BRPI0814440A2

BRPI0814440A2 - Uso de proteínas de ruptura de membrana exterior de bacteriófago expressas em plantas para o controle de bactérias gram-negativas

Info

Publication number: BRPI0814440A2
Application number: BRPI0814440-0A
Authority: BR
Inventors: Joseph D Reddy; Dean W Gabriel
Original assignee: Integrated Plant Genetics Inc; Univ Florida
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2008-07-21
Publication date: 2014-08-19
Also published as: CN101952300A; CN101952300B; WO2009012481A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE PROTEÍNAS DE RUPTURA DE MEMBRANA EXTERIOR DE BACTERIÓFAGO EXPRESSAS EM PLANTAS PARA O CONTROLE DE BACTÉRIAS GRAM-NEG ATIV AS".

Referência-Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados

O presente pedido de patente reivindica o benefício de pedido de patente provisório 60/950 749, depositado em 19 de julho de 2007, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Descrição do Arquivo Texto Submetido Eletronicamente Os conteúdos do depósito texto submetido eletronicamente com

o mesmo são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Uma cópia formato legível em computador da Listagem de Seqüências (nome de arquivo: INTE 004 01WO SeqList_ST25, data anotada: 21 de julho de 2008, tamanho de arquivo 5 kilobytes).

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a processos para matar ou suprimir crescimento de bactérias Gram - negativas que infectam, infestam ou causam doença em plantas, incluindo micróbios patogênicos, saprofíticos e oportunísticos que causam doenças em plantas e doenças transportadas por alimentos em pessoas ou em alimentação animal.

Antecedentes da Invenção

Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

A descrição que se segue inclui informação que pode ser útil no entendimento da presente invenção. Ela não é uma admissão de que qualquer uma das informações aqui providas é técnica anterior ou relevante para as invenções presentemente reivindicadas, ou que qualquer publicação específica ou implicitamente referida seja técnica anterior.

Plantas crescidas para propósitos de agricultura comercial são quase sempre plantadas como monoculturas uniformes; ou seja, variedades

i simples de uma dada colheita são produzidas em massa através de propagação vegetativa ou através de semente e são plantadas em uma escala muito grande. Quando surge um patógeno ou peste que pode superar a resistência natural à peste ou doença de uma dada variedade, severas perdas 5 econômicas podem ocorrer devido à prática de monocultura, algumas vezes envolvendo perda de inteira colheita em uma dada área. Controle de doenças e pestes usando massivas aplicações de compostos químicos de agricultura é caro, ambientalmente insalubre e frequentemente impossível. Por exemplo, doença de cancro de citrus, causada por um patógeno bacteriano 10 Gram - negativo de quarentena, Xanthomonas citri, espalhou-se descontroIadamente por toda Flórida. Como um segundo exemplo, o patógeno bacteriano Gram - negativo Ca. Liberibacter asiaticus é um agente selecionado USDA (potencial agente bio-terrorista;

http://www.aphis.usda.gov/proqrams/aq selecaqent/aq toxinslis.html) que foi 15 introduzido na Flórida em 2005 e espalhou-se descontrolavelmente por toda Flórida. Este patógeno ameaça a produção mundial de citrus. Como um terceiro exemplo, o patógeno bacteriano Gram- negativo Ralstonia solanacearum Race 3 Biovar 2 foi introduzido nos U.S. numerosas vezes e é uma tal ameaça batatas de U.S. que também é listado um agente selecionado US20 DA. Este patógeno foi introduzido nos U.S. através de infecção de plantas gerânio, mas assintomaticamente, de modo que detecção do patógeno é retardada.

Como um quarto e último exemplo, sérias doenças humanas e mesmo mortes foram reportadas devido à bactéria Gram - negativa Escheri25 chia coli, que é capaz de infectar internamente — não só contaminando — certas colheitas de plantas como espinafre, brotos de alfafa e brotos de feijão mung. Vários surtos de Salmonella e E. coli 0157:H7 associados com brotos crescidos organicamente e alface mesclun foram reportados (Doyle, M.P. 2000. Nutrition 16:647-9). De acordo com a FDA em seu relatório na 30 web do surto de 2006 de E. coli em espinafre contaminado (http://www.cfsan.fda.gov/~dms/spinacqa.htmn: "Até agora, 204 casos de doença devido à infecção com E.coli 0157.H7 foram reportados para o CDC incluindo 31 casos envolvendo um tipo de insuficiência renal chamada síndrome urêmica hemolítica (HUS)1 104 hospitalizações, e três mortes. A primeira morte foi uma mulher idosa em Wisconsin; a segunda morte, de idade de dois anos em Idaho; e a terceira morte uma mulher idosa no Nebraska". 5 Cultivo convencional de plantas para controlar tais doenças de plantas ou contaminação transportada por alimento provou ser impossível. Por isso há uma necessidade urgente e pressionando, de técnicas de enegenharia genética para prover plantas, incluindo plantas carreadoras como gerânios, com resistência à doença e peste contra doenças e pestes a que elas são 10 suscetíveis ou tolerantes.

Uma ampla variedade de proteínas antibacterianas e antifungos foi identificada e seus genes isolados de ambos, animais e plantas. Devido às principais diferenças nas estruturas de paredes de células de fungos, bactérias Gram - positivas e bactérias Gram - negativas, muitas destas pro15 teínas atacam somente fungos ou bactérias Gram - positivas, que têm paredes de células que são diretamente expostas ao ambiente. Bactérias Gram negativas não têm paredes de células que são expostas diretamente ao ambiente. Ao invés, suas paredes de células são envelopadas e protegidas por uma única estrutura de membrana exterior, a barreira de lipolissacarídeo 20 (LPS), que provê uma barreira adicional muito eficaz para proteger suas paredes de células contra maior parte de defesas eucarióticas, particularmente defesas de plantas. A grande maioria dos patógenos listados pela USDA como Agentes Selecionados são patógenos bacterianos, e todos estes são Gram negativos.

O LPS provê uma defesa eficaz para bactérias Gram-negativas

contra enzimas produzidas externamente que podem efetivamente degradar a parede de célula bacteriana (também chamada a camada mureína), incluindo as paredes de células relativamente espessas, mas expostas de bactérias Gram - positivas e fungos. Por exemplo, Iisozimas são agentes antimi30 crobianos encontrados em células mamíferas, insetos, plantas, bactérias e vírus que rompem paredes de células bacterianas e de fungos, especificamente clivando ligações entre os amino açúcares dos muropeptídeos recorrentes (C-1 de ácido N-acetil murâmico e C-4 de N-acetil glicosamina de paredes de células microbianas (Ibrahim et al. 2001 e referências ali). Algumas Iisozimas também são proteínas pleiotropicamente líticas, significando que elas são ativas na eliminação de bactérias Gram - negativas e Gram - posi5 tivas, mas esta atividade não é devida a ação enzimática de lisozima, mas especificamente devida a um fragmento de peptídeo linear, curto, que é um produto de degradação de algumas lisozimas; é o produto de degradação linear da lisozima que penetra a barreira LPC e a parede de célula (mas sem danificar qualquer uma), atingindo a membrana interna e permabilizando a 10 membrana interna, resultando em Iise (During et al., 1999; Ibrahim et al. 2001). Entretanto, esta atividade de peptídeo linear não funciona b (ver abaixo).

Aquelas proteínas antimicrobianas demonstradas eliminarem bactérias Gram - negativas são principalmente peptídeos pequenos (proteínas de menos que 50 aminoácidos em comprimento) que são anfipáticos e carregados positivamente, de modo que eles são atraídos para a membrana externa de Gram negativa carregada negativamente, são pequenos o suficiente para penetrarem o LPS exposto, e também a parede de célula Gram negativa relativamente fina. Estas partículas usualmente atuam para permeabilizar a membrana interna, causando diretamente morte de célula. Durante as últimas duas décadas, acima de 500 peptídeos antimicrobianos foram descobertos em vírus, insetos plantas e animais (Jaynes et al., 1987; Mitra e Zhang, 1994; Broekaert et al. 1997; Nakajima et al., 1997; Vunnam et al., 1997). O melhor descrito destes peptídeos tendo atividade de amplo espectro no organismo fonte e em meios artificiais contra vírus, bactérias, fungos, parasitas e mesmo células de tumor (Hancock and Lehrer, 1998).

De longe o maior grupo descrito destes peptídeos antimicrobianos é linear (por exemplo, cecropinas, atacinas e magaininas). Entretanto, peptídeos lineares não são encontrados naturalmente em plantas e maior 30 parte de peptídeos lineares são rapidamente degradados por proteases de plantas. Por exemplo, cecropina B é rapidamente degradada quando incubada com fluido intercelular de planta, com uma meia-vida variando de cerca de três minutos em batatas a cerca de 25 horas em arroz (Owens & Heutte, 1997). Plantas transgênicas de tabaco expressando cecropinas têm resistência somente levemente aumentada Pseudomonas syringae pv. Tabaci (Gram - negativa), a causa de fogo selvagem de tabaco (Huang et al.,m 5 1997). Análogos sintéticos de cecropina Shiva-1 e SB-37, expressos de transgenes em plantas de batata, reduziram somente levemente infecção bacteriana causada por Erwinia carotovora (Gram - negativa) (Arce et al. 1999). Maçã transgênica expressando o peptídeo SB-37 mostrou resistência somente levemente aumentada a E. amylovora (Gram - negativa) em testes 10 de campo (Norelli et al., 1998). Similarmente, batatas transgênicas expressando atacina mostraram resistência à infecção bacteriana por E. carotovora (Arce et al., 1999) e pera e maçã transgênicas expressando genes atacina também mostraram resistência levemente aperfeiçoada a E. amylovora (Norelli et al., 1994; Reynoird et al., 1999). Atacina E também foi verificada ser 15 rapidamente degradada por plantas (Ko et al., 2000). Plantas transgênicas de tabaco expressando um análogo sintético de magainina que foi modificado para ser menos sensível a proteases extracelulares de plantas foram somente levemente resistentes ao patógeno bacteriano E. carotovora (Li et al., 2001).

Os peptídeos ligados por dissulfeto (por exemplo, defensinas,

profeninas e taumatinas) mostram mais promessa de estabilidade quando expressos em plantas, mas resistência foi fraca, não demonstrada ou surgiram questões de citotoxidez. Genes de lisozima de clara de ovo de galinha (com habilidade lítica) foram usados para conferirem fraca resistência à do25 ença bacteriana Gram - negativa para plantas de tabaco transgênicas (Trudel et al. 1995; Kato et al. 1998). Lisozima de bacteriófago T4 foi reportada aperfeiçoar levemente resistência em batata transgênica contra E. carotovora (During et al., 1993;Ahrenholz et al., 2000) e em plantas de maçã transgênicas contra E. amylovora (Ko 1999). Entretanto, como previamente men30 cionado, a ação de lisozima contra bactérias Gram-negativas é especificamente devido a um fragmento de peptídeo lítico curto (Ibrahim et al. 2001) que é presumivelmente sensível a protease. Taumatinas exibem a faixa mais ampla de atividade antimicrobiana bem caracterizada, mas também exibe potentes efeitos citotóxicos sobre células eucarióticas (Taguchi et al. 2000). Defensinas, produzidas por plantas, mamíferos e insetos, são caracterizadas por complexas estruturas de folha - beta com várias ligações dissulfeto que 5 ligam e interrompem membranas de plasma microbiano. Uma defensina de planta de alfafa rendeu robusta resistência a um patógeno de planta (Guo et al. 2000) e defensinas de espinafre foram ativos in vitro contra bactérias Gram-positivas e Gram negativas (Segura et al., 1998). Entretanto, doenças humanas resultaram de ambos, alface e espinafre infectados com bactérias 10 entéricas; evidentemente estas defensinas não são disparadas por estas bactérias ou elas são ineficazes contra estas bactérias. Agentes antibacterianos mais efetivos são urgentemente necessários para proteção de plantas de colheitas.

Peptídeos antimicrobianos, não-enzimáticos são abundantes na 15 natureza, mas de limitado valor em plantas transgênicas, primariamente devido à degradação por proteases de plantas. Em adição, algumas bactérias Gram - negativas são resistentes a peptídeos antimicrobianos mesmo em meios de cultura, devido a variações na estrutura química do LPS (Gutsmann et al., 2005). Isto pode ajudar a explicar porque bactérias patogênicas 20 de plantas podem superar defensinas de plantas hospedeiras. Atualmente, nenhum peptídeo antimicrobiano provou ser mais que marginalmente eficaz contra bactérias Gram - negativas quando expresso em plantas. Processos mais eficazes para controlar doença de planta são urgentemente necessários.

Em contraste com patógenos bacterianos de animais, a maioria

de patógenos bacterianos de plantas são todos Gram-negativos. Como mencionado acima, a característica distinguível de bactérias Gram - negativas é a presença do LPS, que forma uma membrana externa que circunda completamente a parede de célula. Mutações afetando a estrutura do LPS 30 de um patógeno de planta bacteriano (Gram - negativo) de citrus fez com que o patógeno morresse muito rapidamente sobre citrus, mas não sobre feijão (Kingsley et al., 1993), indicando a importância da estrutura LPS evadir específicas defesas fitoquímicas de plantas. Em adição, mutações afetando efluxo multifármacos em bactérias Gram - negativas fazem com que as bactérias morram rapidamente em plantas, realçando o papel de compostos de defesa de planta de baixo peso molecular (fitoalexinas) em defesa de planta, 5 e ainda indicando a importância do LPS intacto de Gram - negativas na resistência a compostos de defesa de planta (Reddy et al., 2007). Efluxo multifármaco requer um LPS intacto para funcionar.

Animais têm um conjunto único de defesas inatas contra invasão microbiana que é independente de anterior exposição a patógenos (Hoffman 10 et al., 1999). Entre estes estão peptídeos líticos discutidos acima, e também o neutrófilo, uma célula branca do sangue que é parte do sistema imune inato. Neutrófilos produzem uma variedade de antibióticos peptídeos e proteínas que matam micro-organismos. Entre estes está a proteína de aumento de permeabilidade/bactericida (BPI), que é uma potente proteína antimicro15 biana que é primariamente ativa na direção de bactérias Gram - negativas (Levy, 2000). BPI não é tóxica para bactérias Gram positivas, células de fungos ou animais, mas antes ataca a camada LPS de células Gram negativas, rompendo sua estrutura, e eventualmente atacando sua membrana interna e causando Iise (Mannion et al., 1990). Um marco de proteínas BPI é sua na20 tureza rica em lisina, fortemente catiônica e sua habilidade de ativação de sistema imune ou opsônico (Levy et al., 2003). Membros da família de proteínas BPI incluem proteína de ligação de lipopolissacarídeo (LBP), proteína X específica de pulmão (LUNX), clone epitelial nasal e de pulmão (PLUNC) e proteína secretora parótida (PSP), muitas das quais foram identificadas atra25 vés de técnicas de bioinformática com até 43% de identidade entre membros de família (Wheeler et al., 2003). Existem numerosas patentes cobrindo o uso de BPI e certos menores derivados de peptídeos (por exemplo, 5 830 860 e US 5 948 408).

Proteínas de Bacteriófaqos Antimicrobianas Todos os bacteriófagos devem escapar de células hospedeiras

bacterianas, tanto por extrusão a partir da célula hospedeira, como com fagos filamentosos, ou através de Iise de célula hospedeira a partir de dentro. Lise de célula hospedeira a partir de dentro requer dois eventos: habilidade para penetrar a membrana interior de ambas, bactérias gram-negativas e gram-positivas, e habilidade para despolimerizar a camada mureína, que é relativamente espessa em paredes de células gram-positivas.

Penetração de bacteriófago de, e egresso através, de membrana

interna é realizada em muitos, mas evidentemente não todos, fagos através do uso de pequenas proteínas localizadas na membrana chamadas "holins" que parecem acumular na membrana interna bacteriana até atingirem uma específica concentração, em cujo momento eles são pensados se automontarem para permeabilizar a membrana interna (Grundling et al., 2001; Wang et al. 2000; Young et al., 2000). Os termos "holin" e "semelhante a holin" não são termos bioquimicamente ou mesmo funcionalmente precisos, mas ao invés como aqui usados referem-se a qualquer proteína de fago com pelo menos um domínio transmembrana que é capaz de permeabilizar a membrana interna, pelo que permitindo outras moléculas que não holins que são normalmente seqüestradas no citoplasma pela membrana interna, incluindo proteínas tais como endolisinas, para romper ou penetrar a membrana interna para atingir a parede de célula. A(s) função(ões) bioquímica de holins é(são) especulativa(s); maior parte, se não todo o atual conhecimento sobre holins é baseado sobre a proteína λ fago S (Haro et al. 2003).

Holins são codificadas por genes em pelo menos 35 diferentes famílias, tendo pelo menos um domínio transmembrana e classificadas em três classes topológicas (classes I, II, e III, com três, dois e um domínio transmembrana [TMD], respectivamente), todas sem detectadas relações 25 ortólogas (Grundling et al., 2001). Pelo menos duas holins são conhecidas serem hemolíticas e sobre esta função hemolítica foi feita a hipótese de desempenhar um papel na patogênese de certas bactérias na direção de insetos e nematódeos (Brillard et al., 2003). Somente umas poucas foram parcialmente caracterizadas em termos de função in vivo, conduzindo a pelo me30 nos duas teorias muito diferentes de como elas podem funcionar. A teoria mais amplamente aceita é que holinas funcionam para formar poros de membranas oligoméricos (Graschopf & Blasi, 1999; Young et al., 2000). Despolimerização da camada mureína é realizada por enzimas líticas chamadas endolisinas. Existem pelo menos três classes distintas funcionalmente de endolisinas: 1) glicosaminidases (Iisozimas) que atacam as ligações glicosídicas entre os amino açúcares do peptidoglicano; 2) amida5 ses que atacam a ligação N-acetil muramoil-L-alanina amida entre a fita glicano e o peptídeo de reticulação, e 3) endopeptidases que atacam as ligações de ponto inter-peptídeo (Sheehan et al., 1997). Endolisinas são sintetizadas sem uma seqüência sinal de exportação que pode permitir às mesmas acessar a camada peptidoglicano (mureína), e elas por isso usualmente 10 acumulam-se no citoplasma de bactérias infectadas com fagos até serem liberadas pela atividade holinas (Young and Blasi, 1995).

Lisozimas foram sugeridas como antibióticos úteis que podem ser usados como agentes externos contra ambas bactérias, Gram - positivas e Gram - negativas porque pelo menos algumas delas são multifuncionais (During et al., 1999). Esta funcionalidade dual é baseada na verificação de ambas, lisozima de clara de ovo de galinha e fago T4 têm atividade glicosaminidase assim como estiramentos helicoidais anfipáticos que permitem as mesmas penetrarem e romperem membranas bacterianas, de fungo e de planta (During et al., 1999). A atividade microbicida de Iisozimas pode ser afetada por adições de terminais-C; adições de aminoácidos hidrofóbicos diminuíram atividade contra bactérias Gram-positivas, mas aumentou atividade contra E. coli Gram-negativa (Arima et al., 1997; Ito et al., 1997). Adições de histidina, um aminoácido hidrofílico, a lisozima T4 duplicou sua atividade antimicrobiana contra bactérias Gram - positivas e Gram - negativas (During et al., 1999).

A função microbicida, não-enzimática de Iisozimas pareceu ser devida a domínios terminais-C anfipáticos que podem ser imitados por pequenos peptídeos sintéticos modelados após os domínios de lisozima terminais-C (During et al., 1999). Como descrito acima, plantas transgênicas fo30 ram criadas que expressam Iisozimas e proporcionam alguma resistência a certos patógenos de plantas. Uma vez que maior parte de endolisinas se acumula para altos títulos dentro de célula bacteriana sem causar lise, endoIisinas outras que não certas Iisozimas como T4 não podem ser esperadas atacarem bactérias Gram - negativas se aplicadas externamente, uma vez que circundadas com uma membrana exterior compreendida por LPS e uma bicamada de lipídeo que pode proteger sua camada mureína de ataque enzimático justo tão efetivamente como o faz sua membrana interna.

Foram feitas tentativas para tratamento de doenças bacterianas de ambos, animais e plantas através do uso de bacteriófago intacto. Todas estas tentativas têm severas limitações em sua utilidade. Por exemplo, a patente US 5 688 501 mostra um processo para tratamento de uma doença infecciosa de animais usando bacteriófago específico para o agente causador bacteriano daquela doença. A patente US 4 957 686 mostra um processo para prevenção de cáries dentárias através do uso de bacteriófagos específicos para o agente causador bacteriano de cáries dentárias. Flaherty et al. (2000) descrevem um processo para tratamento de uma doença infecciosa de plantas usando bacteriófago intacto específico para o agente causador bacteriano daquela doença. Em todos estes casos e em casos similares usando bacteriófago intacto, o bacteriófago tem de se ligar ao hospedeiro bacteriano, e esta ligação é altamente específica de hospedeiro, limitando a utilidade do fago para específicas espécies hospedeiras bacterianas, e algumas vezes específicas linhagens hospedeiras bacterianas. Em adição, para ocorrência de ligação, as bactérias têm de estar da fase de crescimento certa, e o fago tem de ser capaz de ganhar acesso às bactérias, que frequentemente estão profundamente enterradas dentro de tecidos de animais ou plantas, ou protegidas por biofilmes bacterianos, formados em parte pela secreção de polissacarídeos extracelulares bacterianos (EPS).

Foram feitas tentativas para tratar infecções bacterianas de Erwinia amylovora de árvores de pêra e maçã através do uso de plantas transgênicas expressando uma enzima de degradação de polissacarídeo extraceIular (EPS), despolimerase - EPS, derivada de um fago E. amylovora. Entre30 tanto, o nível de resistência obtido foi fraco, no máximo, e a fago EPS - despolimerase foi muito específica para a EPS de E. amylovora. Estratégias mais eficazes, e mais genericamente aplicáveis são claramente necessárias. Foram feitas tentativas para tratamento de doenças bacterianas Gram - positivas de animais, mas não plantas, através do uso de preparações de enzima lítica extraídas de bactérias infectadas com bacteriófago ou de bactérias expressando genes bacteriófagos. Estes, também, têm sérias limitações. Por exemplo, patente US 5 985 271 mostra um processo de tratamento de doença animal causada por uma específica bactéria Grampositiva, Streptococcus, através do uso de uma preparação bruta específica de endolisina. Similarmente, a patente US 6 017 528 mostra um processo de prevenção e tratamento de infecção de animais com Streptococcus através do uso de uma preparação de endolisina específica bruta. Similarmente, WO 01/90331 e US 2002/0058027 mostram processo de prevenção e tratamento de infecção de animais com Streptococcus através do uso de uma prpearação purificada consistindo em uma endolisina específica. Em todos estes casos, as preparações de enzima têm de ser purificadas, aradas para Iiberação para as áreas alvos e preservadas no sítio-alvo. Em adição, a enzima tem de ser capaz de ganhar acesso às bactérias infectantes, e estar presente em quantidade suficiente para matar as bactérias em desenvolvimento. Nenhum destes processos pode ser útil no tratamento de bactérias gramnegativas, porque endolisinas não podem penetrar a membrana externa de tais bactérias.

