BR102017001164A2 - Composições de rna de fita dupla para controle de diaphorina citri e métodos de uso. - Google Patents

Composições de rna de fita dupla para controle de diaphorina citri e métodos de uso. Download PDF

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Abstract

a presente invenção compreende dsrna gerado a partir do gene da trehalase de d. citri, que é eficaz na redução do vigor e/ou sobrevivência de d. citri. assim, as plantas geneticamente modificadas que expressam o dsrna e as plantas às quais as soluções de dsrna são aplicadas aumentam a mortalidade de d. citri e reduzem a infestação de d. citri. com reduzida população de d. citri, a dispersão de microrganismos para os quais d. citri é um vetor é reduzida. tais microrganismos incluem, mas não estão limitados a espécies de c. liberibacter, incluindo: clas, clam e claf. assim, a aplicação do dsrna da trehalase de d. citri a uma planta reduz a transmissão de doenças e/ u microrganismos ao matar d. citri que se alimenta na planta tratada.

Description

COMPOSIÇÕES DE RNA DE FITA DUPLA PARA CONTROLE DE Diaphorina citri E MÉTODOS DE USO”
CAMPO DE INVENÇÃO [0001] Este invento refere-se a um RNA de cadeia dupla e composições contendo RNA de cadeia dupla (dsRNA) para reduzir vigor e / ou aumentar a mortalidade de Diaphorina citri, (Psilídeo Asiático dos citros, Hemiptera: Lilviidae), reduzindo assim a infestação de D. citri em plantas cítricas e, deste modo, reduzindo a transmissão de agentes patogênicos as plantas para os quais D. citri é um vetor. Exemplo de tal microrganismo são as espécies de Candidatus Liberibacter. O invento também se refere a métodos para reduzir o vigor e/ou aumentar a mortalidade de D. citri por meio da aplicação de dsRNA via pulverização, tratamento de solo ou outro método de aplicação em plantas as quais D. citri se alimenta. Este invento também se refere a plantas geneticamente alteradas para expressar o dsRNA descrito aqui.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Huanglongbing (HLB) (também conhecido como “Greening dos citros”) é a mais séria doença que ameaça a citricultura no mundo. Ela é especialmente de importante para o Brasil pela devastação que está causando atualmente na indústria citrícola dos estados de São Paulo, Paraná e Minas Gerais. Além disso, tanto o inseto vetor quanto o patógeno causador do HLB estão disseminados em outros países produtoras de citros (Estados Unidos, China, Índia, Países do Oriente Médio). Atualmente, não existe tratamento efetivo contra a doença. Os agentes causais do HLB são espécies de bactérias do gênero Candidatus, incluindo Candidatus Liberibacter africanus (CLaf), Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), and Candidatus Liberibacter americanus (CLam), sendo que CLas e CLam foram detectadas no Brasil. As espécies de bactéria Clas e CLam são transmitidas de planta para planta pelo Psilídeo Asiático dos citros (D. citri).
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A espécie de bactéria CLaf é transmitida de planta para planta pelo psilídeo Trioza erytreae. A planta da espécie Murraya paniculata e outras espécies de plantas hospedam CLam e/ou CLas. D. citri ao se alimentar nestas plantas infectadas adquire a bactéria que pode ser transmitida para plantas de citros não infectadas. A lista destas plantas hospedeiras pode ser encontrada em www.freshfromflorida.com/content/download/24041/486974/hostlist.pdf. Assim, há a necessidade de se ter uma composição e métodos para interromper a transmissão da doença. Uma abordagem para prevenir a disseminação da doença é aumentar a mortalidade de D. citri, vetor da bactéria. Outra abordagem é reduzir o vigor de D. citri. Reduzindo a população de D. citri, pelo aumento da mortalidade ou redução do seu vigor, é o objetivo, reduzindo assim a transmissão da bactéria e da doença. Uma abordagem para reduzir a população de D. citri, sem reduzir os insetos benéficos, é usar a tecnologia RNA de interferência (RNAi).
[0003] Fire, etal. (USPN 6,506,559) descreveram um processo de introdução de RNA em uma célula viva para inibir a expressão gênica de um gene alvo naquela célula. Este mecanismo celular foi denominado de RNA de interferência, ou RNAi. 0 RNA tem uma região com estrutura de dupla fita. A inibição é específica da sequência na medida em que as sequências nucleotídicas da região duplex do RNA e de uma porção do gene alvo são idênticas. Especificamente, Fire, et o/. (USPN 6,506,559) descrevem um método para inibira expressão de um gene alvo numa célula, o método envolve a introdução de um ácido ribonucleico de cadeia dupla, dsRNA, na célula numa quantidade suficiente para desencadear o processo RNAi que conduz à inibição da tradução de uma proteína específica a partirdo RNA mensageiro (mRNA) do gene alvo. Uma das cadeias do dsRNA ativador tem a sequência correspondente à sequência de nucleotídeos do mRNA alvo. 0 dsRNA ativa o mecanismo de defesa natural da célula, definido como RNA de interferência (RNAi), que usa o dsRNA ativador (designado neste documento como dsRNA), para produzir pequenos RNAs interferentes (small interfering RNA, siRNA)que são incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RNA-induced silencing complex, RISC), que é um complexo multiproteico, especificamente
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3/47 ribonucleoproteico, que incorpora uma das fitas do siRNA. O complexo RISC - siRNA causa a degradação do mRNA alvo, assim prevenindo sua tradução em proteína. Conforme utilizado neste documento, ativador é qualquer molécula de dsRNA que induza a atividade de RNAi contra um gene específico.
[0004] Um mecanismo de ação envolve um longo ativador (isto é, um longo dsRNA) sendo clivado por uma enzima denominada dicer 'para produzir diversos siRNAque são menores em tamanho que o dsRNA. Acredita-se que o tamanho destes siRNA menores variam de 19 pares de base a 25 pares de base, mas a classe mais comum de siRNA possui 21 pares de base ou 24 pares de base (Hamilton, et al., 2002 EMBOJ., 21:4671-4679). As moléculas de siRNA são então, cada uma, incorporadas no RISC. A dupla fita do RNA é separada, e a fita antisenso é incorporada ao RISC, guiando-o para encontrar mRNA complementar e a subsequente clivagem endonucleolítica. Isto resulta na redução da proteína correspondente que que teria sido feita a partir do mRNA alvo degradado. Deste modo, isto é comumente referido como silenciamento gênico ou regulação negativa.
[0005] Poucas sequências de dsRNA foram identificadas e estão atualmente sendo avaliadas para (1) reduzir a capacidade de Diaphorína citri de hospedar CLas, e (ii) reduzir a sobrevivência de ninfas e adultos de Diaphorína citri. Veja em, El-Shesheny, et al. (2013) PLoS ONE 8(5): e65392 (doi.org/10.1371/journal.pone.0065392); e Killiny, etal. (2014) PLoS ONE 9(10): ell0536 (doi.org/10.1371/journal.pone.0110536).
[0006] Um objetivo de se utilizar RNAi é que identificando uma sequência de RNA que seja relativa mente única para a praga alvo (neste caso, D. citri) e que é efetivo em reduzir a expressão do gene alvo de modo que o aumento na mortalidade da praga alvo ocorra, então pode-se evitar o uso de tratamentos que prejudiquem insetos benéficos, como polinizadores, predadores e parasitoides. Esta invenção atinge estes objetivos com sucesso, e que a sequência de dsRNA para o mRNA da trehalase de D. citri (descrito neste documento) aparenta ser único para D. citri e não prejudica abelhas e outros polinizadores. Trehalase hidroliza o dissacarídeo α,α-trehalose em duas moléculas de Dglicose. α,α-trehalose é o principal açúcarencontrado na hemolinfa (sangue) de insetos, e é possui papel crítico na produção de energia e biossíntese de macromoléculas
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4/47 incluindo quitina. Trehalase tem sido purificada e caracterizada a partir de diferentes insetos, onde é encontrada nas formas solúvel (Tre-1) e ligada a membrana (Tre-2), codificadas por genes distintos. A forma solúvel é encontrada na hemolinfa e a forma ligada é encontrada em diferentes tecidos do inseto. Veja, Lee, et al., (2007) Biosci Biotechnol Biochem 71(9);2256-65.
[0007] A sequência codificadora da trehalase de D. citri (daqui em diante trehalase) foi obtida por meio da análise computacional automática da sequência genômica de D. citri (NW_007377674.1), anotada usando o método de predição Gnomon (NCBI, Rockville, MD). Veja também Reese, et al. (2013) J. Genomics 2:54-58; doi: 10.7150/jgen.7692. Evidências que corroboram incluem a similaridade com outras 16 proteínas, e 100% de cobertura da sequência genômica caracterizada pelo alinhamento de sequências de RNA (RNAseq), incluindo 5 amostras corroborando todos os introns anotados. Análises comparativas da sequência codificadora da trehalase de D. citri com sequências genômicas de outros insetos indicam que ela corresponde a Tre-1 (forma solúvel da trehalase), e ela compartilha alta homologia com trehalase homólogas de insetos conhecidos (Aphis glycines, GenBank: mRNA: JQ246351.1/ proteína: AFJ00065.1; Nilaparvata lugens, mRNA: FJ790319.1 / proteína: ACN85420.1; Locusta migratoria, mRNA: FJ795020.1 / proteína: ACP28173.1). Veja, Reese, etal. (2013) J. Genomics2:5458 (doi: 10.715/gen.7692); Hunter, etal. (2009) Open Entomol. J. 3:18-29; Hunter, etal. (2008) Florida Entomology Society meeting, resumos, p.11. (flaentsoc.org/2008annmeetabstracts.pdf); e Hunter, et al. (2014) J. Citrus Pathology 1:4.7 (Proc. 3rd International Research Conference Huanglongbing, Orlando, FL). A sequência do cDNA da trehalase está na SEQ ID NO: 26.
[0008] Existe a necessidade de reduzir a transmissão de CLas e/ou CLam á plantas não infectadas, e em particular, plantas de citros. Um método para reduzir o vigor ou a sobrevivência de D. citri (e consequentemente reduzir a infestação de D. citri) reduz o número de D. citri infectivos que podem transmitir os patógenos do HLB para plantas não infectadas, desta forma reduzindo ou interrompendo a transmissão do patógeno e a disseminação da doença. Além disso, qualquer solução para este problema que não
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5/47 afete insetos benéficos, tais como predadores e parasitoides de D. citri, irá favorecer o aumento do controle biológico que irá auxiliar na supressão da população de D. citri.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009] É um objeto desta invenção de ter um dsRNA capaz de reduzir o vigor e/ou aumentar a mortalidade (reduzir a sobrevivência) de D. citri após D. citri ter ingerido o dsRNA. Este dsRNA contém uma região sendo contendo aproximadamente dezesseis nucleotídeos e 1908 nucleotídeos, e uma região antisenso complementar a região senso. A região antisenso é também complementar ao cDNA da trehalase de D. citri ou um fragmento do cDNA da trehalase de D. citri. Este cDNA da trehalase de D. citritem a sequência da SEQ ID NO: 26 ou condifica a trehalase de D. citri que tem a sequência da SEQ ID NO: 29. Os fragmentos da trehalase de D. citri tem a sequências da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 11. É um outro objeto desta invenção que a região sendo deste dsRNA tenha uma sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 14, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos da SEQ ID NO: 26.
[0010] É um outro objeto desta invenção ter o dsRNA da trehalase de D. citri em uma solução que contenha um veículo aceitável na agricultura. É outro objeto desta invenção que uma fita do dsRNA da trehalase de D. citri tenha uma das seguintes sequências: entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 14, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. É um objeto adicional desta invenção que o veículo do dsRNA aceitável na agricultura possa ser água, surfactantes, lipossomos, lipídeos, proteínas, peptídeos, nanutubos, nanopartículas, micropartículas, quitina, microrganismos inativados, ou a combinação deles.
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6/47 [0011] É um objeto desta invenção ter um método de reduzir a infestação de D. citri em uma planta tratada (o número de D. citri que se alimenta da planta tratada) comparado a infestação de D. citri em uma planta não tratada (o número de D. citri que se alimenta em uma planta não tratada) pela administração de uma solução de dsRNA da trehalase de D. citri em uma planta não tratada em uma quantidade efetiva para reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri para obter uma planta tratada, e permitindo que a D. citri ingira ou absorva a solução de dsRNA ans assim matando a D. citri que ingeriu ou absorveu a solução de dsRNA. Esta solução de dsRNA contém um veículo aceitável na agricultura e o dsRNA da trehalase de D. citri que tem atividade inseticida contra D. citri, assim reduzindo a infestação de D. citri na planta tratada em comparação com a planta não tratada. É um outro objeto desta invenção que o dsRNA da trehalase de D. citri tenha uma ou mais das seguintes sequências: entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 14, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. É um objeto adicional desta invenção que o veículo do dsRNA aceitável na agricultura possa ser água, surfactantes, lipossomos, lipídeos, proteínas, peptídeos, nanutubos, nanopartículas, micropartículas, quitina, microrganismos inativados, ou a combinação deles. A solução de dsRNA pode conter ainda um componente para prevenir a degradação do dsRNA, um químico translaminar, um mineral, uma argila, um fertilizante, um açúcar ou a combinação deles. Em uma concretização desta invenção, a etapa de administração envolve a pulverização da solução de dsRNA da trehalase de D. citri em uma planta não tratada para gerar uma planta tratada. Eu outra concretização desta invenção, a etapa de administração envolve a aplicação da solução de dsRNA da trehalase de D. citri no solo ao redor da planta não tratada para permitir que as raízes da planta não tratadas absorvam o dsRNA de D. citri, assim gerando uma planta tratada. Uma concretização alternativa desta invenção, a etapa de administração envolve aplicar a solução de dsRNA da trehalase de D. citri em uma ou mais raízes de uma planta não tratada para gerar uma planta tratada.
