CN101952300A - 植物中表达的噬菌体外膜破坏蛋白用于控制革兰氏阴性细菌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供杀死或抑制感染、侵染植物或导致植物疾病的革兰氏阴性细菌生长的组合物和方法，所述革兰氏阴性细菌包括导致植物疾病或人类或动物饲料中的食物传播疾病的病原性、腐生性和条件性微生物。

Description

植物中表达的噬菌体外膜破坏蛋白用于控制革兰氏阴性细菌的应用

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年7月19日提交的美国临时申请No.60/950,749的权益，此处将该申请整体通过述及并入本文用于所有目的。

电子提交文本文件的描述

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技术领域

本发明涉及杀死或抑制在植物中感染、侵染或导致疾病的革兰氏阴性细菌的生长的方法，所述革兰氏阴性细菌包括在植物中导致疾病或在人类或动物饲料料中导致食物传播疾病的病原性、腐生性和条件性微生物。

背景技术

将此处所有出版物和专利申请通过述及并入，其范围如同每一篇独立出版物或专利申请被详细和单独的通过述及并入一样。

以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。其并非承认此处提供的任何信息是现要求保护的发明的现有技术或与之相关，也并非承认任何明确或隐含引用的出版物是现有技术。

为了商业化农业目种植的植物近乎总是作为一致的单种栽培来种植；也就是说，一种给定作物的单个变种通过无性繁殖或通过种子进行大规模生产，并以极大规模种植。当能克服给定变种的天然疾病抗性或抗虫性的病原体或害虫到来时，由于单种培养的实施会产生严重的经济损失，有时牵涉到给定地区全部作物的损失。大量应用农药控制病虫害是昂贵的、不环保的且经常不太可能。例如，柑橘溃疡病(citrus canker disease)，由受检疫的革兰氏阴性细菌病原体柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)引起，无法控制的席卷了整个佛罗里达。作为又一个例子，革兰氏阴性细菌病原体柑橘黄龙病菌(Ca.Liberibacter asiaticus)是一种USDA选择剂(USDA Select Agent)(潜在的生物恐怖剂；http://www.aphis.usda.qov/programs/ag_selectaqent/ag._bioterr_toxinslist.html)，其在2005年被引入佛罗里达并不可控制的蔓延整个佛罗里达。该病原体威胁了世界柑橘生产。作为第三个例子，革兰氏阴性细菌病原体茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)种3生物变体2(Race 3Biovar 2)曾多次被引入美国，并且其对于美国马铃薯生产如此具有严重威胁以致其也被列入USDA选择剂。该病原体通过感染天竺葵(geranium)植株而进入美国，但无症状，因此延误了对该病原体的检出。

作为第四个也是最后一个例子，已报道了由于革兰氏阴性细菌大肠杆菌的严重的人类疾病甚至死亡，该细菌能在内不感染-不仅是污染-特定作物植株，例如菠菜、苜蓿芽和绿豆芽。已报道了几次与有机培养的芽苗和生菜(mesclun lettuce)相关的沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌O157:H7的爆发(Doyle，M.P.2000.Nutrition 16：647-9)。根据FDA在其网站上对2006年在受污染菠菜中的大肠杆菌的爆发的报道(http://www.cfsan.fda.qov/～dms/spinacqa.html)：“迄今为止，已向CDC报道了204例由大肠杆菌O157:H7感染引起的疾病，包括31例涉及一种称为溶血性尿毒性综合征(HUS)的肾衰竭，104例入院治疗，和3例死亡。首例死亡是威斯康辛州的一名大龄妇女；第二例死亡，是爱达荷州的一名2岁儿童，而第三例死亡，是内布拉斯加州的一名大龄妇女”。常规植物育种来控制这些植物病或食物传播污染已被证实不可能。因此紧急和迫切的需要基因工程技术提供植物(包括载体植物如天竺葵)，所述植物对其天然易感的或耐受的疾病或害虫具有抗病性和抗虫性。

广泛多样的抗细菌和抗真菌蛋白已被鉴定，且其基因已从动物和植物二者中分离。由于真菌，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁结构的显著不同，这些蛋白中许多只攻击真菌或革兰氏阳性细菌，这两者具有直接暴露于环境的细胞壁。革兰氏阴性细菌不具有直接暴露于环境的细胞壁。相反，它们的细胞壁被独特的外膜结构所包被和保护，即脂多糖(LPS)屏障，其提供非常有效的附加屏障来保护它们的细胞壁免受大多数真核防御，尤其是植物防御。USDA作为选择剂列出的病原体中绝大多数是细菌病原体，并且其均为革兰氏阴性。

