가진 다양한 식물들의 제조

일실시예에서, pVZA100 이종 폴리뉴클레오티드(예 3)는 다양한 식물들이 다양한 Phytophthora종의 내성에 대해 내성을 부여하도록 형질전환시키는 데 사용된다. 예를 들어, Chrysalidocarpus palm, Catharanthus, Dendrobium, 포인세티아, 봉선화, 세이지, 스패티필룸(spathiphyllum), 또는 양파 중 어느 하나가 pVZ100 (SEQ ID NO: 5)로 형질전환될 때, Phytophthora spp.-유도된 잎과 줄기 감염에 대해 내성을 부여한다. 포인세티아, 토마토, 파인애플, 또는 안튜륨 중 어느 하나가 pVZA100을 사용하여 형질전환되면, Phytophthora spp.-유도된 뿌리혹에 대한 내성이 부여된다.

수박, 프로티(protea), 또는 아프리카 제비꽃 중 어느 하나가 pVZA100을 사용하여 형질전환되면, Phytophthora spp.-유도된 수관(crown) 및 줄기 역 병(collarrot)에 대한 내성이 부여된다.

토마토, 파파야, 또는 가지 중 어느 하나가 pVZA100을 사용하여 형질전환되면, Phytop0hthora spp.-유도된 과일 역병에 대한 내성이 부여된다.

예. 42 용설란 뿌리 역병( Fusarium solani pisi cutinase )에 대한 내성을 가진 용설란의 제조

용설란 숙주세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Fusarium solani pisi (GenBank locus K02640, 1, SEQ ID NO: 48)로부터의 cutinase 유전자에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 이 서열을 트리에(trie) 종인 Fusarium 내에서 유전자의 상동성(homology) 때문에 선택한다. 용설란 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생아형 Fusarium oxysporum 접종 후에 용설란 역병에 대하여 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 43. 고사병( Magnaporthe grisea RNA polymerase Ⅱ)에 대한 내성을 가진 쌀의 제조

쌀 숙주세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 (GenBank Locus XM 362268, SEQ ID NO: 63)의 Magnaporthe grisea RNA polymerase Ⅱ 서열에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 형질전환은 전기충격 또는 Agrobacteriitm tumefaciens에 의해 이루어졌다. 쌀은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Magnaporthe grisea 접종 후 쌀 고사병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 44. Phytophthora -유도된 뿌리병 ( Phytophthora cirticola cutinase )에 대해 내성을 다진 다양한 식물들의 제조

Rhododendron (예를 들면, Rh. catawbiense, Rh. simsii, Rh. Catawbiense), Erica sp., Calluna sp., 애보카도 나무, 감귤나무 및 홉을 포함하는 다양한 식물들은 이종 폴리뉴클레오티드 pVZA100(예 3)를 사용하여 형질전환된다. Phytophthora nicotianae SEQ ID NO: 14와 Phytophthora citricola SEQ ID NO: 34 사이의 상동성 때문에 이 구조가 선택되었다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포드로부터 발생하여 Phytophthora citricola. 접종 후 질병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 45. 보리점녹병( Puccinia hordei 18S ribosomal RNA )에 대한 내성을 가진 보리의 제조

보리 세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Puccinia hordei 18S rRNA (GenBank locus AY125412, SEQ ID NO:64)에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Puccinia hordei 접종 후 보리점녹병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 46. 노균(Pseudoperonospora humuli rDNA)에 대한 내성을 가진 보리의 제조

보리 세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Pseudoperonospora humuli isolate HV 148 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA (GenBank locus AY198305, SEQ ID NO: 65)로부터의 서열들에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Pseudoperonospora humuli 접종 후 노균에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 47. 회색곰팡이병( Botrytis cinerea cytochrome P450 monoxygenase )에 대한 내성을 가진 보리의 제조

보리 세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Botrytis cinerea for aba2 gene for cytochrome P450 monoxygenase, exons 1-5 (GenBank locus AJ851088, SEQ ID NO : 66)로부터의 서열에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Botrytis cinerea 접종 후 회색곰팡이병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 48. 토마토 얼룩병(Pseudomonas syringe rDNA)에 대한 내성을 가진 토마토의 제조

토마토 세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Pseudomonas syringae ribosomal RNA (GenBank locus AY342210, SEQ ID NO: 67)에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 세포들은 형질전환된 세포들로부터 발생되어 Pseudomonas syringae 접종 후 토마토 얼룩병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 49. 풋마름병( Clavibacter michiganense michiganense Cel A 유전자)에 대한 내성을 가진 토마토의 제조

토마토 세포들이, 센스 및 안티센스 서열들이 Clavibacter michiganense michiganense Cel A gene (GenBank locus AY007311, SEQ ID NO: 68)에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생하여 Clavibacter michiganense michiganense 접종 후 풋마름병에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 50. Goss 의 풋마름병과 고사병( Clavibacter michiganense endo β-glucosidase 유전자)에 대한 내성을 가진 옥수수의 제조

옥수수 세포들은, 센스 및 안티센스 서열들이 Clavibacter michiganense gene for endo β-glucosidase (GenBank locus X62582, SEQ ID NO: 69)에 해당하는 것을 제외하고 pVZA100(예 3)과 유사한 이종 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다. 숙주 식물들은 형질전환된 세포들로부터 발생되어 Clavibacter michiganense 접종 후 Goss의 풋마름병 및 고사병(잎주근깨와 마름)에 대해 부여된 내성을 위해 성공적으로 선택된다.

예 51. 콩을 하나 또는 두개의 균성 질병으로부터 보호하기 위한 침묵 컨스트럭트 방법

콩의 숙주 식물 세포가 도 10에 도시된 유전자 침묵 컨스트럭트들 중의 하나로 변형되며 성숙된 식물들이 그것들로부터 발생된다. 성숙된 식물들은 두개의 주요 균성 질병들 즉, Phytophthora sojae로 인한 콩의 뿌리 및 줄기 썩음병 및 Phakopsora pachyrhizi로 인한 대두 녹두균에 저항하도록 차단된다. 식물들은 그러 한 두개의 질병들 중의 하나 또는 모두에 저항하는 것으로 확인된다. 상부 컨스트럭트로 변형된 식물들은 콩의 뿌리 및 줄기 썩음병에 저항한다. 중간 컨스트럭트로 변형된 식물들은 대두 녹두균에 저항한다. 하부 컨스트럭트로 변형된 식물들은 콩의 뿌리 및 줄기 썩음병과 대두 녹두균 모두에 저항한다.

예 52. 콩을 세개의 균성 질병으로부터 보호하기 위한 폴리시스트론( polycistronic ) 침묵 컨스트럭트 방법

콩의 숙주 식물 세포가 도 9에 도시된 폴리시스트론 유전자 침묵 컨스트럭트로 변형되며 성숙한 식물들이 그것들로부터 발생된다. 성숙된 식물들은 세개의 주요 균성 질병들 즉, JPhytophthora sojae로 인한 콩의 뿌리 및 줄기 썩음병, Fusarium solani f. sp . glycines로 인한 콩의 돌연사 증후군, 및 Phakopsora pachyrhizi로 인한 대두 녹두균에 저항하도록 차단된다. 식물들은 그러한 세개의 질병들 중의 하나 또는 모두에 저항하는 것으로 확인된다.

예 53. 유전형질전환 식물들로의 영양 공급 또는 pVZA 100, pVZA300 또는 pVZA400을 이용한 직접 변형을 통한 Phytophthiora 종들의 탈병인( Depathogenesis )

담배 숙주 세포들이 침묵 컨스트럭트 pVZA 100 (SEQ ID NO: 5)로 변형되었고 식물들이 그것들로부터 발생되었다. 그렇게 변형된 식물들은 P. nicotianae에 강한 저항성을 보였다. 담배 식물들의 전형적인 반응들이 도 11에 도시되어 있다. 식물 A는 야생 담배 식물들 또는 pCAMBIA 1201로 변형된 담배 식물들에 전형적인 반응들을 보인다. 그 식물들은 감염되기 쉬우며, 상당한 줄기 손상들이 존재하고, 줄기 조직이 필연적으로 파괴된다. 그러한 식물들은 대개 예방접종 후 5~8일 만에 죽는 다. 식물 B는 유전형질전환 라인 26으로부터 이루어진다(하기 참조). 이는 pVZAlOO로 변형된 식물들에 전형적인 것이다. 그것은 P. nicotianae에 저항성이 높고 상부 뿌리들의 상단들의 작은 손상들 외에는 어떠한 증후군도 보이지 않는다. 그러한 식물들은 성숙하게 자라서 풍부한 씨앗들을 생산한다.