Foram feitas tentativas para tratar ambas, doenças gram - positivas e gram - negativas de animais, mas não plantas, através do uso de preparações de enzimas líticas extraídas de bactérias infectadas com bacteriófago ou de bactérias expressando genes bacteriófagos. WO 01/51073, 25 WO 01/82945, WO 01/019385, US 2002/0187136 e US 2002/0127215 mostram processos de prevenção e tratamento de uma variedade de infecções bacterianas gram positivas e gram-negativas de animais através do uso de enzimas líticas que opcionalmente podem incluir específicas "enzimas líticas holinas" ou "enzimas holina".

Uma vez que holinas não são conhecidas exibirem função enzi

mática, e uma vez que exemplos de tais enzimas líticas não são demonstrados ou ensinados nos WO 01/51073, WO 01/82945, WO 01/019385, US 2002/0187136 e US 2002/0127215, tais enzimas parecem representar uma enzima teórica ou não-demonstrada definida através de referência a uma desejável característica ou propriedade. Como corretamente estabelecido em outra parte pelos mesmos inventores: "Holina não tem atividade enzimá5 tica" (referir-se o WO 01/90331, página 9, linha 12). Enzimas líticas, que formam as bases para os processos mostrados em todas estas publicações PCT, são internamente definidas: "A presente invenção é baseada na verificação de que enzimas líticas de fagos específicas para bactérias infectadas com um específico fago podem efetiva e eficientemente romper a parede de 10 células da bactéria em questão. Ao mesmo tempo, o substrato para a enzima na está presente em tecidos mamíferos..." (WO 01/51073 parágrafo 3, página 4). "As enzimas líticas produzidas por fagos bacteriais são específicas e eficazes para morte de bactérias selecionadas" (parágrafo 2, página 7).

O termo "enzima holina" como usado na Reivindicação #3 de

WO 01/51073 refere-se às enzimas definidas na reivindicação #1 como "o grupo consistindo em enzimas líticas, enzimas líticas modificadas e suas combinações...". Referências similares podem ser encontradas nas reivindicações dos WO 01/82945, WO 01/019385 e US 2002/0187136 e US 20 2002/0127215. Nenhum destes pedidos de patente mostra ou reivindica o uso de holina ou outras proteínas derivadas de fago que carecem de atividade enzimática em qualquer maneira, incluindo a formulação de um composto ou processo de tratamento de doenças de animal ou planta.

WO 02/102405 mostra um processo de prevenção de envene25 namento de alimento de animais através de inclusão de uma preparação purificada consistindo em específicas enzimas líticas e opcionalmente, específicas "enzimas holinas" líticas. Novamente, uma vez que holinas não são conhecidas exibirem função enzimática, não é claro o que é ensinado ou especificado nas reivindicações, outra que não uma enzima teórica e não30 demonstrada definida através de referência a uma desejável característica ou propriedade.

Foi sugerido que uma específica endolisina de um bacteriófago que ataca um patógeno de planta bacteriano gram-negativo pode ser efetiva no provimento de resistência àquele patógeno se o gene endolisina fosse clonado e expresso em plantas (Ozawa et al., 2001). Esta sugestão é mais improvável, uma vez que endolisinas outras que não lisozima T4 não são 5 conhecidas penetrarem membranas bacterianas, e bactérias Gram - negativas têm uma membrana externa distintiva, a barreira LPS, que provê uma forte barreira ambiental que é impermeável a maior parte de moléculas.

Foi demonstrado que um gene de um bacteriófago infectando Ralstonia solanacearum codifica um peptídeo lítico que é capaz de Iisar vá10 rias linhagens de R. solanacearum (Ozawa et al. 2001). Estes autores sugeriram que este peptídeo lítico de seqüência não-mostrada pode ser usado para aperfeiçoar resistência contra R. solanacearum em plantas de tabaco transgênicas. Entretanto, não há ensinamento ou sugestão de que este peptídeo lítico tenha habilidade bactericida ou bacteriostática contra quaisquer 15 bactérias outras que não certas linhagens de R. solanacearum. Realmente, este peptídeo lítico evidentemente específico de espécies foi expresso em E. coli sem relato de dano para as linhagens de E. coli produzindo (Ozawa et al. 2001). Isto não é inesperado, uma vez que fagos são altamente específicos para suas linhagens hospedeiras bacterianas, e são normalmente Iimita20 dos em faixa de hospedeiro a um pequeno subconjunto de linhagens dentro de umas dadas espécies hospedeiras. São urgentemente necessários processos para aperfeiçoamento de resistência de plantas contra uma faixa mais ampla de bactérias patogênicas que umas poucas linhagens de uma espécie patogênica.

Em todos os casos publicados anteriormente onde genes fagos

são reportados ou sugeridos para uso em uma abordagem transgênica, os genes fagos tanto codificaram enzimas ou, em um caso, um peptídeo lítico altamente específico de espécies. Em todos os casos previamente publicados onde preparações de fagos são incorporadas, usadas ou descritas, en30 zimas ou preparações de enzimas são envolvidas. Estas enzimas têm de ser purificadas, tamponadas, preparadas para liberação para as áreas-alvos e preservadas no sítio-alvo. Assim, a técnica anterior falha para ensinar ou descrever a identificação ou uso de proteínas fagos com ampla atividade antimicrobiana contra bactérias Gram - negativas. A técnica anterior também falha para ensinar o uso de genes codificando proteínas fago com ampla atividade antimicrobi5 ana contra bactérias Gram - negativas. Em particular, a técnica anterior falha para ensinar o uso de proteínas fago que sejam capazes de desestabilizar ou permeabilizar a membrana bacteriana externa (o lipopolissacarídeo bacteriano ou barreira LPS) para o controle de infecções de bactérias Gram negativas de plantas.

Resumo da Invenção

Como descrito aqui em outra parte, a presente invenção provê um processo para desestabilização e permeabilização de membrana externa (barreira LPS) baseado na ação de uma proteína de bacteriófago previamente não-descrita aqui chamada proteína de ruptura de membrana externa de 15 bacteriófago (BOMB). A presente invenção é baseada, em parte, na verificação de que BOMBs não somente rompem, mas desestabilizam a membrana externa bacteriana Gram-negativa. Esta ação ocorre não somente se a BOMB é sintetizada a partir de dentro de célula bacteriana, mas em adição, ocorre se a BOMB é aplicada também externamente. Atividade de BOMBs 20 na desestabilização da membrana externa presumivelmente permite que moléculas de defesa natural secretadas por plantas e/ou por outros micróbios também rompam a membrana externa das células-alvos, pelo que comprometendo a "função barreira" da membrana externa Gram-negativa. KingsIey et al., (1993) provê forte evidencia de que a membrana externa de uma 25 bactéria patogênica de planta pode funcionar como uma barreira na prevenção de moléculas de defesa de planta matem a bactéria. A invenção também provê a incorporação de despolimerização de parede de célula enzimática baseada em proteínas de bacteriófago de degradação de peptidoglicano chamadas endolisinas e provê a incorporação de ambas funções de BOMBs 30 e endolisina em uma série de fusões de genes e genes completamente sintéticos modelados sobre as fusões de genes.

Esta invenção provê: 1) processo para a identificação de BOMBs de amplo espectro com um alto nível de atividade não-enzimática para romper membranas externas microbianas e pelo que aumentar a eficácia de ambos, compostos naturais de defesa de planta e compostos aplicados artificialmente; 2) condições requeridas para manutenção e aumento de eficácia 5 antimicrobiana e antipeste de BOMBs em fusões de genes; 3) processos para efetivo alvejamento de BOMBs expressas em plantas através de uso de um promotor aperfeiçoado de xilema e um peptídeo líder para direcionar a proteína BOMB para o apoplasto e xilema de planta; 4) processos para o controle de doenças bacterianas Gram-negativas de plantas através de ex10 pressão de fusões de genes envolvendo BOMBs e fragmentos de BOMBs, adições de terminal-C e peptídeos líderes, e opcionalmente, endolisinas e/ou lípases; 5) processos para aumento de vida útil de flores cortadas; e 6) plantas transgênicas úteis para a produção de novas proteínas antimicrobianas baseadas em BOMBs e fragmentos de BOMB.

Foi agora verificado pelos presentes inventores que certos bac

teriófagos carreiam genes que codificam proteínas outras que não holinas e endolisinas que auxiliam o fago no rompimento de células hospedeiras, e especificamente em interrupção de membrana externa bacteriana ou camada LPS encontrada somente em bactérias Gram-negativas. Foi ainda verifi20 cado que pelo menos uma tal proteína de ruptura de membrana externa bacteriana (BOMB) trabalha a partir do exterior da célula para comprometer a integridade da membrana externa de LPS bacteriana. Foi ainda verificado que expressão de uma proteína BOMB em bactérias Gram - negativas inibe o crescimento das bactérias em cultura, e que quando com detergentes, pro25 teínas líticas tais como certas Iisozimas ou compostos de defesa de plantas tais como cloreto de berberina, inibição de crescimento e/ou Iise ocorrem. Assim foi verificado que uma proteína BOMB não somente pode ter um efeito inibidor direto sobre bactérias Gram - negativas em meio de cultura, mas o efeito é sinergístico com enzimas que causam Iise ou com compostos que 30 são tóxicos. Foi ainda verificado que proteínas BOMB comprometem a integridade da barreia LPS bacteriana, mas não a membrana interna. Ainda, os presentes inventores: 1) identificaram, clonaram e expressaram BC proteína BOMB Xp15 fago Xanthomonas pelargonii em E. coli, 2) fundiram operavelmente o gene bombBC separadamente a promotores de plantas em um cassete de expressão de gene; 3) expressaram BombBC funcional em múltiplas plantas transgênicas diferentes, monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluin5 do tomate, tabaco, gerânio, citrus e arroz; 4) mataram ou inibiram o crescimento de muitos diferentes patógenos Gram - negativos das ditas plantas, conferindo aperfeiçoada resistência a doença ou imunidade para as ditas plantas. Assim, foi verificado que BombBC, e mais geralmente, BOMBs, podem ser funcionalmente expressas em ambas as plantas monocotiledôneas 10 e dicotiledôneas para aperfeiçoar mecanismos naturais de resistência a doença da planta.

Esta invenção por isso provê um processo geral para aperfeiçoar fortemente resistência à doença em plantas contra bactérias Gram - negativas, se patógenos de planta ou não, compreendendo introdução na planta 15 de um cassete de expressão de gene fundindo operavelmente: 1) um promotor que funciona em plantas; 2) um gene BOMB ou fragmento de gene que funciona para expressar proteína BOMB ativa em plantas; 3) uma região terminadora transcricional que funciona em plantas; e 4) obtenção de expressão do dito gene para produção de BOMB nas ditas plantas.

Em uma realização, o cassete de expressão acima contendo um

gene BOMB ou fragmento de gene que funciona para expressar proteína BOMB ativa em plantas tem uma seqüência de sinal de secreção de planta que funciona em plantas, fundida operavelmente ao terminus amino do gene BOMB ou fragmento de gene.

A presente invenção ainda provê moléculas de ácidos nucleicos,

ligadas operavelmente a um ou mais elementos de controle de expressão, incluindo vetores compreendendo as moléculas de ácidos nucleicos isoladas. As seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser produzidas naturalmente ou produzidas sinteticamente usando-se processos 30 bem conhecidos por aqueles versados na técnica de preparação de ácido nucleico.

A invenção ainda inclui células hospedeiras transformadas para conterem as moléculas de ácidos nucleicos da invenção e processos para produção de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína compreendendo a etapa de cultura de uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção sob condições nas quais a proteína é expressa.

Esta invenção provê vetores compreendendo os construtos de

ácidos nucleicos da presente invenção, assim como células hospedeiras, células recombinantes e tecidos transgênicos e organismos compreendendo os vetores da presente invenção. Mais particularmente, esta invenção provê tais células e tecidos transgênicos e organismos que são hemizigóticos, heterozigóticos ou homozigóticos para os construtos de ácido nucleico, onde se o organismo é uma planta ela pode ser monoploide, diploide ou poliploide. É um objetivo da presente invenção prover tais células e tecidos transgênicos e organismos onde eles expressam uma cópia simples ou cópias múltiplas de uma ou mais proteínas BOMB, ou produtos proteínas ortóloga semelhante a BOMB da presente invenção. Células ou tecidos transgênicos e organismos que expressam cópias múltiplas de uma das proteínas BOMB, ou proteínas semelhantes a BOMB, proteínas semelhantes a BOMB ou BOMB mutante, ou BOMB ou proteínas ortólogas semelhantes a BOMB, que expressam mais de uma das BOMBs ou proteínas semelhantes a BOMB, BOMB mutante ou proteínas semelhantes a BOMB, ou proteínas ortólogas semelhante a BOMB ou BOMB, ou que expressam uma fusão de gene transcricional ou traducional carreando uma proteína semelhante a BOMB ou BOMB pode ser desejável, por exemplo, para produzir uma resistência ou tolerância de amplo espectro para uma variedade de bactérias Gramnegativas, se patógenas, oportunísticas ou saprofíticas.

Bactérias Gram - negativas são em particular bactérias com um LPS, incluindo, mas não limitado aos seguintes gêneros: Agrobacterium, Burkholderia, Candidatus Liberibacter, Erwinia, Escherichia, Pseudomonas, Ralstonia, Salmonella, Shigella, Xanthomonas e Xylella.

De acordo com a invenção é possível proporcionar em virtual

mente todas as plantas resistência, ou resistência aumentada, a bactérias Gram - negativas, incluindo, mas não limitado a, os gêneros patogênicos citados acima. Há uma particular demanda pela geração de tal resistência em plantas de colheitas, ambas, agronômicas assim como de horticultura, para uso em colheita alimentícia assim como ornamental. Há também uma particular demanda pela eliminação de bactérias Gram - negativas que são 5 patogênicas a seres humanos e animais que podem ser transportadas assintomaticamente em algumas plantas, como alfafa fresca e brotos de feijão, alface e espinafre. Também existe uma particular demanda por eliminação de bactérias Gram - negativas que podem ser transportadas assintomaticamente em algumas plantas, tais como plantas ornamentais, incluindo gerâ10 nios, mas que podem causar doença em outras plantas, tais como plantas de colheitas, incluindo batatas. Também há particular demanda pela extensão de vida de prateleira de flores de corte, devido a atraque por bactérias Gram-negativas que são saprofíticas.

A presente invenção por isso também refere-se a um processo para preparação de células de planta transformadas e plantas, incluindo sementes e todas as partes de plantas tendo aumentada resistência ou imunidade a infecção ou infestação bacteriana Gram-negativa, se patogênica para planta ou não. Este processo provê um ou mais genes BOMB, fusões de gene BOMB, e a introdução destes genes e fusões no genoma de células de plantas, seguido pela introdução dos ditos genes em células de plantas, regeneração de plantas transformadas inteiras a partir das ditas células, provimento de plantas transgênicas com resistência ou imunidade a doença, infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas. Esta invenção descreve o uso de genes BOMB para controlar doença, infecção e infestação em plantas transgênicas para: 1) controlar doenças de outro modo afetando as ditas plantas transgênicas, 2) para eliminar as ditas plantas transgênicas de serem carreadoras de doenças que afetam outras plantas ou animais (por exemplo, infestações nosocomiais ou em alimentação animal), e 3) para prolongar a vida de prateleira das ditas plantas transgênicas se as ditas plantas são destacadas de raízes (por exemplo, flores cortadas, enxertos).

Mútliplos processos são usados por aqueles versados na técnica para a introdução de genes BOMB em plantas ou células de plantas de dicotiledôneas ou monocotiledôneas, incluindo, mas não limitado a, uso de Agrobacterium tumefaciens e várias variações de plasmídeo-Ti, uso de Rhizobium spp., Sinorhizobium spp ou Mesorhizobium spp. (Broothaerts et al., 2005) e várias variações de plasmídeo - Ti, uso de eletroporação, bombar5 deio de partículas, fios de carbeto de silício fibroso, pulverizado de carbeto de silício não-fibroso. Múltiplos processos são disponíveis para aqueles versados na técnica para a regeneração de plantas inteiramente transgênicas, incluindo ambas, dicotiledôneeas e monocotiledôneas. O termo "plantas" como aqui usado representa plantas completas e também partes de plantas, 10 incluindo sementes, tubérculos, cortes, etc.

A invenção ainda provê sondas de ácidos nucleicos para a detecção de expressão das proteínas BOMB ou semelhantes a BOMB da presente invenção, ou seus mutantes, ou homólogos ou ortólogos, em, por exemplo, plantas que foram geneticamente alteradas para expressarem pelo 15 menos uma das ditas proteínas, ou que possa expressar naturalmente proteínas BOMB ou semelhantes a BOMB, ou seus mutantes, ou homólogos ou ortólogos.

Esta invenção também provê a seqüência de ácidos nucleicos isolada e seu complemento para Fago P15 ORF "BC" (bombBC: SEQ ID 20 NO: 1) e sua correspondente seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) codificando o peptídeo BombBC. A invenção ainda provê todas as variações e iterações possíveis de SEQ ID NO: 1 incluindo, mas não limitado a suas correspondentesd seqüências de DNA, seqüências codificantes, seqüências genômicas, seqüências de ARN, seqüências de ARN interferentes (RNAi), 25 seqüências de RNAi de fita dupla (dsRNA), seqüências de microRNA (miRNA), seqüências de RNA interferente pequenas (siRNA), seqüências de RNAi expressas (eRNAi ou eiRNA), seqüências antissenso, seqüências de DNA complementares (cDNA), seqüências cDNA inversas, etc.

A presente invenção também provê iniciadores preparados a partir de SEQ ID NO: 1 que podem ser usados para localizar e identificar homólogos e ortólogos em qualquer organismo procariótico ou eucariótico. A presente invenção também provê processos de uso de tais iniciadores para obtenção e isolamento de tais homólogos e ortólogos para SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também provê processos de uso de toda ou parte da seqüência de SEQ ID NO: 1 para identificar homólogos ou ortólogos através de pesquisa de bases de dados de seqüências de ácidos nucleicos. 5 Exemplos de tais bases de dados incluem, mas não são limitados às bases de dados de seqüência genômica para milho, arroz e Arabidopsis. Tais processos de busca de seqüência são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

A presente invenção também provê quaisquer seqüências de 10 ácidos nucleicos que hibridizam para SEQ ID NO: 1 sob condições rigorosas. Tais condições são bem conhecidas por aqueles versados na técnica, usando processos ensinados, por exemplo, por Sambrook et al. (1989), mas são normalmente uma combinação de temperatura e concentração de sal que é aproximadamente 20 graus Celsius abaixo de temperatura de fusão 15 calculada (Tm) da molécula alvo. A temperatura de fusão é tipicamente calculada usando a fórmula de Bolton e McCarthy (1962).

A presente invenção ainda provê moléculas de ácidos nucleicos e seus complementos que codificam uma seqüência com pelo menos cerca de 65% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 1, ou pelo menos cerca 20 de 70% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 87% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 88% de identidade de 25 seqüência, ou pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência, ou pelo me30 nos cerca de 95% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99,9% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 1. A presente invenção também provê quaisquer tais ácidos nucleicos que codificam um peptídeo ou proteína com atividade BOMB.

A presente invenção ainda provê aminoácidos isolados que codificam uma seqüência com pelo menos cerca de 65% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2, ou pelo menos cerca de 75%% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência, ou 10 pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 87% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 91%

de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 97% de identidade de sequên20 cia, ou pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99,5% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99,9% de identidade de seqüência com SEQ ID NO: 2. A presente invenção também provê os peptídeos e proteínas codificados por tais seqüências de aminoácidos 25 incluindo aquelas com atividade BOMB.

A invenção também provê uma região codificante de DNA de acordo com a reivindicação 2, consistindo em bombBC (SEQ ID NO: 1) ou qualquer seqüência de DNA consistindo em um estiramento de 70% de identidade de seqüência sobre um estiramento de 50 pares de bases. Este é um 30 padrão prático que é usado pelo Food Allergy Research Resource Program para determinar se uma proteína é provável ser similar a quaisquer alérgenos conhecidos, baseado nas seqüências codificando DNA ou proteína. A invenção também provê um fragmento de peptídeo consistindo em pelo menos 8 aminoácidos contíguos de BombBC (SEQ ID NO: 2), ou qualquer fragmento de peptídeo ou proteína tendo 35% ou maior similaridade sobre 80 aminoácidos com BombBC (SEQ ID NO: 2). Este é um padrão 5 prático que é usado pelo Food AIIergyResearch Resource Program para determinar se uma proteína é provável de ser similar a quaisquer alérgenos conhecidos, baseado nas seqüências codificante de DNA ou proteína.

A presente invenção provê uma seqüência de ácidos nucleicos isolada compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em uma seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 e suas substituições conservativas; uma seqüência de ácidos nucleicos com pelo menos 70% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 1; uma seqüência de ácidos nucleicos contígua com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a uma seqüência de ácidos nucleicos contígua de pelo menos 50 pares de bases de SEQ ID NO: 1; uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza para a seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 sob condições rigorosas de hibridização; ou codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. A presente invenção também provê construtos de ácidos nucleicos, vetores, células de plantas, partes de plantas, tecidos de plantas, e plantas inteiras compreendendo tais seqüências de ácidos nucleicos. A planta pode ser qualquer planta, tal como qualquer planta monocotiledôneea ou qualquer planta dicotiledônea. Exemplos de tais plantas úteis na presente invenção incluem, mas não são limitados a um gerânio, tabaco, citrus e arroz. A presente invenção também provê processos de transformação de uma célula de planta compreendendo introdução, na célula de planta, das seqüências de ácidos nucleicos isoladas da presente invenção.

A presente invenção também encontra uso na transformação ou tratamento de algas para infecções bacterianas, incluindo através de transformação de algas com as seqüências providas pela presente invenção.

A presente invenção também provê processos para aperfeiçoa

mento de resistência de uma planta a infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas, se patogênicas ou não, compreendendo introdução no genoma de planta da dita planta das seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção.