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7/47 [0012] É objeto desta invenção de ter um método para reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri que se alimente em uma planta alterada para ter a capacidade de reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri. Este método envolve a introdução do dsRNA da trehalase de D. citri em uma planta natural (tipo selvagem) na qual D. citri se alimenta, assim produzindo uma planta alterada capaz de reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri, e permitindo que D. citrise alimente na planta alterada, de modo que D. citri morra após ingestão do dsRNA da trehalase de D. citri. Uma concretização desta invenção, o dsRNA da trehalase de D. citri tenha uma ou mais das seguintes sequências: entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 14, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citritendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. A introdução do dsRNA da trehalase de D. citri na planta tipo selvagem pode ocorrer pela pulverização de uma solução de dsRNA contendo o dsRNA da trehalase de D. citri na planta tipo selvagem; pela aplicação de uma solução de dsRNA contendo o dsRNA da trehalase de D. citri nas raízes de uma planta tipo selvagem, ou pela aplicação da solução de dsRNA contendo o dsRNA da trehalase de D. citri no solo ao redor da planta tipo selvagem para que as raízes da planta tipo selvagem possa absorver o dsRNA da trehalase de D. citri. Esta solução de dsRNA pode também conter um veículo aceitável na agricultura (como água, surfactante, lipossomo, lipídeo, proteína, peptídeo, nanotubo, nanopartículas, micropartículas, quitina, microrganismos inativados, ou a combinação deles) ou outros compostos (tais como um composto que previne a degradação do dsRNA, um químico translaminar, um mineral, uma argila, um fertilizante, um açúcar, ou a combinação deles).
[0013] É outro objeto desta invenção de ter um método de redução do vigor ou sobrevivência de D. citri que se alimenta em uma planta alterada tendo a capacidade de reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri. Este método envolve a introdução de um vetor de expressão codificando o dsRNA da trehalase de D. citri em uma planta tipo selvagem na qual D. citri se alimenta, produzindo assim uma planta alterada capaz de
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8/47 reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri, e permitindo que D. citri se alimente em uma planta alterada, de modo que D. citri morra após ingerir o dsRNA da trehalase de D. citri. Nesta concretização, o vetor de expressão tem pelo menos um promotor heterólogo operativamente ligado a um polinucleotídeo que contém a região sendo e antisenso. É um objeto adicional desta invenção que a sequência da região senso esteja entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Além disso, a região antisenso tenha a sequência complementar a sequência da região senso. Nesta concretização, as etapas de introdução do vetor codificando o dsRNA da trehalase de D. citri na planta tipo selvagem envolve a transformação da célula da planta tipo selvagem com o vetor de expressão para produzir uma célula de planta alterada; permitindo que a célula da planta alterada cresça para se transforme em uma planta alterada; e permitindo que o vetor de expressão produza o dsRNA de trehalase de D. citri. Em uma concretização desta invenção, um promotor controla a transcrição da região senso e da região antisenso. Em outra concretização, um promotor controla a transcrição da região senso e um segundo promotor controla a transcrição da região anti-senso.
[0014] É um outro objeto desta invenção ter um método de reduzir a transmissão por D. citri de microrganismo causador de doença de uma planta tratada para uma planta não tratada pela aplicação de uma solução de dsRNA em uma planta tipo selvagem para produzir uma planta tratada, e permitindo que D. citri se alimente em uma planta tratada, de modo que a solução de dsRNA contenha um veículo aceitável na agricultura e o dsRNA da trehalase de D. citri, de modo que o dsRNA da trehalase de D. citri cause a morte da D. citri que ingira ou absorva o dsRNA da trehalase de D. citri, porque D. citri morta é incapaz de transmitir o microrganismo causador da doença para uma planta não tratada. É ainda objeto desta invenção, que o dsRNA da trehalase de D. citri tenha a sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 4, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, entre 16 nucleotídeos e 730
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9/47 nucleotídeos da SEQ ID NO: 14, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. A etapa de aplicação da solução de dsRNA na planta tipo selvagem ocorre via (i) pulverização da solução de dsRNA na planta tipo selvagem, (ii) aplicação da solução de dsRNA nas raízes da planta tipo selvagem, e/ou (iii) aplicação da solução de dsRNA no solo ao redor da planta tipo selvagem para que as raízes da planta tipo selvagem possa absorver o dsRNA da trehalase de D. citri.
[0015] É um objeto desta invenção ter uma planta alterada geneticamente, e partes dela (i.e., folhas, flores, caule, raiz, célula, pólen, protoplasto, etc.), que contenha um vetor de expressão tendo um primeiro promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e um segundo promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri, de modo que o polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e o polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri seja complementares entre si. O polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri possua sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Em uma concretização, o primeiro promotor e o segundo promotor são os mesmos promotores. Em outra concretização, o primeiro promotor e o segundo promotor são promotores diferentes.
[0016] É também objeto desta invenção ter uma planta alterada geneticamente, e partes dela (i.e., folhas, flores, caule, raiz, célula, pólen, protoplasto, etc.), que contenha um vetor de expressão tendo um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que tem a região senso da trehalase de D. citri e a região antisenso da trehalase de D. citri, de modo que que região antisenso da trehalase de D. citri é complementar a região senso da trehalase de D. citri. O polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri tem a sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, entre 16
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10/47 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29.
[0017] É um objeto desta invenção em ter um método para obter uma planta alterada geneticamente que produza o dsRNA da trehalase de D. citri pela transformação da célula da planta tipo selvagem com um vetor de expressão para produzir dsRNA da trehalase para gerar uma célula de planta alterada geneticamente que produza o dsRNA da trehalase de D. citri, e cultivando a célula da planta alterada geneticamente para que uma planta geneticamente alterada. Em uma concretização, o vetor de expressão para produzir o dsRNA da trehalase de D. citricontém um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que tem a região senso da trehalase de D. citri e a região antisenso da trehalase de D. citri, de modo que que região antisenso da trehalase de D. citri é complementar a região senso da trehalase de D. citri, e que a região senso da trehalase de D. citri tem a sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e/ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Em uma outra concretização desta invenção, o vetor de expressão para produzir o dsRNA da trehalase de D. citri possui primeiro promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e um segundo promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri, de modo que o polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e o polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri sejam complementares entre si, e que a região senso da trehalase de D. citri tem a sequência entre 16 nucleotídeos e 469 nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, entre 16 nucleotídeos e 438 nucleotídeos da SEQ ID NO: 6, entre 16 nucleotídeos e 730 nucleotídeos da SEQ ID NO: 11, ou entre 16 nucleotídeos e 1908 nucleotídeos do RNA equivalente à SEQ ID NO: 26, e/ou entre 16 nucleotídeos e 1908
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11/47 nucleotídeos do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29. Em uma outra concretização desta invenção ter uma planta alterada geneticamente, e parte dela (i.e., folhas, flores, caule, raiz, célula, pólen, protoplasto, etc.), produzidas por este método e capazes de produzir o dsRNA da trehalase de D. citri. É um outro objeto desta invenção ter uma célula de planta alterada geneticamente desta planta alterada geneticamente.
[0018] Em uma outra concretização desta invenção ter um cDNA condificando a trehalase de D. citri com a sequência SEQ ID NO: 26. Em uma outra concretização desta invenção ter um vetor de expressão contendo um promotor heterólogo operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a trehalase de D. citri contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:29.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
[0019] FIG. 1 é a sequência do DNA dos nucleotídeos 809 até 1277 (SEQ ID NO: 1) do cDNA da trehalase (SEQ ID NO: 26) que codifica a fita senso do dsRNA da trehalase #1. Os nucleotídeos em negrito e sublinhados estão contidos nos iniciadores direto e reverso, respectivamente (SEQ ID Nos: 2 e 3).
[0020] FIG. 2 é a sequência do DNA dos nucleotídeos 168 até 605 (SEQ ID NO: 6) do cDNA da trehalase (SEQ ID NO: 26) que codifica a fita senso do dsRNA da trehalase #2. Os nucleotídeos em negrito e sublinhados estão contidos nos iniciadores direto e reverso, respectivamente (SEQ ID Nos: 7 e 8).
[0021] FIG. 3 é a sequência do DNA dos nucleotídeos 1157 até 1886 (SEQ ID NO: 11) do cDNA da trehalase (SEQ ID NO: 26) que codifica a fita senso do dsRNA da trehalase #3. Os nucleotídeos em negrito e sublinhados estão contidos nos iniciadores direto e reverso, respectivamente (SEQ ID Nos: 12 e 13).
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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0022] A sequência do gene d trehalase de D. citri não é idêntica às sequências de trehalase em vários insetos benéficos que puderam ser analisados. Como tal, a utilização do dsRNA de trehalase de D. citri (ou fragmentos do dsRNA da trehalase) para reduzir o vigor e sobrevivência de D. citri proporciona um mecanismo para reduzir a disseminação das espécies de C. Liberibacter e outros microrganismos para os quais D. citri é hospedeiro de plantas infectadas para plantas não infectadas sem prejudicar insetos benéficos. Exemplo não limitado de tais microrganismos para os quais D. citri hospeda inclui reovírus. Veja, Marutani-Hert, et al. (2009) Florida Entomologist 92:314-320. Assim, o dsRNA pode ser administrado a plantas, ou produzidos por plantas geneticamente modificadas, ou por microrganismos (bactéria, levedura, vírus, fungos, etc.). As invenções aqui descritas incluem o dsRNA aqui descrito, as composições contendo o dsRNA aqui descrito, plantas ou microrganismos geneticamente alterados que produzam o dsRNA aqui descrito, métodos para gerar as plantas geneticamente alteradas, e métodos para utilizar o dsRNA aqui descrito para reduzir o vigor e sobrevivência das populações de D. citri e assim reduzir a infestação de D. citri, e também assim reduzir a transmissão de microrganismos que infectam plantas, tal como, mas não se limitando a espécies de C. Liberibacter, por espécies de psilídeos, e mais especificamente por D. citri.
[0023] A Tabela 1 fornece uma lista explicativa das sequências aqui discutidas e inclui a sequências codificadora (cds) e do dsRNA da trehalase de D. citri; sequências codificadora e do dsRNA da proteína maternal exuperantia; e sequências codificadora e do dsRNA da pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase (PCBD1); e os iniciadores utilizados. Notar que três cds para trehalase, cada uma abrangendo diferentes secções da cds da trehalase estão listados na Tabela 1 e usados nos exemplos abaixo.
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Tabela 1
SEQ ID NO: 1 Sequência de DNA codante da fita senso do dsRNA #1 da trehalase correspondendo aos nucleotídeos 809-1277 da trehalase
SEQ ID NO: 2 Iniciador senso 5' para SEQ ID NO: 1 onde os nucleotídeos 1-22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 3 Iniciador antisenso 3' para SEQ ID NO: 1 onde os nucleotídeos 1 22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 4 Sequência de RNA da fita senso para o dsRNA #1 da trehalase
SEQ ID NO: 5 Sequência de RNA da fita antisenso para o dsRNA #1 da trehalase
SEQ ID NO: 6 Sequência de DNA codante da fita senso do dsRNA #2 da trehalase correspondendo aos nucleotídeos 168-605 da trehalase
SEQ ID NO: 7 Iniciador senso 5' para SEQ ID NO: 6 onde os nucleotídeos 1-22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 8 Iniciador antisenso 3' para SEQ ID NO: 6 onde os nucleotídeos 1 22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 9 Sequência de RNA da fita senso para o dsRNA #2 da trehalase
SEQ ID NO: 10 Sequência de RNA da fita antisenso para o dsRNA #2 da trehalase
SEQ ID NO: 11 Sequência de DNA codante da fita senso do dsRNA #3 da trehalase correspondendo aos nucleotídeos 1157-1886 da trehalase
SEQ ID NO: 12 Iniciador senso 5' para SEQ ID NO: 11 onde os nucleotídeos 1 -22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 13 Iniciador antisenso 3' para SEQ ID NO: 11 onde os nucleotídeos 1 22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da trehalase
SEQ ID NO: 14 Sequência de RNA da fita senso para o dsRNA #3 da trehalase
SEQ ID NO: 15 Sequência de RNA da fita antisenso para o dsRNA #3 da trehalase
SEQ ID NO: 16 Sequência de DNA codante da fita senso do dsRNA da proteína maternal exuperantia correspondendo aos nucleotídeos 1-447 da proteína maternal exuperantia
SEQ ID NO: 17 Iniciador senso 5' para SEQ ID NO: 16 onde os nucleotídeos 1-22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-41 são sequencias da proteína maternal exuperantia
SEQ ID NO: 18 Iniciador antisenso 3' para SEQ ID NO: 16 onde os nucleotídeos 1 22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da proteína maternal exuperantia
SEQ ID NO: 19 Sequência de RNA da fita senso para o dsRNA da proteína maternal exuperantia
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SEQ ID NO: 20 Sequência de RNA da fita antisenso para o dsRNA da proteína maternal exuperantia
SEQ ID NO: 21 Sequência de DNA codante da fita senso do dsRNA da pterin-4alpha-carbinolamine dehydratase (PCBD1) dsRNA correspondendo aos nucleotídeos 3-268 da PCBD1
SEQ ID NO: 22 Iniciador senso 5' para SEQ ID NO: 21 onde os nucleotídeos 1 -22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-43 são sequencias da PCBD1
SEQ ID NO: 23 Iniciador antisenso 3' para SEQ ID NO: 21 onde os nucleotídeos 1 - 22 são sequências do promotor T7 e nucleotídeos 23-42 são sequencias da PCBD1
SEQ ID NO: 24 Sequência de RNA da fita senso para o dsRNA da PCBD1
SEQ ID NO: 25 Sequência de RNA da fita antisenso para o dsRNA da PCBD1
SEQ ID NO: 26 Sequência do cDNA da trehalase
SEQ ID NO: 27 Sequência do cDNA da proteína maternal exuperantia
SEQ ID NO: 28 Sequência do cDNA da PCBD1
SEQ ID NO: 29 Sequência de aminoácidos da trehalase
[0024] Uma vez que esta invenção envolve a produção de plantas geneticamente alteradas e envolve técnicas de DNA recombinante, são proporcionadas as seguintes definições para auxiliar na descrição desta invenção. Os termos isolado, purificado ou biologicamente puro tal como aqui utilizado, referem-se a material que está substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material no seu estado nativo ou quando o material é produzido. Numa concretização preferencial, a pureza e a homogeneidade são determinadas utilizando técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta resolução. Um ácido nucleico ou uma bactéria em particular que é a espécie predominante presente numa preparação é substancialmente purificado. Numa concretização preferencial, o termo purificado denota que um ácido nucleico ou proteína que dá origem essencialmente a uma banda num gel de eletroforese. Tipicamente, os ácidos nucleicos ou proteínas isoladas têm um nível de pureza expresso em um intervalo. A extremidade inferior da gama de pureza para o componente é de cerca de 60%, cerca de 70% ou cerca de 80% e a extremidade superior
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15/47 da gama de pureza é de cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou mais de cerca de 90%.