P. nicotianae가 저항성 식물들에 대한 제한된 손상들로부터 다시 격리되었고 야생 식물들에 대해 다시 테스트되었을 때, 그것은 더이상 발병원이 아니었다. 이러한 균으로부터의 RNA의 격리와 상기 예 14에서와 같은 방사성 큐티나아제 프로브를 이용한 잡종번식은 P. nicotianae에서의 큐티나아제 유전자를 위한 siRNA들의 존재를 나타내며, 이는 병원균성의 상실을 설명해 준다. 도 12에서, 레인 1은 분자 크기 제어의 역할을 하는 35 nt 올리고뉴클레이티드 VZA 3F (SEQ ID NO:3) 및 VZA 4R (SEQ ID NO: 4)을 보이며, 레인 2는 야생성 균으로부터의 620 nt 메신저 RNA 보이고, 레인 3은 침묵된 유전형질전환 담배 식물로부터의 siRNA들을 보이며, 레인 4는 저항성 유전형질전환 담배로부터 격리된 비병원성 균으로부터의 siIRNA들을 보인다.

예 13에서와 같이, 침묵 컨스트럭트들로 직접적으로 또는 침묵 컨스트럭트들로 변형된 식물들에 해충 종을 공급하여 해충의 종을 변형하는 것은 그 해충(이 예에서는 균)의 병원성, 성장 및 생존에 상당한 영향을 준다. 이러한 결과들은 해충들로 인한 작물의 손실을 최소화하고 농업 생산성을 향상시키는 본 발명의 유용성을 직/간접적으로 증명한다.

예 54. 탈병인 : 큐티나아제 침묵화 이종 폴리뉴클레오티드 (F. oxysporum ctitiiiase)로 변형된 워터멜론

Tn Florida and Georgia 워터멜론들은 일 년 동안만 밭에 심어질 수 있다. 이러한 일 년 동안의 밭의 사용은 Fusarium oxysporum의 높은 병원균 격리를 초래하기 때문에, 농부는 그 밭은 다시 사용하기 위해 6 또는 7 년을 기다려야 한다. 밭을 여러 해 동안 연속적으로 사용하기 위해서는, 농부는 비싼 메틸 브로마이드(methyl bromide)와 같은 화학 약품들로 그 밭은 연례적으로 처리해야만 한다.

워터멜론은 센스 및 안티센스 서열들이 J ⁷ . oxysporum의 큐티나아제 유전자와 대응된다는 것을 제외하고는 pVZA 100(예 3)와 유사한 이종 폴리뉴클레오티드로 변형된 숙주 식물 세포로부터 재생된다. F. oxysporum은 워터멜론을 감염시키며 F. oxysporum cutinase 유전자는 침묵화되었다. 다른 워터멜론 종들(본 발명에 따라 변형되지 않음)은 상기 재생된 (유전형질전환된) 워터멜론으로부터 6 피트 이내의 거리에 심어졌다. 이러한 다른 워터멜론 종들은 그것들에 인접하여 상기 재생된 (유전형질전환된) 워터멜론을 심지 않았을 때 예상되었던 것보다 F. oxysporum에 덜 감염되었다.

예 55. broad based 식물 저항성 및 리보솜 RNA 침묵화 이종 폴리뉴클레오티드에 대한 탈병인

선택적으로, 탈병인을 효과적으로 구현하기 위하여, 병원성 균의 여러 종들에 대한 broad-based 또는 cross generic 보호가 구현될 수 있다. 이는 리보솜 DNA (rDNA) 유전자들을 함유하는 침묵 컨스트럭트들을 이용하여 달성될 수 있다. 균성 병원균들의 rDNA 서열들은 밀접하게 관련된 균 종들의 제어에 기능할 만큼 서로 충분히 유사하지만 균들의 그룹들 간의 구분이 가능하도록 충분히 상이하므로, 단일 또는 복수의 폴리시스트론성 유전자 침묵 컨스트럭트들을 가지는 균성 병원균들의 특정 그룹들에 대한 선택적인 대상화를 가능케 한다.

이러한 방식이 도 13에 도시되어 있다. Phytophthora sojae 및 Phakopsora pachyrhizi의 18S rDNA 서열들은 NCBI/NIH GenBank의 데이터에 대해 "blasted(해독)" 되었다. Phytophthora sojae 서열은 밀접하게 관련된 16 개의 추가적인 균 종들의 서열들에 대해 강한(100 내지 93%) 동족성(homology)을 보였으나, Phakopsora pachyrhizi의 서열에 대해서는 상당한 동족성을 보이지 않았다. 반대로, Phakopsora pachyrhizi의 18S rDNA 서열은 밀접하게 관련된 19 개의 추가적인 균 종들의 서열들에 대해 강한(100 내지 93%) 동족성을 보였으나, Phytophthora sojae의 서열에 대해서는 상당한 동족성을 보이지 않았다. 따라서, 개별적인 유전자 침묵 컨스트럭트들이 본 발명의 개시에 따라 Phytophthora sojae 및 Phakopsora pachyrhizi와 관련된 균들의 그룹을 제어하도록 발전될 수 있거나, 대안적으로, 폴리시스트론성 유전자 침묵 컨스트럭트가 두 그룹들을 동시에 제어하도록 발전될 수 있다.

[표 13]

대상 종들과의 상당한 정렬을 생성하는 GenBank 서열 리보솜 DNA


Phytophthora sojae 18s ribosomal DNA 서열들의 동일성은 129 뉴클레오티드들에 대해 100 내지 93%의 범위이다		Phakopsora pachyrhizi 18s ribosomal DNA 서열들의 동일성은 89 뉴클레오티드들에 대해 100 내지 93%의 범위이다
Fungus Species = (17)	( bits )	Fungus Species = (18)	( bits )
Phytophthora sojae	278	Phakopsora pachyrhizi	278
Phytophthora vignae	194	Phakopsora meibomiae	153
Phytophthora drechsleri	174	Uromyces aemulus	131
Phytophthora cinnamomi	174	Puccinia striiformis	123
Plasmopara viticola	168	Pandora neoaphidis	121
Phytophthora melonis	167	Puccinia allii	119
Phytophthora cryptogea	165	Piromyces sp .	119
Phytophthora pistaciae	161	Dioszegia sp .	117
Hyaloperonospora parasitica	161	Bullera sp . T	117
Phytophthora niederhauserii	161	Dioszegia crocea	117
Phytophthora sinensis	153	Cadophora sp .	117
Phytophthora cajani	153	Dioszegia hungarica	117
Pythium insidiosum	153	Phialophora sp .	117
Phytophthora palmivora	151	Anaeromyces sp .	117
Phytophthora ramorum	149	Phialophora melinii	117
Peronospora corydalis	149	Puccinia triticina	117
Pythium rostratum	141	Neocudoniella radicella	115
		Pinctada nigra	115
		Peziza vesiculosa	115
		Phillipsia domingensis	115

예 56. 복수의 침묵화 이종 폴리뉴클레오티드들을 이용한 복수의 식물 해충들의 억제

식물들은 종종 복수의 해충들에의해 공격을 받는다. 선택적으로, 동일한 식물에 대하여 여러 종류의 해충들을 억제하는 것이 유용할 것이다. 복수의 해충들을 억제하는 유전자 스태킹(stacking) 방법들과 유용한 유전자 서열들(예: 유전자 부호화 리보솜 RNA, 큐티나아제, 카텝신 및 기타 필수 효소 및 단백질)이 본 명세서에서 개시된다. 그 예들로는 콩들과 Phytophthora 뿌리 및 줄기 썩음병, Aaian 녹병, 콩 낭종 선충, 돌연사 증후군, 및 진디 등이 있다. stacked fox에 대한 예시적인 유전자들은 Phytophthora 뿌리 및 줄기 썩음병에 대한 SEQ ID NO: 14, Asian 녹병에 대한 SEQ ID NO: 50, 콩 낭종 선충에 대한 SEQ ID NO: 62, 돌연사 증후군에 대한 SEQ ID NO: 48, 및 진디에 대한 SEQ ID NO: 56을 포함한다.

마찬가지로, 옥수수는 뿌리 및 줄기 썩음병, 마이코톡신, 잎 고사, 줄기 및 이삭 뚤림(borer), 진디, 및 선충에 내성을 가지게 할 수 있다. 또한, 목화는 꼬투리 썩음병, Verticillium 및 Fusarium 시들병, 묘목 고사병, 댐핑 오프(damping off), 꼬투리 바구미(boll weevil), 목화씨 벌레(bollworm), 진디, 및 자벌레에 내성을 가지게 할 수 있다. 또한, 캐놀라는 블랙 레그(black leg), 줄기 썩음병(stem rot), 블랙 스팟(black spot), 댐핑 오프, 묘목 고사병, 풍뎅이(flea beetle), 바구미, 및 진디에 내성을 가지게 할 수 있다.