LPS为革兰氏阴性细菌针对外部产生的酶提供有效防御，所述外部产生的酶能够有效降解细菌细胞壁(也称胞壁质层)，包括革兰氏阳性细菌和真菌的相对厚但暴露的细胞壁。例如，溶菌酶是抗微生物剂，其发现于哺乳动物细胞、昆虫、植物、细菌和病毒中，其破坏细菌和真菌细胞壁，特异性切割再生胞壁肽的氨基糖间的键(微生物细胞壁的N-乙酰胞壁酸的C-1和N-乙酰葡萄糖胺的C-4(Ibrahim等.2001及其参考文献))。一些溶菌酶也是多效裂解蛋白，意味着它们在杀死革兰氏阴性和阳性细菌方面有活性，但这种活性不是由于溶菌酶的酶促作用，而是特定的由于一种短线性肽片段，该片段是一些溶菌酶的降解产物；是所述溶菌酶的线性降解产物穿透LPS屏障和细胞壁(但均无损害)，到达内膜并透化内膜，导致裂解(During等，1999；Ibrahim等.2001)。但是，这种线性肽活性在植物中作用不佳(见下文)。

那些显示杀死革兰氏阴性细菌的抗微生物蛋白大多数是小肽(长度小于50个氨基酸的蛋白质)，其为两亲性的并荷正电，因此他们被吸引到带负电的革兰氏阴性外膜，其足够小而可以穿过暴露的LPS，并且也可以穿过相对薄的革兰氏阴性细胞壁。这些肽通常发挥透化内膜的作用，直接引起细胞死亡。在刚过去的20年内，在病毒、昆虫、植物和动物中发现了超过500种的抗微生物肽(Jaynes等，1987；Mitra and Zhang，1994；Broekaert等.1997；Nakajima等，1997；Vunnam等，1997)。其中描述最好的是在来源生物体和人工媒介中对病毒、细菌、真菌、寄生虫和甚至肿瘤细胞有广谱活性的肽(Hancock and Lehrer，1998)。

迄今在这些抗微生物肽中描述最广泛的组是线性的(如，杀菌肽(cecropins)、天蚕抗菌肽(attacins)和爪蟾抗菌肽(magainins))。但是，线性肽并不在植物中天然存在，并且大多数线性肽被植物蛋白酶迅速降解。例如，当与植物细胞间液一起温育时，杀菌肽B迅速降解，其半衰期从在马铃薯中的约3分钟到在稻中的约25小时(Owens & Heutte，1997)。表达杀菌肽的转基因烟草植株只有轻微增加的抗(革兰氏阴性)丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomanas syringae pv.tabaci)抗性，该菌是烟草野火病(tobacco wildfire)(Huang等1997)的起因。合成的杀菌肽类似物Shiva-1和SB-37(表达自马铃薯植株中的转基因)只轻微降低由(革兰氏阴性)胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)引起的细菌感染(Arce等1999)。表达SB-37肽的转基因苹果在田间试验中只显示了轻微增加的对(革兰氏阴性)解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)的抗性(Norelli等1998)。类似的，表达天蚕抗菌肽的转基因马铃薯显示了对胡萝卜软腐欧文氏菌引起的细菌感染的抗性(Arce等1999)，且表达天蚕抗菌肽基因的转基因梨和苹果也已显示了轻微增强的对解淀粉欧文氏菌的抗性(Norelli等1994；Reynoird等1999)。也发现了天蚕抗菌肽E由植物迅速降解(Ko等2000)。表达合成爪蟾抗菌肽类似物的转基因烟草植株对细菌病原体胡萝卜软腐欧文氏菌仅有轻微抗性，该类似物经修饰而对胞外植物蛋白酶较不敏感(Li等2001)。

二硫键连接的肽(如防卫素(defensins)、prophenins和奇甜蛋白(thaumatins))当在植物中表达时显示了更有前景的稳定性，但抗性要么弱，未证明，要么产生细胞毒性问题。母鸡卵白溶菌酶基因(具有裂解活性)已被用于为转基因烟草植株赋予弱革兰氏阴性细菌疾病抗性(Trudel等1995；Kato等1998)。也已报道了噬菌体T4溶菌酶轻微增强转基因马铃薯对胡萝卜软腐欧文氏菌的抗性(During等1993；Ahrenholz等.，2000)以及在转基因苹果中对解淀粉欧文氏菌的抗性(Ko 1999)。但是，如先前所述，溶菌酶对革兰氏阴性细菌的作用是特定地由于一种据推测对蛋白酶敏感的短裂解肽片段(Ibrahim等.2001)。奇甜蛋白表现出迄今表征的最广泛的抗微生物活性，但也表现出对真核细胞的强力细胞毒性作用(Taguchi等2000)。由植物、哺乳动物和昆虫产生的防卫素的特征是复杂的β-折叠结构，带有几个结合和破坏微生物质膜的二硫键。一种来自苜蓿的植物防卫素针对真菌病原体提供强力抗性(Guo等2000)，而来自菠菜的防卫素在体外对革兰氏阳性和阴性细菌有活性(Segura等.1998)。但是，感染了肠细菌的苜蓿和菠菜二者已导致了人类疾病的产生；显然这些防卫素要么不是由这些细菌触发，要么对这些细菌无效。迫切需要更有效的抗细菌剂来保护作物植株。