[0025] O termo gene refere-se a uma sequência de DNA envolvida na produção de um RNA ou polipeptídeo ou seu precursor. O polipeptídeo ou RNA pode ser codificado por uma sequência de codificação de comprimento completo (cds) ou por porções da sequência codificadora interrompidas por intron, tais como sequências de exons. Em uma concretização desta invenção, o alvo genético é o mRNA da trehalase de D. citri. A sequência polinucleotídica da trehalase é SEQ ID NO: 26.
[0026] O termo ácido nucleico tal como aqui utilizado, refere-se a um polímero de ribonucleotideos ou desoxirribonucleotideos. Tipicamente, os polímeros de ácido nucleico ocorrem na forma de cadeia simples ou dupla, mas também são conhecidos por formarem estruturas compreendendo três ou mais cadeias. O termo ácido nucleico inclui polímeros de ácido nucleico de ocorrência natural bem como ácidos nucleicos compreendendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificada ou ligações, que são sintéticos, de ocorrência natural e não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência, e que são metabolizados de forma semelhante aos nucleotídeos de referência. Análogos exemplares incluem, sem limitação, Fosforotiotatos (phosphorothioates), Fosforamidatos (phosphoramidates), Metil fosfonatos (methyl phosphonates), Chiral-metil fosfonatos (chiral-methyl phosphonates), 2-O-metil ribonucleotideos (2-O-methyl ribonucleotideos), Peptideo-ácido nucleico (PNA) e Ácidos nucleicos ligados (BNA, 2'-O,4'-aminoethylene bridged nucleic acid). Veja, por exemplo, Rahman, et al. (2007) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 26:1625-1628. DNA”, “RNA”, polynucleotídeos, “sequência de polynucleotídeo”, “oligonucleotídeo”, “nucleotídeo”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico”, “fragmento de ácido nucleico”, e “ fragmento de ácido nucleico isolado” são aqui utilizados indistintamente.
[0027] Para ácidos nucleicos, os tamanhos são dados tanto em quilobases (kb), ou em pares de bases (bp), ou nucleótidos (nt). As estimativas são tipicamente derivadas de eletroforese em gel de agarose ou de acrilamida, a partir de ácidos nucleicos
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16/47 sequenciados ou de sequências de DNA publicadas. Para as proteínas, os tamanhos são dados em quilodaltons (kDa) ou números de resíduos de aminoácidos. Os tamanhos de proteínas são estimados a partir de eletroforese em gel, de proteínas sequenciadas, de sequências de aminoácidos derivadas ou de sequências de proteínas publicadas. [0028] A menos que indicado de outro modo, uma determinada sequência de ácido nucleico engloba também implicitamente variantes modificadas conservativamente do mesmo (e.g., substituições do códon degenerado), a complementariedade da sequência (ou complemento), e a sequência complementar reversa, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códons degeneradas podem ser conseguidas gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxinosina (deoxyinosine) (veja por exemplo, Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)). Devido à degenerescência dos códons de ácido nucleico, podese utilizar vários polinucleotídeos diferentes para codificar polipeptídeos idênticos. A Tabela 2, infra, contém informação sobre quais códons de ácido nucleico codificam quais aminoácidos.
Tabela 2
Aminoácido Códons do ácido nucleico Aminoácido Códons do ácido nucleico
Ala/A GCT, GCC, GCA, GCG Leu/L TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG
Arg/R CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG Lys/K AAA, AAG
Asn/N AAT, AAC Met/M ATG
Asp/D GAT, GAC Phe/F TTT, TTC
Cys/C TGT, TGC Pro/P CCT, CCC, CCA, CCG
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Gln/Q CAA, CAG Ser/S TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
Glu/E GAA, GAG Thr/T ACT, ACC, ACA, ACG
Gly/G GGT, GGC, GGA, GGG Trp/W TGG
His/H CAT, CAC Tyr/Y TAT, TAC
Ile/I ATT, ATC, ATA Val/V GTT, GTC, GTA, GTG
[0029] O termo iniciador refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese quando colocado sob condições em que a extensão do iniciador é iniciada. Um iniciador pode ocorrer naturalmente, bem como de uma restrição purificado, ou pode ser produzido sinteticamente.
[0030] Um iniciador é selecionado para ser substancialmente complementar a uma cadeia de sequência específica de um molde. Um iniciador deve ser suficientemente complementar para hibridizar com uma cadeia molde para que ocorra o alongamento do iniciador. A sequência do iniciador não necessita refletir a sequência exata do molde. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado à extremidade 5' do iniciador, sendo o restante da sequência de ini ciador substancialmente complementar à cadeia. As bases não complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas no iniciador, desde que a sequência de iniciador seja suficientemente complementar com a sequência do molde para hibridizar e assim formar um complexo de iniciador e molde para que a síntese do produto seja iniciada.
[0031] “dsRNA” refere-se ao RNA de cadeia dupla que compreende uma região senso e uma região antisenso de um gene alvo selecionado (ou sequências com elevada identidade de sequência para que o silenciamento de genes possa ocorrer), bem como qualquer RNA de cadeia dupla formados a partir dele pela atividade de RNAse ou de uma Dicer. Tal dsRNA pode incluir porções de RNA de cadeia simples, mas contém pelo menos 18 pares de bases de dsRNA. Um dsRNA depois de ser processado pela Dicer gera siRNAs (18-25 pb de comprimento), que são de cadeia dupla, e podem conter com 2 nucleotídeos salientes nas extremidades, que são de cadeia simples. Prevê-se que
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18/47 geralmente siRNA com cerca de 21 nt de comprimento (ou, alternativamente, entre 17 e 27 nt de comprimento), será incorporado no RISC. Em uma concretização, a região de senso e a região antisenso de um dsRNA estão na mesma cadeia de RNA. Nesta concretização, quando a região de sentido e a região anti-sentido se anelam em conjunto, o dsRNA contém um laço (loop). Um promotor operacionalmente ligado ao DNA que codifica tanto a região senso como a região antisenso é utilizado para produzir uma molécula de RNA contendo tanto a região de senso como a região antisenso. Em outra concretização, a região de senso e a região antisenso estão presentes em duas cadeias distintas de RNA (uma cadeia senso e a cadeia antisenso que é complementar à cadeia senso) que se anelam para formar o dsRNA. Nesta concretização, um promotor está operacionalmente ligado a cada cadeia de DNA; onde uma cadeia de DNA codifica o RNA contendo a região de senso e a outra cadeia de DNA codifica o RNA que contém a região antisenso. Nesta concretização, o promotor em cada cadeia pode ser o mesmo ou um diferente do presente na outra cadeia. Depois de os RNAs serem transcritos, as duas cadeias de RNA se anelam em conjunto porque a região senso e a região antisenso são complementares entre si, formando assim o dsRNA. Ainda noutra forma de concretização, uma cadeia de DNA pode codificar tanto a região de senso como a região antisenso do dsRNA. No entanto, o DNA que codifica cada região está separado um do outro de modo que dois promotores são necessários para transcrever cada região. Isto é, o DNA que codifica a região antisenso e o DNA que codifica a região de senso estão operacionalmente ligados ao seu próprio promotor. Novamente, os dois promotores podem ser o mesmo promotor ou promotores diferentes. Numa concretização, o promotor pode ser um promotor da T7 RNA polimerase. Outros promotores são bem conhecidos no estado da técnica e estes também podem ser utilizados em concretizações da presente invenção.
[0032] Em relação à especificidade, ela é conduzida pelo siRNA. Há duas publicações que abordaram esta questão em insetos. Uma publicação mostra que para ser específico, um siRNA deve partilhar um mínimo de pelo menos 19 nt de comprimento com o mRNA alvo. Ver, Whyard, et al. (2009) Insect Biochem Molecul. Biol. 39: 824-32. A segunda publicação mostra que é necessário compartilhar um comprimento de
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19/47 sequência contígua de 20 nt ou mais, entre o dsRNA e o mRNA alvo para eficácia na degradação (silenciamento). Ver, Bachman, et al. (2013) Transgenic Res. 22: 1207-22. [0033] As moléculas ativas de dsRNA têm funcionado são de até 1000 pb e devem funcionar quando ainda maior. Para os propósitos das invenções aqui descritas, qualquer siRNA com pelo menos 19 nt de comprimento derivado da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 21 serão específicas à D. citri. Esta região é específica para D. citri, porque ao longo do ativador não existem regiões de 25 nt ou mais que sejam 100% idênticas a qualquer sequência conhecida de inseto, animal, humano ou espécie de planta. Numa concretização, o dsRNA pode ter qualquer 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, ou mais longos nucleotídeos contíguos do cDNA da trehalase de D. citri (SEQ ID NO: 26) ou da SEQ ID NOs: 1, 6, e 11, até ou incluindo todos 469 nt of SEQ ID NO: 1, até ou incluindo todos 438 nt of SEQ ID NO: 6, até ou incluindo todos 730 nt of SEQ ID NO: 11, e até ou incluindo todos 1908 nt of SEQ ID NO: 26. Em uma concretização alternativa, o dsRNA pode variar no comprimento entre 16 pb e 30 pb, entre 16 pb e 25 pb, entre 18 e 30 pb e entre 19 pb e 28 pb. Ainda noutra forma de concretização da invenção, as formas de RNA que são criadas pela família RNAse III (Dicer ou ribonuclease semelhante a Dicer) ou pela atividade de Dicer que são dsRNA mais longos estão dentro do âmbito desta invenção.
[0034] O siRNA pode ser produzido sinteticamente, expresso e secretado diretamente a partir de uma célula transformada, ou um microrganismo, ou pode ser gerado a partir de um dsRNA mais longo por atividade enzimática. Estes siRNAs podem ser de extremidade abrupta ou podem ter extremidades sobrepostas de 1 pb a 4 pb de várias combinações de nucleotídeos. Além disso, microRNAs modificados compreendendo uma porção do gene putativo da trehalase e a sua sequência complementar são aqui incluídos como dsRNAs. Para clarificação, pb é uma abreviatura de pares de bases e nt é uma abreviatura de nucleotídeo.
[0035] Em uma concretização desta invenção, o dsRNA é utilizado para controlar D. citri sem que o dsRNA seja co-administrado com um agente promotor de transfecção, embora em algumas formas de concretização, o dsRNA do invento possa ser fornecido
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20/47 numa solução com um agente promotor de transfecção. Numa concretização desta invenção, o dsRNA é expresso numa planta a ser protegida ou expresso em microrganismos que podem ser organismos endêmicos da planta (micróbios, vírus, fitoplasma, viróides, fungos, protistas) ou micróbios de vida livre (leveduras, bactérias, protistas, fungos), qualquer dos quais são fornecidos, vivos, mortos ou processados, por meio de tratamentos de raiz, ou pulverização foliar em plantas, ou injetado em plantas, que devem ser protegidos. Alternativamente, o microrganismo pode ser um organismo transgênico endêmico à planta e fornecer o dsRNA para a planta. Ver, por exemplo, Subhas, et al. (2014) J. Biotech. 176: 42-49 para um exemplo de silenciamento de genes induzido por vírus utilizando o vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza virus). Ver, também, Tenllado, et al. (2003) BMC Biotechnol 3: 3 para um exemplo de um extrato bruto de uma cultura de células bacterianas contendo dsRNA que protege plantas contra infecções virais [0036] Em uma concretização, uma solução de dsRNA é administrada à planta na qual D. citri se alimenta. Uma solução de dsRNA contém um ou mais dos dsRNA aqui discutidos e um veículo aceitável na agricultura. Um veículo agricolamente aceitável pode ser água, um ou mais lipossomas, um ou mais lípidos, um ou mais surfactantes, uma ou mais proteínas, um ou mais peptídeos, um ou mais nanotubos, um ou mais nanoesferas, um ou mais microesferas, quitina e / ou um ou mais microrganismos inativados que encapsulam o dsRNA. Ver WO 2003/004644 exemplos de outros veículos agricolamente aceitáveis. A solução de dsRNA também pode conter um ou mais açúcares, compostos que ajudam na prevenção da degradação de dsRNA, produtos químicos translaminares, branqueadores químicos, argilas, minerais e / ou fertilizantes. Pode-se pulverizar a solução de dsRNA nas plantas (folhas, ramos, tronco, raízes expostas, etc.) que a D. citri irá ingerir ou absorver quando estiver na planta. Pode-se aplicar a solução de dsRNA no solo ao redor da planta de modo que as raízes da planta absorvam a solução de dsRNA e transportem-no para outras partes das plantas. Então, quando D. citri se alimente da planta, irá ingerir o dsRNA (e talvez outros componentes da solução de dsRNA) da solução de dsRNA quando se alimentar na planta. Alternativamente, uma ou mais raízes podem ser colocadas num recipiente que contém
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21/47 a solução de dsRNA de modo que essas raízes absorvam a solução de dsRNA. A solução de dsRNA pode também ser injetada na planta. Como tal, a solução de dsRNA pode estar em uma solução de dsRNA para pulverização, uma solução de dsRNA de encharcamento ou uma solução de dsRNA injetável. Outros tipos de soluções conhecidos do estado da técnica podem ser empregados.
[0037] O termo quimérico e fusão quando se referindo a um gene ou polinucleotídeo são utilizados para se referir a um gene ou polinucleotídeo contendo pelo menos dois polinucleotídeo de DNA / RNA funcionalmente relevantes (tais como promotor, 5'UTR, região codante, 3'UTR e / ou intron) que não estão naturalmente associados um ao outro, tal como uma fusão de polinucleotídeos funcionalmente relevantes de diferentes fontes para formar um polinucleotídeo quimérico expressível em plantas que gera um dsRNA que visa o transcrito de trehalase de D. citri.