A presente invenção também provê peptídeos isolados, polipeptídeos ou proteínas compreendendo, consistindo essencialmente em, ou 5 consistindo na seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; uma seqüência de ácidos amino nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; uma seqüência de aminoácidos que hibridiza com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou maior similaridade de 10 seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também provê peptídeos isolados, polipeptídeos ou proteínas que são derivados de um bacteriófago; carecem de uma seqüência de aminoácidos sinal de secreção de bactéria; carecem de um 15 domínio transmembrana; que quando expressas em uma bactéria, não causam lise, mas ao invés causam "quasilise", pelo que a densidade ótica da cultura aumenta brevemente após indução e a seguir declina para aproximadamente a densidade ótica de partida; e que quando expressas em uma bactéria crescida na presença de uma fitoalexina, causa "quasilise" e adicio20 nal morte de célula, pelo que a densidade ótica da cultura aumenta logo após indução e a seguir declina para um nível significantemente abaixo daquele da densidade ótica de partida.

As células de plantas, partes de plantas, tecidos de plantas ou plantas inteiras da presente invenção também podem fazer com que insetos 25 e nematódeos falhem para ameaçar ou evitem alimentação sobre a dita célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira devido a inibição ou morte de bactérias Gram - negativas simbióticas que são importantes para digestão ou sobrevivência do inseto ou nematódeo.

A presente invenção também provê processos de prevenção, tratamento ou redução de uma infecção ou infestação de bactérias Gramnegativas de uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira, o dito processo compreendendo contato de célula de planta, parte de planta, tecido de planta, ou planta inteira com o peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada da presente invenção.

A presente invenção também provê composições compreendendo os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas isoladas da presente invenção. 5 Exemplos de tais composições incluem, mas não são limitados a tratamentos de sementes, tais como revestimentos de sementes, e outras formas de tais composições incluindo mas não limitado a espargimentos, pulverizados, pastas, pós, e semelhantes.

A presente invenção provê processos de prevenção, tratamento 10 ou redução de infecção microbiana de uma célula de animal, tecido de animal, ou animal inteiro, o dito processo compreendendo contato de célula de animal, tecido de animal, ou animal inteiro com os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas isoladas da presente invenção. Os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas podem ser incluídos em composições usadas para tratar tais ani15 mais. Exemplos de tais composições incluem, mas não são limitados a espargimentos, pulverizados, pastas, emplastros, implantes e semelhantes.

A presente invenção provê processos de prevenção, tratamento ou redução de infecção microbiana de uma superfície ou dispositivo, tal como um balcão usado para preparar um alimento ou dispositivo médico, os 20 ditos processos compreendendo contato de superfície ou dispositivo com os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas isolados da presente invenção. Os peptídeos, polipeptídeos ou proteínas podem ser incluídos em composições usadas para tratar tais superfícies e dispositivos. Exemplos de tais composições incluem, mas não são limitados a, tintas, detergentes, espargimentos, 25 pulverizados, pastas, emplastros, implantes e semelhantes.

A presente invenção provê processos para aperfeiçoamento de resistência de uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira a infecção ou infestação por bactérias Gram-negativas compreendendo introdução na célula de planta, parte de planta, tecido de planta 30 ou planta inteira de um cassete de expressão compreendendo como componentes operavelmente ligados: a) uma região promotora funcional em plantas; b) uma seqüência de ácidos nucleicos da reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3; e c) uma região terminadora funcional em plantas; e então permitindo a expressão do cassete de expressão; pelo que obtendo aperfeiçoada resistência da célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira a infecção ou infestação por bactérias Gram negativas.

Tais processos ainda podem compreender autopoiinização de plantas inteiras com o cassete de expressão introduzido ou polinização cruzada de plantas inteiras com o cassete de expressão introduzido para uma planta de sua mesma espécie. Em adição, tais processos podem mesmo ainda compreender teste de plantas inteiras obtidas através de introdução de cassete de ex10 pressão para a presença do cassete de expressão ou resistência aperfeiçoada a infecção ou infestação por bactérias Gram negativas antes de autopolinização ou polinização cruzada de plantas inteiras. Os processos ainda podem compreender colheitas de quaisquer sementes produzidas como um resultado de autopoiinização ou polinização cruzada. Tais processos ainda 15 podem mesmo compreender germinação de sementes colhidas para produzir plântulas e testando células de plantas, partes de plantas, tecidos de plantas ou plantas inteiras das plântulas germinadas para a presença do cassete de expressão ou aperfeiçoada resistência à infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas.

A presente invenção também provê culturas de tecidos das célu

las de plantas, partes de plantas, tecidos de plantas ou plantas inteiras obtidas através dos processos da presente invenção, onde as células de planta, partes de planta, tecidos de planta ou plantas inteiras assim obtidos contêm

o cassete de expressão introduzido.

As plantas inteiras obtidas de acordo com os processos da pre

sente invenção que contêm as seqüências de ácidos nucleicos introduzidas ainda podem ser autopolinizadas ou polinizadas cruzadas para uma outra planta da mesma espécie. Quaisquer sementes resultantes podem ser colhidas e usadas para produção de ainda plantas para autopoiinização ou polinização cruzada.

Os processos da presente invenção podem ser usados para ambas bactérias Gram-negativas, patogênicas e não-patogênicas. Os processos da presente invenção ainda podem compreender introdução no genoma de planta de uma segunda seqüência de ácidos nucleicos codificando um segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína que aperfeiçoa a resistência da planta a infecção ou infestação por um patógeno de 5 planta. O segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode incluir, mas não é limitado a um peptídeo lítico não-enzimático, um peptídeo lítico enzimático, ou um peptídeo degradando peptidoglicano enzimático. Por exemplo, o segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser uma lisozima, uma endolisina, uma protease, enzima mureinolítica, uma enzima com atividade trans10 glicosilase, uma lípase e uma esterase.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra proteína BombBC purificada (18 kDa) na faixa

1 e marcadores de peso molecular de tamanho indicado na faixa 2 de um gel de poliacrilamida manchado com azul Coomassie.

A Figura 2 mostra confirmação por PCR de transformação de

quatro espécies de plantas usando bombBC, incluindo 3 plantas de cada umas de gerânio de Florista (Pelargonium X hortorum) cv. Avenida (Faixas 3, 4, 5), citrus (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) cv. Carizzo1 tabaco (Nicotiana tobacum) cv. Xanthi, e arroz (Oryza sativa japonica) cv. TP309. Faixa 20 1N de 1 kb; 2, controle Avenida não-transgênico; 3, Av250; 4, Av386; 5, Av387; 6, controle Carizzo não-transgênico; 7, C12; 8, C17; 9, C18; 10, controle Xanthi não-transgênico; 11, X473; 12, X480; 13, X901; 14, controle TP309 não-transgênico, 15, TP147; 16, TP170; 17, TP192; 18, escada DNA de 1 kb. Iniciadores de PCR usados foram IPG872 (5’-tca gcc act cga tgc cgt 25 c) e IPG911 (5’-gca cga ttc aag agt agg). O produto de PCR esperado em todos os casos é de 974 pb.

A Figura 3 mostra sintomas típicos de doença bacteriana sobre um gerânio de Florista não-transgênico (Pelargonium X hortorum) cultivar folha "Avenida" inoculado com células de X. pelargonii espargidas sobre as 30 folhas em uma concentração de 107 unidades formadoras de colônia por mililitro (cfu/mL) e também inoculado usando tesouras imersas em 109 cfu/mL de células de X. pelargonii para prender as folhas em vários locais. Seguindo inoculação, plantas foram mantidas a 32°C. A região circulada foi então cortada, e contida em aproximadamente 105 cfu/cm2 células de X. pelargonii vivas (para detalhes, referir-se a Exemplo 11 abaixo). Fototomada quatro semanas após inoculação.

A Figura 4 mostra um gerânio de Florista transgênico (Pelargo

nium X hortorum) cultivar folha "Avenida" expressando BombBC e inoculado ao mesmo tempo e da mesma maneira como aquela descrita na legenda de Figura 1. Seguindo inoculação, plantas foram mantidas a 32°C. A região externa de corte circular não conteve células de X. pelargonii detectadas. Foto tomada quatro semanas após inoculação.

A Figura 5 mostra crescimento de X. perlargonii linhagem CHSC inoculado sobre gerânio não-transgênico (Pelargonium X hortorum) variedade "Avenida"e morte rápida de linhagem CHSC inoculada sobre variedade transgênica de "Avenida" expressando BombBC. Contagens de células foram tomadas diariamente por nove dias através de remoção de seções circulares totalizando 1 centímetro quadrado (cm2) usando uma broca de cortiça de três folhas inoculadas na área mais provável de conter células patógenas (referir-se as Figuras 1 e 2). Estas seções de folhas foram maceradas com um almofariz e pistilo e 1 mililitro de tampão, diluídas usando uma série de diluições 1:10 e gotas de 10 microlitros colocadas sobre um meio de crescimento sólido para contagem. Consistentemente, uma densidade de células máxima de 106 cfu/mL de X. pelargonii foi obtida em plantas de gerânio não-transgênico variedade "Avenida" após cinco dias, e sintomas progrediram estavelmente e sistemicamente até a planta inteira ser morta, usualmente em 12 semanas após inoculação. Entretanto, nenhuma célula X. pelargonii viva foi recuperada de plantas gerânio transgênico variedade "Avenida" após cinco dias seguindo inoculação (Figura 3), e não houve evidência de sintomas de doença de gerânio causada por X. pelargonii. Estas plantas foram ambas, imunes a infecção com X. pelargonii, e rapidamente levaram a população de patógenos inoculados artificialmente à extinção.

A Figura 6 mostra uma comparação de folha de gerânio de Florista (Pelargonium X hortorum) cultivar "Avenida" inoculada com células de R. solanacearum inoculadas através de infiltração com seringa de 106 cfu/mL diretamente no mesofilo esponjoso de folhas usando a extremidade embotada de uma seringa tuberculina. Em adição, estas mesmas plantas inoculadas com seringa também foram inoculadas pela adição de 5 mL de uma cultura líquida de 107 cfu/mL diretamente ao solo de potes de plantas gerânio. Seguindo inoculação, plantas foram mantidas a 32°C para encorajar crescimento de patógeno e desenvolvimento de sintomas. Quatro semanas após inoculação, fotografias foram tomadas de ambos, gerânio nãotransgênico variedade "Avenida" (esquerda) e gerânio transgênico da mesma variedade "Avenida" expressando BombBC (direita). Sintomas típicos de murchar bacteriano desenvolveram-se nas plantas não-transgênicas, que morreram após 12 semanas. Nenhum desenvolvimento de sintomas, que não aquele que se desenvolveu inicialmente em, e permaneceu restrito à região de inoculação foi observado sobre a variedade transgênica "Avenida" expressando BombBC (direita).

Descrição Detalhada

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendidos por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. 20 Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os processos e materiais exemplares são descritos. As técnicas de clonagem de DNA usadas na presente invenção são convencionais e podem ser realizadas por qualquer um versado na técnica, usando os processos ensi25 nados por, por exemplo, Sambrook et al. (1989).

A presente invenção é baseada em nossa verificação de que pelo menos alguns bacteriófagos codificam proteínas anteriormente desconhecidas chamadas proteínas BOMB (ruptura de membrana externa bacteriana) que inibem fortemente crescimento de pelo menos algumas bactérias 30 em cultura, evidentemente através de degradação ou afetação de estrutura da barreira LPS das bactérias. Além disso, verifica-se que: 1) tensoativos, 2) enzimas que atacam o peptidoglicano ou parede de célula, e 3) compostos de defesa de planta aumentam a eficácia de BOMBs expressas contra crescimento de cultura Gram-negativa. Além disso, verifica-se que BombBC, de bacteriófago Xp15 de X. pelargonii, teve um efeito letal ou inibidor sobre múltiplas bactérias Gram - negativas quando expressa em várias plantas trans5 gênicas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Finalmente, nós verificamos que não somente algumas BOMBs podem pelo menos, tal como BombBC, ser estavelmente produzidas por células de plantas sem efeitos tóxicos para plantas, mas a dita expressão de genes BOMB em plantas provê um novo meio de proteção de plantas contra bactérias Gram-negativas.

A presente invenção também é baseada na verificação de que

pelo menos alguns peptídeos de sinal de secreção de plantas podem ser usados como um meio para alvejamento de efeito antimicrobiano de BOMBs para o apoplasto e xilema de plantas, onde eles se acumulam, provendo um novo meio de proteção de plantas contra uma ampla variedade de bactérias 15 Gram-negativas. Além disso, verifica-se que plantas transgênicas expressando BOMBs podem ser usadas para produção de extratos brutos ou purificados de compostos antimicrobianos.

As seguintes realizações exemplares são pretendidas ilustrarem a presente invenção em maior detalhes:

I.Para identificar genes BOMB e/ou semelhantes a BOMB, pri

meiro é necessário isolar e purificar um bacteriófago DNA que tenha atividade antimicrobiana muito forte contra uma variedade de organismos-alvos. Isto é realizado primeiro obtendo bacteriófago que ataca bactérias Gramnegativas alvos. Bacteriófago que ataca uma específica bactéria pode ser 25 isolado com facilidade de despejo bruto, água de tanque, ou drenagem de complexos de estufas usando processos bem publicados conhecidos por aqueles versados na técnica. Em segundo lugar, uma variedade ede placas de bacteriófagos são avaliadas por tamanho das placas formadas após revestimento de bacteriófago com uma bactéria hospedeira gram negativa u30 sando processos conhecidos por aqueles versados na técnica. Em terceiro, bacteriófagos são selecionados por sua habilidade para Iisar ou inibir adicionais bactérias gram-negativas que eles são incapazes de infectar. Isto é reaIizado através de uma série de ensaios de infecção e ensaios de revestimento. Finalmente, ácido nucleico fago é isolado e tratado com DNAse e separadamente com RNAse usando processos conhecidos por aqueles versados na técnica. Somente fagos baseados em DNA são selecionados.

2.Seguindo purificação de fago, o DNA bacteriófago é fragmen

tado e inteiramente sequenciado, como exemplificado por seqüência de Fago 15 depositada em GenBank como Accession NC_007024. Existe uma variedade de estratégias disponíveis para este propósito conhecidas por aqueles versados na técnica; sequenciamento pode ser realizado através de 10 sequenciamento de biblioteca de espingarda ou através de subclonagem, mapeamento de restrição e sequenciamento usando técnicas de caminhada de iniciador. Regiões genômicas de fago expressando BOMBs de bactérias Gram negativas podem não ser facilmente clonáveis em E. coli e são reconhecidas pelo fato de que elas somente podem ser clonadas tanto sem seus 15 promotores nativos ou clonadas a jusante de promotores inteiramente reprimidos. Estas regiões podem ser sequenciadas diretamente de DNA fago.

3.Seguindo sequenciamento de DNA do genoma de bacteriófago, direção transcricional é determinada através de identificação de promotores e terminadores transcricionais usando programas bem conhecidos por 20 aqueles versados na técnica. Genomas de fago são tipicamente transcritos como mensagens policistrônicas em grandes blocos. Todos os quadros de leitura abertos (ORFs) são então identificados usando programas bem conhecidos por aqueles versados na técnica, e prováveis genes funcionais (LFGs) também são identificados, baseado no comprimento do ORF, utiliza25 ção de códon, viés de códon de terceira posição, presença ou ausência de seqüências Shine - Delgarno e contexto transcricional, incluindo prováveis promotores, terminadores transcricionais e direção de transcrição. As funções bioquímicas de alguns dos LFGs são então determinadas através de comparações com outros genes frequentemente caracterizados catalogados 30 em grandes bases de dados como GenBank. Uma vez que BOMBs não foram previamente descritas, os genes BOMB são improváveis de serem verificados por comparações com quaisquer genes conhecidos em bases de dados públicas ou privadas.

4.0s genes codificando BOMBs e/ou genes semelhantes a BOMBs são identificados através de exame de todo LFG do fago, partindo com aqueles encontrados em qualquer fragmento de DNA que não seja sub5 clonável. BOMBs caracteristicamente são: 1) pequenos LFGs (20 kD ou menos) com 2) múltiplos domínios de hélice - laço - hélice - laço, 3) nenhum domínio transmembrana e 4) nenhuma seqüência líder. LFGs com estas características são então selecionados para ainda testes usando um ensaio de expressão de gene funcional. As regiões codificantes de peptídeo previstas 10 dos genes BOMB putativos são amplificadas por reação de cadeia polimerase (PCR) a partir de DNA fago e clonadas sem promotores em um vetor apropriado. Estas regiões codificantes são então operavelmente fundidas com promotores repressíveis, fortemente regulados em apropriados vetores de expressão bacteriana. Repressão do promotor operavelmente fundido com 15 os genes BOMB putativos é então liberada, o que deve resultar em uma notável redução ou terminação de crescimento de linhagens E. coli carreando os clones. Quaisquer tais clones são então ainda testados para seu efeito em outras bactérias.

5. Quaisquer clones DNA que, na indução, causam uma visível redução ou terminação de crescimento das linhagens de E. coli carreando os clones são ainda avaliados através de medição de densidade ótica em 600 nanometros (nm) das culturas sobre um período de tempo de 24 horas partindo com uma OD baixa, mas mensurável no momento de indução. Estas medições são tomadas na presença e na ausência de uma fitoalexina tal como berberina ou um detergente tal como Silwet L77. Observações são feitas para evidência de Iise de célula ou sua falta. Quaisquer clones DNA que, com indução, cause um declínio contínuo em densidade de célula sobre o tempo (até 24 horas) são prováveis genes candidatos BOMB. Tais clones podem ser ainda confirmados como genes BOMB se o efeito de fitoalexina adicionada, tal como cloreto de berberina, ou agente umectante, tal como Silwet L77 é sinergístico com o clone DNA em redução de densidade de cultura de célula continuamente sobre o tempo (até 24 horas). Em uma realização é um bombBC clonado.

6. O dito clone BPMB é operavelmente fundido dentro de um cassete de expressão de gene de planta, compreendendo minimamente um promotor que é funcional em plantas, seguido pelo clone BOMB e seguido

por um terminador de planta em um vetor de expressão de planta que pode ser usado para expressão transiente de gene em plantas. Vários promotores de plantas e promotores de vírus de plantas que são funcionais em plantas são amplamente disponíveis para uso para expressão funcional de um gene estranho em plantas em ensaios de expressão transiente, por exemplo, o 10 promotor CaMV encontrado nas séries pCAMBIA de vetores de expressão de plantas (Cambia, Canberra, Austrália). Vários terminadores de planta também são disponíveis, incluindo o terminador NOS amplamente disponível, também encontrado nas séries de vetor de expressão de planta pCAMBIA. Para transferência em células de plantas, os vetores de expressão em 15 planta opcionalmente também podem conter bordas DNA-T e habilidade para replicar em Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium spp., Sinorhizobium spp. ou Mesorhizobium spp., que são subsequentemente usados para transferir a região de DNA entre as bordas de DNA-T em plantas.

7.Em uma outra realização, um íntron pode ser opcionalmente 20 usado para aumentar expressão de gene. íntrons são conhecidos ser requeridos para abundante expressão de muitos genes em plantas, incluindo plantas dicotiledôneas e ornamentais e especialmente monocotiledôneas, possivelmente através de aperfeiçoamento de estabilidade de transcrito ou facilitação de maturação de mRNA (Callis et al., 1987; Mun, J.H. et al. 2002; Ro

se & Beliakoff, 2000; Rose, 2002, Simpson & Filipowicz, 1996).

8. Em uma realização, um sinal de secreção de planta é adicionado à região codificante BOMB. Algumas proteínas associadas com tensão e/ou doença em plantas foram verificadas acumularem-se preferencialmente e mais abundantemente no xilema de plantas, presumivelmente requerendo

uma específica seqüência de sinal de secreção. Somente muito poucas proteínas são encontradas no xilema; é incerto como elas são secretadas através de parede de célula de planta para atingirem o xilema. Tais proteínas têm peptídeos sinais de secreção que são úteis para alvejar compostos antimicrobianos para o apoplasto e xilema; nós chamamos estes de "peptídeos sinais de secreção de xilema". A seqüência de peptídeo sinal de secreção de xilema é amplificada a partir de uma apropriada fonte de planta por PCR 5 e clonada À montante da seqüência BOMB. Em uma realização é um peptídeo sinal de planta de 24 aminoácidos derivado de uma tal proteína P12 (GenBank Accession #AF015782; Ceccardi et al., 1998).

9. Expressão em planta de uma BOMB corretamente dobrada, ativa, é verificada em qualquer uma de várias espécies de plantas usando

expressão de gene transiente (Wroblewski et al. 2005). O vetor de expressão de planta transportando o gene BOMB clonado no cassete de expressão de gene é transformado em A. tumefaciens, e as resultantes células transformadas são inoculadas em plantas através de inundação de uma área mensurável de tecido de folha com culturas de células diluídas. Um controle 15 vetor vazio, consistindo no vetor de expressão de planta, mas sem o gene BOMB clonado no cassete de expressão, também é inoculado, preferivelmente sobre a mesma folha. Após 3-4 dias, proteína é extraída do tecido de planta que foi inoculado e usado para análises Western blot. Níveis de proteína BOMB nos tecidos inoculados com o clone BOMB são comparados com 20 níveis BOMB nos tecidos inoculados com o controle vetor vazio.

10. Os construtos de DNA mais ativos são então testados em ensaios desafios de expressão transiente em planta hospedeira usando apropriadas espécies patogênicas de bactérias Gram-negativas; por exemplo, Xanthomonas pelargonii inoculada em gerânio ou Ralstonia solanacearum

inoculada em tabaco, gerânio, tomate ou pimenta. Ensaios desafios de expressão transiente em planta não-hospedeira também podem ser usados, contanto que planta não-hospedeira produza uma resposta hipersensível visível (HR) para o patógeno desafio. Em ambos os casos, tecidos de folha de planta são inoculados por inundação com culturas diluídas de A. tumefa30 ciens transportando o vetor de expressão de gene BOMB como ilustrado na reivindicação 5, acima, e a extensão das áreas inoculadas é marcada. Após 3-4 dias, o tecido de planta que foi inoculado é novamente superinoculado na mesma zona de tecido, esta vez com um patógeno de planta ou bactéria Gram - negativa alvo que tem um marcador de resistência a antibiótico diferente daquele da linhagem de A. tumefaciens usada. Se um patógeno, sintomas patogênicos visíveis ou a resposta HR observada sobre os tecidos 5 controles de vetor vazio é comparada com aquela observada com os tecidos de clone BOMB. Se patógeno ou não-patógeno, discos de folha de 1 cm são removidos de dentro das zonas superinoculadas, triturados em meio e ensaios de contagem de células são realizados, comparando contagens de células com zonas inoculadas dentro de tecidos controles de vetor vazio com 10 aquelas tomadas de zonas inoculadas com o clone BOMB.