非酶的抗微生物肽在自然界中是丰富的，但在转基因植物中含量有限(of limited value)，主要由于植物蛋白酶的降解。此外，一些革兰氏阴性细菌即使在培养基中也对抗微生物肽有抗性，因为LPS的化学结构中的变异(Gutsmann等.，2005)。这可以帮助解释为什么植物病原细菌能克服宿主植物防卫素。迄今，当在植物中表达时没有证明抗菌肽有除了针对革兰氏阴性细菌的边缘效果之外的效果。迫切需要更有效的控制植物疾病的方法。

与动物的细菌病原体相比，植物的细菌病原体中的绝大多数均为革兰氏阴性。如上所述，革兰氏阴性细菌的区别特征是存在LPS，其形成一种完全围绕细胞壁的外膜。影响柑橘的一种(革兰氏阴性)细菌植物病原体LPS结构的突变引起该病原体在柑橘上迅速消失，但在大豆(bean)上没有，表明LPS结构在避免特定植物的植物化学防御中的重要性。此外，影响革兰氏阴性细菌中多药运出的突变导致细菌在植物中迅速消失，凸显了低分子量植物防御化合物(植物抗毒素)在植物防御中的作用，并进一步表明革兰氏阴性菌的完整LPS在抵抗植物防御化合物中的重要性(Reddy等.，2007)。多药运出需要完整的LPS行使功能。

动物针对微生物入侵具有一套独特的固有防御，不依赖于在先暴露给病原体(Hoffman等.，1999)。其中有上面讨论的裂解肽，也有嗜中性粒细胞，一种作为先天免疫系统一部分的白细胞。嗜中性粒细胞产生多种杀死微生物的蛋白质和肽抗生素。其中有杀细菌/渗透性增强(BPI)蛋白，其是一种强力的抗微生物蛋白，主要对革兰氏阴性细菌有活性(Levy，2000)。BPI对革兰氏阳性细菌、真菌或动物细胞无毒，但却攻击革兰氏阴性细胞的LPS层，破坏其结构并最终攻击内膜和导致裂解(Mannion等.，1990)。BPI蛋白的一个标志是他们的强阳离子性、富含赖氨酸的本质，以及其调理能力或免疫系统激活能力(Levy等.，2003)。BPI蛋白家族成员包括脂多糖结合蛋白(LBP)，肺特异性X蛋白(LUNX)，颚、肺和鼻上皮克隆(PLUNC)和腮腺分泌性蛋白(PSP)，其中许多是通过生物信息学技术鉴定的，家族成员之间具有高达43％的同一性(Wheeler等.2003)。涵盖BPI和特定的较小的肽衍生物的用途的专利有许多(例如，US 5,830,860和US 5,948,408)。

抗微生物的噬菌体蛋白

所有噬菌体必须逃脱细菌宿主细胞，要么通过从宿主细胞挤出，如对于丝状噬菌体，要么通过宿主细胞从内裂解。宿主细胞从内裂解需要两个事件：穿过革兰氏阴性和革兰氏阳性两种细菌的内膜的能力，和解聚在革兰氏阳性细胞壁中相对厚的胞壁质层的能力。

噬菌体穿入并流出通过内膜在许多(但显然不是所有)噬菌体中是通过使用称为“穴蛋白(holin)”的小膜定位蛋白完成的，显示该蛋白积累于细菌内膜直到达到特定浓度，此时它们被认为进行自组装以透化内膜(Grundling等.，2001；Wang等.2000；Young等.，2000)。术语“穴蛋白”和“类穴蛋白(holin-like)”在生化上或者甚至在功能上都不是准确的术语，但相反如此处所用，意指任何具有至少一个能透化内膜的跨膜结构域的噬菌体蛋白，由此允许穴蛋白之外的通常由内膜隔离的胞质内分子(包括诸如内溶素等的蛋白质)攻破或穿过内膜以达到细胞壁。穴蛋白的生化功能是推测的；大多数(如不是所有的)关于穴蛋白的现有知识是基于λ噬菌体S蛋白(Haro等.2003)。