[0038] Os oligonucleotídeos e polinucleotídeos que não estão comercialmente disponíveis podem ser sintetizados quimicamente, por exemplo, de acordo com o método de triester fosforamidita em fase sólida (solid phase phosphoramidite triester method) descrito pela primeira vez por Beaucage e Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), ou utilizando um sintetizador automatizado, como descrito em Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). Outros métodos para sintetizar oligonucleotídeos e polinucleotídeos são conhecidos do estado da técnica e também podem ser empregados. A purificação de oligonucleotídeos é por eletroforese em gel de acrilamida nativa ou por HPLC de troca aniônica como descrito em Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).
[0039] Os termos idêntico ou identidade percentual, no contexto de dois ou mais polinucleotídeos ou sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma percentagem especificada de nucleotídeos ou aminoácidos (respectivamente) que são iguais (por exemplo, 80%, 85% de identidade, 90% de identidade, 99% ou 100% de identidade), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma região designada, medida usando um algoritmo de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual.
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22/47 [0040] A expressão percentagem elevada idêntica ou percentagem elevada de identidade, no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de nucleotídeo ou aminoácido, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, medida utilizando um algoritmo de comparação de sequências ou por inspeção visual. Numa concretização preferencial, existe uma elevada percentagem de identidade sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 16 nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento. Noutra forma de concretização preferencial, existe uma elevada percentagem de identidade sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento. Ainda noutra forma de concretização preferencial, existe uma elevada percentagem de identidade sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 100 nucleotídeos ou aminoácidos ou mais de comprimento. Numa concretização preferencial, as sequências possuem elevada percentagem idênticas ao longo de todo o comprimento das sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas.
[0041] Para a comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, são designadas coordenadas de subsequência, se necessário, e são designados parâmetros do algoritmo do programa. Parâmetros padrão do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidades das sequências teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. Alinhamento de sequências para comparação podem ser conduzidos, por exemplo, por algoritmo de homologia local de of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca
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23/47 por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementação computadorizada de vários algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA no pacote de softwares de genética de Wisnconsin, Grupo de computação genética, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 1995 suplemento).
[0042] O complemento de uma sequência polinucleotídica particular é a sequência nucleotídica que é capaz de formar uma molécula de DNA ou RNA de cadeia dupla com a sequência nucleotídica representada e que pode ser derivada da sequência nucleotídica representada substituindo os nucleotídeos pelo seu nucleotídeo complementar de acordo com as regras de Chargeaff (A <> T; G <> C) e leitura na direção 5 'para 3', isto é, na direção oposta da sequência nucleotídica representada.
[0043] Numa concretização da invenção, os RNAs senso e antisenso e dsRNA podem ser expressos separadamente in vitro ou in vivo. A produção in vivo de RNAs senso e antisenso podem utilizar diferentes construções de polinucleotídeos quiméricos utilizando o mesmo ou diferentes promotores ou utilizando um vector de expressão contendo dois promotores convergentes em orientação oposta. Estes RNAs senso e antisenso que são formados, por exemplo, na mesma célula hospedeira, ou sintetizados, podem então combinar para formar o dsRNA. É claro que sempre que é aqui feita referência a um polinucleotídeo de dsRNA quimérico ou de fusão ou a uma molécula de dsRNA, que esse dsRNA formado, por exemplo, em células de plantas, a partir de RNA senso e antisenso produzido separadamente. Também o dsRNA feito pelo anelamento de cadeias de RNA feitas sinteticamente são aqui incluídas quando as cadeias senso e antisenso estão presentes em conjunto.
[0044] Tal como aqui utilizado, o termo promotor refere-se a um polinucleotídeo que no seu estado nativo está localizado a montante ou 5' do códon de iniciação de tradução de uma sequência aberta de leitura (ou região codificadora de proteína) e que está envolvido no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas (fatores de transcrição que atuam em trans) para iniciar a transcrição. Um promotor vegetal é um promotor nativo ou não nativo que é funcional em células vegetais, mesmo se o promotor estiver presente em um microrganismo que infecta plantas ou um
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24/47 microrganismo que não infecta plantas. Os promotores que são predominantemente funcionais num tecido específico ou conjunto de tecidos são considerados promotores específicos de tecidos. Um promotor vegetal pode ser utilizado como um elemento regulador 5' para modular a expressão de um polinucleotídeo desejado (polinucleotídeo heterólogo) operacionalmente ligado a ele. Quando operativamente ligado a um polinucleotídeo transcritível, um promotor tipicamente faz com que o polinucleotídeo transcritível seja transcrito de uma maneira semelhante àquela da qual o promotor está normalmente associado.
[0045] Os promotores de plantas podem incluir promotores produzidos através da manipulação de promotores conhecidos para produzir promotores artificiais, quiméricos ou híbridos. Tais promotores podem também combinar elementos em cis de um ou mais promotores, por exemplo, adicionando um elemento regulador heterólogo a um promotor ativo mantendo seus próprios elementos reguladores parciais ou completos. O termo elemento em cis refere-se a um elemento regulador transcricional que atua em cis que confere um aspecto de controle global da expressão gênica. Um elemento cis pode funcionar local para ligação de fatores de transcrição, fatores proteicos agindo em trans, que regulam a transcrição. Alguns elementos cis ligam mais de um fator de transcrição, e os fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais de um elemento cis.
[0046] O termo vetor refere-se a DNA, RNA, uma proteína ou polipeptídeo que se destinam a ser introduzidos numa célula ou organismo hospedeiro. Os polinucleotídeos, a proteína e o polipeptídeos que se destinam a ser introduzidos num hospedeiro podem ser de natureza terapêutica ou profiláctica; podem codificar ou ser um antígeno; pode ser de natureza regulatória; etc. Existem vários tipos de vetores incluindo vírus, viróides, plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e bactérias.
[0047] Um vetor de expressão é um ácido nucleico capaz de se replicar numa célula ou organismo hospedeiro selecionado. Um vetor de expressão pode replicar-se como uma estrutura autónoma ou, alternativamente, pode integrar, no todo ou em parte, nos cromossomas das células hospedeiras ou no ácido nucleico de uma organela, ou ser utilizado como transportador para distribuir DNA estranho às células, e assim replicar
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25/47 juntamente com o genoma da célula hospedeira. Assim, vetor de expressão são polinucleotídeos capazes de se replicar numa célula hospedeira, organela ou organismo selecionados, por exemplo, um plasmídeo, vírus, cromossomo artificial, fragmento de ácido nucleico, e no qual os genes no vector de expressão (incluindo genes se interesse) são transcritos e traduzidos num polipeptídeo ou proteína dentro da célula, organela ou organismo; ou qualquer construção adequada conhecida no estado da arte, que compreende uma cassete de expressão. Em contraste, como descrito nos exemplos aqui, uma cassete é um polinucleotídeo contendo uma secção de um vector de expressão. A utilização dos cassetes auxilia na montagem dos vetores de expressão. Um vector de expressão é um replicador, tal como um plasmídeo, fago, vírus, vírus quimérico ou cosmídeo, e que contém a sequência polinucleotídica desejada operacionalmente ligada à (s) sequência (s) de controle da expressão.
[0048] Uma sequência polinucleotídica heteróloga está operacionalmente ligada a um ou mais elementos reguladores da transcrição (por exemplo, promotor, terminador e, opcionalmente, intensificador) de tal modo que os elementos reguladores da transcrição controlam e regulam a transcrição e / ou a tradução dessa sequência polinucleotídica heteróloga. Um cassete pode ter o polinucleotídeo heterólogo ligado operacionalmente a um ou mais elementos reguladores de transcrição. Tal como aqui utilizado, o termo operacionalmente ligado refere-se ao primeiro polinucleotídeo, tal como um promotor, ligado a um segundo polinucleotídeo transcritível, tal como um gene de interesse, onde os polinucleotídeos estão dispostos de tal modo que o primeiro polinucleotídeo afeta a transcrição do segundo polinucleotídeo. Em algumas cocnretizações, as duas moléculas de polinucleotídeos são parte de um único polinucleotídeo contíguo. Noutras concretizações ou representações, os dois polinucleotídeos são adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a um gene de interesse se o promotor regula ou medeia a transcrição do gene de interesse numa célula. De modo semelhante, um terminador está operacionalmente ligado ao polinucleotídeo de interesse se o terminador regula ou medeia a transcrição do polinucleotídeo de interesse e, em particular, a terminação da transcrição. As construções da presente invenção conteriam tipicamente um promotor
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26/47 operacionalmente ligado a um polinucleotídeo transcritível operacionalmente ligado a um terminador.
[0049] O termo recombinante quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, organismo, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativo, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes podem expressar genes / polinucleotídeos que não são encontrados na forma nativa (não recombinante ou selvagem) da célula ou expressar genes nativos numa quantidade anormal - super expressa, sub expressa ou não expressa - em comparação com a célula ou organismo não recombinante ou de tipo selvagem. Em particular, pode-se alterar o DNA genômico de uma planta de tipo selvagem por técnicas de biologia molecular que são bem conhecidas dos peritos na arte e gerar uma planta recombinante.
[0050] Os termos transgênico, transformado, transformação e transfecção são semelhantes em significado a recombinante. Transformação, transgênico e transfecção referem-se à transferência de um polinucleotídeo para um organismo hospedeiro ou para uma célula. Tal transferência de polinucleotídeos pode resultar numa herança geneticamente estável dos polinucleotídeos ou na permanência extra cromossômica dos polinucleotídeos (não integrados no cromossoma da célula). A herança geneticamente estável pode potencialmente requerer que o organismo transgênico ou célula seja sujeito a um período de tempo em uma ou mais condições que requerem a transcrição de algum ou todos os polinucleotídeos transferido para que o organismo ou célula transgénica viva e / ou cresça. Os polinucleotídeos que são transformados numa célula, mas não estão integrados no cromossomo do hospedeiro permanecem como um vetor de expressão dentro da célula. Pode ser necessário crescer a célula sob certas condições de crescimento ou ambientais para que o vetor de expressão permaneça na célula ou nos descendentes desta célula. Além disso, para que a expressão ocorra, o organismo ou célula precise ser mantido sob certas condições. Os organismos ou células geneticamente alteradas contendo o polinucleotídeo
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27/47 recombinante podem ser referidos como organismos ou células transgênicos ou transformados ou simplesmente como transformantes, bem como organismos ou células recombinantes.
[0051] Um organismo geneticamente alterado é qualquer organismo com quaisquer alterações ao seu material genético, quer no núcleo quer no citoplasma (organela). Como tal, um organismo geneticamente modificado pode ser um organismo recombinante ou transformado. Um organismo geneticamente alterado pode também ser um organismo que foi sujeito a um ou mais agentes mutagênicos ou ser a progénie de um organismo que foi sujeito a um ou mais mutagênicos e tem mutações no seu DNA causadas por um ou mais mutagênicos, em comparação com o selvagem (ou seja, organismo não sujeito aos mutagênicos). Além disso, um organismo que foi criado para incorporar uma mutação em seu material genético é um organismo geneticamente alterado.
[0052] A transformação e regeneração de monocotiledôneas e dicotiledôneas alteradas geneticamente são amplamente exploradas no estado da arte. Ver, por exemplo, Weising, et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988); U.S. Patent 5,679,558; Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995); and Wang, etal. Acta Hort. 461:401-408 (1998). A escolha do método varia com o tipo de planta a ser transformada, o tipo de aplicação e /ou o resultado desejado. A técnica de transformação apropriada é prontamente escolhida por um praticante habilidoso.
[0053] O polinucleotídeo codificando a trehalase putativa (SEQ ID NO: 1) ou a porção dela, operacionalmente ligada a um ou dois promotores apropriados, pode ser estavelmente inserido de uma maneira convencional no genoma (genoma citoplasmático ou genoma nuclear) de uma célula individualizada, e a célula vegetal alterada geneticamente pode ser usada de forma convencional para produzir uma planta geneticamente alterada que produz o dsRNA desta invenção que pode reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri. Neste sentido, um plasmídeo-Ti desarmado, contendo o polinucleotídeo desta invenção, in Agrobacterium tumefaciens pode ser usada para alterar geneticamente uma célula vegetal, e em seguida, uma planta alterada geneticamente pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal geneticamente
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28/47 alterada utilizando procedimentos descritos na arte, por exemplo, em EP 0 116 718, EP 0 270 822, WO 84/02913 e EP 0 242 246. Regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados está descrito em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, in Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração pode ser também obtida a partir de calos, explantes, órgãos ou partes dele. Tais técnicas de regeneração estão descritas de maneira geral em Klee, et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).
[0054] O plasmídeo-Ti vetor escolhido contendo o polinucleotídeo codificando a trehalase ou uma porção da trehalase entre as sequências de borda, ou pelo menos a esquerda da sequência da borda direita, do T-DNA do plasmídeo-Ti. Obviamente, outros tipos de vetores podem ser utilizados para transformar uma célula vegetal, usando procedimentos tais como transferência direta de gene (como descrito, por exemplo em EP 0 233 247), transformação mediada por pólen (com descrito, por exemplo em EP 0 270 356, WO 85/01856, and USPN 4,684,611), transformação medida por vírus de RNA (como descrito, por exemplo em EP 0 067 553 e USPN 4,407,956), transformação medidada por lipossomo (como descrito, por exemplo em USPN 4,536,475), e outros métodos tais como os métodos de transformação de certas linhagens de milho (por exemplo, USPN 6,140,553; Fromm, et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990); GordonKamm, et al., The Plant Cell 2:603-618 (1990)) e rice (Shimamoto, et al., Nature 338:274-276 (1989); Datta etal., Bio/Technology8:736-740 (1990)). Para transformação de algodão, o método descrito em WO 00/71733 pode ser utilizado. Para transformação de soja, referências podem ser feitas para métodos conhecidos na arte, por exemplo, Hinchee, et al., Bio/Technology 6:915 (1988) e Christou, et al., Trends Biotechnology 8:145 (1990) ou o método de WO 00/42207.
[0055] A planta geneticamente alterada resultante pode ser utilizada no melhoramento convencional para produzir mais plantas alteradas geneticamente com as mesmas características ou para introduzir o polinucleotídeo codificador da trehalase em outras variedades da mesma espécie ou espécies correlacionadas. Sementes, que sejam obtidas a partir de plantas geneticamente alteradas, contém o dsRNA do gene da
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29/47 trehalase como um inseto genômico estável. Plantas contendo o dsRNA em acordo com esta invenção incluem plantas possuindo ou derivada de porta-enxertos de plantas contendo dsRNA do gene da trehalase desta invenção, por exemplo, árvores frutíferas e plantas ornamentais. Assim, qualquer planta tipo selvagem enxertada em uma planta alterada geneticamente ou uma parte da planta estão incluídas nesta invenção porque a atividade de RNAi é transportada para estas partes enxertadas, e qualquer inseto se alimentando na planta enxertada vai ser similarmente afetado pelo dsRNA ou siRNA desta invenção.