11. Transformação permanente de células de plantas, ambas, monocotiledôneas e dicotiledôneas, seguida por regeneração e propagação de plantas transformadas das desejadas espécies dicotiledôneas e monocotiledôneas de interesse são então empreendidas.

É também um objetivo da invenção prevenir doenças de ambas

as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas profilaticamente matando qualquer bactéria Gram - negativa que infecta ou alimenta-se sobre a planta e causa doença de planta. Em uma realização da invenção, o tratamento profilático e terapêutico de uma variedade de doenças causadas por várias 20 espécies e variedades patogênicas de Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, Agrobacterium, Ca. Liberibacter, Xylella, Ralstonia e Burkholderia é obtido. Plantas transgênicas são criadas usando plantas que são hospedeiras do gênero patógeno indicado, as ditas plantas hospedeiras transportando um ou mais peptídeos BOMB ou semelhante a BOMB fundidos com um pep25 tídeo sinal de secreção de xilema, ligado operavelmente com um promotor de planta de modo que peptídeos semelhantes a BOMB são fabricados pelas plantas.

É também um objetivo da invenção prevenir doenças de seres humanos e animais transportadas por alimentos em ambas, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas através de eliminação profilática de qualquer bactéria Gram-negativa que infecta ou se alimenta sobre a planta e causa uma doença de seres humanos e/ou animais transportada por alimento. Em uma realização da invenção, a eliminação profilática e terapêutica de bactérias fecais que podem infectar vegetais frescos como espinafre e brotos de feijão e causam uma variedade de doenças intestinais, incluindo Escherichia, Shigella e Salmonella é obtida. Plantas transgênicas são criadas usando 5 plantas que são hospedeiras que são hospedeiras do gênero patógeno indicado, as ditas plantas hospedeiras carreando um ou mais peptídeos BOMB ou semelhantes a BOMB fundidos com um peptídeo sinal de secreção de xilema, ligado operavelmente com um promotor de planta de modo que os peptídeos semelhantes a BOMB são fabricados pelas plantas.

Em uma outra realização da invenção, plantas transgênicas são

criadas que são hospdeiras do gênero indicado, as ditas plantas hospedeiras carreando um ou mais de peptídeos BOMB ou semelhantes a BOMB fundidos com um peptídeo sinal de secreção de xilema junto com uma esterase, peptídeo lítico, ou enzima lítica, todos ligados operavelmente com promoto15 res de plantas de modo que os peptídeos BOMB ou semelhantes a BOMB e enzimas líticas são fabricados pelas plantas hospedeiras. Peptídeos ou enzimas líticas podem ser lineares ou compactas e globulares, e incluem mas não são limitadas a lisozimas, cecropinas, atacinas, magaininas, holinas, proteínas de aumento de permeabilidade, etc.

É ainda um objetivo da invenção prevenir ou amortecer epidemi

as ou pragas através de plantio destas plantas transgênicas como plantas "armadilhas"em um ambiente de modo que populações de bactérias, fungos, nematódeos ou insetos infecciosos sejam reduzidos através de alimentação sobre as plantas transgênicas. Um tal ambiente pode incluir colheitas co25 merciais, incluindo colheitas não-transgênicas das mesmas ou diferentes espécies de plantas como as plantas armadilhas transgênicas, jardins e construções interiores.

Também é um objetivo da invenção prevenir profilaticamente contaminação de alimentação de gado e alimentos humanos matando qualquer bactéria Gram negativa que possa contaminar a alimentação ou alimentos. Em uma outra realização da invenção, alimentações de gado podem incorporar ou consistir em plantas integrais transgênicas, partes de plantas transgências ou um extrato bruto, semi - puro ou puro de plantas transgênicas expressando enzimas BOMB e/ou semelhantes a BOMB ou fragmentos de peptídeo. Em uma outra realização da invenção, alimentos humanos tais como ovos ou brotos podem ser tratados com uma preparação de espargi5 mento de enzimas BOMBs ou semelhantes a BOMBs ou fragmentos de peptídeos obtidos a partir de plantas transgênicas.

Definições

Como aqui usado, o termo "BOMB" refere-se inclusivamente a qualquer proteína derivada de bacteriófago: 1) sem uma seqüência sinal de secreção bacteriana; 2) sem um domínio transmembrana, e 3) com a capacidade para afetar negativamente, permeabilizar ou degradar a barreira LPS externa de bactérias Gram negativas. Expressão de uma proteína BOMB em E. coli causa "quasilise"—com indução, a densidade ótica da cultura de células continua a aumentar por uma a duas horas em uma maneira similar àquela de uma cultura não-induzida, mas então a densidade ótica cai de volta para o nível de partida no momento de indução. BOMBs carecem da capacidade de causar Iise—com indução, a densidade ótica da cultura de células cai abruptamente. BOMBs também carecem de capacidade de interromper a membrana interna de bactérias em uma maneira similar àquela de holins quando produzidas ou superproduzidas dentro de uma célula bacteriana. Interrupção da membrana interna de uma bactéria é ensaiada através de expressão de ambos um gene BOMB e um gene endolisina simultaneamente dentro de uma célula de bactéria; superexpressão de um gene BOMB e endolisina simultaneamente não resultará em Iise de célula dentro de várias horas ou menos.

Como aqui usado, o termo "holin" refere-se a qualquer proteína derivada de bacteriófago com pelo menos um domínio transmembrana com a capacidade para romper a membrana interna de bactérias quando produzida sem um líder dentro de uma célula bacteriana. Rompimento da mem30 brana interna de uma bactéria é ensaiado através de expressão de ambos, o gene holin e um gene endolisina simultaneamente dentro de uma célula bacteriana; superexpressão de um gene holin e endolisina simultaneamente resultará em Iise de célula dentro de várias horas ou menos.

Como aqui usado, o termo "endolisina" refere-se a qualquer enzima capaz de despolimerização da mureína ou parede de célula peptidoglicano. O termo inclui: 1) glicosaminidases (Iisozimas) que atacam as ligações 5 glicosídicas entre os amino açúcares do peptidoglicano; 2) amidases que atacam a ligação N-acetil muramoil-L-alanina amida entre a fita glicano e o peptídeo de reticulação, e 3) endopeptidases que atacam as ligações de ponte interpeptídeo (Sheehan et al., 1997). Endolisinas são sintetizadas sem uma seqüência de sinal de exportação que possa permitir as mesmas aces10 sar a camada peptidoglicano (mureína), e elas por isso usualmente se acumulam no citoplasma de bactérias infectadas com fago até eles serem liberados através da atividade de holinas.

Como aqui usado, o termo "quasilise" significa que com indução, a densidade ótica da cultura de células continua a aumentar por uma ou duas horas em uma maneira similar àquela de uma cultura não-induzida, mas então a densidade ótica cai de volta para o nível de partida no momento de indução.

Como aqui usado, o termo "lise" significa que com indução, a densidade ótica da cultura de células cai abruptamente.

Como aqui usado, o termo "esterase" refere-se inclusivamente a

qualquer enzima de categoria como uma hidrolase éster - carboxílica (EC

3.1.1.1) ou uma triacil glicerol acil hidrolase (EC 3.1.1.3).

Como aqui usado, o termo "hidrolase éster - carboxílica" (EC

3.1.1.1), refere-se a uma "carboxil esterase" e catalisa a reação de um éster carboxílico + H2O a um álcool plus um carboxilato. Outros nomes comuns

para hidrolase éster - carboxílica são: ali - esterase; B-esterase; monobutirase; cocaína esterase; procaína esterase; metil butirase; vitamina A esterase; butiril esterase; carboxi esterase; carboxilato esterase; esterase carboxílica; metil butirato esterase; triacetina esterase; carboxil éster hidrolase; buti30 rato esterase; metil butirase; carboxil esterase; propionil esterase; carboxil esterase não-específica; esterase D; esterase B; esterase A; serina esterase; ácido carboxílico esterase; cocaína esterase. Como aqui usado, o termo "lípase" refere-se a qualquer triacil glicerol acil hidrolase (EC 3.1.1.3), comumente chamada "triacil glicerol lípase" e catalisando a reação de triacil glicerol plus H2O a diacil glicerol mais um carboxilato. Outros nomes comuns para Iipase são: tributirase; butirina5 se; glicerol éster hidrolase; tributirinase; Tween hidrolase; esteapsina; triacetinase; tributirina esterase; Tweenase; amno N-AP; Takedo 1969-4-9; Meito MY 30; Tween esterase; GA 56; capalase L; triglicerídeo hidrolase; trioleína hidrolase; tween - hidrolizante esterase; amano CE; cacordase; trigliceridase; triacil glicerol éster hidrolase; amano P; amano AP; PPL; glicerol éster 10 hidrolase; GEH; meito Sangyo OF lipase; Iipase hepática; lipazina; protamina plasma pós-heparina - resistente à lipase; pós-heparina lipase resistente a sal; lipase hepática liberável de heparina; amano CES; amano B; tributirase; triglicerídeo lipase; lipase de fígado; monoacil glicerol acil transferase hepática.

Como aqui usado, o termo "bactéria Gram negativa" refere-se a

qualquer bactéria produzindo lipopolissacarídeo (LPS).

Como aqui usado, o termo, "resistência à doença" refere-se a qualquer redução em sintomas de doença ou números de patógenos na planta ou material testado causada pelo tratamento, comparado com os sintomas fenotípicos mais suscetíveis ou números de patógenos conhecidos em testes comparáveis de plantas ou materiais não-tratados.

Como aqui usado, o termo "resistência" a bactérias refere-se a qualquer redução em números bacterianos na planta ou material testado causados pelo tratamento, comparado com plantas ou materiais nãotratados.

Como aqui usado, o termo "imunidade" a bactéria refere-se e eliminação de contagens de células bacterianas detectáveis na planta ou material testado causada pelo tratamento, comparado com plantas ou materiais não-tratados.

Como aqui usado, o termo "alelo" refere-se a qualquer uma de

várias formas alternativas de um gene.

Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere-se aos ácidos aminocarboxílicos que são componentes de proteínas e peptídeos. As abreviaturas de aminoácidos são como se segue: A (Ala); C (Cys); D (Asp); E (Glu); F (Phe); G (Gly); H (His); I Isso); K (Lys); L (Leu); M (Met); N (Asn); P (Pro); Q (Gin); R (Arg); S (Ser); T (Thr); V (Vai); W (Trp); e Y (Tyr).

Como aqui usado, "homóloga" refere-se à similaridade de se

qüência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exmeplo, entre duas moléculas de ácidos nucleicos, por exemplo, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeos. Quando uma posição de subunidade em ambas das duas moléculas está ocupada pela mesma subunidade monomérica, por exemplo, se uma posição em cada uma de duas moléculas de DNA está ocupada por adenina, então elas são homólogas naquela posição. A homologia entre duas seqüências é uma função direta do número de emparelhamentos ou posições homólogas, por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero de dez subunidades de comprimento) das posições em duas seqüências de composto são homólogas então as duas seqüências são 50% homólogas, se 90% das posições, por exemplo, 9 de 10, são emparelhadas ou homólogas, as duas seqüências compartilham 90% de homologia. Por exemplo, as seqüências de DNA 3’ATTGCC5’ e 3’TATGGC compartilham 50% de homologia.

Como aqui usado, "homologia" é usado sinonimamente com "identidade". Em adição, quando os termos "homologia" ou "identidade" são usados aqui para referirem-se aos ácidos nucleicos e proteínas, eles devem ser construídos para serem aplicados à homologia ou identidade em ambos 25 os níveis de seqüência de aminoácido e ácido nucleico. Um primeiro oligonucleotídeo anela com um segundo oligonucleotídeo com "alta rigorosidade" ou "sob condições de alta rigorosidade" se os dois oligonucleotídeos anelam sob condições pelo que somente oligonucleotídeos que são pelo menos cerca de 60%, mais preferivelmente pelo menos cerca de mesmo mais preferi30 velmente pelo menos cerca de 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, e preferivelmente pelo menos cerca de 90% ou, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% complementares anelam um com outro. A rigorosidade de condições usadas para anelar dois oligonucleotídeos é uma função de, entre outros fatores, temperatura, resistência iônica do meio de anelamento, o período de incubação, o comprimento dos oligonucleotídeos, o teor de G-C dos oligonucleotídeos, e o grau esperado de não5 homologia entre os dois oligonucleotídeos, se conhecido. Processos de ajuste de rigorosidade de condições de anelamento são conhecidos (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989; em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, New York).

A determinação de porcentagem de identidade entre duas se10 quências de nucleotídeos ou aminoácidos pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Por exemplo, um algoritmo matemático útil para comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268), modificado como em Karlin and Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877). Este algoritmo é in15 corporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), e podem ser acessados, por exemplo, no site BLAST do National Center for Biotechnology Information (NCBI) world wide web site at the National Library of Medicine (NLM) at the National Institutes of Health (NIH). Buscas de nucleotídeos BLASDT podem ser realizadas com 20 o programa NBLAST (designado "blastn" no NCBI web site), usando os seguintes parâmetros: penalidade de folga = 5; penalidade de extensão de folga = 2; penalidade de desemparelhamento = 3; prêmio de emparelhamento = 1; valor de espectativa 10,0; e tamanho de palavra = 11 para obter seqüências de nucleotídeos homólogas a um ácido nucleico aqui descrito. 25 Buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST (designado "blastn" no NCBI web site) ou o programa "blastp" NCBI, usando os seguintes parâmetros: valor de espectativa 10,0, matriz de escore BLOSUM62 para obter seqüências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína aqui descrita.

Para obter alinhamentos com folgas para propósitos de compa

ração, Gapped Blast pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Alternativamente, PSI-BIast ou PHI-BIast podem ser usados para realização de uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas (id.) e relações entre moléculas que compartilham um padrão comum. Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast, e PHI-Blast, os parâmetros de falha dos respec5 tivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados como disponíveis no website do National Center for Biotechnology Information of the National Library of Medicine at the National Institutes of Health.

A porcentagem de identidade entre duas seqüências pode ser determinada usando-se técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem permissão de folgas. No cálculo de porcentagem de identidade, tipicamente emparelhamentos exatos são contados.

Um "ácido nucleico isolado" refere-se a um segmento ou fragmento de ácido nucleico que foi separado de seqüências que flanqueiam o mesmo em um estado ocorrendo naturalmente, por exemplo, um fragmento 15 de DNA que foi removido das seqüências que são normalmente adjacentes ao fragmento, por exemplo, as seqüências adjacentes ao fragmento em um genoma no qual ele ocorre naturalmente. O termo também se aplica a ácidos nucleicos que foram substancialmente purificados de outros componentes que acompanham naturalmente o ácido nucleico, por exemplo, RNA ou 20 DNA ou proteínas. O termo por isso inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo ou vírus replicando autonomamente, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que exista como uma molécula separada (por exemplo, como um cDNA ou um fragmento de cDNA ou genômico produzido por PCR ou digestão com 25 enzima de restrição) independente de outras seqüências. Ele também m DNA recombinante que é parte de um gene híbrido codificando adicional seqüência de polipeptídeos.

Como aqui usado, o termo "planta de colheita" refere-se a qualquer planta desenvolvida para qualquer propósito comercial, incluindo, mas não limitado aos seguintes propósitos: produção de semente, produção de feno, uso ornamental, produção de frutas, produção de bagas, produção de vegetais, produção de óleo, produção de proteína, produção de forragem, pastagem de animais, campos de golfe, gramados, produção de flores, paisagem, controle de erosão, estrume verde, aperfeiçoamento de inclinação/saúde de solo, produção de produtos/drogas farmacêuticas, produção de alimento ou aditivos de alimentos, produtos de fumo, produção de polpa e produção de madeira.

Como aqui usado, o termo "polinização cruzada" ou "cultivo cruzado" refere-se ao processo através do qual o pólen de uma flor de uma planta é aplicado (artificialmente ou naturalmente) ao óvulo (estigma) de uma flor de uma outra planta.

Como aqui usado, o termo "cultivar" refere-se a uma variedade,

linhagem ou raça de planta que foi produzida através de técnicas horticulturais ou agronômicas e não é normalmente encontrada em populações selvagens.

Como aqui usados, os termos "dicotiledônea" e “dicot" referemse uma planta florindo tendo um embrião contendo duas metades de sementes ou cotilédones. Exemplos incluem citrus; gerânio; tabaco; tomate; legumes, incluindo ervilhas, alfafa, trevo e sojas; carvalhos; bordos; rosas; hortelãs; abóboras; margaridas; nozes; cactus; violetas e botão-de-ouro.

Como aqui usado, o termo "sinal de retenção ER" refere-se a uma seqüência de aminoácidos (o peptídeo sinal de retenção ER) ligado a um polipeptídeo que faz com que o polipeptídeo seja retido e acumulado no retículo endoplásmico (ER).

Como aqui usado, o termo "planta fêmea" refere-se a uma planta que produz óvulos. Plantas fêmeas geralmente produzem sementes após 25 fertilização. Uma planta designada como uma "planta fêmea" pode conter ambos, órgãos sexuais de macho e fêmea. Alternativamente, a "planta fêmea" pode conter somente órgãos sexuais de fêmea tanto naturalmente (por exemplo, em espécies dioecious) ou devido a emasculação (por exemplo, através de detasselling).

Como aqui usado, o termo "geração filial" refere-se a qualquer

uma das gerações de células, tecidos ou organismos seguindo uma particular geração parente. A geração resultante de um acasalamento dos parentes é a primeira geração filial (designada como "F1" ou "F1", enquanto aquela resultante do cruzamento de indivíduos F1 é a segunda geração filial (designada como "F2" ou "F2").

Como aqui usado, o termo "gameta" refere-se a uma célula reprodutiva cujo núcleo (e frequentemente citoplasma) funde com aquele de um outro gameta de origem similar, mas de sexo oposto para formar um zigoto, que tem o potencial de desenvolver-se em um novo indivíduo. Gametas são haploides e são diferenciados em machos e fêmeas.

Como aqui usado, o termo "gene" refere-se a qualquer segmen10 to de DNA associado com uma função biológica. Assim, genes incluem, mas não são limitados a, seqüências codificantes e/ou as seqüências reguladoras requeridas para sua expressão. Genes também podem incluir segmentos de DNA não-expressos que, por exemplo, formam seqüências de reconhecimento para outras proteínas. Genes podem ser obtidos de uma variedade de 15 fontes, incluindo clonagem a partir de uma fonte de interesse ou síntese a partir de uma informação de seqüência conhecida ou prevista, e pode incluir seqüências desenhadas para terem desejados parâmetros.

Como aqui usado, o termo "genótipo" refere-se à constituição genética de uma célula individual, cultura de células, tecido, organismo (por exemplo, uma planta), ou grupo de organismos.

Como aqui usado, o termo "hemizigoto" refere-se a uma célula, tecido ou organismo no qual um gene está presente somente uma vez em um genótipo, como um gene em uma célula haploide ou organismo, um gene ligado a sexo no sexo heterogamético, ou um gene em um segmento de 25 cromossoma em uma célula diploide ou organismo onde seu segmento parceiro foi suprimido.

Como aqui usados, os termos "polinucleotídeos heterólogos" ou um "ácido nucleico heterólogo" ou "um segmento de DNA exógeno" referese a um segmento de polinucleotídeo, ácido nucleico ou DNA que origina-se 30 de uma fonte estranha para a particular célula hospedeira, ou, se da mesma fonte, está modificado de sua forma original. Assim, um gene heterólogo em uma célula hospedeira inclui um gene que é endógeno para a particular céluIa hospedeira, mas foi modificado. Assim, os termos referem-se a um segmento de DNA que é estranho ou heterólogo para a célula, ou homólogo para a célula, mas em uma posição dentro de ácido nucleico da célula hospedeira na qual o elemento não é comumente encontrado. Segmentos de DNA exógenos são expressos para renderem polipeptídeos exógenos.

Como aqui usado, o termo "característica heteróloga" refere-se a um fenótipo proporcionado a uma célula hospedeira transformada ou um organismo transgênico por um segmento de DNA exógeno, polinucleotídeo heterólogo ou ácido nucleico heterólogo.

Como aqui usado, o termo "heterozigoto" refere-se a uma célula

individual diplóide ou poliploide ou planta tendo diferentes alelos (formas de um dado gene) presente pelo menos em um locus.

Como aqui usado, o termo "heterozigoto" refere-se à presença de diferentes alelos (formas de um dado gene) em um particular locus de

gene.

Como aqui usado, o termo "homóloga" refere-se a uma seqüência de ácidos nucleicos ou peptídeos que tem uma origem e funções comuns similarmente a uma seqüência de ácidos nucleicos ou peptídeos de uma outra espécie.

Como aqui usado, o termo "homozigoto" refere-se a uma célula

ou planta individual tendo os mesmos alelos em um ou mais loci.

Como aqui usado, o termo "homozigoto" refere-se à presença de alelos idênticos em um ou mais Ioci em segmentos cromossômicos homólogos.

Como aqui usado, o termo "híbrido" refere-se a qualquer célula,

tecido ou planta individual resultante de um cruzamento entre parentes que diferem em um ou mais genes.

Como aqui usado, o termo "inata" ou "linha inata" refere-se a uma linhagem de cultivo relativamente verdadeira.

Como aqui usado, o termo "linha" é usado amplamente para in

cluir, mas não é limitado a, um grupo de plantas propagadas vegetativamente a partir de uma planta original simples, via técnicas de cultura de tecido ou um grupo de plantas inatas que são geneticamente muito similares devido à descendência de um parente comum. Uma planta é dita "pertencer" a uma particular linha se ela (a) é uma planta transformante primário (TO) regenerada de material daquela linha; (b) tem um pedigree compreendido por uma 5 planta TOdaqueIa linha; ou (c) é geneticamente muito similar devido a ancestral comum (por exemplo, via endogamia ou autopoiinização). Neste contexto, o termo "pedigree" representa a linhagem de uma planta, por exemplo, em termos dos cruzamentos sexuais efetuados de modo que um gene ou uma combinação de genes, em condição heterozigoto (hemizigoto) ou ho10 mozigoto, proporcione uma desejada característica para a planta.

Como aqui usado, o termo ‘locus" (plural: "loci") refere-se a qualquer sítio que foi geneticamente definido. Um locus pode ser um gene, ou parte de um gene, ou uma seqüência de DNA que tenha algum papel regulador, e possa ser ocupada por seqüências diferentes.