또한, 밀은 잎 및 줄기 녹병, 머리 고사병(head blight), Septoria 병반, 입고병(take-all), 흑수병(smut), 가루 및 솜털 노균병(powdery and downy mildew), 진디, 및 선충에 내성을 가지게 할 수 있다. 또한, 토마토는 후기 고사병(late blight), 탄저병(anthracnose), 그레이 몰드(gray mold), Verticillium 시들병, 선충, 및 진디에 내성을 가지게 할 수 있다. 또한, 감자는 후기 고사병, 조기 고사엽, Verticillium 시들병, 선충, Colorado 토마토 풍뎅이, 및 진디에 내성을 가지게 할 수 있다.

본 명세서에서 인용된 참조문헌들은 본 명세서의 명시적인 개시 내용에 모순되지 않는 범위 내에서 그것들의 개시 내용이 참조로써 본 명세서에 병합된다. 비록 상기의 상세한 설명과 관련하여 본 발명이 설명되었으나, 그 상세한 설명은 첨부된 청구항들의 범위로 정의되는 본 발명의 범위을 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 이해되어져서는 안된다. 기타 다른 형태, 장점, 변 형들은 첨부된 청구항들의 범위에 속한다.

하기의 서열 리스트들이 참조로써 병합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Niblett, Charles L. <120> Methods and Materials for Conferring Resistance to Pests and Pathogens of Plants <130> VEN-100 <160> 69 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VZA 1F <400> 1 taaattagcg gccgcatgaa attcttcgct cgcagtag 38 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VZA 2R <400> 2 aaaaatccat ggtcaagcag aaccacggct tagtg 35 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VZA 3F <400> 3 aaataagggc ccatgaaatt cttcgctcgc agt 33 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VZA 4R <400> 4 aaatatctcg agtcaagcag aaccacggct tagtg 35 <210> 5 <211> 2201 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pVZA100 silencing construct <400> 5 gggcccatga aattcttcgc tcgcagtaga tggcactcca gtcgttgccg tgtcgtcacg 60 gctcgcctac gatccgatta accgcagaca caccgattgt gcctgattca gagaggctcc 120 cactgaaacg agatgagcct ggctcacggt cgatgcgcag caccttcata ccatcttcac 180 aatgctcgaa cttgtcttcg gcaacggctt cgtcatcgcg tcggcgatca tgtcgtcggt 240 accaacatgg cgaagccgtt gcctcgtcct ccactaggtg gcgcaccaag tggaacttgt 300 tcataatatg cttgctcttg ctgtgcttgc caggcttggc agttagatac atgcacgaca 360 tgttttcgcc gtgtatctcc ggagtcgcaa actcccagca tagttcgtca cagagtccac 420 gtagccactg tagatctctg gtaccttcat tcatagcaat atactctgct tccgttgtgc 480 tctgtgcgtt gatctcttgc tttcttgatc cgtacgaaac cacattgcca ttgacgaacg 540 tgacgaactg cctaacactc tttcggtcat cagggtcatt gcgtagtgag catcggtgta 600 gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggcaac aattgtccat cactagccgt ggttctgctt 660 gacactaagc cgtggttctg cttgactcga ggtagatctg agggtaaatt tctagttttt 720 ctccttcatt ttcttggtta ggaccctttt ctctttttat ttttttgagc tttgatcttt 780 ctttaaactg atctattttt taattgattg gttatggtgt aaatattaca tagctttaac 840 tgataatctg attactttat ttcgtgtgtc tatgatgatg atgatagtta cagaaccgac 900 gactcgtccg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg 960 cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttgatcagcg ttggtgggaa agcgcgttac 1020 aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata 1080 ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg 1140 caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca 1200 ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc 1260 cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta tcaccgtttg tgtgaacaac gaactgaact 1320 ggcagactat cccgccggga atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa aagcagtctt 1380 acttccatga tttctttaac tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc tacaccacgc 1440 cgaacacctg ggtggacgat atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac tgtaaccacg 1500 cgtctgttcc atggtcaagc agaaccacgg cttagtgtca agcagaacca cggctagtga 1560 tggacaattg ttgccgggaa cgacgtgaat ctgacgtgct acaccgatgc tcactacgca 1620 atgaccctga tgaccgaaag agtgttaggc agttcgtcac gttcgtcaat ggcaatgtgg 1680 tttcgtacgg atcaagaaag caagagatca acgcacagag cacaacggaa gcagagtata 1740 ttgctatgaa tgaaggtacc agagatctac agtggctacg tggactctgt gacgaactat 1800 gctgggagtt tgcgactccg gagatacacg gcgaaaacat gtcgtgcatg tatctaactg 1860 ccaagcctgg caagcacagc aagagcaagc atattatgaa caagttccac ttggtgcgcc 1920 acctagtgga ggacgaggca acggcttcgc catgttggta ccgacgacat gatcgccgac 1980 gcgatgacga agccgttgcc gaagacaagt tcgagcattg tgaagatggt atgaaggtgc 2040 tgcgcatcga ccgtgagcca ggctcatctc gtttcagtgg gagcctctct gaatcaggca 2100 caatcggtgt gtctgcggtt aatcggatcg taggcgagcc gtgacgacac ggcaacgact 2160 ggagtgccat ctactgcgag cgaagaattt catgcggccg c 2201 <210> 6 <211> 2031 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pVZA200 Silencing construct <400> 6 gggcccacaa gagcgaagat gcagagtacg acaacacata cattccaagg ttctttgacg 60 ctaggagaaa atggagacat tgtagtacga tcggaagagt ccgtgaccaa ggaaactgtg 120 gatcttgttg ggctgtggcc actagctcgg ctttcgctga ccgtttgtgt gtagcaacaa 180 atgcagactt caacgaatta ttatccgccg aagaaatcac tttctgctgt catacatgtg 240 gcttcggatg caacggtggt tacccgatta aagcatggaa acgttttagt aaaaaaggtt 300 tagtcaccgg aggagactac aaatctggag agggttgtga accatacaga gttccacctt 360 gtcctaatga cgaccaagga aataatacat gcgccggtaa accaatggaa tcaaaccaca 420 ggtgtaccag gatgtgctac ggtgaccagg acctcgactt cgacgaagac 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cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg acctcgagac 1380 cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttatttcac gtaaacgcct 1440 gacttgtaac tggggaaatc gtcgtataca tcgaacgatg cttcaattgg tccgtaagtc 1500 atgacgtcct tttggatgct accgtatgtt aggtagtagt aatcacgtgt gtatctgtgg 1560 tcttcgtcga agtcgaggtc ctggtcaccg tagcacatcc tggtacacct gtggtttgat 1620 tccattggtt taccggcgca tgtattattt ccttggtcgt cattaggaca aggtggaact 1680 ctgtatggtt cacaaccctc tccagatttg tagtctcctc cggtgactaa acctttttta 1740 ctaaaacgtt tccatgcttt aatcgggtaa ccaccgttgc atccgaagcc acatgtatga 1800 cagcagaaag tgatttcttc ggcggataat aattcgttga agtctgcatt tgttgctaca 1860 cacaaacggt cagcgaaagc cgagctagtg gccacagccc aacaagatcc acagtttcct 1920 tggtcacgga ctcttccgat cgtactacaa tgtctccatt ttctcctagc gtcaaagaac 1980 cttggaatgt atgtgttgtc gtactctgca tcttcgctct tgtgcggccg c 2031 <210> 7 <211> 3159 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pVZA300 Silencing construct <400> 7 gggcccgccc tcgtcggctc cacttccgcc accacgtgca ccacctcgca 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gttatcaccg aatatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgtcgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acgttaccat tgacgaacgt cacgaaccca ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta 440 <210> 14 <211> 452 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora nicotianae (VZA 2 69F = Pnic 21) <400> 14 accatctcga caatgcctcg aacttgtcct tcggcaacgg cttcgtcatc gcgtcggcga 60 tcatgtcgtc ggtaccaaca tggcgaatcc gtagctgctc gtcctccact aggtggcgca 120 ccaagtggaa cttgttcata atatgcttgc tcttgctgtg cttgccaggc ttggcagtta 180 gatagatgca cgacatgtta tcgccgagta tctccggagt cgcaaactcc cagcatagtt 240 cgtcacagag tccacgtagc cactgtagat ctctggtacc ttcattcata gcaatatact 300 ctgcttccgt tgtgctctgt gcgttgatct cttgctttct tgatccgtac gaaaccacat 360 tgccattgac gaacgtcacg aacccgctaa cactctttcg gtcatcaggg tcattagcgt 420 agtcagcatc ggtgtagcac gtcagattca cg 452 <210> 15 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora nicotianae (VZA 3 73F = Pnic 23) <400> 15 tcataccatc tcgacaatgc tcaaacttgt ccttcggcaa cggcttcatc atcgcgtcgg 60 ctatcatgtc