[0056] Para uma planta alterada geneticamente que produz o dsRNA, pode-se construir um vetor de expressão ou cassete (feito de DNA) que codifica, pelo menos, um promotor inicial e a sequência de dsRNA de interesse de modo que a sequência promotora está a 5' (a montante) do e operacionalmente ligado a sequência do dsRNA. O vetor de expressão ou cassete pode opcionalmente conter um segundo promotor (igual ou diferente do primeiro promotor) a montante e operacionalmente ligado a sequência complementar reversa da sequência do dsRNA de modo que as duas cadeias do RNA serão complementares entre si possam ser produzidas. Alternativamente, o vetor de expressão ou cassete pode conter um promotor operacionalmente ligado a ambas, a sequência do dsRNA (cadeia senso) em questão e a sequência complementar ou complementar reversa do dsRNA (cadeia antisenso) em questão, de modo que o RNA transcrito pode ser dobrado sobre ele mesmo e as duas sequências desejadas pode se anelar. Alternativamente, um segundo vetor de expressão ou cassete (feito de DNA) pode codificar, pelo menos, um segundo promotor (igual ou diferente do primeiro promotor) operacionalmente ligado a sequência complementar reversa do dsRNA de modo que que as duas cadeias de RNA complementares possam ser produzidas na planta. O(s) vetor(es) de expressão ou cassete(s) é/são inserido(s) no genoma da célula vegetal (nuclear ou citoplasmático). O(s) promotor(es) usado(s) pode(m) ser promotor(es) que é/são ativo(s) em planta. Obviamente, o vetor de expressão ou cassete pode ter outros elementos regulatórios da transcrição, como intensificadores, terminadores, etc.
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30/47 [0057] Promotores que são ativos em plantas são bem conhecidos na área. Tais promotores pode ser constitutivo, induzível e /ou tecido-específico. Exemplos não limitados de promotores de planta constitutivo inclui o promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV) (por exemplo, dos isolados CM 1841(Gardner, et al., Nucleic Acids Research 9:2871-2887 (1981)), CabbB-S (Franck, et al., Cell 21:285-294 (1980)) e CabbB-JI (Hull and Howell, Virology 86:482-493 (1987))), promotor da ubiquitina (e.g., promotor da ubiquina de milho de Christensen, et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)), promotor gos2 (de Pater, etal., The Plant J. 2:834-844 (1992)), promotor emu (Last, et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1990)), promotor da actina (ver, An, et al., The Plant J. 10:107 (1996)) e Zhang, et al., The Plant Cell 3:1155-1165 (1991)); promotores do Cassava vein mosaic virus (ver, e.g., WO 97/48819 e Verdaguer, et al., Plant Mol. Biol. 37:1055-1067 (1998)), a série promotores pPLEX do Subterranean Clover Stunt Virus (WO 96/06932, particularmente os promotores S4 or S7), promotor da álcool desidrogenasse (por exemplo, pAdh1S (número de acesso no GenBank X04049, X00581)), e o promotores TR1' e TR2' que direcionam a expressão dos genes 1' e 2', respectivamente, do T-DNA (Velten, etal., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)). Os promotores tecido-específico são promotores que dirigem um nível mais elevado de expressão transcricional em algumas células ou tecidos da planta do que em outras células ou tecidos. Exemplos não limitados de promotores tecido-específico incluem o promotor da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP ou PPC1) (Pathirana, et al., Plant J. 12:293-304 (1997), e Kausch, et al., Plant Mol. Biol. 45(1):1-15 (2001)), promotor da proteína de ligação na clofofila A/B (CAB) (Bansal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(8):3654-8 (1992)), promotor da pequena subunidade da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (ssRBCS) (Bansal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(8):3654-8 (1992)), promotor ativado de senescência (SEE1) (Robson, et al., Plant Biotechnol. J. 2(2):101-12 (2004)), e promotor específico do primórdio foliar do sorgo (RS2) (número de acesso no GenBank EI979305.1). Estes promotores (PPC1, CAB, ssRBCS, SSE1 e RS2) são todos ativos na parte aérea de uma planta. Além disso, o promotor PPC1 é um promotor forte para expressão em tecido vascular e é uma concretização potencialmente útil da presente invenção. Além disso, promotores específicos de floema derivados de citros podem ser utilizados
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31/47 para gerar plantas transgênicas para conduzir a expressão do dsRNA no floema. Alguns exemplos são o promotor da sacarose sintase (CsSUS1p e CsSUSp-2) (Singer etal., Planta 234:623-637 (2011)) e o promotor da proteína de floema-2 (CsPP2) (Miyata etal., Plant CellReport 31(11):2005-2013 (2012)) proveniente de Citrus sinensis. Alternativamente, um promotor expressível em plantas pode também ser um promotor induzível por ferimentos, tal como o promotor do gene da invertase de parede celular de ervilha (Zhang, et al., Plant Physiol. 112:1111-1117 (1996)).
[0058] Outros tipos de promotores de RNA polimerase que podem ser utilizados são promotores de microrganismos, tais como, mas não se limitando ao promotor da T7 RNA polimerase de bacteriófago, promotor da galactose de levedura (GAL1), promotor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de levedura (GAP), promotor da Álcool Oxidase de levedura (AOX).
[0059] Outros elementos que podem ser utilizados para aumentar a expressão da transcrição em células vegetais incluem, mas não estão limitados a, um intron (por exemplo, intron da hsp70) na extremidade 5 'ou extremidade 3' do gene quimérico, ou na sequência codificadora do gene quimérico do dsRNA (tal como, entre as regiões codificadoras da região senso e antisenso do dsRNA), elementos intensificadores do promotor, regiões promotoras duplicadas ou triplicadas, sequência sinal na extremidade 5 'diferente da sequência sinal do gene quimérico ou de gene endógeno (planta hospedeira), sequência 3 não traduzidas, diferentes do gene quimérico ou de gene endógeno (planta hospedeira).
[0060] O vetor de expressão ou cassete poderá conter sequências de regulação de transcrição não traduzida 3 ' adequadas (isto é, a formação de transcritos e sequências de poliadenilação). As sequências potenciais de poliadenilação e de transcrição incluem as sequências do gene da nopalina sintase (Depicker, et al., J. Molec. Appl. Genetics 1:561-573 (1982)), do gene da octopina sintase (Gielen, et al., EMBO J. 3:835-845 (1984)), o SCSV ou o terminador da enzima Malica (Schunmann, et al., Plant Functional Biology 30:453-460 (2003)), e a do gene 7 do T-DNA (Velten and Schell, Nucleic Acids Research 13:6981-6998 (1985)).
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32/47 [0061] Em outra concretização desta invenção, pode-se utilizar plantas infectadas com vírus de RNA ou vírus de DNA para produzir siRNAs relacionados com vírus nas células da planta. O dsRNA, tanto derivado de um intermediário da replicação ou de uma região do vírus de fita simples com característica de estrutura secundária, pode acumular-se a níveis elevados em células de plantas infectadas com vírus. No caso de vírus de planta com genoma de DNA, o dsRNA pode ser formado por anelamento dos transcritos complementares sobrepostos. Ver, Baulcombe (2004) Nature 431: 356-363. O silenciamento de genes induzido por vírus para genes de plantas (VIGS) oferece uma alternativa atraente a plantas geneticamente alteradas que produzem dsRNA, porque VIGS permite investigar a função do gene sem requerer transformação de plantas. Ver, por exemplo, Ruiz, et al. (1998) Plant Cell 10: 937-946; e Burch-Smith, et al. (2004) Plant Physiol. 142: 21-27. Os vírus vegetais recombinantes podem ser construídos para transportar uma sequência inserida parcial ou completa de um gene candidato (um polinucleotídeo heterólogo) operacionalmente ligado a um promotor viral. Tais vírus de plantas recombinantes podem infectar e mover-se sistematicamente em plantas, produzindo dsRNA (que são então processados em siRNA pelas células da planta) ou produzem RNA antisenso. O dsRNA e / ou siRNA ou RNA antisenso podem ser ingeridos por um inseto praga durante a sua alimentação, mediando a supressão dos transcritos de genes endógenos do inseto. Verificou-se que um VIGS derivado do Citrus tristeza virus (CTV) que expressa um fragmento do gene do disco de asa anormal (Abnormal wing disc, Awg) de D. citri induziu efeitos de RNAi em D. citri (Hajeri, et ai (2014) J. of Biotech 176: 42-49, doi: 10.1016 / j.jbiotec.2014.02.010). Os insetos que se desenvolveram em plantas de Citrus macrophylla infectadas com o CTV-Awd apresentaram menores níveis do mRNA correspondente, resultando em fenótipo de asa malformada em adultos e aumento da mortalidade de adultos. Numa abordagem semelhante, um CTV recombinante contendo SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14 e / ou o RNA equivalente de SEQ ID NO: 26 (como o gene candidato) ou o seu reverso complementar podem ser gerados utilizando genética reversa ou outras técnicas que são bem conhecidas no campo da arte. Os CTV recombinantes passam então a infectar e replicar em plantas cítricas, produzindo assim RNA contendo a sequência senso e
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33/47 antisenso do gene candidato que então formam o dsRNA. Quando D. citri se alimenta da planta infectada, D. citri ingerirá o dsRNA, causando a morte da D. citri. Ver, também, Patente U.S. Pub. 2013/0125254 Dawson et al.; e Patente U.S. Pub. 2015/0067918 Kress para obter mais informações sobre CTV VIGS. Ver, também, EP 2 730 657 A1 para informações adicionais sobre VIGS.
[0062] Atividade inseticida de um dsRNA, tal como aqui utilizado, refere-se à capacidade para reduzir o vigor e / ou sobrevivência de insetos quando os insetos ingerem ou se alimentam do dsRNA, tal redução no vigor e / ou sobrevivência é maior do que a nível de vigor e / ou sobrevivência de insetos que não estão expostos ao dsRNA. O controle de insetos de um dsRNA, tal como aqui utilizado, refere-se à capacidade de inibir o desenvolvimento de insetos, a fertilidade, a inibição da produção de feromônios ou o crescimento de tal forma que a população de insetos provoca menos danos a uma planta, produz menos descendentes, são menos vigorosos, mais susceptíveis a agentes patogênicos de insetos, ou são mais susceptíveis a ataque de predadores, ou são impedidos de se alimentar de tal planta, em comparação com a população de insetos que não é tratada ou a uma população de insetos que se alimentam numa planta não tratada.
[0063] O termo planta inclui plantas inteiras, órgãos de plantas, progênies de plantas inteiras ou órgãos de plantas, embriões, embriões somáticos, estruturas semelhantes a embriões e suspensões de células vegetais. Os órgãos vegeta is compreendem, por exemplo, os órgãos / estruturas vegetais (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos / estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), semente (incluindo embrião, endosperma e revestimento de sementes) e fruto (o ovário maduro), tecido vegetal (por exemplo, tecido vascular, tecido moído e semelhantes) e células (eg, células guarda, tricomas e semelhantes). A classe de plantas que podem ser utilizadas no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores passíveis de serem utilizadas nas técnicas de biologia molecular e de melhoramento de plantas aqui descritas, especificamente gimnospermas e angiospermas (monocotiledôneas (monocots) e plantas dicotiledôneas (dicots). Inclui plantas de uma variedade de níveis
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34/47 ploidia, incluindo aneuploidia, poliploidia, diploide, haploide e hemizigota. As plantas aqui descritas são plantas cítricas, tais como, mas não se limitando a, laranja, limão, lima, tangerina, lima persa e toranjas (grapefruit). As plantas também incluem cítricos e parentes próximos de plantas cítricas ou citron. Outras plantas nas quais D. citri se alimenta estão incluídas nesta invenção. Exemplos não limitados de tais outras plantas incluem Aegle marmelos, Aeglopsis chevalieri, Afraegle gabonensis, Afraeglepaniculata, Atalantia missionis, Atalantia monophylla, Balsamocitrus dawei, Citropsis gilletiana, Citropsis schweinfurthii, Clausena anisum-olens, Clausena excavate, Clausena indica, Clausena lansium, Eremocitrus glauca, Fortunella crassifolia, Fortunella margarita, Fortunella polyandra, Limonia acidissima, Merrillia caloxylon, Microcitrus australasica, Microcitronella, Murraya exotica, Murraya koenigii, Murraya paniculata, Naringi crenulata, Pamburus missionis, Poncirus trifoliate, Severinia buxifolia, Swinglea glutinosa, Toddalia asiatica, Triphasia trifolia, Vepris lanceolata, Zanthoxylum fagara.
[0064] Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para atingir os resultados benéficos ou prejudiciais desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações. Em termos de tratamento, uma quantidade eficaz é aquela quantidade suficiente para tornar a praga alvo não funcional devido a um efeito adverso causado sobre essa praga, incluindo, mas não limitado a, danos fisiológicos à praga; inibição ou modulação do crescimento de pragas; inibição ou modulação da reprodução de pragas; ou morte da praga. Em uma concretização da invenção, o inseto alvo ingere a solução contendo dsRNA que interrompe a produção de proteína(s) crítica(s) que é (são) necessárias para as funções de desenvolvimento, de alimentação e / ou de reprodução do inseto.
[0065] Os termos aproximadamente e cerca de referem-se a uma quantidade, nível, valor ou quantidade que varia tanto quanto 30% numa concretização, ou noutra concretização até 20%, e numa terceira concretização até 10% a uma quantidade, nível, valor ou montante de referência. Tal como aqui utilizado, a forma singular a, um, e o incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo uma bactéria inclui tanto uma única bactéria como uma pluralidade de bactérias.