Como aqui usado, o termo "proteína lítica" refere-se a qualquer

enzima, no todo ou em parte, ou peptídeo lítico que: 1)degrada ou penetra a camada mureína ou peptidoglicano que forma a parede de célula bacteriana de ambas, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, e 2) tem a habilidade para permeabilizar ou interromper a membrana interna bacteriana. As ditas 20 proteínas podem ser lineares, parcialmente degradadas ou compactas e globulares, e incluem, mas não são limitadas a lisozimas, cecropinas, atacinas, magaininas, proteínas de aumento de permeabilidade, etc.

Como aqui usado, o termo "planta macho" refere-se a uma planta que produz grãos de pólen. A "planta macho" geralmente refere-se ao se25 xo que produz gametas para fertilização de ovário. Uma planta designada como uma "planta macho" pode conter ambos, órgãos sexuais de macho e fêmea. Alternativamente, a "planta macho" pode conter somente órgãos sexuais de macho tanto naturalmente (por exemplo, em espécies dioecious) ou devido a emasculação (por exemplo, através de remoção de ovário).

Como aqui usado, o termo "seleção de massa" refere-se a uma

forma de seleção na qual plantas individuais são selecionadas e a geração seguinte propagada a partir do agregado de suas sementes. Como aqui usado, o termo "monocotiledônea" ou "monocot" refere-se a qualquer de uma subclasse (MonocotyIedoneae) de plantas forindo tendo um embrião contendo somente uma folha semente e usualmente tendo folhas nervadas - paralelas, partes de flor em múltiplos de três, e nenhum 5 crescimento secundário em caules e raízes. Exemplos incluem lírios; orquídeas; arroz; milho; gramas, como capim-do-prado alto, erva galega, e erva zul de Kentucky; grãos, como trigo, aveias e cevada; arco-íris; cebolas e palmas.

Como aqui usados, os termos "mutante" ou "mutação" referemse a um gene, célula, ou organismo com uma constituição genética anormal que pode resultar em um fenótipo variante.

Como aqui usados, os termos "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" referem-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e seus polímeros em forma de fita única ou dupla. A menos que especificamente Iimitado, os termos abrangem ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm similares propriedades de ligação como o ácido nucleico referência e são metabolizados em uma maneira similar a nucleotídeos ocorrendo naturalmente. A menos que de outro modo indicado, uma particular seqüência de ácidos nucleicos também abrange implicitamente suas variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares assim como a seqüência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser obtidas através de geração de seqüências nas quais a terceira posição de um ou mais (ou todos) os códons selecionados seja substituída com resíduos desoxinosina e/ou base mista (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605- 2608; cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98). O termo ácido nucleico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA, e mRNA codificado por um gene. O termo "ácido nucleico" também abrange polinucleotídeos sintetizados em um laboratório usando procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Como aqui usado, um segmento de DNA é referido como "operavelmente ligado" quando ele é colocado em uma relação funcional com um outro segmento de DNA. Por exemplo, DNA para uma seqüência sinal está operavelmente ligado a DNA codificando um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um pro5 motor ou aperfeiçoador está operavelmente ligado a uma seqüência codificante se ele estimula a transcrição da seqüência. Geralmente, seqüências de DNA que são operavelmente ligadas são contíguas, e no cso de uma seqüência sinal contígua e em fase de leitura. Entretanto, aperfeiçoadores não precisam ser contíguos com as seqüências codificantes cuja transcrição eles 10 controlam. Ligação é realizada por ligação em convenientes sítios de restrição ou em adaptadores ou Iigadores inseridos em seu lugar.

Como aqui usado, o termo "polinização aberta" refere-se a uma população de plantas que é livremente exposta a algum fluxo de genes, como oposta a uma fechada na qual há uma barreira efetiva para fluxo de gene.

Como aqui usados, os termos "população polinizada aberta" ou "variedade polinizada aberta" referem-se a plantas normalmente capazes de pelo menos alguma fertilização - cruzada, selecionadas para um padrão, que pode mostrar variação, mas que também tem uma ou mais característi20 cas genotípicas ou fenotípicas através da qual a população ou a variedade pode ser diferenciada de outras. Um híbrido, que não tem barreiras para polinização cruzada, é uma população polinizada aberta ou uma variedade polinizada aberta.

Como aqui usado, o termo "ortólogo" refere-se a uma seqüência 25 de ácidos nucleicos ou peptídeos que funciona similarmente a uma seqüência de ácidos nucleicos ou peptídeos de uma outra espécie. Por exemplo, onde um gene de uma espécie de planta tem uma alta similaridade de seqüência de ácidos nucleicos e codifica uma proteína com uma função similar a um outro gene de uma outra espécie de planta, tais genes podem ser ortó30 logos.

Como aqui usado quando discutindo plantas, o termo "óvulo" refere-se ao gametófito fêmea, enquanto o termo "pólen" significa o gametófito macho.

Como aqui usado, o termo "fenótipo" refere-se aos caráteres observáveis de uma célula individual, cultura de células, organismo (por exemplo, uma planta), ou grupo de organismo que resultam da interação daquela constituição genética de indivíduo (isto é, fenótipo) e o ambiente.

Como aqui usado, o termo "fitoalexina" refere-se a qualquer composto químico antimicrobiano fabricado por uma planta, se pré-formado ou fabricado em resposta à presença de um micróbio.

Como aqui usado, o termo, "linha de planta" é usado amplamente para incluir, mas não é limitado a, um grupo de plantas propagadas vegetativamente a partir de uma planta original simples, via técnicas de cultura de tecido ou um grupo de plantas inatas que são geneticamente muito similares devido à descendência de um parente(s) comum. Uma planta é dita "pertencer" a uma particular linha se ela (a) é uma planta transformante primário (TO) regenerada de material daquela linha; (b) tem um pedigree compreendido por uma planta TO daquela linha; ou (c) é geneticamente muito similar devido a ancestrais comuns (por exemplo, via endogamia ou autopolinização). Neste contexto, o termo "pedigree" representa a linhagem de uma planta, por exemplo, em termos dos cruzamentos sexuais modo que um gene ou uma combinação de genes, em condição heterozigoto (hemizigoto) ou homozigoto, proporciona uma desejada característica para a planta.

Como aqui usado, o termo "tecido de planta" refere-se a qualquer parte de uma planta. Exemplos de órgãos de plantas incluem, mas não são limitados à folha, caule, raiz, tubérculo, ramo, pubescência, nódulo, axila 25 de folha, flor, pólen, estame, pistilo, pétala, pedúnculo, haste, estigma, estilo, bráctea, fruto, tronco, carpelo, sépala, antera, óvulo, pedicelo, agulha, cone, rizoma, estolho, broto, pericarpo, endosperma, placenta, baga, estame, e bainha de folha.

Como aqui usado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA envolvida em ligação de RNA polimerase para iniciar transcrição.

Como aqui usados, os termos "proteína", "peptídeo" ou "polipeptídeo" referem-se aos resíduos de aminoácidos e seus polímeros. A menos que especificamente limitado, os termos abrangem aminoácidos contendo conhecidos análogos de resíduos aminoácidos naturais que têm similares propriedades Iigantes como o aminoácido referência e são metabolizados em uma maneira similar ao resíduos de aminoácidos ocorrendo naturalmen5 te. A menos que de outro modo indicado, uma particular seqüência de aminoácidos também implicitamente abrange suas variantes modificadas conservativamente (por exemplo, substituições conservativas) assim como a seqüência explicitamente indicada. O termo "polipeptídeo" também abrange polipeptídeos sintetizados em um laboratório usando procedimentos bem 10 conhecidos por aqueles versados na técnica.

Como aqui usado, o termo "recombinante" refere-se a uma célula, tecido ou organismo que sofreu transformação com DNA recombinante. O recombinante original é designado como "RO" ou "R0". Autopoiinização de RO produz uma primeira geração transformada designada como "R1" ou "Ri".

Como aqui usado, o termo "sinal de secreção" refere-se a uma seqüência de aminoácidos (o peptídeo sinal de secreção) ligada a um término-N de um polipeptídeo, que é necessária para secreção do polipeptídeo maduro a partir da célula.

Como aqui usado, o termo "auto polinizada" ou "autopoiinização"

significa que o pólen de uma flor de uma planta é aplicado (artificialmente ou naturalmente) ao óvulo (estigma) da mesma ou uma diferente flor sobre a mesma planta.

Como aqui usado, o termo "transcrito" refere-se a um produto de um processo de transcrição.

Como aqui usado, o termo "transformação" refere-se à transferência de ácido nucleico (isto é, um polímero nucleotídeo) em uma célula. Como aqui usado, o termo "transformação genética" refere-se à transferência e incorporação de DNA, especialmente DNA recombinante, em uma célula.

Como aqui usado, o termo "transformante" refere-se a uma célula, tecido ou organismo que sofreu transformação. O transformante original é designado "TO" ou 11T0". AutofertiIização de T- produz uma primeira geração transformada designada como "T1" ou "ΤΓ.

Como aqui usado, o termo "transgene" refere-se a um ácido nucleico que é inserido em um organismo, célula hospedeira ou vetor em uma maneira que assegura sua função.

Como aqui usado, o termo "transgênico" refere-se a células, culturas de células, organismos (por exemplo, plantas), e progênie que receberam um gene estranho ou modificado através de um dos vários processos de transformação, onde o gene estranho ou modificado é da mesma, ou dife10 rente, espécie que a espécie de organismo recebendo o gene estranho ou modificado.

Como aqui usado, o termo "evento de transposição" refere-se ao movimento de um transposon de um sítio doador para um sítio alvo.

Como aqui usado, o termo "variedade" refere-se a uma subdivisão de uma espécie, consistindo em um grupo de indivíduos dentro de espécie que são distintos em forma ou função de outros similares arranjos de indivíduos.

Como aqui usados, os termos "região não-traduzida" ou "UTR" refere-se a qualquer parte de uma molécula de mRNA não codificando uma proteína (por exemplo, em eucariotes o cauda poli(A)).

Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se amplamente a qualquer plasmídeo ou vírus codificando um ácido nucleico exógeno. O termo também deve ser construído para incluir compostos não-plasmídeo e não virais que facilitam transferência de ácido nucleico em virions ou células, tais 25 como, por exemplo, compostos polilisina e semelhantes. O vetor pode ser um vetor viral que é apropriado como um veículo de liberação para liberação do ácido nucleico, ou seu mutante, para uma célula, ou o vetor pode ser um vetor não-viral que é apropriado para o mesmo propósito. Exemplos de vetores virais e não-virais para liberação de DNA para células e tecidos são bem 30 conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94:12744-12746). Exemplos de vetores virais incluem, mas não são limitados a, um vírus vaccinia recombinante, um adenovírus recombinante, um retrovírus recombinante, um vírus adeno - associado recombinante, um vírus de pútula aviária recombinante, e semelhantes (Cranage et al., 198. 5:3057-3063; pedido de patente internacional N2 W094/17810, publicado em 18 de agosto de 1994; pedido de patente inter5 nacional N- W094/23744, publicado em 27 de outubro de 1994). Exemplos de vetores não-virais incluem, mas não são limitados a, lipossomas, derivados de poliamina de DNA, e semelhantes.

Transformação de Planta

Como aqui discutido, várias realizações da presente invenção 10 empregam unidades de expressão (ou vetores ou sistemas de expressão) para expressão de uma seqüência de ácidos nucleicos suprida exogenamente em uma planta. Processos para geração de unidades/sistemas/vetores de expressão para uso em plantas são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente adaptados para uso na presente in15 venção. Aqueles versados podem facilmente usar qualquer planta/vetor/sistema de expressão apropriado nos presentes processos seguindo o esboço aqui provido.

Os elementos de controle de expressão usados para regular a expressão da proteína podem ser o elemento de controle de expressão que é normalmente encontrado associado com a seqüência codificante (elemento de expressão homólogo) ou podem ser um elemento de controle de expressão heterólogo. Uma variedade de elementos de controle de expressão homólogos e heterólogos é conhecida na técnica e podem ser facilmente usados para obtenção de unidades de expressão para uso na presente invenção. Regiões de iniciação de transcrição, por exemplo, podem incluir qualquer uma das várias regiões de iniciação opina, como octopina, manopina, nopalina e semelhantes que podem ser encontradas nos plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens. Alternativamente, promotores virais de plantas também podem ser usados, como os promotores 19S e 35S de vírus de mosaico de couve - flor (promotores CaMV 19S e CaMV 35S, respectivamente) para controlar expressão de gene em uma planta (patente U.S. N— 5 352 605; 5 530 196 e 5 858 742, por exemplo). Seqüências aperfeiçoadoras derivadas do CaMV também podem ser utilizadas (patentes U.S. N— 5 164 316; 5 196 525; 5 322 938; 5 530 196; 5 352 605; 5 359 142; e 5 858 742, por exemplo). Por último, promotores de plantas como promotores de subunidade pequena e grande RUBISCO, promotor prolifera, promotores especí5 ficos de frutos, promotor Ap3, promotores de choque térmico, promotores específicos de semente, etc. também podem ser usados.

Tanto um promotor específico de gameta, um promotor constitutivo (tal como o promotor CaMV ou Nos), um promotor específico de órgão (tal como o promotor E8 de tomate) ou um promotor induzível é tipicamente 10 ligado à proteína ou região codificante antissenso usando técnicas padrão conhecidas. A unidade de expressão ainda pode ser otimizada através de emprego de elementos suplementares como terminadores de transcrição e/ou elementos aperfeiçoadores.

Assim, para expressão em plantas, as unidades de expressão 15 tipicamente conterão, em adição à seqüência de proteína, uma região promotora de planta, um sítio de iniciação de transcrição e uma seqüência de terminação de transcrição. Sítios de enzima de restrição únicos nas extremidades 5’ e 3’ da unidade de expressão são tipicamente incluídos para permitirem fácil inserção em um vetor preexistente.

Na construção de combinações antissenso ou gene estrutu

ral/promotor heterólogo, o promotor é preferivelmente posicionado a cerca de mesma distância a partir do sítio de início de transcrição heterólogo como ele está do sítio de início de transcrição em sua posição natural. Como é conhecido na técnica, entretanto, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem perda de função de promotor.

Em adição a uma seqüência promotora, o cassete de expressão também pode conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para prover eficiente terminação. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene como a seqüência promotora ou pode ser ob30 tida de genes diferentes. Se o mRNA codificado pelo gene estrutural é para ser eficientemente processado, seqüências de DNA que direcionam poliadenilação do RNA também são comumente adicionadas à construção de vetor. Seqüências de poliadenilação incluem, mas não são limitadas ao sinal octopina sintase de Agrobacterium (Gielen et al., EMBO J 3:835-846 (1984)) ou o sinal nopalina sintase (Depicker et al., Mol. And Appl. Genet. 1:561-573 (1982)).

A resultante unidade de expressão é ligada a, ou de outro modo

construída para ser incluída em um vetor que é apropriado para transformação de planta superior. O vetor também pode conter um gene marcador selecionável através do qual células de planta transformadas podem ser identificadas em cultura. Seqüências de replicação, de origem bacteriana ou viral, 10 genericamente também são incluídas para permitir que o vetor seja clonado em um hospedeiro bacteriano ou fago, preferivelmente uma origem de replicação procarrótica de ampla faixa de hospedeiros é incçuída. Um marcador selecionável para bactérias também deve ser incluído para permitir seleção de células bacterianas trnasportando a construto desejado. Apropriados 15 marcadores selecionáveis procarióticos também incluem resistência a antibióticos como ampicilina, canamicina ou tetraciclina.

Outras seqüências de DNA codificando adicionais funções também podem estar presentes no vetor, como é conhecido na técnica. Por exemplo, no caso de transformações de Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, seqüências DNA-T também serão incluídas para subsequente transferência para cromossomas de planta.

As seqüências da presente invenção também podem ser fundidas a várias outras moléculas de ácidos nucleicos tais como Etiquetas de Seqüência Expressas (ESTs), epítopos ou marcadores de proteína fluorescentes.

ESTs são fragmentos de genes, tipicamente de 300 a 400 nucleotídeos em comprimento, sequenciados a partir da extremidade 3’ ou 5’ de clones de DNA - complementar (cDNA). Aproximadamente 30 000 ESTs de Arabidopsis thaliana foram produzidos por um consórcio Francês e Ame30 ricano (Delseny et al., FEBS Lett. 405(2): 129-132 (1997); base de dados de Arabidopsis thaliana, http://aenome.www.stanford.edu/Arabidopsis). Para uma discussão da análise de padrões de expressão de gene derivada de grandes bases de dados de EST, ver, por exemplo, M.R. Fannon, TIBTECH 14:294-298 (1996).

Para introduzir um desejado gene ou conjunto de genes através de processos convencionais é requerido um cruzamento sexual entre duas 5 linhas, e então repetidos retrocruzamentos entre descendência híbrida e um dos parentes até uma planta com as desejadas características ser obtida. Este processo, entretanto, é restrito a plantas que podem hibridizar sexualmente, e genes em adição ao desejado gene serão transferidos.

Técnicas de DNA recombinante permitem que pesquisadores de 10 plantas superem estas limitações permitindo que os geneticistas de plantas identifiquem e clonem específicos genes para desejáveis características, como resistência a uma peste de inseto, e para introdução destes genes em variedades de plantas já úteis. Uma vez que os genes estranhos tenham sido introduzidos em uma planta, aquela planta então pode ser usada em 15 convencionais esquemas de cultivo de planta (por exemplo, cultivo de pedigree, esquemas de cultivo de descendente de semente simples, seleção recorrente recíproca) para produzir progênie que também contem o gene de interesse.

Genes podem ser introduzidos em uma maneira direcionada a 20 sítio usando recombinação homóloga. Recombinação homóloga permite modificações específicas de sítio em genes endógenos e assim mutações herdadas ou adquiridas podem ser corrigidas, e/ou novas alterações podem ser engenheiradas no genoma. Recombinação homóloga e integração direcionada - sítio em plantas são discutidas em, por exemplo, patente US 5 25 451 513; 5 501 967 e 5 527 695.

Processos de produção de plantas transgênicas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Plantas transgênicas agora podem ser produzidas através de uma variedade de diferentes processos de transformação incluindo, mas não limitado a, eletroporação; microinjeção; 30 bombardeio com microprojétil, também conhecido como aceleração de partícula ou bombardeio biolístico; transformação mediada com vírus; transformação mediada com Agrobacterium-, Rhizobium-, Mesorhizobium-, e Sinorhizobium-. Ver, por exemplo, patentes U.S. N— 5 405 765; 5 472 869; 5 538 877; 5 538 880; 5 550 318; 5 641 664; 5 736 369; US 2005/0289672; US 2005/0289667, PCT WO 2006/004914; Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books (1992); Hinchee et al., Bio/Tech. 6:915-922 5 (1988); McCabe et al., Bio/Tech. 6:923-926 (1988); Toriyama et al., Bio/Tech. 6:1072-1074 (1988); Fromm et al., Bio/Tech. 8:833-839 (1990); MulIins et al., Bio/Tech. 8:833-839 (1990); Hiei et al., Plant Molecular Biology 35:205-218 (1997); Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745-750 (1996); Zhang et al., Molecular Biotechnology 8:223-231 (1997); Ku et al., Nature 10 Biotechnology 17:76-80 (1999); Raineri et al., Bio/Tech. 8:33-38 (1990), e Broothaerts et al., Nature 433:629-633 (2005), cada uma dasi quais é aqui expressamente incorporada por referência em sua totalidade.

Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria ocorrendo naturalmente que é capaz de inserir seu DNA (informação genética) em plantas,

resultando em um tipo de dano para a planta conhecido como galha coroa. Ela também pode inserir DNA estranho em plantas através do uso de seu sistema natural de inserção de DNA modificado ou "desarmado", mas sem formação de doença de galha coroa. Maioria de espécies de plantas agora pode ser transformada usando este processo. Ver, por exemplo, Wang et al., 20 Australian Journal of Plant Physiology 23(3):265-270 (1996); Hoffman et al., Molecular Plant-Microbe Interaetions 10(3):307-315 (1997); e, Trieu et al., Plantcell Reports 16:6-11 (1996).

Rhizobium spp., Mesorhizobium spp. e Sinorhizobium spp. são bactérias ocorrendo naturalmente que também são capazes de inserir DNA estranho (informação genética) em plantas. Muitas espécies de plantas agora podem ser transformadas usando este processo. Ver, por exemplo, Broothaerts et al., Nature 433:629-633 (2005).

Bombardeio com microprojétil é também conhecido como aceleração de partícula, bombardeio biolístico, e a pistola de gene (Biolistic Gene Gun). A pistola de gene é usada para disparar pelotas que são revestidas com genes (por exemplo, para desejadas características) em sementes de plantas ou tecidos de plantas de modo a obter as células de plantas para então expressar os novos genes. A pistola de gene usa um explosivo real (branco calibre 0,22) para impelir o material. Ar comprimido ou vapor também pode ser usado como o propelente. A Biolistic Gene Gun foi inventada em 1983-1984 na Universidade de Cornell por John Sanford, Edward Wolf, e 5 Nelson Allen. Ela e sua marca registrada são agora propriedades de E.l. du Pont de Nemours and Company. Maioria de espécies de plantas foi transformada usando este processo, incluindo alfafa (patente U.S. 5 324 646) e trevo (Voisey et al., Biocontrol Science and Technology 4(4):475-481 (1994); Quesbenberry et al., Crop Science 36(4): 1045-1048 (1996); Khan et al., 10 Plant Phisiology 105(10);81-88 (1994); e, Voisey et al., Plant Cell Reports 13(6):309-314 (1994)).

Desenvolvido por ICI Seeds Inc. (Garst Seed Company) em 1993, WHISKERS é uma alternativa a outros processos de inserção de DNA em células de plantas (por exemplo, a Biolistic Gene Gun, Agrobacterium 15 tumefaciens, o processo "Espingarda", etc.); e ele consiste em cristais semelhantes à agulha ("fios") de carbeto de silício. As fibras são colocadas em um recipiente junto com as células de planta, então misturadas em alta velocidade, o que faz com que os cristais perfurem as paredes de células de planta com "orifícios" microscópicos (passagens). Então o novo DNA (gene) é 20 adicionado, o que faz com que o DNA penetre nas células de planta. As células de planta então incorporam o novo gene(s); e assim elas foram geneticamente engenheiradas.

A essência da tecnologia WHISKERS é o pequeno "fio" de carbeto de silício semelhante a uma agulha (0,6 mícron em diâmetro e 5-80 mi25 eras em comprimento) que é usado na seguinte maneira. Um recipiente contendo um "coquetel de transformação" composto por DNA (por exemplo, gene agronômico mais um gene marcador selecionável), tecido de milho embriogênico, e "fios" de carbeto de silício é misturado ou agitado em uma maneira robusta tanto em um misturador de amálgama dentário como um mis30 turador de tinta. As subsequentes colisões entre células de milho embriogênicas e os afiados "fios" de carbeto de silício resultam na criação de pequenos orifícios na parede de célula de planta através dos quais DNA (o gene agronômico) é presumido entrar na célula. Aquelas células recebendo e incorporando um novo gene são então induzidas a crescerem e por último desenvolverem-se em plantas transgênicas férteis.