gtcggtgcca acatggcgaa tccgtagctg ctcgtcctcc actaggtggc 120 gcaccaagtg aaacttgttc ataatgtgct tgctcttgct gtgcttgcca ggcttggcag 180 tcaggtagat gcacgacttg ttatcgccga gtatctccgg agtcgcaaac tcccagcata 240 gttcttcaca gagtccacgt agccactgta gatatctggt accttcattc atagcaatat 300 actctgcttc cgttgtactc tgtacgttga tctcttgctt ccttgatccg tacgaaacca 360 cattgccatt gacgaacgtc acgaaccc 388 <210> 16 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora nicotianae (VZA 3 73F = Pnic 23) <400> 16 tcataccatc acgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggg 467 <210> 17 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora nicotianae (VZA 1 65R = Pnic Ri) <400> 17 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccg 465 <210> 18 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 6 70F = Pcap 30) <400> 18 ccatctcgac aatgcctcga acttgtcctt cggcaacggc ttcgtcatcg cgtcggcgat 60 catgtcgtcg gtaccaacat ggctaatccg tagctgctcg tcctccacta ggtggcgcac 120 caagtggaac ttgttcataa tatgcttgct cttgctgtgc ttgccaggct tggcagttag 180 atagatgcac gacatgttat cgccgagtat ctccggagtc gcaaactccc agcatagttc 240 gtcacagagt ccacgtagcc actgtagatc tctggtacct tcattcatag caatatactc 300 tgcttccgtt gtgctctgtg cgttgatctc ttgctttctt gatccgtacg aaaccacatt 360 gccattgacg aacgtcacga acccgctaac actct 395 <210> 19 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 7 72F = Pcap 31) <400> 19 ctataacgac aatgcctcga actgggcctt cggcaacggc ttcgtcatcg cgtcggcgat 60 catgtcgtcg gtaccaacat ggcgaatccg tagctgctcg tcctccacta ggtggcgcac 120 caagtggaac ttgttcataa tatgcttgct cttgctgtgc ttgccaggct tggcagttag 180 atagatgcac gacatgttat cgccgagtat ctccggagtc gcaaactccc agcatagttc 240 gtcacagagt ccacgtagcc actgtagatc tctggtacct tcattcatag caatatactc 300 tgcttccgtt gtgctctgtg cgttgatctc ctgctttctt gatccgtacg aaaccacatt 360 gccattgacg 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cccagcatag 240 ttcgtcacag agtccacata gccactgtag atctctggta ccttcattca tagcaatata 300 ctctgcttcc gttgcgctct gtgcgttgaa cccttgcttt cttgatcctc actaaaccac 360 attgccattg acgaacgtca ctaaccctct aacactcttt agatcattaa tatcattagc 420 ctaatcaaca aactcctaat acctcagatt cactacaatc c 461 <210> 22 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 10 87F = Pcap 32) <400> 22 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggc 467 <210> 23 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 11 89F = Pcap 03) <400> 23 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct tcagattcac gtcgtt 416 <210> 24 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 12 90F = Pcap 22) <400> 24 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccgg 466 <210> 25 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora capsici (VZA 13 91F = Pcap 25) <400> 25 tcaaaccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcaa atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggg 467 <210> 26 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora palmivora (VZA 14 81F = Ppal 02) <400> 26 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccgg 466 <210> 27 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora palmivora (VZA 15 82F = Ppal 10) <400> 27 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccg 465 <210> 28 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora palmivora (VZA 16 83F = Ppal 11) <400> 28 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggc 467 <210> 29 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora palmivora (VZA17 85F = Ppal 04) <400> 29 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccgg 466 <210> 30 <211> 467 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora palmivora (VZA 18 86F = Ppal 05) <400> 30 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggg 467 <210> 31 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora cinnamomi (VZA 19 64R = Pcin Ri) <400> 31 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga agccgttgcc tcgtcctcca ctaggtggcg 120 caccaagtgg aacttgttca taatatgctt gctcttgctg tgcttgccag gcttggcagt 180 tagatagatg cacgacatgt tatcgccgag tatctccgga gtcgcaaact cccagcatag 240 ttcgtcacag agtccacgta gccactgtag atctctggta ccttcattca tagcaatata 300 ctctgcttcc gttgtgctct gtgcgttgat ctcttgcttt cttgatccgt acgattcggt 360 catcagggtc attagcgtag tcagcatcgg tgtagcacgt cagattcacg tcgttcccgg 420 <210> 32 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora cinnamomi (VZA 20 77F = Pcin 01) <400> 32 atcatctcga caatgcctcg aacttgtcct tcggcaacgg cttcgtcatc gcgtcggcga 60 tcatgtcgtc ggtaccaaca tggcgaagcc gtacctcgtc ctccactagg tggcgcacca 120 agtggaactt gttcataata tgcttgctct tgctgtgctt gccaggcttg gcagttagat 180 agatgcacga catgttatcg ccgagtatct ccggagtcgc aaactcccag catagttcgt 240 cacagagtcc acgtagccac tgtagatctc tggtaccttc attcatagca atatactctg 300 cttccgttgt gctctgtgcg ttgatctctt gctttcttga tccgtacgaa accacattgc 360 cattgacgaa cgtcacgaac ccgctaacac tctttcggtc atcagggtca ttagcgtagt 420 cagcatcggt gtagcacgtc agattcacgt cgttcccgg 459 <210> 33 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora citrophthora (VXA 21 63R = Pcto Ri) <400> 33 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacgtgggat cggcgttgct cgtcctccac taggtggcgc 120 accaagtgga acttgttcat aatatgcttg ctcttgctgt gcttgccagg cttggcagtt 180 agatagatgc acgacatgtt atcgccgagt atctccggag tcgcaaactc ccagcatagt 240 tcgtcacaga gtccacgtag ccactgtaga tctctggtac cttcattcat agcaatatac 300 tctgcttccg ttgtgctctg tgcgttgatc tcttgctttc ttgatccgta cgaaaccaca 360 ttgccattga cgaacgtcac gaacccgcta acactctttc ggtcatcagg gtcattagcg 420 tagtcagcat cggtgtagca cg 442 <210> 34 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora citricola (VZA 22 66R = Pctr Ri) <400> 34 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacgtgggat cggcgttgct cgtcctccac taggtggcgc 120 accaagtgga acttgttcat aatatgcttg ctcttgctgt gcttgccagg cttggcagtt 180 agatagatgc acgacatgtt atcgccgagt atctccggag tcgcaaactc ccagcatagt 240 tcgtcacaga gtccacgtag ccactgtaga tctctggtac cttcattcat agcaatatac 300 tctgcttccg ttgtgctctg tgcgttgatc tcttgctttc ttgatccgta cgaaaccaca 360 ttgccattga cgaacgtcac gaacccgcta acactctttc ggtcatcagg gtcattagcg 420 tagtcagcat cggtgtagca cg 442 <210> 35 <211> 469 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora megakarya (VZA 23 80F = Pmek 01) <400> 35 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtacc aacatggcga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacgaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt tcccggcaa 469 <210> 36 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora megasperma/ P. sojae (VZA 24 92F = Pmeg 01) <400> 36 cagaccatct cgacaatgcc tcgaacttgt ccttcggcaa cggcttcgtc atcgcgtcgg 60 cgatcatgtc gtcggtacca acatggctaa tcctagctgc tcatcctcca ctaggtggcg 120 caccaagtgg aacttgttca taatatgctt gctcttgctg tgcttgccag gcttggcagt 180 tagatagatg cacgacatgt tatcgccgag tatctccgga gtcgcaaact cccagcatag 240 ttcgtcacag agtccacgta gccactgtag atctctggta ccttcattca tagcaatata 300 ctctgcttcc gttgtgctct gtgcgttgat ctcttgcttt