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35/47 [0066] Muitas técnicas envolvendo biologia molecular aqui discutidas são bem conhecidas de um especialista na técnica e são descritas em, por exemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed. 2012, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 1994 -- atual, John Wiley & Sons; and Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1993). Salvo indicação em contrário, os termos técnicos são utilizados de acordo com a utilização convencional. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, Benjamin Lewin, Genes IX, Oxford University Press, 2007 (ISBN 0763740632); Krebs, etal. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0067] Tendo agora descrito genericamente a presente invenção, a mesma será melhor compreendida por referência a certos exemplos específicos e aos desenhos anexos, que estão aqui incluídos apenas para ilustrar adicionalmente a invenção e não se destinam a limitar o âmbito da invenção tal como definido pelas reivindicações. Os exemplos e desenhos descrevem pelo menos uma, mas não todas as formas de concretização das invenções reivindicadas. De fato, estas invenções podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e as concretizações descritas no relatório descritivo não devem ser interpretadas como limitadoras do escopo de proteção.
Exemplo 1 - Seleção das sequências e produção do dsRNA [0068] A sequência da trehalase de D. citrifoi obtida por meio da análise computacional automática a partir da sequência genômica de D. citri (NW_007377674.1), anotada usando o método de predição Gnomon. Evidências que corroboram incluem a similaridade com outras 16 proteínas, e 100% de cobertura da sequência genômica caracterizada pelo alinhamento de sequências de RNA (RNAseq), incluindo 5 amostras corroborando com todos os introns anotados. Todas as sequências anotadas como trehalase na biblioteca do transcriptoma foram selecionadas, alinhadas de modo a verificar possíveis erros de sequenciamento e, finalmente a sequência correta foi
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36/47 identificada. A sequência final foi submetida a outra rodada de análises comparativas, que incluiu: (1) sequenciamento e análise comparativa da sequência de nucleotídeos utilizando ferramentas de análise BLAST® (NCBI website, blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para confirmar que a sequência é da trehalase (1); (2) tradução in silico para encontrar provável sequência de aminoácidos da proteína trehalase; (3) seguido por análise comparativa da sequência de aminoácidos com sequências contidas em sites GenBank, Pfam e Prosite, utilizando várias ferramentas de análise de proteínas para confirmar a identidade da sequência. Esta análise também mostrou que a sequência de aminoácidos contém domínios funcionais associados a outras proteínas trehalase.
[0069] Com referência ao gene da trehalase de D. citri, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 14 são as cadeias senso da sequência de polinucleotídeos do RNA de cadeia dupla, projetadas como a cadeia capaz de hibridizar com o mRNA transcrito a partir do gene de trehalase de D. citri nas posições 168-605 (SEQ ID NO: 6), 809-1277 (SEQ ID NO: 1) e 1157-1886 (SEQ ID NO: 11). Os três dsRNAs longos concebidos foram produzidos utilizando o MEGAscript RNAi Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).
[0070] Com referência ao gene da proteína maternal exuperantia de D. citri, SEQ ID NO: 19 é a cadeia senso da sequência de polinucleotídeos do RNA de cadeia dupla, projetada como a cadeia capaz de hibridizar com o mRNA transcrito a partir do gene da proteína maternal exuperantia de D. citri nas posições 1-447 (SEQ ID NO: 16). O dsRNA longo concebido foi produzido utilizando o MEGAscript RNAi Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).
[0071] Com referência ao gene da proteína pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase (PCBD1) de D. citri, SEQ ID NO: 24 é a cadeia senso da sequência de polinucleotídeos do RNA de cadeia dupla, projetada como a cadeia capaz de hibridizar com o mRNA transcrito a partir do gene da pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase de D. citri nas posições 3-268 (SEQ ID NO: 21). O dsRNA longo concebido foi produzido utilizando o MEGAscript RNAi Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).
[0072] O cDNA que codifica a trehalase (SEQ ID NO: 26) foi sintetizado a partir do RNA total de D. citri extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Waltham, MA). Inicialmente, o
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37/47 cDNA foi reversamente transcrito a partir de 5 pg de RNA total utilizando o SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Waltham, MA), utilizando os hexâmeros aleatórios fornecidos pelo fabricante. A região que codifica os nucleotídeos 809-1277 da trehalase (SEQ ID NO: 1) foi amplificada por PCR combinando o cDNA, o iniciador 5' (SEQ ID NO: 2) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 3) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado para AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo os nucleotídeos 809-1277 de trehalase flanqueado pela sequência de reconhecimento da T7 RNA polimerase. A FIG. 1 mostra a sequência de SEQ ID NO: 1; as sequências de D. citri contidas no iniciador 5' (SEQ ID NO: 2) e no iniciador 3' (SEQ ID NO: 3) estão em negrito e sublinhadas. As sequências de T7 RNA polimerase presente nos iniciadores não estão presentes na FIG. 1. Este amplicon foi clonado no plasmídeo pCR™2.1-TOPO® utilizando o kit de clonagem TOPO® TA, Cat. N° K4500J10 (Invitrogen, Waltham, MA). O plasmídeo (daqui em diante denominado pACP-Tr_1) foi então transfectado para E. coli TOP 10 competente. Utilizando o cDNA da trehalase produzido acima, a região que codifica os nucleotídeos 168-605 da trehalase (SEQ ID NO: 6) foi amplificada por PCR combinando o cDNA, o iniciador 5' (SEQ ID NO: 7) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 8) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado para AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo os nucleotídeos 168-605 de trehalase flanqueado pela sequência de reconhecimento da T7 RNA polimerase. A FIG. 2 mostra a sequência de SEQ ID NO: 6; as sequências de D. citri contidas no iniciador 5' (SEQ ID NO: 7) e no iniciador 3' (SEQ ID NO: 8) estão em negrito e sublinhadas. As sequências de T7 RNA polimerase presente nos iniciadores não estão presentes na FIG. 2. Este amplicon foi clonado no plasmídeo pCR™2.1-TOPO® utilizando o kit de clonagem TOPO® TA, Cat. N° K4500J10 (Invitrogen, Waltham, MA). O plasmídeo (daqui em diante denominado pACP-Tr_2) foi então transfectado para E. coli TOP 10 competente. Utilizando também o cDNA da trehalase produzido acima, a região que codifica os nucleotídeos 1157-1886 da trehalase (SEQ ID NO: 11) foi amplificada por PCR combinando o cDNA, o iniciador 5' (SEQ ID NO: 12) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 13) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado para AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied
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Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo os nucleotídeos 168-605 de trehalase flanqueado pela sequência de reconhecimento da T7 RNA polimerase. A FIG. 3 mostra a sequência de SEQ ID NO: 11; as sequências de D. citri contidas no iniciador 5' (SEQ ID NO: 12) e no iniciador 3' (SEQ ID NO: 13) estão em negrito e sublinhadas. As sequências de T7 RNA polimerase presente nos iniciadores não estão presentes na FIG. 3. Este amplicon foi clonado no plasmídeo pCR™2.1 -TOPO® utilizando o kit de clonagem TOPO® TA, Cat. N° K4500J10 (Invitrogen, Waltham, MA). O plasmídeo (daqui em diante denominado pACP-Tr_3) foi então transfectado para E. coli TOP 10 competente.
[0073] Para a síntese de RNA de cadeia dupla, cada um dos polinucleotídeos de DNA que codificam a trehalase (nucleotídeos 809-1277, SEQ ID NO: 1, nucleotídeos 168-605, SEQ ID NO: 6 e nucleotídeos 1157-1886, SEQ ID NO: 11) foi sintetizado em reações separadas. Para este propósito, combinou-se o plasmídeo pACP-Tr_1 contendo nucleotídeos 809-1277 da trehalase (SEQ ID NO: 1) flanqueado por sequências de reconhecimento da T7 RNA polimerase foi combinado com o iniciador 5' (SEQ ID NO: 2) e os 3' (SEQ ID NO: 3), DNA polimerase, nucleotídeos e tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo nucleotídeos 809-1277 de trehalase flanqueada por sequências de reconhecimento pela T7 RNA polimerase. O plasmídeo pACP-Tr_2 contendo nucleotídeos 168-605 da trehalase (SEQ ID NO: 6) flanqueado por sequências de reconhecimento da T7 RNA polimerase foi combinado com o iniciador 5' (SEQ ID NO: 7) e os 3' (SEQ ID NO: 8), DNA polimerase, nucleotídeos e tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo nucleotídeos 168-605 de trehalase flanqueada por sequências de reconhecimento pela T7 RNA polimerase. O plasmídeo pACP-Tr_3 contendo nucleotídeos 1157-1886 da trehalase (SEQ ID NO: 11) flanqueado por sequências de reconhecimento da T7 RNA polimerase foi combinado com o iniciador 5' (SEQ ID NO: 12) e os 3' (SEQ ID NO: 13), DNA polimerase, nucleotídeos e tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo nucleotídeos 1157-1886 de trehalase flanqueada por
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39/47 sequências de reconhecimento pela T7 RNA polimerase. Cada um destes amplicons foi submetido a eletroforese para verificar a presença de uma única banda do tamanho correto. Cada amplicon foi purificado separadamente. Cada um dos amplicons foi purificado, foram combinados separadamente com a T7 RNA polimerase, os nucleotídeos e o tampão apropriado para o kit MEGAscript (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para produzir RNA de cadeia simples de sentido senso e antisenso tendo as sequências de SEQ ID NOs: 4 e 5 (nucleotídeos 809-1277 de trehalase); A sequências de SEQ ID NOs: 9 e 10 (nucleotídeos 168-605 de trehalase); E a sequências de SEQ ID NOs: 14 e 15 (nucleotídeos 1157-1886 de trehalase), respectivamente. Os RNA de cadeia simples sentido senso e antisenso foram então deixadas para se anelarem para produzir RNA de cadeia dupla. Cada conjunto de dsRNAs produzidos foi digerido com RNAse A e DNAse para remover RNA de cadeia simples e DNA, respectivamente, purificados e quantificados.
[0074] O cDNA que codifica a proteína maternal exuperantia (SEQ ID NO: 16) foi sintetizado a partir do RNA total de D. citri extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Waltham, MA). Inicialmente, o cDNA foi reversamente transcrito a partir de 5 pg de RNA total utilizando o SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Waltham, MA), utilizando os hexâmeros aleatórios fornecidos pelo fabricante. A região que codifica os nucleotídeos 1-447 da proteína maternal exuperantia (SEQ ID NO: 16) foi amplificada por PCR combinando o cDNA, o iniciador 5' (SEQ ID NO: 17) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 18) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado para AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo os nucleotídeos 1-447 da proteína maternal exuperantia flanqueado pela sequência de reconhecimento da T7 RNA polimerase. Este amplicon foi clonado no plasmídeo pCR™2.1-TOPO® utilizando o kit de clonagem TOPO® TA, Cat. N° K4500J10 (Invitrogen, Waltham, MA). O plasmídeo (daqui em diante denominado pACP-Exu_1) foi então transfectado para E. coli TOP 10 competente. Para a síntese de RNA de cadeia dupla, o polinucleotídeo de DNA que codifica os nucleotídeos 1-447 da proteína maternal exuperantia (SEQ ID NO: 16) foi sintetizado pela combinação do plasmídeo pACP-Exu_1 contendo nucleotídeos 1-447 da proteína maternal
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40/47 exuperantia (SEQ ID NO: 16) flanqueado por sequências de reconhecimento da T7 RNA polimerase foi combinado com o iniciador 5' (SEQ ID NO: 17) e o 3' (SEQ ID NO: 18), DNA polimerase, nucleotídeos e tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo nucleotídeos 1-447 da proteína maternal exuperantia flanqueada por sequências de reconhecimento pela T7 RNA polimerase. O amplicon gerado foi submetido a eletroforese para verificar a presença de uma única banda do tamanho correto, e então o amplicon foi purificado. O amplicon purificado foi combinado com a T7 RNA polimerase, os nucleotídeos e o tampão apropriado para o kit MEGAscript (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para produzir RNAs de cadeia simples de sentido senso e antisenso tendo as sequências de SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente. Os RNA de cadeia simples sentido senso e antisenso foram então deixadas para se anelarem para produzir RNA de cadeia dupla. O dsRNA produzido foi digerido com RNAse A e DNAse para remover RNA de cadeia simples e DNA, respectivamente, purificado e quantificado.
[0075] O cDNA que codifica a pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase (PCBD1) (SEQ ID NO: 21) foi sintetizado a partir do RNA total de D. citri extraído utilizando Trizol (Invitrogen, Waltham, MA). Inicialmente, o cDNA foi reversamente transcrito a partir de 5 pg de RNA total utilizando o SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Waltham, MA), utilizando os hexâmeros aleatórios fornecidos pelo fabricante. A região que codifica os nucleotídeos 3-268 do PCBD1 (SEQ ID NO: 21) foi amplificada por PCR combinando o cDNA, o iniciador 5' (SEQ ID NO: 22) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 23) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado para AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo os nucleotídeos 3-268 da PCBD1 flanqueado pela sequência de reconhecimento da T7 RNA polimerase. Este amplicon foi clonado no plasmídeo pCR™2.1-TOPO® utilizando o kit de clonagem TOPO® TA, Cat. N° K4500J10 (Invitrogen, Waltham, MA). O plasmídeo (daqui em diante denominado pACP-Pcd_1) foi então transfectado para E. coliTOP 10 competente. Para a síntese de RNA de cadeia dupla, o polinucleotídeo de DNA que codifica os nucleotídeos 3-268 da PCBD1 (SEQ ID NO: 21)
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41/47 foi sintetizado pela combinação do plasmídeo pACP-Pcd_1 contendo nucleotídeos 3-268 da PCBD1 (SEQ ID NO: 21) flanqueado por sequências de reconhecimento da T7 RNA polimerase foi combinado com o iniciador 5' (SEQ ID NO: 22) e o 3' (SEQ ID NO: 23), DNA polimerase, nucleotídeos e tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA) para gerar um amplicon contendo nucleotídeos 3-268 da PCBD1 flanqueada por sequências de reconhecimento pela T7 RNA polimerase. O amplicon gerado foi submetido a eletroforese para verificar a presença de uma única banda do tamanho correto, e então o amplicon foi purificado. O amplicon purificado foi combinado com a T7 RNA polimerase, os nucleotídeos e o tampão apropriado para o kit MEGAscript (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) para produzir RNAs de cadeia simples de sentido senso e antisenso tendo as sequências de SEQ ID NOs: 24 e 25, respectivamente. Os RNA de cadeia simples sentido senso e antisenso foram então deixadas para se anelarem para produzir RNA de cadeia dupla. O dsRNA produzido foi digerido com RNAse A e DNAse para remover RNA de cadeia simples e DNA, respectivamente, purificado e quantificado.