Não surpreendentemente, os "fios" semelhantes à agulha, fibrosos, formados de carbeto de silício são um perigo de saúde pulmonar e por isso têm de ser manuseados muito diferentemente de pulverizados de carbeto de silício não-fibroso que não contem fios. As duas formas de carbeto de silício, pulverizado e fios fibrosos, são reguladas muito diferentemente, com o British Columbian (Canadian) Occupationalk Health and Safety (OHS) reguiando a forma fibrosa da mesma maneira como asbestos em limite de exposição de 0,1 fibra por cm3 (f/cc), enquanto a forma não-fibrosa, comum tem um limite de exposição de 3-10 mg/metro cúbico. Fios de carbeto de silício foram mostrados gerarem radicais hidroxila reativos mutagênicos em uma maneira similar a asbestos e causarem ruptura de fita de DNA; pulverizado de carbeto de silício não causa tais efeitos (Svensson et al., 1997).

Rompimento de parede de célula de planta usando pulverizado de carbeto de silício não direciona qualquer DNA associado com o pulverizado para o núcleo de planta, embora isto vá acontecer em uma baixa frequência. Este problema pode ser superado se o DNA é direcionado ao nú20 cleo, como ocorre em infestações naturais de A. tumefaciens ou através de certos vírus. Seqüências sinais de localização nuclear (NLSs) guiam a proteína e qualquer ácido nucleico associado para o núcleo de planta.

Genes introduzidos com sucesso em plantas usando metodologias de DNA recombinante incluem, mas não são limitados àqueles codifi25 cando as seguintes características: proteínas de estocagem em sementes, incluindo proteínas de estocagem em semente de legume 7S modificadas (ver, por exemplo, patentes U.S 5 508 468, 5 559 223 e 5 576 203); tolerância ou resistência a herbicida (ver, por exemplo, De Greef et al., Bio/Technology 7:61 (1989); patente US 4 940 835; patente US 4 769 061; 30 patente US 4 975 374; Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83, 435; patente US 5 489 520; patente US 5 498 544; patente US 5 554 798; Powell et al., Science 232:738-743 (1986); Kaniewski et al., Bio/Tech. 8:750-754 (1990)); Day et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:6721-6725 (1991)); fitase (ver, por exemplo, patente US 5 593 963); resistência pestes bacterianas, de fungos, nematódeos e insetos, incluindo resistência aos insetos lepidóptera conferida pelo gene Bt (ver, por exemplo, patentes U.S. 5 597 945 e 5 597 5 946; Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:9871-9875 (1989); Perlak et al., Bio/Tech. 8:939-943 (1990)); Iectinas (patente US 5 276 269); cor de flor (Meyer et al., Nature 330:677-678 (1987); Napoli et al., Plant Cell 2:279- 289 (1990); van der Krol et al., Plant cell 2:291-299 (1990)); genes Bt (Voisey et al., supra); neomicina fosfotransferase Il (Quesbenberry et al., supra); o 10 gene Iectina de ervilha (Diaz et al., Plant Phisiology 109(4): 1167-1177 (1995); Eijsden et al., Plant Molecular Biology 29(3):431-439 (1995)); promotor GH3 responsivo a auxina (Larkin et al., Transgenie Research 5(5):325- 335 (1996)); gene albumina de semente de girassóis (Khan et al., Transgenic Research 5(3):179-185 (1996)); e genes codificando as enzimas fosfino15 tricina acetil transferase, beta - glicuronidase (GUS) codificando resistência para o herbicida BastaR, neomicina fosfotransferase, e um inibidor de alfa amilase (Khan et al., supra), cada uma das quais é expressamente aqui incorporada por referência em suas totalidades.

Para certos propósitos, diferentes marcadores de seleção de 20 herbicida ou antibiótico podem ser preferidos. Marcadores de seleção usados rotineiramente em transformação incluem o gene nptll que confere resistência a canamicina e antibióticos relacionados (ver, por exemplo, Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), o gene bar que confere resistência ao herbicida fosfinotricina (White et al., Nu25 Cl. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor Appl Genet 79:625-631 (1990)), e o gene dhfr, que confere resistência a metotrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).

Uma planta transgênica formada usando processos de transformação de Agrobacterium, Rhizobium, Mesorhizobium ou Sinorhizobium tipicamente contém um gene simples sobre um cromossoma, embora múltiplas cópias sejam possíveis. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo homozigotas para o gene adicionado. Um nome mais preciso para uma tal planta é um segregante independente, porque cada planta transformada representa um único evento de integração de DNA-T (patente U.S. 6 156 953). Um Iocus transgene é geralmente caracterizado pela presença e/ou ausência do transgene. Um genótipo heterozigoto no qual um alelo cor5 responde à ausência do transgene é também designado hemizigoto (patente U.S. 6 008 437).

Assumindo hemizigosidade normal, autofertilização resultará em máxima segregação genotípica na primeira geração recombinante autofertilizada, também conhecida como a geração R1 ou R1. A geração R1 é produ10 zida por autofertilização de linha recombinante original, também conhecida como a geração RO ou R0. Devido cada inserção atuar como um alelo dominante, na ausência de ligação e assumindo somente uma inserção hemizigoto ser requerida para expressão de tolerância, uma inserção pode segregar 3:1, duas inserções, 15:1, três inserções, 63:1, etc. Por isso, relativamente 15 poucas plantas R1 precisam ser crescidas para encontrar pelo menos um fenótipo de resistência (patente US 5 436 175 e 5 776 760).

Como mencionado acima, autopolinização de uma planta regenerada transgênica hemizigoto deve produzir progênie equivalente a uma F2 onde aproximadamente 25% devem ser plantas transgênicas homozigotos. 20 Autopolinização e cruzamento teste da progênie F2 para plantas controles não-transformadas podem ser usados para identificar plantas transgênicas homozigoto e para manter a linha. Se a progênie obtida para uma planta regenerada foi de polinização cruzada, então identificação de plantas transgênicas homozigoto requererá uma adicional geração de autopolinização (pa25 tente U.S. 5 545 545).

Processos de cultivo

Populações polinizadas - abertas. O aperfeiçoamento de populações polinizadas - abertas de colheitas tais como centeio, muitos milhos e beterrabas - sacarinas, gramas herbáceas, legumes como alfafa e trevo, e 30 colheitas de árvores tropicais como cacau, cocos, palma de óleo e algumas borrachas, depende essencialmente de mudanças de frequências de genes na direção de fixação de alelos favoráveis enquanto mantendo um alto (mas longe do máximo) grau de heterozigosidade. Uniformidade em tais populações é impossível e fidelidade-para-tipo polinizada - aberta é uma característica estatística da população como um todo, não uma característica de plantas individuais. Assim, a heterogeneidade de populações polinizadas 5 abertas contrasta com a homogeneidade (ou virtualmente assim) de linhas inatas, clones e híbridos.

Processos de aperfeiçoamento de população caem naturalmente em dois grupos, aqueles baseados em seleção puramente fenotípica, normalmente chamados seleção de massa, e aqueles baseados em seleção 10 com testes de progênie. Aperfeiçoamentos de interpopulação utilizam o conceito de populações inatas abertas; permitindo que genes fluam de uma população para outra. Plantas em uma população (cultivar, linhagem, ecotipo, ou qualquer fonte germe plasma) são cruzadas tanto naturalmente (por exemplo, através de vento) como manualmente ou por abelhas (comumente 15 Apis mellifera L. ou Megachile rotundata F.) com plantas de outras populações. Seleção é aplicada para aperfeiçoar uma (algumas vezes ambas) populações através de plantas isolantes com desejáveis características de ambas as fontes.

Existem basicamente dois processos primários de aperfeiçoamento de população de polinização aberta. Primeiro, há a situação na qual uma população é alterada en masse através de um procedimento de seleção escolhido. O resultado é uma população aperfeiçoada que é indefinidamente propagável através de emparelhamento - randômico dentro de si própria em isolamento. Segundo, a variedade sintética obtém o mesmo resultado final como aperfeiçoamento de população, mas não é ela própria propagável como tal; ela tem de ser reconstruída a partir de linhas parentes ou clones. Estes procedimentos de cultivo de plantas para aperfeiçoamento de populações polinizadas abertas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e revisões compreensivas de procedimentos de cultivo rotineiramente usados para aperfeiçoamento de plantas polinizadas cruzadas são providos em numerosos textos e artigos, incluindo: Allard, Principies of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960); Simmonds, Principies of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979); Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981); e, Jensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988).

Seleção de Massa. Em seleção de massa, plantas individuais 5 desejáveis são escolhidas, colhidas, e a semente composta sem testes de progênie produzir a geração seguinte. Uma vez que seleção é baseada somente no parente maternal, e não existir controle sobre polinização, seleção de massa totaliza uma forma de emparelhamento randômico com seleção. Como estabelecido acima, o propósito de seleção de massa é aumentar a 10 proporção de genótipos superiores na população.

Sintéticos. Uma variedade sintética é produzida por cruzamento inter se de um número de genótipos selecionados para boa habilidade de combinação em todas as combinações híbridas possíveis, com subsequente manutenção da variedade através de polinização aberta. Se parentes são (mais ou menos inatos) linhas propagadas por sementes, como em algumas beterrabas sacarinas e feijões (Vicia) ou clones, como em gramas herbáceas, trevos e alfafa, em princípio não faz diferença. Parentes são selecionados sobre habilidade de combinação geral, algumas vezes através de cruzamentos testes ou cruzamentos superiores, mais geralmente através de policruzamentos. Linhas sementes parentes podem ser deliberadamente inatas (por exemplo, através de autofertilização ou cruzamento sib). Entretanto, mesmo se os parentes não são deliberadamente inatos, seleção dentro de linhas durante manutenção de linha assegurará que alguma endogamia ocorra. Parentes clonais permanecerão, é claro, inalterados e altamente heterozigotos.

Se um sintético pode seguir direto do ponto de produção de semente parente para o fazendeiro ou primeiro tem de sofrer um ou dois ciclos de multiplicação depende de produção de semente e a escala de demanda por semente. Na prática, gramas e trevos são genericamente multiplicados 30 uma vez ou duas e são assim consideravelmente removidos do sintético original.

Embora seleção de massa seja usada algumas vezes, teste de progênie é genericamente preferido para policruzamentos, devido sua simplicidade operacional e óbvia relevância para o objetivo, por exemplo, exploração de habilidade de combinação geral em um sintético.

O número de linhas parentes ou clones que entram em um sintético varia amplamente. Na prática, números de linhas patentes variam de 10 a várias centenas, com 100-200 sendo a média. Sintéticos baseados amplos formados de 100 ou mais clones podem ser esperados serem mais estáveis durante multiplicação de sementes que sintéticos baseados estreitos.

Híbridos. Um híbrido é uma planta individual resultante de 10 um cruzamento entre parentes de diferentes genótipos. Híbridos comerciais são agora usados extensivamente em muitas colheitas, incluindo milho, sorgo, beterraba sacarina, girassol e brócolis. Híbridos podem ser formados em um número de diferentes maneiras, incluindo através de cruzamento direto de dois parentes (híbridos de cruzamento simples), através de cruzamento 15 de um híbrido de cruzamento simples com um outro parente (híbridos de cruzamento triplo ou três - vias), ou através de cruzamento de dois diferentes híbridos (híbridos de cruzamento duplo ou quatro - vias).

Estritamente falando, maioria de indivíduos em uma população de cultivo fora (isto é, polinizados abertos) são híbridos, mas o termo é usu20 almente reservado para casos nos quais os parentes são indivíduos cujos genomas são suficientemente distintos para os mesmos para serem reconhecidos como espécies diferentes ou subespécies. Híbridos podem ser férteis ou estéreis dependendo de diferenças qualitativas e/ou quantitativas nos genomas dos dois parentes. Heterose, ou vigor híbrido, está usualmente 25 associada com aumentada heterozigosidade que resulta em aumentado vigor de crescimento, sobrevivência, e fertilidade de híbridos como comparados com as linhas parentes que foram usadas para formar o híbrido. Heterose máxima é usualmente obtida por cruzamento de duas linhas altamente inatas, geneticamente diferentes.

A produção de híbridos é uma indústria bem desenvolvida, en

volvendo a produção isolada de ambas as linhas parentes e os híbridos que resultam de cruzamento daquelas linhas. Para uma discussão detalhada do processo de produção de híbridos, ver, por exemplo, Wright, Commercial Hybrid Seed Production 8:161-176, In Hvbridization of crop Plants.

Deve ser entendido que os exemplos e realizações aqui descritos são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à sua Iuz serão sugeridas para aqueles versados na técnica e são para serem incluídas no espírito e escopo deste pedido de patente.

Exemplos

Exemplo 1: Uso de um patóaeno de planta para isolar bacteriófaao capaz de infectar um patóaeno de planta Gram negativo, Xanthomonasd pelarqonii Uma cultura de toda noite de X. campestri pv. Pelargonii (syn X.

pelargonii) linhagem CHSC foi desenvolvida a 30°C em meio PYGM (peptona, extrato de levedura, glicerol e ácido morfolino propano sulfônico; DeFeyter et al. 1990) com agitação moderada. Cinco mL desta cultura de toda noite plus 50 mL de água não-esterilizada tomada da borda de um tanque 15 grande em uma instalação de agricultura foram adicionados a 50 mL de PYGM plus 2,5 g de CaCO3 e deixados incubar a 30°C por 48 horas sem agitação. Seguindo incubação, 1 mL desta cultura de enriquecimento foi centrifugado por 1 minuto em 5000 g para remover maioria de bactérias e debris, e 500 μί do sobrenadante foram removidos e esterilizados com uma 20 gota de clorofórmio. Gotículs deste sobrenadante foram colocadas sobre uma placa contendo linhagem CHSC em ágar. Placas foram placas de ágar PYGM revestidas com 200 μί de caldo de cultura de CHSC por toda noite adicionado a 3 mL de agar água 0,7% mantido a 50°C e deixado resfriar e solidificar. Placas foram observadas após 24 horas de incubação; estas fo25 ram coletadas raspando-se as placas, tituladas e estocadas de acordo com procedimentos padrão (Sambrook et al., 1989). Estas misturas de fagos foram então purificadas de placas simples, e fago individual testado para faixa de hospedeiro bacteriano contra X. citri Iinahgem B21.2, X. campestris linhagem 528, e Ralstonia solanacearum linhagem G2. Todos os fagos foram es30 pecificamente capazes de atacar somente X. pelargonii linhagem CHSC e não infectaram as outras linhagens.

Exemplo 2: Uso de ensaios de revestimento de placa ágar para caracterizar faixa de hospedeiro de faao e para identificar faao com uma habilidade para matar hospedeiros bacterianos aue eles não podem infectar

Placas PYGM foram revestidas com X. pelargonii CHSC e gotículas de várias amostras de fago purificadas obtidas de Exemplo 1 foram 5 adicionadas às placas e incubadas a 30°C por 48 horas. Todos os fagos foram capazes de infectar CHSC e causarem zonas claras de lise. Suspensões de células de caldo de culturas de noite inteira de X. citri B21.2, X. campestris 528 e R. solanacearum G2 foram adicionados a ágar água 0,7% como descrito no Exemplo 1 e individualmente revestidos sobre as placas 10 CHSC infectadas com fago.

Placas foram incubadas por adicionais 48 horas a 30°C e fagos foram avaliados para habilidade para matar bactérias Gram-negativas que eles não podem infectar a partir do Exterior. Alguns fagos exibiram presença de um fator de morte que aparentemente pode ser difundido, forte, para to15 das as bactérias testadas. Isolado de fago 15 (P15) foi selecionado para sequenciamento e ainda avaliação.

Exemplo 3: Uso de sequenciamento qenômico e técnicas de anotação para identificar candidatos genes de fago P15 codificando proteínas com habilidade para matar bactérias a partir do exterior. O genoma P15 foi completa20 mente sequenciado de modo a identificar o gene(s) expressando o fator de morte que pode ser difundido. DNA P15 foi obtido de acordo com protocolos padrões usando X. pelargonii linhagem CHSC como a bactéria hospedeira. O DNA P15 foi digerido com EcoRV, rendendo onze fragmentos, variando em tamanho de 12,4 kb a 357 kb. Maior parte dos fragmentos foram clona25 dos; alguns não foram clonados, a despeito de repetidas tentativas, mais provavelmente devido à presença de endonucleases de restrição e holinas. Os fragmentos de DNA clonados foram usados diretamente para sequenciamento, usando inicialmente iniciadores baseados em vetor, e a seguir caminhada de iniciador até cada fragmento ser completado. Fragmentos que 30 não foram clonados foram sequenciados usando DNA genômico P15. Montagem de fragmentos foi realizada usando DNA genômico P15 e iniciadores estendendo-se fora de cada fragmento em ambas direções. P15 tem um genoma de DNA de fita dupla que é de 55 770 bp em comprimento (GenBank NC_007024).

Análises ORF do fago sequenciado foram feitas usando uma combinação de vários programas incluindo PromScan1 Terminator (GCG), GeSTer (Unniraman et al. 2001, 2002), Glimmer, Genie, Códon preference (GCG), ORF finder (NCBI) e análises Blast (NCBI). Seqüências ShineDelgarno potenciais foram identificadas manualmente através de exame de seqüência. Usando fixações Glimmer default, somente 32 ORFs foram identificados; nenhum destes ORFs correspondeu a genes funcionais depois identificados como holinas ou BOMB através de análises funcionais, embora Iys Y1 prevista codificar uma endolisina, foi identificada. Após identificação de promotores e terminadores no genoma, análise manual de todos ORFs usando preferência de códon (GCG) permitiu a identificação de 52 ORFs adicionais, incluindo aqueles previstos para codificarem holinas. O genoma codificou 84 ORFs putativos (GenBank NC_007024). Existiram vários ORFs previstos de função desconhecida. Fago P15 ORF "BC" (bombBC; SEQ ID NO: 1) foi previsto codifiar uma proteína de 17,9 kD com uma carga de -0,5 em pH neutro (BombBC; SEQ ID NO: 2). Este ORF estava entre vários Fago P150RFs clonados, expressos e funcionalmente avaliados para evidência de efeito sobre a membrana externa de E. coli.

Exemplo 4: Uso de uma fitoalexina e sistemas de expressão de gene induzível para identificar genes candidatos codificando proteínas com habilidade para matar a partir do exterior. Como detalhado acima, bacteriófagos são conhecidos codificarem proteínas que são capazes de degradar a parede de 25 célula bacteriana (endolisinas) e proteínas que são capazes de degradar ou romper a membrana interna bacteriana (holinas). São desconhecidas até agora proteínas de bacteriófagos com habilidade para degradar ou romper a membrana externa bacteriana (isto é, proteínas "BOMB", e também ensaios descritos para identificar tais proteínas. A regiões codificando peptídeo pre30 vistas da holina putativa de P15, holZ (SEQ ID NO: 27 em pedido de patente U.S. Série N2 10/556 563 e PCT/US2004/015099) sua endolisina, IysY (SEQ ID NO: 26 em pedido de patente U.S. Série N2 10/556 563 e PCT/US2004/015099), e sua BOMB1 bombBC (SEQ ID NO: 82 em pedido de patente U.S. Série N2 10/556 563 e PCT/US2004/015099) foram amplificadas por reação de cadeia polimerase (PCR) a partir de DNA de fago P15 e clonadas em pGemT sem promotores. Estas regiões codificantes foram ope5 ravelmente fundidas com um promotor repressível em um sistema de vetor de expressão pET27b modificado usando E. coli linhagem BL21DE3 (Novagen). No caso de bombBC, duas versões foram criadas, uma delas com, e a outra sem, uma seqüência líder peIB. Esta seqüência líder assegurou exportação de bombBC através de membrana interna para o periplasma bacteria10 no. Experimentos foram conduzidos para comparar o efeito de expressão destes três genes em pET27b através de comparação com o vetor vazio em culturas líquidas. Em adição, foram conduzidos experimentos para comparar o efeito de expressão da holina, holZ com a BOMB, bombBC, em células BL21 DE3 que também expressaram constitutivamente um gene endolisina,

IysS. Células foram cultivadas sobre placas agar sob repressão de glicose, e então crescidas em meio de cultura líquido sem repressão. Células foram então induzidas por adição de IPTG 1 mM e a densidade ótica (OD) das culturas em 600 nm foram comparadas em diferentes momentos após indução. Resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo.

Expressão induzida da holina, HolZ, sem a endolisina LysS,

causou quasilise; a densidade ótica da cultura aumentou um pouco e então declinou para a densidade de partida. Não houve evidência de debris de células nestas culturas. Em contraste, expressão induzida de HoIZ com LysS causou imediata lise, com óbvios debris de células no Iisado clareado. Estes 25 efeitos são característicos de holinas, que matam a célula através de rompimento de membrana interna, mas que não podem degradar a parede de célula bacteriana, e assim conteúdo celular permanece contido e não há aparecimento de um Iisado na cultura.

Expressão induzida da endolisina, LysS, causou uma lenta redução em densidade de células (não mostrada), e em contraste com os efeitos de HoIZ expressa sozinha, debris de Iise de células foram visíveis nestas culturas. Uma vez que LysY foi clonada sem uma seqüência líder, esta endolisina pareceu comportar-se similarmente à lisozima, e exibiu alguma habilidade para penetrar ou permeabilizar a membrana interna bacteriana, permitindo a mesma atingir e degradar a parede de célula bacteriana, causando lise.

Expressão induzida da proteína BOMB BombBC causou quasili

se que pareceu similar àquela causada por HolZ; a densidade ótica da cultura aumentou um pouco e então declinou para a densidade de partida. Também não houve evidência de debris de células nestas culturas. Entretanto, e em contraste com HoIZ combinada com LysS, BombBC combinada com 10 LysS não causa lise, mas antes BombBC combinada com LysS pareceu não ter efeito lítico, indicando que a membrana bacteriana interna estava intacta LysS não pode atingir o periplasma e atacar a parede de célula. Isto sugeriu fortemente que a atividade de BombBC foi qualitativamente diferente daquela de uma holin, que rompe a membrana interna, ou uma endolisina, que 15 degrada a parede de célula peptidoglicano ou mureína.