cttgatccct acgaaaccac 360 attgccattg acgaacgtca cgaacccgct aacactcttt cggtcatcaa ggtcattagc 420 gtagtcagca tcggtgtagc acgtcagatt cacgtcgttc ccg 463 <210> 37 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Cutinase, Phytophthora heve (VZA 25 93F = Phev 02) <400> 37 tcataccatc tcgacaatgc ctcgaacttg tccttcggca acggcttcgt catcgcgtcg 60 gcgatcatgt cgtcggtgcc aacatgacga atccgtagct gctcgtcctc cactaggtgg 120 cgcaccaagt ggaacttgtt cataatatgc ttgctcttgc tgtgcttgcc aggcttggca 180 gttagataga tgcacgacat gttatcgccg agtatctccg gagtcgcaaa ctcccagcat 240 agttcgtcac agagtccacg tagccactgt agatctctgg taccttcatt catagcaata 300 tactctgctt ccgttgtgct ctgtgcgttg atctcttgct ttcttgatcc gtacgaaacc 360 acattgccat tgacgaacgt cacaaacccg ctaacactct ttcggtcatc agggtcatta 420 gcgtagtcag catcggtgta gcacgtcaga ttcacgtcgt 460 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M. persicae cathepsin FP <400> 38 gggcccacaa gagcgaagat gc 22 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> M. persicae cathepsin RP <400> 39 atttcacgta aacgcctgac ttgtaactgg 30 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P. infestans elicitin FP <400> 40 gggcccgccc tcgtcggctc c 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P. infestans rDNA FP <400> 41 gggccctttc cgtaggtgaa cc 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P. infestans rDNA RP <400> 42 aaaccggtcg ccaactcgct ac 22 <210> 43 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Phialophora gregata rDNA <400> 43 tgcggaagga tcattactag agcaaaggat agggagcacc ccacaggagc ttgctccgtg 60 gcgggctgcc cgtcgagcct ctcgaagaag ctcggtcctg aactccaccc ttgaataaat 120 tacctttgtt gctttggcgg gccgcctcgc gccagcggct tcggctgttg cgtgcccgcc 180 agaggaccac aactcttgtt tttagtgatg tctgagtact atataatagt taaaactttc 240 aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg 300 tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctctggtatt 360 ccggggggca tgcctgttcg agcgtcatta taaccactca agctctcgct tggtattggg 420 gttcgcggtt ccgcggcccc taaaatcagt ggcggtgcct gtcggctcta cgcgtagtaa 480 tactcctcgc gattgagtct ggcaggtcta catgccagca acacccaaat ttttacaggt 540 tgacctcgga tcaggtaggg ataccccgct gaacttaagc atat 584 <210> 44 <211> 658 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Phialophora gregata Genotype B DNA Marker <400> 44 ctccaccaac taagaacggc catgctggac acgaccactc cggtcatgat cactcccacg 60 accacggaaa gggcaaagct atcgatacca gtgaggacaa gaaggatgag gatgaggatg 120 atggagagga ggttgatgct actggacttg aggacaagga tattgagttg gtcatgaccc 180 aagctagcgt ctcacgaaac aaggctgtca aggcattgaa ggagaacgac aatgatatag 240 tcagctctat tatggctcta agcatataga gagttgacct gttatattcg tctggctgct 300 agactgaact tggctcgttg gaggacgttg tatggagcat gcgtaccctg catctctatc 360 tggggatatg tattctgaaa aagcacttgt ggaacttcaa gtccaaattc tcagaaattt 420 gcacacttgc tacccaatcc tcgtgtatat tgtgactacc ctatacctgt ttgttgtggc 480 ggagatgaag tacctaaaag tttgtgcatt tactctgata tttgatgttc gcgactatgt 540 aggctgccag gaactcccca atagtatgaa tcaagaaatc ggtgcaggga cgtgtaccaa 600 gttagagaac taggtagact ttgaacaatc gctgcatggc cgttcttagt tggtggag 658 <210> 45 <211> 1096 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sclerotinia sclerotiorum RNA Pol Subunit <400> 45 ctgttccgca gattaacaac agatgtctac aggtacctgc aacgttgcgt ggaaaacaac 60 agagagttca atttgacgct gggtgtgaaa tccacgacga tcacgaacgg tctgaaatat 120 tctttggcta caggtaactg gggtgaccag aagaaggcag caagttctac cgctggtgtt 180 tctcaagtat tgaacagata taccttcgca tcaacacttt ctcatttgcg ccgaaccaat 240 acgcctatcg gacgtgatgg aaagatcgcc aaacctagac aactgcataa tactcattgg 300 ggtctggttt gtccagcaga gacgccagaa ggtcaagctt gtggtttggt caagaattta 360 gctttgatgt gttacgttac agttggtacg ccaagtgatc caatcgttga gttcatgatt 420 caacgaaata tggaagtgct ggaggagtat gaaccgctcc gagcacccaa tgcaacaaag 480 gtcttcgtca atggtgtttg ggttggtgtc catcgagacc ctgcccattt ggttaaatgt 540 gtacaagatc ttcgtagatc acatttgatt tctcatgaag tctcacttat tcgagaaatt 600 cgagacagag agttcaagat tttcactgat gcaggacgag tgtgcagacc tctgttggtc 660 atcgacaatg atccagacag ccccaacaaa ggtaatttgg tactgaacaa ggatcacatc 720 cgccgtttgg aggatgatca atctctgcca tcgaacatgg ataaggatga gaaagtacac 780 catggttatt atggattcca aggtttgatt aatgatggtg tggttgaata tttagacgcc 840 gaggaagagg agactgttat gattaccatg acacctgaag atttggatat ttctcgacag 900 cttcaagctg gttatcaaat tcgtcctgat gacagcggtg atttgaataa gcgtgtcaag 960 gcacctatca atccaactgc gcacgtctgg actcattgtg aaattcatcc aagtatgatt 1020 ctgggtatct gtgcaagcat cattcccttc ccggatcata atcaggtaag ctttaagtcc 1080 aataatgaat ttatta 1096 <210> 46 <211> 883 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Puccinia hordei 18S ribosomal RNA gene <400> 46 agtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatgata ccttactaca 60 tggataactg tggtaattct agagctaata catgctgaaa agccccaacc tttggaaggg 120 gtgtatttat tagataaaaa accaatggcc cttgggtctc cttggtgatt cataataact 180 tctcgaatcg catggccttg tgccggtgat gcttcattca aatatctgcc ctatcaactt 240 tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg atgacgggta acggggaata agggttcgat 300 tccggagaga gggcctgaga aacggccctc aaatctaagg attgcagcag gcgcgcaaat 360 tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aataaataac aatgtatggc tcttttgggt 420 cttacaattg gaatgagtac aatttaaatc tcttaacgag gatcaattgg agggcaagtc 480 tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tattaaaatt gttgacgtta 540 aaaagctcgt agtcgaactt cggcctctgg cagttggtcc gccttttggt gtgtactgat 600 ttgttggagg cttacctctt ggtgaacttc aatgcacttt actgggtgtt gaaaggaacc 660 aggactttta ctttgaaaaa attagagtgg ttcaaagcag cttatgcctg aatacattac 720 catggaataa taaaatagga cgtgtgattc tattttgttg gtttctagga ttaccgtaat 780 gatgaataag gtcagttggg ggcatttgta ttacatcgtc agaggtgaaa ttcttggatt 840 gatgtaagac aaactactgc gaaagcatct gccaaggatg acc 883 <210> 47 <211> 2040 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sclerotinia sclerotiorum Hexose Transporter <400> 47 ggagactgct gagtctcctg ttattaccga caagaacctc agcagcgctg aaggaactcc 60 agcagcacac acaccagccg atactcctcg tgtcgtcaga tccttaaatg gttctgcacc 120 agagcatcat gatatagtac ccgaggaagc tctcgacaac ttgcctgtca ccaaattagc 180 tattatgctt ggtgctatcg catctatcgg tggtttcatg ttcggttatg aatctggtca 240 aatttctggt ttcgtccaaa tgtccgactt cttagatcga ttcggtgaaa atggtgaact 300 ttctgctgtc cgtcaaggaa ccatcgtcgc cattctctgc gccggtactc ttgttggatg 360 ccttggatct agttacctct gcgatacaat cggtcgtcgt tacactatct ccagttctgc 420 attcttctac atcatcggtg ttatcatcga aatcacttct tctactcact gggttcaatt 480 cgctatgggg agattcactg ctggtgtgaa tgctcccttt aagtttcaat tttagtatct 540 aaactctgta ttataagttg ggtattggtg ctttgagtac tagtgttcct atgtaccaat 600 ctgagtctgt gccaaagaac attcgtggtg ctgtcgtttc cagttatcag ttgttgatta 660 ctcttggtat ctggactgct tatatgatca actacggaac tcattctgcc tataccaaca 720 gtgcacagtg gcggattcct aacggtctct ccgcactctg ggccatcatc ctcggtaccg 780 ctgtcctctt catgcccgaa tccctcgctt tgcataccgt atcggacgtg aagatgaaag 840 ctcgcaaaaa catggctctc ctcaacggtg ttgaccctta ctccccactt atcgattccg 900 agatccaaga aatcgaacaa aagctcgcag ccgaaagaga aggtggtgat