Exemplo 2 - Bioensaio de alimentação de RNAi de D. citri [0076] Em geral, o bioensaio de alimentação de RNAi utilizando brotações de plantas tem o seguinte protocolo. Em citros, brotações foliares novas foram coletados de mudas de citros cultivados em vasos em estufa para produzir pequenas estacas. As brotações têm cerca de 7-8 cm de comprimento. As brotações foram lavadas em solução de água sanitária a 0,2%, durante 10 min. Em seguida, a base da haste de cada brotação foi cortada com um ângulo de 45 graus enquanto submersa em água filtrada. Cada brotação foi então colocada em um microtubo de 1,5 mL contendo 0,5 mL de água. Uma solução de dsRNA (100 ng de dsRNA em 300 pL de água) foi adicionada à água de cada tubo e a parte superior do tubo foi coberta com plástico ou Parafilm™ (Bemis NA, Neenah, WI) e deixada sob luz artificial para estimular a absorção da solução de dsRNA. Após a brotação absorver a solução de dsRNA inteira (aproximadamente 8 horas), o tubo foi preenchido com água utilizando uma seringa e agulha. As brotações tratadas foram então colocadas individualmente em gaiolas e foram adicionados a cada gaiola
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42/47 aproximadamente 15 insetos adultos de D. citri (número real de insetos por gaiola em cada experimento variou de 13 a 18 insetos) para se alimentar na brotação tratada. A mortalidade dos adultos de D. citri foi medida diariamente por até 15 dias após o início do período de acesso à alimentação.
[0077] Utilizando este bioensaio de alimentação de RNAi, o dsRNA baseado em SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NOs: 4 e 5, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NOs: 9 e 10, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), e SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NOs: 14 e 15, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), foram avaliados quanto à sua capacidade para causar mortalidade em D. citri. Os tratamentos foram (1) brotação com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1; (2) brotação com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 6; (3) brotação com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 11; (4) controle negativo (brotações que receberam apenas água). Cada tratamento foi composto de três repetições (uma repetição significa uma gaiola contendo um corte e aproximadamente quinze adultos D. citri).
[0078] A mortalidade de insetos obtida após 15 dias de alimentação nas brotações tratadas e no controle, mostrou que o tratamento n ° 1 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1) causou uma mortalidade média de 95,92% dos insetos entre repetições (47 de 49 insetos adultos). Tratamento n ° 2 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 6) causou uma mortalidade média de 86,36% dos insetos entre repetições (38 de 44 insetos adultos). Tratamento n ° 3 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 11) causou uma mortalidade média de 55,56% dos insetos entre repetições (25 de 45 insetos adultos). Tratamento n ° 4 (controle negativo) causou uma mortalidade média de 6,67% dos insetos entre repetições (3 de 45 insetos adultos).
[0079] Utilizando este bioensaio de alimentação de RNAi, o dsRNA baseado em SEQ ID NO: 16 (SEQ ID NOs: 19 e 20, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), foi avaliada quanto à sua capacidade para causar mortalidade em D. citri. Os tratamentos foram (1) brotação com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 16; (2) controle negativo (brotações que receberam apenas água). Cada tratamento foi composto de três repetições. Neste experimento, cada brotação tratada tanto com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 16 quanto a do controle negativo, foi acondicionado com cerca de 12
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43/47 adultos de D. citri (número de D. citri por gaiola variou de 11 a 13 insetos). O tratamento n ° 1 foi representado por quatro repetições, e o tratamento n ° 2 foi representado por três repetições (uma repetição significa uma gaiola contendo uma brotação e cerca de doze adultos de D. citri).
[0080] A mortalidade de insetos obtida após 15 dias de alimentação nas brotações tratadas e no controle, mostrou que o tratamento n ° 1 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 16) causou uma mortalidade média de 16,08% dos insetos entre repetições (8 de 49 insetos adultos). Tratamento n ° 2 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 6) causou uma mortalidade média de 3,03% dos insetos entre repetições (1 de 34 insetos adultos).
[0081] Utilizando este bioensaio de alimentação de RNAi, o dsRNA baseado em SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NOs: 24 e 25, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), foi avaliada quanto à sua capacidade para causar mortalidade em D. citri. Os tratamentos foram (1) brotação com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 21; (2) controle negativo (brotações que receberam apenas água). Cada tratamento foi composto de três repetições. Neste experimento, cada brotação tratada tanto com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 21 quanto a do controle negativo, foi acondicionado com cerca de 12 adultos de D. citri (número de D. citri por gaiola variou de 11 a 13 insetos). O tratamento n ° 1 foi representado por quatro repetições, e o tratamento n ° 2 foi representado por três repetições (uma repetição significa uma gaiola contendo uma brotação e cerca de doze adultos de D. citri).
[0082] A mortalidade de insetos obtida após 15 dias de alimentação nas brotações tratadas e no controle, mostrou que o tratamento n ° 1 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 21) causou uma mortalidade média de 4,17% dos insetos entre repetições (2 de 48 insetos adultos). Tratamento n ° 2 (dsRNA baseado na SEQ ID NO: 6) causou uma mortalidade média de 2,08% dos insetos entre repetições (1 de 48 insetos adultos).
Exemplo 3 - Bioensaio de alimentação [0083] Mudas de laranjeira doce foram cultivadas em recipientes de plástico (recipientes de 2 galões) contendo terra e mantidas em estufa. Mudas de cerca de 30 cm de altura foram podadas, removendo todos os ramos, deixando apenas o tronco da
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44/47 muda. Quando a muda emitiu brotações novas, 20 fêmeas adultas D. citri foram enjauladas com cada muda, para ovipositar os ovos durante 48 horas. Os adultos foram então removidos e 10 pg de dsRNA de trehalase (baseado em SEQ ID NO: 1) foram misturados com 10 mL de água, e a solução de dsRNA foi vertida no solo do vaso das mudas. Após o tratamento, as mudas foram regadas conforme necessário. Três mudas de laranja doce foram tratadas com dsRNA baseado em SEQ ID NO: 1 (tratamento n°1) e três mudas de laranja doce receberam apenas 10 mL de água (tratamento n°2, controle negativo). As três mudas de cada tratamento foram colocadas juntas em uma gaiola criação “Bug Dorm 2, catálogo N° 1462W (BioQuip, Rancho Dominguez, CA). As plantas foram mantidas a 22 °C. O desenvolvimento de D. citrifoi monitorizado ao longo do tempo. Em todas as seis mudas, os ovos eclodiram, as ninfas desenvolveram-se com sucesso sem quaisquer problemas e não ocorreu mortalidade (como determinado pela ausência de ninfas mortas observadas no chão da gaiola), indicando assim que o dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1 não afetou negativamente a sobrevivência das ninfas. Cerca de trinta dias após o tratamento, as ninfas emergiram como adultos de D. citri. Quando os adultos de D. citri tinham aproximadamente 10 dias de idade, eles começaram a morrer e cair no fundo da gaiola. O número total de adultos de D. citri mortos foi contado aos 14 dias após a emergência dos adultos. O tratamento # 1 resultou na morte de 100% de adultos de D. citri neste ensaio (643 adultos D. citri mortos foram contados). Ao mesmo tempo, não foi observada mortalidade significativa para adultos de D. citri na gaiola de controlo negativo (Tratamento # 2).
[0084] O ciclo de vida de D. citri de ovo a adultos varia com a temperatura: a 25 °C os ovos eclodem em 4 dias e as ninfas desenvolvem-se até o estádio adulto em um período de 13 dias durante, num total de 17 dias de ovo a adulto (Tsai and Liu, J. Econ. Entomol. 93(6):1721-1725 (2000)). A média de desenvolvimento do ovo até o adulto varia de 49,3 dias a 15°C até 14.1 dias a 28°C (Liu and Tsai, Ann. Appl. Biol. 137: 201-206 (2000)). A 24 °C, os machos adultos vivem uma média de 21 a 25 dias, e as fêmeas vivem uma média de 31 a 32 dias (Nava, etal., J. Appl. Entomol. 131:709-715 (2007)). Estes parâmetros de vida mostram que as condições do experimento anterior não influenciaram negativamente o desenvolvimento das ninfas e que a mortalidade de adultos de D. citri
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45/47 que se alimentaram nas plantas tratadas com dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1 não foi causada por causas naturais, visto que os adultos de D. citri morreram quando eram adultos bastante jovens (10-14 dias de idade). Assim, o dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1 suprimiu a população de D. citri reduzindo a vigor e a sobrevivência do adulto de D. citri que se desenvolveu a partir de ninfas que se alimentavam em plantas tratadas. Este exemplo demonstra que a SEQ ID NO: 1 baseada em dsRNA, os nucleotídeos 809-1277 de trehalase, pode suprimir a população de D. citri matando os adultos de D. citri que se alimentam e / ou desenvolvem a partir de ninfas provenientes de plantas tratadas.
Exemplo 4 - Plantas cítricas geneticamente alteradas, ou plantas filogeneticamente relacionadas, que têm capacidade para reduzir o vigor e sobrevivência de D. citri que nelas se alimentam [0085] A geração de plantas cítricas transgênicas que expressam o dsRNA baseado na SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NOs: 4 e 5, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), é obtida utilizando o protocolo descrito em Oliveira, et al. (2015) SpringerPlus 4:264. Segmentos de epicótilo estiolado crescidos in vitro de laranjeira Hamlin [Citrus sinensis (L.) Osbeck.] é usado como fonte de explantes. As porções de epicótilo de mudas estioladas são cortadas transversalmente em segmentos de 0,8-1 cm e são utilizadas para transformação. Um método de transformação mediado por Agrobacterium é usado para transformar o tecido cítrico. O plasmídeo pCAP-Tr_1 é gerado pela inserção do amplicon correspondente à SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NOs: 4 e 5, cadeias de sentido senso e antisenso, respectivamente), no pCambia2300. O plasmídeo é transformado em A. tumefaciens EHA 105 (Hood, etal. (1986) J. Bac. 168:1291-1301) utilizando o utilizando o método de congelar-descongelar (Hofgen and Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877). O tecido epicótilo de laranja doce 'Hamlin' é inoculado durante 15 minutos com uma cultura de Agrobacterium crescida durante a noite e diluída a OD600 = 0,4. O tecido epicótilo é co-cultivado por 3 dias em meio MS básico contendo 3% de sacarose, 1 mg L-1 de BAP, 100 mg L-1 de acetosyringona, 8.0 g L-1 de agar e incubado em uma temperatura média de 24 ± 1°C no escuro. Após 3 dias de co-cultivo, os explantes são transferidos para meio MS contendo 300 mg L-1 de timentina, 250 mg L-1 de cefotaxima
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46/47 e 100 mg L-1 de kanamicina. Após 45 dias de cultura em meios de seleção de kanamicina, os potenciais brotos transformados são transferidos para um meio de indução de raízes (RIM), consistindo em 1% do meio MS, sacarose a 2%, Gelrita a 0,25%, IBA a 2,5 mg L-1, 0,5 mg L-1 de NAA e 0,0025 mg de L-1 de espermidina. As plantas que desenvolvam sistemas radiculares são transferidas para tubetes com solo estéril, cobertas com sacos plástico e gradualmente expostas à humidade ambiente numa câmara de crescimento, durante um período de 15 dias. As plantas aclimatadas são transferidas para casa de vegetação para maturação. Para confirmar que a planta contém o transgene (SEQ ID NO: 1), o DNA genômico é extraído utilizando PureLink® Genomic Plant DNA Purification Kit, Cat. N° K1830-01 (Invitrogen, Waltham, MA), e utilizado como molde em reação de PCR, utilizando o iniciador 5 '(SEQ ID NO: 2) e o iniciador 3' (SEQ ID NO: 3) com DNA polimerase, nucleotídeos e o tampão apropriado por AmpliTaq Gold® 360 Master Mix, Cat. N° 4398881 (Applied Biosystems, Waltham, MA). O produto amplificado por PCR é separado em gel de agarose a 1,2% e visualizado por coloração com brometo de etídio.
Exemplo 5 - Bioensaio alimentação de RNAi para os potenciais efeitos deletérios em insetos benéficos não-alvo [0086] As abelhas (Apis mellifera) são insetos benéficos para as árvores de citros, atuando como polinizadores. As abelhas também se alimentam do néctar e do pólen da planta e, por isso, podem ingerir o dsRNA da trehalase (baseado na SEQ ID NO: 1) de uma árvore de citros tratada. Para avaliar a ausência de efeitos nocivos do dsRNA da trehalase (baseado na SEQ ID NO: 1) para um inseto não alvo, i.e., abelhas melíferas, foi realizado um bioensaio de alimentação. Um quadro com uma ninhada madura selada foi retirado da colônia e mantido durante a noite a 33 °C dentro da caixa de quadros de emergência. Um grupo de 30 abelhas recém-emergidas foram alimentadas manualmente com 5 pL de uma solução de dsRNA: sacarose 1: 1 contendo 10 ng de dsRNA de trehalase baseado em SEQ ID NO: 1 (tratamento # 1). Um segundo grupo de 30 abelhas recém-emergidas foram alimentadas manualmente com 5 pL de uma solução de água: sacarose 1: 1 (tratamento # 2, controle negativo). As abelhas de cada tratamento foram marcadas com tinta (as abelhas de cada tratamento foram pintadas
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47/47 com uma cor diferente) e colocadas todas juntas na mesma colmeia. Após 10 dias, as abelhas foram recolhidas utilizando um micro aspirador e o número de abelhas marcadas recuperadas foi contado. A percentagem de insetos do tratamento # 1 recuperados após 10 dias foi de 73% (22 recuperados do total de 30 tratados). A percentagem de insetos do tratamento # 2 recuperados após 10 dias foi de 70% (21 recuperados do total de 30 tratados). Adicionalmente, as abelhas recuperadas de cada tratamento foram analisadas individualmente para alterações significativas nos níveis de expressão de alguns mRNAs utilizando o protocolo RT-qPCR estabelecido por Evans (2006) (J. Invert. Path. 93:135-139). Os níveis de mRNA dos seguintes genes foram analisados: vitelogenina (Sequência de referência no NCBI: NM_001011578.1), eater (também conhecida como nimrodC1) (Sequência de referência no NCBI:
XM_006561053.1), hymenoptaecina (Sequência de referência no NCBI: NM_001011615.1) e arginine kinase (Sequência de referência no NCBI:
NM_001011603). O gene da proteína ribossomal 5 (Sequência de referência no NCBI: XM_006567834.1) foi utilizada como gene de referência. Pares de iniciadores para cada um destes genes foram desenhados utilizado o programa Primer 3 (bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). A análise comparativa dos níveis de mRNA de cada gene de abelhas individuais do tratamento # 1 e tratamento # 2 não foram significativamente diferentes por análise de ANOVA unilateral. Assim, a SEQ ID NO: 1 baseada no dsRNA, nucleotídeos 809-1277 de trehalase, não produziu um efeito nocivo quando ingerida por abelhas.