Em adição, cloreto de berberina, um composto antimicrobiano, derivado de planta, preparado comercialmente (uma "fitoalexina") funcionou sinergisticamente com BombBC para reduzir densidade de cultura. Este efeito sinergístico não foi visto com uma holin nem uma endolisina. Berberina 20 pode ser usada para ensaiar para defeitos na barreira de LPS e/ou habilidade de bombeamento de efluxo de bactérias fitopatogênicas (Reddy et al., 2007). Bactérias são sensíveis à berberina em uma maneira dependente de concentração. Qualquer berberina que vaze através de LPS tem de ser ativamente bombeada para fora (efluxada) para sobrevivência bacteriana; se o 25 LPS é rompido ou as bombas de efluxo são incapacitadas, bactérias são incapazes de crescerem na presença de berberina. Quando berberina (5,6- di-hidro-9,10-dimetoxi benzo-1,3-benzodioxoloquino lizímio, um agente intercalante de DNA alcalóide; Schmeller et al., 1997), foi adicionado (5 microgramas/mL) a células transportando bomBC e crescidas em cultura líquida 30 nestes experimentos, morte de célula foi muito mais rápida quando BombBC foi expressa. Adição de berberina na mesma concentração a células BL21 DE3 carreando o vetor pET sozinho teve pequeno efeito. O efeito sinergístico de berberina com BombBC expressa demonstrou que BombBC atuou sobre a membrana externa, ou camada protetora LPS, das células bacterianas e sugeriu que berberinas e outros agentes que têm de ser efetivamente efluxados de células bacterianas podem ser usados como parte de um adi5 cional ensaio de expressão de gene para distinção de genes Bomb de outros genes bacteriófagos que matam células bacterianas com expressão (por exemplo, genes endolisina e holina).

O h 3 h 18 h 24 h Pl Pl Pl Pl Somente BL21DE3/vetor Não-induzida 0,5 1,0 0,9 0,9 Induzida 0,5 0,9 0,8 0,8 Induzida + 0,5 0,9 0,7 0,7 berberina BL21DE3/P15 holZ (holina) Não-induzida 0,6 1,0 1,0 1,0 Induzida 0,6 0,8 0,6 0,6 Induzida + ND ND ND ND berberina BL21DE3/plysS/holZ (holina Não-induzida 0,4 0,7 ND ND Induzida 0,4 0,1 ND ND Induzida + ND ND ND ND berberina BL21 DE3/plysS/bombBC Não-induzida 0,34 1,1 1,2 1,4 (BOMB + endolisina) Induzida 0,34 0,8 0,35 0,4 Induzida + ND ND ND ND berberina Tabelai. Efeito de expressão de genes holina HolZ, endolisina LysY e BOMB BombBC clonados de fago P15 sobre crescimento de células BL21 DE3 de E. coli em cultura líquida na presença ou ausência da fitoalexina berberina. PI, pós-inoculação; ND, não determinado.

Exemplo 5. Uso de repórter P3rpoH::lacZ para confirmar efeito de proteína BOMB sobre LPS bacteriano. E. coli linhagens ADA410 transporta um gene repórter P3rpoH::lacZ que é seletivamente ativado quando o LPS ou membrana externa das células são danificadas (Shapiro e Baneyx, 2002). A região codificando bombBC foi novamente clonada no vetor de expressão pMAL (New England Biolabs, Ipswich, MA), superexpresso em células BL21 DE3 de E. coli, e purificada (Fig. 1). Gotículas de dez microlitros da preparação de proteína purificada foram gotejadas sobre uma suspensão recente de 5 células ADA410 revestidas sobre ágar LB contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil beta-D-galacto piranosídeo (X-gal), junto com tampão de ressuspensão como um controle. Cor azul desenvolveu-se lentamente e intensificou sobre um período de 24 horas de crescimento ao redor de células ADA410, confirmando um efeito prejudicial de BombBC sobre o LPS bacteriano.

Exemplo 6. Construção de cassetes de expressão de BombBC em vetores de expressão em plantas. O promotor CaMV de pBI221 (Clontech, Palo Alto, CA) foi enzimaticamente reclonado no sítio de clonagem poliligador de pCAMBIA0390 (Cambia, Canberra, AU), que tem uma borda DNA-T esquerda, o sítio poliligador, um terminador transcricional NOS e bordas DNA-T 15 direitas, criando plPG700. O gene bombBC P15 fago foi enzimaticamente reclonado em plPG700 a jusante do promotor CaMV e a montante do terminador NOS, criando plPG780. Um peptídeo sinal de planta de 24 aminoácidos derivado de uma proteína conhecida acumular-se no xilema de citrus, P12 (GenBank Accession # AF015782; Ceccardi et al., 1998) foi usado para 20 criar um líder sinal de secreção de xilema (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4). A seqüência de peptídeo sinal de secreção de xilema foi amplificada a partir de Citrus sinensis (laranja doce) por PCR e clonada a montante do gene bombBC e resultando em uma fusão de gene traducional entre P12 e BombBC (SEQ ID NO: 5) sobre plPG780. Clone plPG780 foi subsequente25 mente usado para ensaios de expressão transiente nas dicotiledôneas: pimenta, citrus e gerânio.

O gene P12::BombBC (SEQ ID NO: 5) foi enzimaticamente reclonado a partir de plPG780 em pCAMBIAI305.2 (Cambia, Canberra, AU), de modo que o gene foi dirigido a partir do promotor CaMV reverso de 30 pCAMBIAI305.2, formando plPG787. pCAMBIAI305.2 transporta o gene de resistência a higromicina dirigido por um promotor CaMV dual para seleção de planta. O gene P12::BombBC (SEQ ID NO: 5) também foi reclonado enzimaticamente a partir de plPG780 em pCAMBIA 2301 (Cambia, Canberra, AU), de modo que o gene BombBCfoi dirigido a partir do promotor CaMV reverso de pCAMBIA2301, formando plPG786.

pCAMBIA2301 transporta o gene de resistência a canamicina dirigido por um promotor CaMV dual para seleção de planta. plPG786 foi usado para transformação e regeneração de tabaco e citrus, enquanto plPG787 foi usado para transformação de gerânio e arroz.

Exemplo 7: Uso de expressão transiente de bombBC em plantas de pimenta doce para demonstrar aperfeiçoada resistência a Xanthomonas e Ralstonia. Para ensaios de expressão transiente, a o vetor de expressão e

transformação de planta plPG780 foi movido em A. tumefaciens linhagem GV2260 tanto através de eletroporação como conjugação bacteriana como descrito (Kapila et al., 1997). GV2260 transportando plPG780 foi usado para expressão transiente em plantas de pimenta e gerânio como descrito (Kapila 15 et al. 1997; Duan et al., 1999; Wroblewski et al. 2005). Culturas de Agrobacterium alojando os construtos de interesse foram crescidas em meio mínimo na presença de acetosiringona para induzir os genes vir de Agrobacterium. A densidade ótica das culturas foi mantida em 0,008 para pimenta e em 0,25 para gerânio. Linhagem GV2260 transportando plPG780 ou controle de ve20 tor vazio foi primeiro inundada nos espaços apoplásticos de folhas de pimenta doce (Capsicum) através de estômatos abertos por meio de injeção usando uma seringa tuberculina sem uma agulha. Uma área de 2 a 10 cm2 de folha foi inundada e a área inoculada foi então circundada com um marcador permanente. Isto foi seguido 3 dias depois por inoculações desafios dentro 25 da área previamente inoculada, novamente através de injeção de seringa, desta vez com aproximadamente 2x106 unidade formadoras de colônia (cfu) de X. pelargonii linhagem CHSC ou R. solanacearum, ambas crescidas por toda noite em culturas líquidas. Isto rendeu uma densidade de inoculum de cada patógeno de cerca de 2x104 cfu/cm2. Ambas linhagens usadas foram 30 linhagens de referência publicadas, confirmadas patogênicas sobre seus hospedeiros: X. pelargonii ataca somente gerânio e causa doença de ferrugem bacteriana de gerânio, enquanto R. solanacearum atraca primariamente plantas da família Solanaceae (batata e tomate). Pimenta doce é um nãohospedeiro para ambos patógenos. (Plantas que são atacadas na natureza são consideradas serem "hospedeiras" dos patógenos indicados. Todas as outras plantas são consideradas serem "não-hospdeiras" dos patógenos in5 dicados. Quando estes mesmos patógenos são inoculados nas densidades indicadas sobre plantas não-hospedeiras ou sobre plantas hospedeiras carreando certos genes de resistência (R), uma rápida resposta hipersensível (HR)1 é observada. A HR aparece como uma zona colapsada, necrótica, confluente no sítio de inoculação dentro de 24-48 horas).

Resultados foram avaliados visualmente de acordo com a pre

sença ou ausência de sintomas de HR observados após 48 horas. Em todos os casos, um ensaio de "folha dividida" foi usado no qual plPG780 foi inocuIado sobre uma metade da folha e o controle vetor vazio foi inoculado sobre a outra metade da mesma folha. Em experimentos repetidos; sintomas HR 15 elicitados sobre o lado controle da folha inoculada por X. pelargonii ou R. solanacearum foram abolidos na presença de BombBC expressa transientemente sobre plPG780.

Devido aos efeitos de BombBC no comprometimento de barreira LPS de E. coli para permitir a fitoalexina berberina penetrar e matar a bacté20 ria no Exemplo 4 e a evidência indireta de dano de barreira LPS de E. coli no Exemplo 5, deduziu-se que as fitoalexinas nativas de plantas pimenta, em combinação com a BombBC expressa transientemente em plantas pimenta, matou ou inibiu o crescimento de ambas Xanthomonas e Ralstonia, pelo que prevenindo a HR nestes experimentos.

Exemplo 8: Uso de expressão transiente de bombBC em planta de gerânio (Pelaroonium X hortorum) para demonstrar aperfeiçoada resistência à Ralstonia. De modo a determinar se patógenos Ralstonia também foram afetados por BombBC expressa em plantas hospedeiras, como oposto a plantas não-hospedeiras como pimenta, ensaios similares àqueles descritos 30 no Exemplo 7 acima foram realizados, desta vez usando gerânio de Florista (Pelargonium X hortorum). Isto foi feito de modo a confirmar que a morte ou incapacitação desta habilidade de patógeno para elicitar uma HR sobre nãohospedeiros também estendeu-se a patógenos de plantas hospedeiras suscetíveis. Ensaios idênticos àqueles descritos no Exemplo 7 foram realizados usando plantas gerânio de florista, exceto que para estes ensaios de patogenicidade em uma planta que é altamente suscetível à doença a partir des5 te patógeno, os resultados foram examinados diariamente por um período de 2 a 7 dias após a inoculação desafio. Novamente, os resultados foram similares àqueles descritos para a HR no Exemplo 7. Sintomas patogênicos causados por X. pelargonii foram grandemente reduzidos quando plPG780 foi usada. Em adição, contagens de células tomadas destas regiões demonstra10 ram uma queda 100X no número de unidades formadoras de colônias em folhas de planta expressando BombBC vs. folhas controles. Estes resultados confirmaram e estenderam o conceito de que BombBC pode ser expresso em plantas para o propósito de morte ou incpacitação de bactérias patogênicas Gram negativas para incluir plantas hospedeiras, mais provavelmente 15 devido aos efeitos combinados de fitoalexinas nativas produzidas pela planta hospedeira e expressão transiente de BombBC para incapacitar a barreira LPS do patógeno.

Exemplo 9: Uso de expressão transiente de bombBC in plantas citrus para demonstrar aperfeiçoada resistência a Xanthomonas citri.

De modo a determinar se patógenos Xanthomonas também fo

ram afetados por BombBC expressa em plantas hospedeiras, como oposto a plantas não-hospedeiras como pimenta, ensaios similares àqueles descritos em exemplos 7 e 8 acima foram realizados, desta vez usando plantas toranja (Citrus paradisi) inoculadas com X. citri, agente causador de doença de 25 cancro de citrus. Este agente é um patógeno regulado, e tais inoculações têm de ser realizadas sob estrita quarentena.

Estes experimentos foram realizados de modo a confirmar que a degradação ou ruptura do LPS de Xanthomonas e subsequente morte do patógeno, afetando sua habilidade para elicitar uma HR sobre não30 hospedeiros também se estendeu a patógenos de plantas hospedeiras suscetíveis. Ensaios idênticos àqueles descritos nos Exemplos 7 e 8 foram realizados usando citrus, exceto que para estes ensaios de patogenicidade em uma planta que é altamente suscetível à doença a partir deste patógeno, os resultados foram examinados diariamente por um período de 6 a 14 dias após inoculação de desafio. Novamente, os resultados foram similares àqueles descritos para a HR no Exemplo 7 ou a reação patogênica no Exemplo 8.

Sintomas patogênicos causados por X. citri foram grandemente reduzidos quando plPG780 foi usada. Estes resultados confirmaram e estenderam o conceito de que BombBC pode ser expressa em plantas para o propósito de morte ou incapacitação de bactérias patogênicas Gram negativas para incluir plantas hospedeiras, mais provavelmente devido aos efeitos combinados de 10 fitoalexinas nativas produzidas pela planta hospedeira e expressão transiente de BombBC para incapacitar a barreira LPS do patógeno.

Exemplo 10: Criação de gerânio transqênico (Pelaraonium X hortorum) usando bombBC. Gerânio transgênico (Pelargonium X hortorum) cv. Avenida foi criado usando Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium spp. usando 15 gene bombBC clonado em plPG787. Os processos mais eficientes para produção de gerânios transgênicos foram obtidos usando A. tumefaciens (Robichon et al., 1995). Aproximadamente 9% de explantes de pecíolo de gerânio positivos PCR foram confirmados (dos 360 pecíolos totais submetidos aos protocolos de transformação). Um total de 33 gerânios transgênicos foram 20 obtidos, baseado em amplificação PCR do gene bombBC(Figura 2). Plantas selecionadas foram reproduzidas assexualmente e inoculadas em desafio com diferentes patógenos como descrito abaixo. Estes resultados demonstraram que o gene bombBC, mostrado ser expresso em ensaios de expressão transiente, pode ser estavelmente transformado e presumivelmente ex25 presso em gerânios em eficiências equivalentes àquelas obtidas usando vetor vazio ou uma outra construção de gene, indicando que BombBC não foi prejudicial para plantas gerânio.

Exemplo 11 Criação de tabaco transgênico (Nicotiana tabaccum) usando bombBC. Plantas transgênicas de Nicotiana tabaccum cv. Xanthi foram criadas usando Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium spp. usando o gene bombBC clonado em plPG786. Os processos mais eficientes para produção de tabaco transgênico foram obtidos usando o processo de disco de folha com A. tumefaciens como descrito (Horsch et al. 1985). Transformantes foram selecionados sobre meios MS (Murashige and Skoog 1962) contendo canamicina em 100 μg/mL. Aproximadamente 21% de explantes de tabaco positivos PCR foram confirmados (dos 235 discos de folhas totais submetidos aos protocolos de transformação. Um total de 50 plantas de tabaco transgênicas foram obtidas, baseado na amplificação PCR do gene bombBC (Figura 2). Plantas selecionadas foram reproduzidas sexualmente e assexualmente e inoculadas em desafio com diferentes patógenos como descrito abaixo. Estes resultados demonstraram que o gene bombBC, mostrado ser expresso em ensaios de expressão transiente, pode ser estavelmente transformado e presumivelmente expresso em tabaco em eficiências equivalentes àquelas obtidas usando vetor vazio ou uma outra construção de gene, indicando que expressão de BombBC não foi prejudicial para plantas de tabaco. Exemplo 12: Criação de citrus transgênico (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) usando bombBC. Plantas transgênicas citrus (Citrmus sinensis x Poncirus trifoliata) cv. Carizzo foram criadas usando Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium spp. usando gene bombBC clonado em plPG786. Os processos mais eficientes para produção de citrus transgênicos foram obtidos usando A. tumefaciens aplicado a seções de tronco de citrus estioladas como descrito (Moore et al., 1992). Aproximadamente 6% de explantes de tronco de citrus positivos PCR foram confirmados (das 650 seções de tronco totais submetidas aos protocolos de transformação. Um total de 40 plantas citrus transgênicas foram obtidas, baseado em amplificação PCR do gene bombBC (Figura 2). Plantas selecionadas foram reproduzidas assexualmente e inoculadas em desafio com diferentes patógenos como descrito abaixo. Estes resultados demonstraram que o gene bombBC, mostrado ser expresso em ensaios de expressão transiente, podem ser estavelmente transformados e presumivelmente expressos em citrus em eficiências equivalentes àquelas obtidas usando vetor vazio ou uma outra construção de gene, indicando que BombBC não foi prejudicial para plantas citrus.

Exemplo 13: Criação de arroz transgênico (Orvza sativa iaponica) usando

bombBC. Arroz transgênico (Oryza sativa japonica) cv. TP309 foi criado usando Agrobacterium tumefaciens e Rhizobium spp. usando gene bombBC clonado em plPG787. Os processos mais eficientes para produção de arroz transgênico foram obtidos usando A. tumefaciens aplicado a callus de arroz produzido de semente como descrito (Hiei et al., 1997). Aproximadamente 5 20% de explantes de arroz positivos PCR foram confirmados (dos 305 de número total de calli submetidos ao protocolo de transformação). Um total de 60 plantas de arroz transgênicas foram obtidas, baseado em amplificação PCR do gene bombBC. Plantas selecionadas foram reproduzidas sexualmente e inoculadas em desafio com diferentes patógenos como descrito a10 baixo. Estes resultados demonstraram que o gene bombBC, mostrado ser expresso em ensaios de expressão transiente, pode ser estavelmente transformado e presumivelmente expresso em arroz em eficiências equivalentes àquelas obtidas usando vetor vazio ou uma outra construção de gene, indicando que BombBC não foi prejudicial para plantas de arroz.

Exemplo 14. Uso de progênie reproduzida assexualmente de plantas transqênicas de gerânio. citrus e tabaco para obter plantas clonadas com bombBC

Plantas transgênicas de gerânio, citrus e tabaco foram obtidas como mostrado nos Exemplos 10, 11 e 12. As plantas transgênicas de gerânio, citrus e tabaco foram propagadas asseuxalmente para produção de clones de progênie usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica de propagação de gerânio, citrus ou tabaco. Para gerânio, tabaco, citrus e outras espécies vegetativas que são normalmente propagadas tomando-se cortes, um internódulo com dois nódulos é cortado de uma planta mãe e raízes são desenvolvidas, normalmente usando um meio suporte, com ou sem hormônios induzindo raiz, produzindo uma planta nova simples para cada tal clone ou "corte". Os cortes foram em todos os casos geneticamente idênticos à planta mãe (isto é, 100% positivo PCR para BombBC). Para citrus e espécies lenhosas propagadas similarmente, um corte "rebento" é tomado de uma seção de caule transgênico com folhas e enxertado ou unido sobre um estoque de raiz não-transgênico, de modo que as raízes e caule principal inferior sejam compreendidos por estoque de raiz nãotransgênico, enquanto o caule principal superior e brotos são compreendidos por rebento transgênico. Os cortes de rebento foram em todos os casos geneticamente idênticos à planta mãe (isto é, 100% positivo PCR para BombBC); as modificações genéticas realizadas na planta mãe foram está5 veis. Estes resultados demonstraram que as modificações genéticas realizadas na planta mãe foram estáveis através de pelo menos uma geração assexual.

Exemplo 15. Uso de progênie reproduzida sexualmente de plantas transqênicas de arroz e tabaco para obter plantas clonadas com bombBC. Plantas transgênicas diploides de arroz e tabaco foram obtidas

como mostrado nos Exemplos 11 e 13. As plantas transgênicas (geração T0) de arroz e tabaco foram autopolinizadas e a semente (geração T1) foi colhida das plantas auto - polinizadas, processadas, plantadas, e plantas de progênie crescidas a partir de semente autopolinizada. Ensaios PCR foram usa15 dos para determinar que as plantas de progênie T1 tiveram todas uma clássica razão 3:1 genética, onde 3A das plantas (1/4 transgênicas homozigoto e Vz plantas transgênicas heterozigoto) foram verificadas serem transgênicas através de testes PCR, e 14 das plantas foram não-transgênicas. Estes testes mostraram que as moléculas de ácido nucleico introduzidas codificando 20 bombBC foram estavelmente integradas em ambas as plantas de arroz e tabaco usando os processos da presente invenção e que bombBC também foi herdável.

Exemplo 16. Uso de BombBC expressa em plantas hospedeiras transgênicas de gerânio (Pelargonium X hortorum) para conferir resistência a Xanthomonas pelargonii e Ralstonia solanacearum.

Inoculações desafios de patógeno de plantas gerânio de Florista transgênico (Pelargonium X hortorum) expressando BombBC ativa e de plantas gerânio de Florista propagadas assexualmente expressando BombBC ativa foram conduzidas usando X. pelargonii e R. solanacearum. 30 Os clones de progênie produzida assexualmente ou parente transgênica obtidos das plantas parentes transgênicas reduziram sintomas de doença.

Inoculações foram realizadas usando células de X. pelargonii de cultura líquida, espargidas sobre as folhas em uma concentração de 107 unidades formadoras de colônia por mililitro (cfu/mL) cada. X. pelargonii também foi inoculado usando tesouras imersas em 109 cfu/mL de células para prender as folhs e vários locais sobre as mesmas plantas que foram espar5 gidas. Seguindo inoculação com X. pelargonii, plantas foram mantidas a 32°C para encorajar crescimento de patógeno e desenvolvimento de sintomas. Quatro semanas após inoculação, foram tiradas fotografias de ambos, gerânio não-transgênico variedade "Avenida" inoculado com X. pelargonii (Figura 1) e gerânio transgênico da mesma variedade "Avenida" expressan10 do BombBC inoculado com X. pelargonii (Figura 2), e seções circulares totalizando 1 centímetro quadrado (cm2) foram removidas usando uma broca de cortiça a partir de três folhas inoculadas na área mais provável de conter células de patógeno (referir-se a Figuras 1 e 2). Consistentemente, 105 cfu/mL de X. pelargonii foram recuperadas de gerânio não-transgênico vari15 edade "Avenida" quatro semanas após inoculação (Figura 3), e sintomas progrediram sistemicamente até a planta inteira ter morrido, usualmente em 12 semanas após inoculação. Entretanto, nenhuma célula de X. pelargonii viva foi recuperada de plantas de gerânio transgênico variedade "Avenida"após cinco dias seguindo inoculação (Figura 3), e não houve evidência 20 de sintomas de doença de gerânio causada por X. pelargonii. Estas plantas foram imunes a infecção com X. pelargonii.