cacccctggt 960 acgaaatctt tactggccct gttgttccat ttctttcatg atgaattcct tttaaccttg 1020 aacgtgatct catagagaat gttgtaccga acacttctcg gaatggttct tcaagctggt 1080 caacaattga ctggtgccaa tttcttcttc tactatggta ctaccatctt caagtctggt 1140 ggtatctccg attcttatgt tacctctatc attctcggta ccgtcaatgt cgtcgctacc 1200 attggtggtc tctggattgt taagaactgc ggtcgtagga aggctctcat ggttggtgct 1260 gccgagatgt ttgtttgcat gttgatctac tctttcgtcg gacacttcaa gatccaaaga 1320 caagcccaat gctcaagccc ctgggctgtt ttgatttgtt tcacctgtat ctacattgtt 1380 ggatctgcta ctacatgggg acctttggtt tgggccattg tcggagaatt atacccagca 1440 cgttacagag cttcttgcat ggctctcgcc accgcatcga actggctctt caacttcctt 1500 atctctttct tcaccacatt tatcaccaac gatatcgatt actactatgg tcttgtcttt 1560 gccggatccc ttttcgctct cttctggatt gtatacttct tcgttatcga gaccaaggat 1620 cgctcccttg aggaaatcga caccatgtac gtcctccacg tcaacccacg aacatcctcc 1680 acttgggacc ccaagtccct cggtgccgaa ggtgtcaaag gtgttgatac cgatggaatg 1740 ttcttgacca ctggagggaa agatattaag aagagtgaga tggctggacg accaatgttg 1800 gaacatgacg agagaaggtt ccctgagacc gctggaggag ctgcttctca ggagcacaaa 1860 cctgagatta tgaatgctta agcttcgctt catttttgat gagcatggat gaaagaaaaa 1920 tgcattttac gaatgtatgt cgttactacg agcaaaaagg ggggtgaaat cagtggatga 1980 taaataaacg atggaatata taatgcatgc atataatggc gtttgggaag cagcatcgtc 2040 <210> 48 <211> 883 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fusarium solani pisi cutinase <400> 48 aaccacacat accttcactt catcaacatt cacttcaact tcttcgcctc ttccttttca 60 ctctttatca tcctcaccat gaaattcttc gctctcacca cacttctcgc cgccacggct 120 tcggctctgc ctacttctaa ccctgcccag gagcttgagg cgcgccagct tggtagaaca 180 actcgcgacg atctgatcaa cggcaatagc gcttcctgcc gcgatgtcat cttcatttat 240 gcccgaggtt caacagagac gggcaacttg ggaactctcg gtcctagcat tgcctccaac 300 cttgagtccg ccttcggcaa ggacggtgtc tggattcagg gcgttggcgg tgcctaccga 360 gccactcttg gagacaatgc tctccctcgc ggaacctcta gcgccgcaat cagggagatg 420 ctcggtctct tccagcaggc caacaccaag tgccctgacg cgactttgat cgccggtggc 480 tacagccagg gtgctgcact tgcagccgcc tccatcgagg acctcgactc ggccattcgt 540 gacaagatcg ccggaactgt tctgttcggc tacaccaaga acctacagaa ccgtggccga 600 atccccaact accctgccga caggaccaag gtcttctgca atacagggga tctcgtttgt 660 actggtagct tgatcgttgc tgcacctcac ttggcttatg gtcctgatgc tcgtggccct 720 gcccctgagt tcctcatcga gaaggttcgg gctgtccgtg gttctgcttg aggaggatga 780 gaattttagc aggcgggcct gttaattatt gcgaggtttc aagtttttct tttggtgaat 840 agccatgata gattggttca acactcaatg tactacaatg cct 883 <210> 49 <211> 595 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Phakopsora pachyrhizi cutinase homolog <400> 49 gagattgtgc tgtgcattgc acagcacagc agcaattcca acatcccccc ttgctcacag 60 tcttcaaggc tttgagcaca gattgagaac tttaagagat ttgaggagtg gtgattttcc 120 cagaggtttg gtgaggaagt cagccaacat atcttcactc ttgacatatg ttaaggatat 180 gtgttgtttc tcaatttctt gcttgacaaa atgaagtctg atgtccatat gttttgtctt 240 gaaggttgag tgactagctt gattatttgc aagttctatt gctccttgat tgtcctcaca 300 gatcgtcgtt ggagtatgaa atggcaggtt gaagaagttg gcgatcaagg ttttgatcca 360 cataacttcc ttggtgacgt cagcaattga cttgtactct gcttctgttg ttgagagaga 420 tattgttggt tgcttttgtg acttccaaga gatgaggttg ccattccata ggaccaagaa 480 tccagatacc gaacgacgag tttgaggaca ggaggcccag tctgcatctg agtaagccaa 540 gagattgttg ccaggaggag actttgtgaa tgtgagacca taggtttttg tatgc 595 <210> 50 <211> 668 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Phakopsora pachyrhizi rDNA <400> 50 ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaataaaa 60 agctaaagag tgcactttat tgtggctcaa aactaaactt tttaataaac ccatttaatt 120 ggctcattga ttgataagat ctttgggcaa tggtagcttt gaaaaaagct gcaacccacc 180 tattaatcat aatctttttt tttttaactc aaagtcaaat agaatgtttt ataaatttaa 240 atatatatat ataactttta acaatggatc tctaggctct catatcgatg aagaacacag 300 tgaaatgtga taattaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcaagtt tttgaacgca 360 ccttgcacct tttggtattc caaaaggtac acctgtttga gtgtcatgaa atcttctcaa 420 cattatttct tttttttaaa gggaaattgt tggattttga gtgttgctgt tgcttttttt 480 gcagctcact ttaaataaat aaatatatat aagtttcagt atattttgat gtaataataa 540 aatcatttca tcaaaaaaat aaatatatgt gagatttatt ataacattaa ttgaatgtaa 600 attttttttt aagacctcaa atcaggtgag actacccact gaacttaagc atatcaataa 660 gcggagga 668 <210> 51 <211> 624 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Fusarium sambucinum translation elongation factor 1 alpha <400> 51 tcgtcgtcat cggccacgtc gactctggca agtcgaccac tgtaagttga cccaaatcta 60 agctcgccta caattggcgg ggtagcctca agatacgctt gtgctgacat acatcataga 120 ccggtcactt gatctaccag tgcggtggta tcgacaagcg aaccatcgag aagttcgaga 180 aggttggtct cattttcctc gatcgcgcgc cctactttcc atcgatccat cattcgaatc 240 gctctgatac gactcgacac acgcctgcta ccccgctcga gttcaaaaat tttacgactt 300 tgtcgtaatt tttttggtgg ggctcatacc ccgccacttg agcgacatgc ccttcctcta 360 aagccacggg cgcgcatcat cacgtgttga tcagttacta acaacctgtc aataggaagc 420 cgccgagctc ggtaagggtt ctttcaagta cgcttgggtt cttgacaagc tcaaagccga 480 gcgtgagcgt ggtatcacca tcgatatcgc tctctggaag ttcgagactc ctcgctacta 540 tgtcaccgtc attggtatgt tgtcactacc acctccatca cattcccgca ctaactcacc 600 tatcagacgc tcccggtcac cgtg 624 <210> 52 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Phytophthora infestans elicitin gene <400> 52 gccctcgtcg gctccacttc cgccaccacg tgcaccacct cgcagcagac cgtagcgtac 60 gtggcgctcg taagcatcct ctcggacacg tcgtttaatc agtgctcgac ggactccggc 120 tactcgatgc tgacggccac ctcgctgccc acgacggagc agtacaagct catgtgcgcg 180 tcgacggcgt gcaagacgat gatcaacaag atcgtgtcgc tcaacgctcc cgactgcgag 240 ctgacggtgc caactagtgg cctggtactc aacgtgttc 279 <210> 53 <211> 1096 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sclerotinia sclerotiorum RNA Polymerase Subunit <400> 53 ctgttccgca gattaacaac agatgtctac aggtacctgc aacgttgcgt ggaaaacaac 60 agagagttca atttgacgct gggtgtgaaa tccacgacga tcacgaacgg tctgaaatat 120 tctttggcta caggtaactg gggtgaccag aagaaggcag caagttctac cgctggtgtt 180 tctcaagtat tgaacagata taccttcgca tcaacacttt ctcatttgcg ccgaaccaat 240 acgcctatcg gacgtgatgg aaagatcgcc aaacctagac aactgcataa tactcattgg 300 ggtctggttt gtccagcaga gacgccagaa ggtcaagctt gtggtttggt caagaattta 360 gctttgatgt gttacgttac agttggtacg ccaagtgatc caatcgttga gttcatgatt 420 caacgaaata tggaagtgct ggaggagtat gaaccgctcc gagcacccaa tgcaacaaag 480 gtcttcgtca atggtgtttg ggttggtgtc catcgagacc ctgcccattt ggttaaatgt 540 gtacaagatc ttcgtagatc acatttgatt tctcatgaag tctcacttat tcgagaaatt 600 cgagacagag agttcaagat tttcactgat gcaggacgag tgtgcagacc tctgttggtc 660 atcgacaatg atccagacag ccccaacaaa ggtaatttgg tactgaacaa ggatcacatc 720 cgccgtttgg aggatgatca atctctgcca tcgaacatgg ataaggatga gaaagtacac 780 catggttatt atggattcca aggtttgatt aatgatggtg tggttgaata tttagacgcc 840 gaggaagagg agactgttat gattaccatg acacctgaag atttggatat ttctcgacag 900 cttcaagctg gttatcaaat tcgtcctgat gacagcggtg atttgaataa gcgtgtcaag 960 gcacctatca atccaactgc gcacgtctgg actcattgtg aaattcatcc aagtatgatt 1020 ctgggtatct gtgcaagcat cattcccttc ccggatcata atcaggtaag ctttaagtcc 1080 aataatgaat ttatta 1096 <210> 54 <211> 538 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tenocarpella maydis rRNA <400> 54 gggggacgat tattctttct gaaccctgtg aactacctaa acgttgcttc ggcgggaata 60 gacggccccg tgaaacgggc cgcccccgcc agaggaccct taactctgtt tctataatgt 120 ttcttctgag taaaacaagc aaataaatta aaactttcaa caacggatct cttggctctg 180 gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat 240 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<210> 64 <211> 883 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Puccinia hordei 18S rDNA <400> 64 agtgaaactg cgaatggctc attaaatcag ttatagttta tttgatgata ccttactaca 60 tggataactg tggtaattct agagctaata catgctgaaa agccccaacc tttggaaggg 120 gtgtatttat tagataaaaa accaatggcc cttgggtctc cttggtgatt cataataact 180 tctcgaatcg catggccttg tgccggtgat gcttcattca aatatctgcc ctatcaactt 240 tcgatggtag gatagaggcc taccatggtg atgacgggta acggggaata agggttcgat 300 tccggagaga gggcctgaga aacggccctc aaatctaagg attgcagcag gcgcgcaaat 360 tacccaatcc tgacacaggg aggtagtgac aataaataac aatgtatggc tcttttgggt 420 cttacaattg gaatgagtac aatttaaatc tcttaacgag gatcaattgg agggcaagtc 480 tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tattaaaatt gttgacgtta 540 aaaagctcgt agtcgaactt cggcctctgg cagttggtcc gccttttggt gtgtactgat 600 ttgttggagg cttacctctt ggtgaacttc aatgcacttt actgggtgtt gaaaggaacc 660 aggactttta ctttgaaaaa attagagtgg ttcaaagcag cttatgcctg aatacattac 720 catggaataa taaaatagga cgtgtgattc tattttgttg gtttctagga ttaccgtaat 780 gatgaataag gtcagttggg ggcatttgta ttacatcgtc agaggtgaaa ttcttggatt 840 gatgtaagac aaactactgc gaaagcatct gccaaggatg acc 883 <210> 65 <211> 802 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pseudoperonospora humuli rDNA <400> 65 ccacacctaa aaactttcca cgtgaactgt ttcaacctca ttaattgggg gttttgtttg 60 gcggtgatcg ctagcttaat tgctggttga ttactgctag gcgagcccta tcatggcgag 120 cgtttgggct tcggtctgaa ctagtagctt ttattttaaa ccctttctta attactgatt 180 atactgtggg gacgaaagtc tctgctttta actagatagc aactttcagc agtggatgtc 240 taggctcgca catcgatgaa gaacgctgcg aactgcgata cgtaatgcga attgcaggat 300 tcagtgagtc atcgaaattt tgaacgcata ttgcacttcc gggttagtcc tgggagtatg 360 cctgtatcag tgtccgtaca tcaaacttgg ttttcttctt tccgtgtagt cggtggagga 420 tatgccagat gtgaagtgtc ttgcggctaa ttttagaatt gactgcgagt cctttgaaat 480 gtacagaact gtacttctct ttgctcgaaa agtgtggcgt tgctggttgt gaaggctgtc 540 catgtgacca gtcggcgatc ggtttgtctg ctatggcatt aatggaggaa tatttaattc 600 gcggtatgat tagcttcggc tgaacaggcg cttattgaac gtttttcctg ttgtggcggt 660 atgaactgat 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aaacatttca aggtgtaaag tatgttacgg atttaagttt 660 gcttccagcc caatcgtaag ccttatctct gacgttgaac tgaagtttag agtttcctgt 720 aagcatatac acttgaaagt acatcctcct caatctgcgg tgattatgcg tttttttttc 780 gcaactcttg taatacgaac acaactactc acaatcactc ttatgaaatt tacttgtccc 840 aaaaggacat catgctgctt agcattaaag acctgtctga aaaatacatc atgctgctcg 900 atgtcaaaga tctgtcgaca ctcaaaacaa ctgttgccgt tctagtgagt ccattattca 960 taccagaggg agggtaattc cttaacatga ccaggtcacg gtagccctta ttgcacaagt 1020 cctttggaaa attttctttc acccgctcag tgcctttcca gggccgtggt tcaacaggat 1080 atccgaaata cccggctcgt gggttattgc aactgggaag cagcactcat attaccggaa 1140 gcttcatgaa aaatatggtg agtaactatt cctgtacctt gctccttctt tcgggaaaca 1200 agttcatact aaaacaaatt caggcccagt tgtgagagtt gccccaaatg agctcagctt 1260 <210> 67 <211> 536 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pseudomonas syringae rDNA <400> 67 atcgacgact cagctgcacc ataagcaccc acacgaattg cttgattcat tgaagaagac 60 gatgagaagc agcttttgct ttgcacaccc gattttgggt ctgtagctca gttggttaga 120 gcgcacccct gataagggtg aggtcggcag ttcgaatctg cccagaccca ccagttacct 180 ggtgaagttg gtcagagcgc gtacgacacc cggatacggg gccatagctc agctgggaga 240 gcgcctgcct tgcacgcagg aggtcagcgg ttcgatcccg cttggctcca ccacttactg 300 cttctgtttg aaagcttaga aatgagcatt ccaccctgag agattgaagg gtgcgtgaat 360 gttgatttct agtctttgat tagatcgttc tttaaaaatt tgggtatgtg atagaaagaa 420 atatagaccg ggcacctctt tcactggtgc gtgtccgggc taaggtaaag tttgtgaaat 480 gcaaactttc ggcgaatgtc gtcttcacag tataaccaga ttgcttgggg ttatat 536 <210> 68 <211> 983 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Clavibacter michiganense michiganense Cel A gene <400> 68 atgactgttc gacaagttag tgtaccctta gtgtccaagc tcttcctttt ctttgcattg 60 gcggtcggcg ccacgtttgg cgcattcgcg gcgcctgcct tagccgccac cgcagcgggg 120 accggtgcgg tggcctcgcc gcctggatgg ctgcacacgg cgggtgggaa gatcgtcacc 180 gcctccggcg ctccgtacac aatccgtggc atcgcgtggt ttggcatgga gacgtcatcc 240 tgcgcgccgc acggcctgga caccatcacc ctcgcgggtg gcatgcagca catcaagcag 300 ctgggattca cgaccgtgcg gctgccgttc tcgaaccagt gcctcgcggc atctggcgtc 360 acgggtgtcg atgcggaccc atcgcttgcc ggtctcacac cgctgcaggt catggatcac 420 gtcgtggctt cggcgaaggc cgccggactt gacgtgatcc tcgaccagca ccggccggac 480 tcgggcggcc agtccgagct ctggtacacc tcggagtacc ccgagtcacg gtggatctcc 540 gactggcgga tgctcgcgaa gcggtacgcc tccgacccca cggtcatcgg tgtcgatctc 600 cacaacgagc cgcacggggc ggcgacgtgg ggtaccgggg cagccacgac cgactggcgg 660 gcggcggccg agcggggcgg gaacgcggta ttggccgaga acccgaagct cctcgtgctc 720 gtcgagggaa tcgaccacca ggccgacgga accggcacct ggtggggcgg tgcgctggac 780 tccgcggcca ctgcatccgt gcgcttgacc gtcgcgaatc gcgtcgtcta ttccccgcac 840 gactacccct cgaccatcta cggccagccc tggttctccg catcgaatta tccgacgaat 900 cttccgggaa tctgggacgc ccactgggga tacctggcaa agaaggacat cgcccccgtc 960 ctcgtgggcg agttcggtac gaa 983 <210> 69 <211> 1260 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Clavibacter michiganense endo B-glucosidase gene <400> 69 ctcagggaac taaccggatg agcactgttt cgggcgtgag gagtgcgtgc gaaaggcgtc 60 tgtggaagtg gttttcagtg cggccggatg gcttccctac gatccttata tgacatttcg 120 ccaagttcgt gcatccttag tgcttcggct cgtccttctc cttgcgttgg tggtcggcac 180 cacgtccgcc gcattcgctg cgcctgtctc agccgccacc gtagcggggc ccgttgcggc 240 ggcctcatcg cctggatggc tgcatacggc gggcgggaag atcgtcaccg cctccggtgc 300 tccgtacacg atccgtggca tcgcttggtt tggcatggag acgtcgtcgt gcgcgccgca 360 tggcctggac accatcaccc tcgcgggcgg tatgcagcac atcaagcaga tggggttcac 420 gaccgtgcgg ttgcccttct cgaaccagtg cctcgccgcg tccggcgtca cgggtgtcag 480 tgcggacccg tcactcgccg ggctcacgcc gctgcaggtc atggaccacg tcgtcgcgtc 540 ggcgaagagc gccggtcttg acgtgatcct cgaccagcac cggccggact cgggcggcca 600 gtctgagctc tggtacacat cgcagtatcc ggagtcgcgg tggatctccg actggaggat 660 gctcgcaaag cgctatgcag ccgaacccac cgtcatcggt gtagacctcc acaacgaacc 720 gcacggtgcg gcgacctggg gtaccggggc ggccaccact gactggcggg cagcggccga 780 gcgtggcggg aatgcggtcc tcgccgagaa cccgaacctc ctcgtgctcg tggagggcat 840 cgaccacgag gccgacggat ctggcacctg gtggggcggc gcgctcgggt tggtaggcaa 900 tgcacctgtg cggctgtcgg tcgcgaatcg cgtcgtctac tccccgcatg actacccctc 960 gaccatttac ggccagtcat ggttctccgc atcaaactat ccggcgaact tgccgggtat 1020 ttgggacgcc cactggggat acctggcgaa gaaggacatt gccccggttc tcgtgggtga 1080 gttcggtacg aagttcgaga cgacgagcga caagcagtgg ctcaacaccc tcgttggata 1140 tctgtcgagc acggggatca gctcgtcgtt ctgggccttc aacccgaata gtggcgacac 1200 cggcggtatc gtgaagtccg actgggtgac cccggagcag gcgaagctcg acgccctggc 1260