[0087] A descrição detalhada acima e certas formas de concretização representativas e detalhes da invenção foram apresentados para fins de ilustração e descrição da invenção. Não se pretende que seja exaustivo ou que limite a invenção às formas precisas reveladas. Será evidente para os especialistas na técnica que podem ser feitas modificações e variações no mesmo sem se afastar do âmbito da invenção.

Claims (42)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um dsRNA caracterizado por compreender uma região senso que contém entre aproximadamente dezesseis nucleotídeos e 1908 nucleotídeos e uma região antisenso complementar à referida região senso, em que a referida região antisenso é também complementar ao cDNA de trehalase de D. citri ou um fragmento do dito cDNA da trehalase de D. citri.
  2. 2. O dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido cDNA da trehalase de D. citri ser selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 26 e um cDNA que codifica a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e em que o referido fragmento de cDNA da trehalase de D. citri é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 11.
  3. 3. O dsRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida região senso ter uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14 e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente a SEQ ID NO: 26.
  4. 4. Uma solução de dsRNA compreendendo um veículo aceitável na agricultura e o dsRNA de trehalase de D. citri, caracterizado pela cadeia do referido dsRNA de trehalase de D. citri ter uma sequência selecionada do grupo consistindo de entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14, entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente de SEQ ID NO: 26, e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  5. 5. Solução de dsRNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo referido veículo aceitável na agricultura ser selecionado a partir de um grupo que consiste em água, surfactante, lipossoma, lipídeo, proteína, peptídeo, nanotubo, nanoesfera, microesfera, quitina, microrganismo inativado e/ou uma combinação destes.
  6. 6. Solução de dsRNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela referida solução de dsRNA compreender adicionalmente um composto que evita a
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    2/8 degradação do dsRNA, um produto químico translaminar, um mineral, uma argila, um adubo, um açúcar e/ou uma combinação destes.
  7. 7. Método para reduzir a infestação de Diaphorina citri numa planta tratada em comparação com a infestação de D. citri numa planta não tratada, caracterizado por compreender a administração de uma solução de dsRNA a uma planta não tratada numa quantidade eficaz para reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri para gerar uma planta tratada, e ingestão ou absorção pela D. citri da referida solução de dsRNA, copmpreendendo a referida solução de dsRNA um veículo aceitável na agricultura e o dsRNA da trehalase de D. citri, em que o referido dsRNA da trehalase de D. citri possui atividade inseticida contra D. Citri.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo referido dsRNA da trehalase de D. citri compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14, entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo veículo aceitável na agricultura ser selecionado a partir do grupo que consiste em água, surfactante, lipossoma, lipídeo, proteína, peptídeo, nanotubo, nanoesfera, microesfera, quitina, microrganismo inativado e/ou uma combinação destes.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida solução de dsRNA compreender ainda um composto que evita a degradação do dsRNA, um produto químico translaminar, um mineral, uma argila, um fertilizante, um açúcar ou uma combinação destes.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida etapa de administração compreender a pulverização da referida solução de dsRNA sobre a referida planta não tratada para gerar a referida planta tratada.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida etapa de administração compreender a aplicação da referida solução de dsRNA ao solo que
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    3/8 circunda a referida planta não tratada para permitir que as raízes da referida planta não tratada absorvam o dsRNA de D. citri e gerem a referida planta tratada.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida etapa de administração compreender a aplicação da referida solução de dsRNA a uma ou mais raízes da referida planta não tratada para gerar a referida planta tratada.
  14. 14. Método para reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri que se alimenta de uma planta alterada tendo a capacidade de reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri, o referido método caracterizado por compreender as etapas de introdução de um dsRNA de trehalase de D. citri numa planta de tipo selvagem da qual D. citri se alimenta; produção da referida planta alterada com a característica de reduzir o vigor ou sobrevivência de D. citri; e ingestão pela D. citri a referida planta alterada e do referido dsRNA da trehalase de D. citri.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo referido dsRNA de trehalase de D. citri compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14, entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela etapa de introdução do dsRNA da trehalase de D. citri na referida planta de tipo selvagem compreender a pulverização de uma solução de dsRNA compreendendo o referido dsRNA da trehalase de D. citri sobre a referida planta de tipo selvagem.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela etapa de introdução do referido dsRNA da trehalase de D. citri na referida planta de tipo selvagem compreender a aplicação de uma solução de dsRNA compreendendo o referido dsRNA da trehalase de D. citri nas raízes da referida planta de tipo selvagem.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela etapa de introdução do referido da trehalase de D. citri na referida planta de tipo selvagem compreender a aplicação de uma solução de dsRNA compreendendo o referido da trehalase de D. citri ao solo em torno da referida planta de tipo selvagem de modo que as raízes da
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    4/8 referida planta de tipo selvagem possam absorver o referido dsRNA da trehalase de D. citri.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela referida etapa de introdução de um dsRNA da trehalase de D. citri numa planta de tipo selvagem compreender a transformação de uma célula vegetal de tipo selvagem com um vetor de expressão codificando o dsRNA da trehalase de D. citri para produzir uma célula vegetal alterada; permitindo que a referida célula vegetal alterada cresça de forma a produzir a referida planta alterada; e permitindo que o referido vetor de expressão produza o referido dsRNA da trehalase de D. citri; e que o referido vetor de expressão compreende pelo menos um promotor heterólogo ligado operacionalmente a um polinucleotídeo compreendendo uma região senso e uma região antisenso, em que a referida região senso tem uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11, entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente ao cDNA codificando a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29; e em que a referida região antisenso tem uma sequência complementar a referida sequência da região senso.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo promotor controlar a transcrição da referida região senso e da referida região antisenso.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender um promotor controlador da transcrição da referida região senso e um segundo promotor controlador da transcrição da referida região antisenso.
  22. 22. Método para reduzir a transmissão por D. citri de um microrganismo causador de doença de uma planta tratada para uma planta não tratada, caracterizado por compreender as etapas de aplicação de uma solução de dsRNA a uma planta de tipo selvagem para produzir a referida planta tratada; ingestão pela D. citri da referida planta tratada, em que a referida solução de dsRNA compreende um veículo aceitável na agricultura e um dsRNA da trehalase de D. citri, e em que o referido dsRNA da
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    5/8 trehalase de D. citri possua ação letal para D. citri que ingira ou absorva o dsRNA da trehalase de D. citri.
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo referido dsRNA da trehalase de D. citri compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14, entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt do RNA equivalente a um cDNA codificando a trehalase de D. citri possuindo sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  24. 24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela dita aplicação da referida solução de dsRNA à referida planta de tipo selvagem compreender a pulverização da referida solução de dsRNA sobre a referida planta de tipo selvagem.
  25. 25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela aplicação da referida solução de dsRNA à referida planta de tipo selvagem compreender a aplicação da referida solução de dsRNA às raízes da referida planta de tipo selvagem.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela aplicação da referida solução de dsRNA à referida planta de tipo selvagem compreender a aplicação da referida solução de dsRNA ao solo em torno da referida planta de tipo selvagem de modo que as raízes da referida planta de tipo selvagem possam absorver o referido dsRNA da trehalase de D. citri.
  27. 27. Planta geneticamente alterada e suas partes caracterizada por compreender um vetor de expressão que contenha um primeiro promotor operativamente ligado a um polinucleotídeo de sentido senso da trehalase de D. citri e um segundo promotor operativamente ligado a um polinucleotídeo de sentido antisenso da trehalase de D. citri, em que o referido polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e o referido polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri são complementares entre si.
  28. 28. Planta geneticamente alterada e suas partes de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo referido polinucleotídeo sentido senso da trehalase de D. citri possuir uma sequência selecionada do grupo consistindo e entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11, entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt de um cDNA
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    6/8 que codifica para a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  29. 29. Planta geneticamente alterada e suas partes de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo referido primeiro promotor e o referido segundo promotor serem os mesmos promotores.
  30. 30. Planta geneticamente alterada e suas partes de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo referido primeiro promotor e o referido segundo promotor serem promotores diferentes.
  31. 31. Planta geneticamente alterada e suas partes compreendendo um vetor de expressão caracterizada por compreender um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo possuindo uma região senso da trehalase de D. citri e uma região antisenso da trehalase de D. citri, em que a referida região antisenso da trehalase de D. citri é complementar da referida região senso da trehalase de D. citri.
  32. 32. Planta geneticamente alterada e suas partes de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pela referida região senso da trehalase de D. citri ter uma sequência selecionada do grupo que consiste entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11, entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt de um cDNA que codifica a trehalase de D. citri tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  33. 33. Método para fazer uma planta geneticamente alterada que produza dsRNA da trehalase de D. citri, caracterizado por compreender as etapas de transformação de uma célula de planta do tipo selvagem com um vetor de expressão produzindo dsRNA da trehalase de D. citri para gerar uma célula de planta geneticamente alterada que pode produzir o dito dsRNA da trehalase de D. citri, e obtenção da referida célula de planta geneticamente alterada para produção da referida planta geneticamente alterada.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo referido vetor de expressão para produção do dsRNA da trehalase de D. citri compreender um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo possuindo uma região senso da trehalase de D. citri e uma região antisenso da trehalase de D. citri, em que
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    7/8 a referida região antisenso da trehalase de D. citri é complementar da referida região senso da trehalase de D. citri, e em que a referida região senso de trehalase de D. citri possui uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11, entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt de um cDNA codificando a trehalase de D. Citri possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo referido vetor de expressão para produção do dsRNA da trehalase de D. citri compreender um primeiro promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo sentido senso da trehalase de D. citri e um segundo promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri, e que o referido polinucleotídeo senso da trehalase de D. citri e o referido polinucleotídeo antisenso da trehalase de D. citri são complementares entre si, e que a referida região senso de trehalase de D. citri tem uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1, entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11, entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26 e entre 16 nt e 1908 nt de um cDNA codificando a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  36. 36. Planta geneticamente alterada capaz de produzir o dsRNA de trehalase de D. citri caracterizada por ser produzida pelo método da Reivindicação 33.
  37. 37. Célula de planta geneticamente alterada da dita planta geneticamente alterada, caracterizada por ser produzida pela Reivindicação 33.
  38. 38. Um cDNA isolado caracterizado por codificar a trehalase de D. citri possuindo a sequência de SEQ ID NO: 26.
  39. 39. Vetor de expressão caracterizado por compreender um promotor heterólogo ligado operacionalmente ao DNA que codifica a trehalase de D. citri possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
  40. 40. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela referida introdução de um dsRNA da trehalase de D. citri numa planta de tipo selvagem compreender a infecção da referida planta de tipo selvagem com um vírus de planta recombinante
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    8/8 para formar a referida planta alterada, em que o referido vírus de planta recombinante compreende um polinucleotídeo heterólogo operativamente ligado a um promotor viral, em que o referido polinucleotídeo heterólogo codifica a trehalase de D. citri ou um fragmento seu, e em que o referido vírus recombinante produz o dsRNA da trehalase de D. citri ou um fragmento de dsRNA da trehalase de D. citri enquanto se replica na referida planta alterada.
  41. 41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que quando o referido vírus de planta recombinante é um vírus de DNA, o referido polinucleotídeo heterólogo tem uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 1 entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 6, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 11 e entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que quando o referido vírus de planta recombinante é um vírus de RNA, o referido polinucleotídeo heterólogo tem uma sequência selecionada do grupo consistindo entre 16 nt e 469 nt de SEQ ID NO: 4 entre 16 nt e 438 nt de SEQ ID NO: 9, entre 16 nt e 730 nt de SEQ ID NO: 14, o RNA equivalente de entre 16 nt e 1908 nt de SEQ ID NO: 26, e o seu complemento inverso.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022006764A1 (zh) * 2020-07-08 2022-01-13 赣南师范大学 柑橘木虱几丁质结合蛋白Chitinase-like EN03及其编码基因和应用
CN113564186B (zh) * 2021-07-16 2023-07-25 山西大学 苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用
CN116769819B (zh) * 2023-05-11 2024-01-02 广东省农业科学院果树研究所 柑橘CsWRKY40基因在驱避柑橘木虱中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
AUPR621501A0 (en) 2001-07-06 2001-08-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of ds rna
ES2444001T3 (es) 2004-10-21 2014-02-21 Venganza Inc. Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas
CA2610644A1 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Devgen Nv Rnai for control of insects and arachnids
PT2275562E (pt) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen Nv Métodos com base em plantas transgénicas para infestações em plantas utilizando arn de interferência¿
US7968525B1 (en) 2007-12-03 2011-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of RNA interference to validate new termiticide target sites and a method of termite control
US20100257634A1 (en) 2009-04-03 2010-10-07 Venganza Inc. Bioassay for gene silencing constructs
EP2483410A4 (en) 2009-09-29 2013-08-28 Temasek Life Sciences Lab Ltd PEST CONTROL IN PLANTS
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
US8575328B2 (en) 2010-12-14 2013-11-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Formicidae (ant) control using double-stranded RNA constructs
CN105939599B (zh) 2011-09-21 2019-10-18 佛罗里达大学研究基金会有限公司 使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达
WO2015031130A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Southern Gardens Citrus Citrus plants resistant to citrus huanglongbing (ex greening) caused by candidatus liberibacter asiaticus (las) and bacterial canker caused by (xanthomonas axonopodis pv. citri) (xac)

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