Em experimentos separados, R. solanacearum linhagem Rsp673, originalmente isolada de gerânio e conhecida ser fortemente patogênica para gerânio, foi inoculada através de infiltração com seringa de 106 25 cfu/mL diretamente no mesófilo esponjoso de folhas usando a extremidade embotada de uma seringa tuberculina. Em adição, estas mesmas plantas inoculadas com seringa também foram inoculadas através de adição de 5 mL de uma cultura líquida contendo 107 cfu/mL de células diretamente para o solo das plantas de gerânio em potes (referir-se a Figura 4). Seguindo ino30 culação, plantas foram mantidas a 32°C para encorajar crescimento de patógeno e desenvolvimento de sintomas. Sintomas sobre plantas de gerânio BombBC transgênico variedade "Avenida" inoculadas com R. solanacearum, agente causador de ferrugem bacteriana, falharam em progredir depois da área de folha onde o patógeno foi diretamente infiltrado e a doença nunca tornou-se sistêmica. Em adição a supressão de doença, expressão de BombBC evidentemente matou o patógeno, uma vez que não existiram célu5 Ias de R. solanacearum detectadas doze semanas após inoculação de R. solanacearum sobre plantas "Avenida" BombBC transgênicas. Em contraste, sintomas sobre plantas "avenida" não-transgênicas progrediram normalmente e sistemicamente; em doze semanas após inoculação de R. solanacearum, todas as plantas "Avenida" não-transgênicas morreram de doença de 10 ferrugem causada por este patógeno (Figura 4).

Estes testes confirmam que as moléculas de ácido nucleico introduzidas codificando a proteína BombBC foram estavelmente integradas em gerânio usando os processos da presente invenção, e demonstram que gerânios transgênicos, se propagados vegetativamente ou não, são resistentes ou imunes a doença causada por X. pelargonii e R. solanacearum.

Estes resultados ainda demonstram que gerânios transgênicos, se propagados vegetativamente ou não, matam células de X. pelargonii e R. solanacearum. Estes resultados também confirmam e estendem a demonstração de interrupção do LPS de genericamente bactérias Gram-negativas 20 como antecipado a partir de testes de células crescidas em cultura e que tal ruptura de LPS resulta em resistência à doença como antecipado de ensaios de expressão transiente.

Exemplo 17. Uso de BombBC expressa em plantas hospedeiras de tabaco transgênico para conferir resistência à Ralstonia solanacearum.

Inoculações desafios com patógeno de plantas de tabaco trans

gênico (Nicotiana tabaccum cv. Xanthi) expressando BombBC foram conduzidas usando R. solanacearum. Ambas plantas de tabaco, propagadas sexualmente (semeadas, geração T1 de Exemplo 15; Exp 3 na Tabela abaixo) e propagadas assexualmente (cortes, geração TO de Exemplo 11; Exp. 1 e 2 30 na Tabela abaixo) foram inoculadas e comparadas, uma vez que o processo de propagação assexual provê superfície de corte curada sobre, mas ainda significantemente aumentada abaixo da linha de solo que pode facilitar entrada pelo patógeno transportado pelo solo.

R. solanacearum linhagem Rsp446, fortemente patogênica para tabaco, foi inoculada através de adição de 5 mL de uma cultura líquida contendo 5x107 a 2x108 cfu/mL de células diretamente ao solo das plantas de 5 tabaco em potes. Seguindo inoculação, plantas foram mantidas a 32°C para encorajar crescimento de patógeno e desenvolvimento de sintomas. Plantas foram examinadas diariamente e plantas com ferrugem exibindo sintomas de nervura negra foram anotadas e descartadas. Os resultados, anotados como número de sobreviventes/total testado, após 68 dias foram como se segue:

Nível de Corte con¬ Controle Corte de BombBC inóculo trole semeado BombBC semeada Exp. 1 5x107 7/19 10/15 (37%) (63%) Exp. 2 1x108 4/20 9/20 (20%) (45%) Exp. 3 2x108 9/24 0/21 (38%) 100%) Estes resultados demonstraram que BombBC proporcionou re

sistência a tabaco contra R. solanacearum, e foi 100% efetiva em tabaco semeado. Estes resultados, combinados com os resultados de gerânios transgênicos contra dois gêneros diferentes de patógenos no Exemplo 16, confirmam a utilidade de uso de BombBC para controlar doença, não justo em gerânios, mas genericamente em plantas transgênicas.

Exemplo 18. Uso de BombBC expressa em plantas hospedeiras transqênicas citrus e tabaco para conferir resistência a Candidatus Liberibacter asiaticus.

Doença greening de citrus, ou Huanglongbina, é causada por 20 Ca. Liberibacter asiaticus. Este patógeno bacteriano não-cultivado é um agente selecionado de USDA. Ele é conhecido atacar plantas de tabaco, que podem ser usadas como um hospedeiro substituto para testar genes para resistência contra a bactéria em tabaco transgênico (Francischini et al., 2007). Cuscuta spp. (cuscuta) foi usada para transmitir greening a partir de uma fonte infectada positivamente conhecida, uma planta de laranja doce, para cada uma de 6 plantas saudáveis de Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi. Duas das plantas de tabaco foram transgênicas para BombBC (criadas usando os processos de exemplos 11 e 15) e as outras quatro foram contro5 les. As plantas de tabaco foram deixadas permanecerem conectadas a cuscuta por 4 semanas, e as plantas foram ensaiadas para greening por PCR aninhada como descrito (Zhou et al., 2007). Resultados foram que três das quatro plantas controles tornaram-se sintomáticas para greening e todas as três foram positivas PCR), e que nenhuma das duas plantas BombBC trans10 gênicas tornou-se sintomática e nem foram positivas PCR. Estas plantas foram mantidas por três semanas, e novamente testadas. Os resultados foram os mesmos, e indicaram que BombBC provê resistência contra doença greening de citrus.

Testes similares foram realizados usando seis plantas saudáveis de citrus Carrizo. Novamente, Cuscuta spp. (cuscuta) foi usada para transmitir greening a partir de uma fonte infectada positivamente conhecida, uma planta de laranja doce, para cada 6 plantas saudáveis de Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) cv. Carizzo. Duas das plantas citrus foram transgênicas para BombBC (criadas usando os processos de Exemplo 12) e as outras quatro foram controles. As plantas citrus foram deixadas permanecer conectadas a cuscuta por 4 semanas, e as plantas foram ensaiadas para greening por PCR aninhada como descrito (Zhou et al., 2007). Resultados foram que nenhuma das plantas Carrizo tornou-se sintomática para greening e somente uma planta controle tornou-se positiva PCR, e que nenhuma das duas plantas BombBC transgênicas tornou-se positiva em PCR. Estas plantas foram retidas por três semanas, e re-testadas. Os resultados foram os mesmos, e novamente indicaram que BombBC provê resistência contra doença greening de citrus.

Exemplo 19. Uso de BombBC expressa em plantas hospedeiras citrus transgênicas para conferir resistência para doenca de cancro de citrus.

Seis plantas saudáveis de Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) cv. Carizzo foram inoculadas através de imersão de parte superior inteira três polegadas das plantas de 22,8 - 30,4cm(9-12 polegadas) de altura em uma solução contendo 200 ppm de Silwet L-77 e Xanthomonas citri em 105 cfu/mL. Sintomas sobre todas as plantas apareceram duas semanas depois, e foram permitidos desenvolverem-se por quatro semanas adicionais. Duas 5 das plantas citrus foram transgênicas para BombBC (criadas usando os processos de Exemplo 12) e as outras quatro foram controles. Sintomas patogênicos causados por X. citri foram grandemente reduzidos nas duas plantas transgênicas BombBC, em termos de números de pústula (muito menos apareceram nas plantas BombBC) e no tamanho das pústulas (pústulas per10 maneceram finas e foram muito menos desenvolvidas nas plantas BombBC).

Estes resultados confirmaram e estenderam o conceito de que BombBC pode ser expressa em plantas para o propósito de morte ou incapacitação de bactérias patogênicas Gram-negativas para incluírem plantas hospedeiras, mais provavelmente devido aos efeitos combinados de fitoale15 xinas nativas produzidas pela planta hospedeira e expressão de BombBC para comprometer a barreira LPS do patógeno.

Exemplo 20: Uso de plantas transgênicas de arroz para expressão de BombBC enzimaticamente ativa.

Plantas transgênicas de arroz expressando BombBC foram criadas usando Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al., 1997) carreando o gene bombBC clonado em plPG787. É antecipado que estas plantas serão resistentes a patógenos bacterianos Gram negativos, incluindo X. oryzae e X. oryzicola.

Exemplo 21. Processo de uso de proteínas Bomb expressas em plantas transgênicas para estender a vida de prateleira de flores de corte.

Antecipou-se que proteínas Bomb, quan do produzidas em plantas transgênicas que são tipicamente comercializadas como flores de corte, como rosas, cravos, crisântemos, gladíolos, etc., aperfeiçoarão longevidade das flores transgênicas de corte através de supressão de crescimento bacte30 riano na água de vaso causado por bactérias oportunísticas ou de de apodrecimento - suave como Erwinia carotovora e Erwinia chrysanthemi. Plantas transgênicas mais tarde serão comercializadas como flores de corte serão produzidas através de processos descritos nos exemplos acima.

Exemplo 22: Processo de uso de proteínas Bomb como um aditivo para estender a vida de prateleira de flores de corte e alimentação animal.

Antecipou-se que proteínas Bomb, possivelmente em combina

ção com proteínas líticas, quando adicionadas à água do recipiente de transporte ou vaso de plantas não-transgênicas que são tipicamente comercializadas como flores de corte, tais como rosas, cravos, crisântemos, gladíolos, etc., aperfeiçoarão longevidade das flores transgênicas de corte atra10 vés de supressão de crescimento de fungos ou bactérias na água do vaso. Estas espécies microbianas que encurtam a vida de prateleira de flores de corte são Erwinia carotovora e Erwinia Chrysanthemi. Por exemplo, antecipou-se que adição de uma proteína secada a água usada para sustentar flores de corte resultará em uma vida de prateleira mais longa para as flores 15 de corte quando comparadas a flores de corte sustentadas em água da mesma fonte sem a adição da proteína seca.

As proteínas Bomb mais provavelmente serão produzidas em plantas transgênicas. Extratos brutos de proteína serão colhidos, e secados usando um aditivo granular ou suspensos em um apropriado líquido e emba20 lado. Em um outro exemplo, quando a proteína secada é adicionada a alimentação animal, ela controlará contaminação microbiana, incluindo aqueles micróbios que podem causar envenenamento de alimento. Uma preparação seca ou líquida de proteínas Bomb pode ser adicionada à alimentação animal durante preparação na fábrica ou depois pelo proprietário do animal a25 través de mistura. De qualquer modo, o resultado será uma vida de prateleira mais longa da alimentação e reduzida oportunidade para crescimento de micróbios que pode resultar em envenenamento de alimento.

Exemplo 23: Processo de uso de proteínas Bomb em plantas transgênicas para controle de bactérias Gram-neoativas. se agentes de doenças de plantas ou não.

Antecipou-se que, quando plantas transgênicas produzindo proteínas Bomb possivelmente em combinação com produção de uma proteína lítica são plantadas em situações de campo, elas exibirão resistência não somente a doenças bacterianas Gram negativas das ditas plantas através de eliminação ou inibição de crescimento destas bactérias Gram-negativas, mas também elas matarão ou inibirão o crescimento de bactérias gram ne5 gativas como E. coli, Shigella spp. e Salmonella spp. que podem infectar as ditas plantas, mas sem causarem doença de planta. Tais plantas transgênicas podem ser tornar parte de um programa de segurança alvejado para reduzir a possibilidade de disseminação de doenças humanas através de contaminação de suprimento de alimento. Resistência em todos os casos é 10 antecipada ser obtida através de atuação combinada de compostois de defesa naturais produzidos pelas plantas transgênicas e as proteínas Bomb, junto com quaisquer enzimas líticas produzidas pelas plantas transgênicas.

Deve ser notado que como usadas neste relatório descritivo e as reivindicações apostas, as formas singulares “um", "e”, e "o" incluem refe15 rentes plurais a menos que os contextos claramente ditem de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "proteínas Bomb" inclui uma, duas, ou mais das proteínas Bomb ou seus fragmentos, independente da fonte; referência a "uma planta transgênica" inclui grandes números de plantas transgênicas e suas misturas, e referência "ao processo" inclui um ou mais processos ou 20 etapas do tipo aqui descrito.

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer processos e materiais, similares ou equivalentes àqueles aqui descri25 tos, possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os processos e materiais exemplares são aqui descritos. Todas as publicações aqui citadas são aqui incorporadas por referência para o propósito de exposição e específicos aspectos da invenção para a qul a publicação é citada.

As publicações aqui discutidas são unicamente providas por sua exposição antes da data de depósito do presente pedido de patente. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude de invenção anterior.

Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com suas específicas modalidades, será entendido que ela ainda é capaz de modificações e este pedido de patente é pretendido cobrir quaisquer variações, usos, 5 ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais partidas da presente exposição como vindo dentro de prática conhecida ou usual dentro da técnica à qual a invenção pertence e podem ser aplicados nas características essenciais mostradas anteriormente e como se segue no escopo das reivindicações apostas.

LiteraturaCitada

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Claims

1. Seqüência de ácidos nucleicos isolada compreendendo: a. uma seqüência de ácidos nucleicos de SE ID NO: 1 e suas substituições conservativas; b. uma seqüência de ácidos nucleicos com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a SEQ ID NO: 1; c. uma seqüência de ácidos nucleicos contígua com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos para uma seqüência de ácidos nucleicos contígua de pelo menos 50 pares de bases de SEQ ID NO: 1; d. uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza à seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização rigorosas; ou e. codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. Seqüência de ácidos nucleicos isolada consistindo essencialmente em: a. uma seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 e suas substituições conservativas; b. uma seqüência de ácidos nucleicos com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a SEQ ID NO: 1; c. uma seqüência de ácidos nucleicos contígua com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a uma seqüência de ácidos nucleicos de pelo menos 50 pares de bases de SEQ ID NO: 1; d. uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza à seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização rigorosas; ou e. codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

3. Seqüência de ácidos nucleicos isolada consistindo em: a. uma seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 e suas substituições conservativas; b. uma seqüência de ácidos nucleicos com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a SEQ ID NO: 1; c. uma seqüência de ácidos nucleicos contígua com pelo menos 70% de identidade de seqüência de ácidos nucleicos a uma seqüência de ácidos nucleicos contígua de pelo menos 50 pares de bases de SEQ ID NO: 1; d. uma seqüência de ácidos nucleicos que hibridiza à seqüência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização rigorosas; ou e. codifica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. Construto de ácidos nucleicos compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2, ou reivindicação 3.

5. Vetor compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2, ou reivindicação 3.

6. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

7. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira de acordo com a reivindicação 6, onde a planta é uma planta monocotiledônea.

8. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira de acordo com a reivindicação 6, onde a planta é uma planta dicotiledônea.

9. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta, ou planta inteira de acordo com a reivindicação 6, onde a planta é selecionada do grupo consistindo em um gerânio, tabaco, citrus e arroz.

10. Processo de transformação de uma célula de planta compreendendo introdução na célula de planta de uma seqüência de ácidos nucleicos isolada como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

11. Processo para aperfeiçoamento de resistência de uma planta a infecção ou infestação por bactérias Gram-negativas, se patogênicas ou não, compreendendo introdução no genoma de planta da dita planta a seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

12. Seqüência de ácidos nucleicos isolada como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3 operavelmente ligada a uma seqüência de ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NO: 3.

13. Seqüência de ácidos nucleicos isolada codificando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína compreendendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições de hibridização rigorosas; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

14. Seqüência de ácidos nucleicos isolada codificando um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína consistindo essencialmente em: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de ácidos amino nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SE ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou maior similaridade de seqüências de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

15. Seqüência de ácido nucleico isolada codificando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína consistindo em: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de ácidos amino nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições de hibridização rigorosas; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

16. Seqüência de ácidos nucleicos isolada codificando um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína tendo as seguintes características: a) ela foi derivada de um bacteriófago; b) ela carece de uma seqüência de aminoácidos sinal de secreção bacteriana; c) ela carece de um domínio transmembrana; d) quando expressa em uma bactéria, ela não causa lise, mas ao invés causa "quasilise", pelo que densidade ótica da cultura aumenta brevemente após indução e a seguir declina para aproximadamente a densidade ótica de partida; e e) quando expressa em uma bactéria crescida na presença de uma fitoalexina, ela causa "quasilise" e adicional morte de célula, pelo que a densidade ótica da cultura aumenta brevemente após indução e a seguir declina para um nível significantemente abaixo daquele da densidade ótica de partida.

17. Seqüência de ácidos nucleicos isolada de acordo com a reivindicação 13, reivindicação 14, reivindicação 15 ou reivindicação 16, ainda compreendendo o ácido nucleico de SEQ ID NO: 3.

18. Construto de ácido nucleico compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 13, reivindicação 14, reivindicação 15, reivindicação 16 ou reivindicação 17.

19. Vetor compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 13, reivindicação 14, reivindicação 15, reivindicação 16 ou reivindicação 17.

20. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira compreendendo a seqüência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 13, reivindicação 14, reivindicação 15, reivindicação 16 ou reivindicação 17.

21. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta, ou planta inteira de acordo com a reivindicação 20, onde a célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira faz com que insetos e nematódeos falhem em vicejar ou para evitar alimentação sobre a dita planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira devido a inibição ou morte de bactérias Gram - negativas simbióticas que são importantes para digestão ou sobrevivência do inseto ou nematódeo.

22. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, onde a planta é uma planta monocotiledônea.

23. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta, ou planta inteira de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, onde a planta é uma planta dicotiledônea.1

24. Célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira de acordo com a reivindicação 20, onde a planta é selecionada do grupo consistindo em um gerânio, tabaco, citrus e arroz.

25. Processo de prevenção, tratamento ou redução de uma infecção ou infestação bacteriana Gram - negativa de uma célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira, o dito processo compreendendo contato de uma planta, parte de planta, tecido de planta, ou planta inteira com um peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada tendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

26. Composição compreendendo um peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada tendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

27. Composição consistindo essencialmente em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada tendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

28. Composição consistindo no peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada tendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

29. Processo de prevenção, tratamento ou redução de infecção microbiana de uma célula animal, tecido animal, ou animal inteiro, o dito processo compreendendo contato de célula de animal, tecido de animal, ou animal inteiro com um peptídeo, polipeptídeo ou proteína isolada tendo: a. uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; b. uma seqüência de aminoácidos nucleicos com pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2; c. uma seqüência de aminoácidos que hibridiza à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 sob condições rigorosas de hibridização; ou d. uma seqüência de aminoácidos tendo 35% ou mais de similaridade de seqüência de aminoácidos sobre pelo menos 80 aminoácidos com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

30. Processo para aperfeiçoamento de resistência de uma célula de planta, uma parte de planta, tecido de planta ou planta inteira a infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas compreendendo introdução na célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira, de um cassete de expressão compreendendo como componentes ligados operavelmente: a) uma região promotora funcional em plantas; b) uma seqüência de ácidos nucleicos como definida na reivindicação 1, reivindicação 2, ou reivindicação 3; e c) uma região terminadora funcional em plantas; permitindo a expressão do cassete de expressão; e pelo que obtendo aperfeiçoada resistência da célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira a infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, ainda compreendendo autopolinização de plantas inteiras com o cassete de expressão introduzido ou polinização - cruzada de plantas inteiras com o cassete de expressão introduzido ou polinização - cruzada de plantas inteiras com o cassete de expressão introduzido para uma planta de sua mesma espécie.

32. Processo de acordo com a reivindicação 31, ainda compreendendo testes de plantas inteiras obtidas através de introdução de cassete de expressão para a presença do cassete de expressão ou aperfeiçoada resistência a infecção ou infestação por bactérias Gram - negativas para auto - polinização ou polinização - cruzada de plantas inteiras.

33. Processo de acordo com a reivindicação 31, ainda compreendendo colheita de quaisquer sementes produzidas como um resultado da autopolinização ou polinização - cruzada.

34. Processo de acordo com a reivindicação 32, ainda compreendendo germinação de sementes colhidas para produção de plântulas e testando células de planta, partes de planta, tecidos de planta ou plantas inteiras das plântulas germinadas para a presença do cassete de expressão ou aperfeiçoada resistência a infecção ou infestação por bactérias Gram negativas.

35. Cultura de tecido da célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira obtida através do processo de acordo com a reivindicação 30, onde a célula de planta, parte de planta, tecido de planta ou planta inteira obtida contem o cassete de expressão introduzido.

36. Planta inteira produzida como definida na reivindicação 30, onde a planta inteira compreende o cassete de expressão.

37. Processo de geração de planta compreendendo autofertilização de plantas inteiras como dfinidas na reivindicação 36, permitindo sementes formarem-se a partir de autopolinização e colhendo a resultante semente autofertilizada.

38. Processo de geração de planta compreendendo cruzamento de plantas inteiras como definidas na reivindicação 36, para outra planta da mesma espécie, permitindo formação de sementes e colhendo a resultante semente cruzada.

39. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde as bactérias Gram - negativas não são patogênicas para a planta.

40. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde a seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3 está localizada a jusante da dita região promotora.

41. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde a região terminadora está localizada a jusante da seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

42. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde um sinal de secreção funcional em plantas é operavelmente ligado à seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

43. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde um sinal de retenção de retículo endoplásmico (ER) funcional em plantas, está operavelmente ligado à seqüência de ácidos nucleicos como definidos na reivindicação 1, reivindicação 2 ou reivindicação 3.

44. Processo de acordo com a reivindicação 30, ainda compreendendo introdução no genoma de planta de uma segunda seqüência de ácidos nucleicos codificando um segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína que aperfeiçoa a resistência da planta a infecção ou infestação por um patógeno de planta.

45. Processo de acordo com a reivindicação 44, onde a segunda seqüência de ácidos nucleicos é incluída no cassete de expressão usado no processo de acordo com a reivindicação 30.

46. Processo de acordo com a reivindicação 44, onde o patógeno de planta é uma bactéria Gram - negativa.

47. Processo de acordo com a reivindicação 44, onde o segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína é um peptídeo lítico não-enzimático, um peptídeo lítico enzimático, ou um peptídeo degradando peptidoglicano enzimático.

48. Processo de acordo com a reivindicação 44, onde o segundo peptídeo, polipeptídeo ou proteína é selecionado do grupo consistindo em uma lisozima, uma endolisina, uma protease, uma enzima mureinolítico, uma enzima com atividade transglicosilase, uma lipase e uma esterase.

49. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde a planta é uma planta monocotiledônea.

50. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde a planta é uma planta dicotiledônea.

51. Processo de acordo com a reivindicação 30, onde a planta é selecionada do grupo consistindo em um gerânio, tabaco, citrus e arroz.