Claims

숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드를 갖고서 변형하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 제1 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 제1 안티센스 서열;

(b) 제2 해충 병원성 유전자와 상동을 갖는 제2 안티센스 서열;

(c) 상기 제1 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 제1 센스 서열; 그리고

(d) 상기 제2 안티센스 서열에 실직적으로 상보적인 제2 센스 서열을 포함하고,

여기서 상기 이종의 폴리튜클레오티드의 전사체(transcript)는 교잡하여 상기 제1 안티센스 서열과 상기 제1 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고,

여기서 상기 이종의 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 제2 안티센스 서열과 상기 제2 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고,

여기서 상기 제1, 제2 센스 서열들 및 상기 제1, 제2 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 상기 이종의 폴리뉴클레오티드가 부족한 실질적으로 동일한 식물과 비교할 때 곤충, 박테리아, 균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 해충에 대하여 내성이 있는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 다른 멤버에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 동일한 멤버의 다른 아종들(subspecies)에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 동일한 멤버의 다른 종들(species)에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 동일한 멤버의 다른 속들(genera)에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 동일한 멤버의 다른 과들(families)에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제1항에 있어서,

상기 식물은 적어도 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있고, 여기서 상기 두 가지 해충들의 각각은 곤충, 박테리아, 진균, 그리고 선충으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 동일한 멤버의 다른 목들(orders)에 속하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드를 갖고서 변형하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중-가닥 영역을 형성할 수 있고;

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고;

상기 안티센스 서열은 다른 종들로부터 적어도 두 가지 해충들의 상기 병원성 유전자와 상동이고, 그리하여 상기 식물은 상기 이종의 폴리뉴클레오티드가 부족한 실질적으로 동일한 식물에 비하여 상기 두 가지 해충들에 대하여 내성이 있는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 해충들은 곤충들, 박테리아, 진균들, 그리고 선충들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 다른 해충들은 두 가지 다른 아종들로부터 유래하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 다른 해충들은 두 가지 다른 종들로부터 유래하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 다른 해충들은 두 가지 다른 속들로부터 유래하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 다른 해충들은 두 가지 다른 과들로부터 유래하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
제9항에 있어서,

상기 적어도 두 가지 다른 해충들은 두 가지 다른 목들로부터 유래하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드를 갖고서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 해충 병원균 유전자와 상동이고 종결자에 구동적으로 연결되는 안티센스 서열에 구동적으로 연결된 제1 프로모터;

(b) 상기 안티센스 서열에 대하여 실질적으로 상보적이고 종결자에 구동적으로 연결되는 센스 서열에 구동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하고,

여기서 상기 제2 프로모터는 상기 제1 프로모터에 비하여 강한 프로모터이고,

여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 서열들 사이에서 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고;

여기서 상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드를 갖고서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는:

(a) 해충 병원균 유전자와 상동인 안티센스 서열;

(b) 상기 안티센스 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 제1 센스 서열, 그리고

(c) 상기 안티센스 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 제2 센스 서열를 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 제1 센스 서열에 의하여 암호화된 서열들 사이에서 이중 가닥 영역을 형성할 수 있고;

상기 제1, 제2 센스 서열들과 상기 안티센스 서열은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고, 상기 해충 병원성 유전자의 복제 부분을 포함하는,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 큐티나아제들(cutinases), 키나아제들, 리보솜의 RNA들, 어드헤신들(adhesins), 엘리시틴들, 그리고 G-단백질들로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

상기 해충은 진균인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열,

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열, 그리고

(c) 상기 센서 및 안티센서 서열들이 별도의 전사체들로 전사되도록 상기 센서 및 안티센서 서열들에 상대적인 방향으로 상기 식물에서 기능하는 적어도 두 개의 프로모터들을 포함하고,

상기 별도의 전사체들은 교잡하여 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충은 진균인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상 기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 키나아제들, 리보솜의 RNA들, G-단백질들, 탈피 인자들(moulting factors), 세린 프로테아제들(serin proteases), 시스타인 프로테아제들(cysteine proteases), 그리고 유충 호르몬 에스테라제들(juvenile hormone esterases)로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

여기서 상기 해충은 곤충인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열,

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열, 그리고

(c) 상기 센서 및 안티센서 서열들이 별도의 전사체들로 전사되도록 상기 센서 및 안티센서 서열들에 상대적인 방향으로 상기 식물에서 기능하는 적어도 두 개의 프로모터들을 포함하고,

상기 별도의 전사체들은 교잡하여 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충은 곤충인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 키나아제들, 리보솜의 RNA들, G-단백질들, 큐티클 콜라겐 단백질들(cuticle collagen proteins), 그리고 카텝신 프로테아제들(cathepsin proteases)로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

상기 해충은 선충인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열, 그리고

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열을 포함하고,

상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충 병원성 유전자는 큐티나아제들(cutinases), 조직해리효소들(macerating enzymes), 키나아제들, 리보솜의 RNA들, 어드헤신들(adhesins), 그리고 G-단백질들로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 그리고

여기서 상기 해충은 박테리아인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.
식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 숙주 식물 세포를 이종의 폴리뉴클레오티드로서 형질전환하는 단계를 포함하고, 상기 이종의 폴리뉴클레오티드는

(a) 해충 병원성 유전자와 상동(homology)을 갖는 안티센스 서열,

(b) 상기 안티센스 서열에 실질적으로 상보적인 센스 서열,

여기서 상기 이종 폴리뉴클레오티드의 전사체는 교잡하여 상기 안티센스 서열과 상기 센스 서열에 의하여 암호화된 뉴클레오티드들을 포함하는 이중가닥 영역을 형성할 수 있고,

(c) 상기 센서 및 안티센서 서열들이 별도의 전사체들로 전사되도록 상기 센서 및 안티센서 서열들에 상대적인 방향으로 상기 식물에서 기능하는 적어도 두 개의 프로모터들을 포함하고,

상기 센스 및 안티센스 서열들은 각각 길이가 적어도 19 뉴클레오티드들이고,

상기 해충은 박테리아인,

식물에게 해충에 대한 내성을 제공하기 위한 방법.