穴蛋白由至少35个不同家族中的基因编码，有至少一个跨膜结构域并分为三种拓扑学类型(类型I、II和III，分别具有三、二和一个跨膜结构域[TMD])，都没有检测到的直向同源关系(Gmndling等.，2001)。已知至少两种穴蛋白是溶血的，且该溶血功能被假设在特定细菌对昆虫和线虫的发病机理中起作用(Brillard等.，2003)。只有少数已在体内功能方面进行了表征，导向至少两种关于它们可能如何发挥功能的非常不同的理论。最为广泛接受的理论是：穴蛋白行使功能形成寡聚膜孔(Graschopf & Blasi，1999；Young等.，2000)。

胞壁质层的解聚是通过称为内溶素的裂解酶完成的。内溶素有至少三种功能不同的类型：1)葡萄糖胺酶(溶菌酶)，其攻击肽聚糖的氨基糖间的糖苷连接；2)酰胺酶，其攻击聚糖链和交联肽之间的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺连接，和3)内肽酶，其攻击肽间桥连接(Sheehan等.，1997)。内溶素的合成未使用可允许其接近肽聚糖(胞壁质)层的输出信号序列，并且因此其通常在噬菌体感染的细菌的细胞质中积累，直到其通过穴蛋白活性释放(Young andBlasi，1995)。

溶菌酶已被建议作为能用作对抗革兰氏阳性和阴性两种细菌的外部作用剂的有用抗生素，因为至少它们中的一些是多功能的(During等.，1999)。该双重功能性是基于发现T4噬菌体和母鸡卵白溶菌酶都具有葡萄糖胺酶(glucosaminidase)活性和使其能够穿透并破坏细菌、真菌和植物的膜的两亲性螺旋状伸展(During等.，1999)。溶菌酶的杀微生物活性能受到C-末端添加的影响；添加疏水性氨基酸降低对革兰氏阳性细菌的活性，但增加对革兰氏阴性的大肠杆菌的活性(Arima等.，1997；Ito等.，1997)。向T4溶菌酶添加组氨酸，一种亲水性氨基酸，使其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的抗微生物活性加倍(During等.，1999)。

溶菌酶的非酶促杀微生物功能似乎缘于两亲的C-末端结构域，该结构域可由模仿C-末端溶菌酶结构域构建的小合成肽所模拟(During等.，1999)。如上所述，已建立了表达溶菌酶并对特定植物病原体有某种抗性的转基因植物。因为大多数内溶素在细菌细胞中积累到高效价而不引起裂解，所以预期除特定溶菌酶如T4之外的内溶素如果在外部施用不会攻击革兰氏阴性细菌，因为革兰氏阴性细菌被由LPS和脂双层组成的外膜包围，其会保护胞壁质层免受酶攻击，如同其内膜一样有效。

已有尝试使用完整噬菌体处理动物和植物的细菌病。所有这些尝试在其用途上都有严重局限。例如，美国专利5,688,501公开了一种使用完整噬菌体处理动物感染性疾病的方法，该噬菌体对于该疾病的细菌引发剂是特异性的。美国专利4,957,686公开了一种使用完整噬菌体预防龋齿的方法，该噬菌体对于龋齿的细菌引发剂是特异性的。Flaherty等(2000)描述了一种使用完整噬菌体治疗植物的感染性疾病的方法，该噬菌体对于该疾病的细菌引发剂是特异性的。在所有这些使用完整噬菌体的例子和类似例子中，噬菌体必须粘附细菌宿主，且这种粘附具有高度宿主特异性，将噬菌体的应用限制于特定的细菌宿主种，并且有时是特定的细菌宿主株。此外，为发生粘附，细菌必须在正确的生长期，且噬菌体必须能接近细菌，细菌经常深埋在动物或植物的组织中或被部分通过分泌细菌胞外多糖(EPS)而形成的细菌生物膜掩蔽。

已尝试过通过用表达胞外脂多糖(Eps)降解酶(EPS-解聚酶)的转基因植物治疗梨和苹果树的解淀粉欧文氏菌细菌感染，该酶衍生自解淀粉欧文氏菌噬菌体。但是，充其量，获得的抗性水平较弱，且噬菌体EPS-解聚酶对来自解淀粉欧文氏菌的EPS特异性很高。显然需要更有效的且更通用的对策。

已尝试过通过使用裂解酶制备物治疗动物的(而非植物的)革兰氏阳性细菌疾病，该酶制备物从感染了噬菌体的细菌或从表达噬菌体基因的细菌中提取。这些也有严重的局限性。例如，美国专利No.5,985,271公开了一种通过使用粗特异性内溶素制备物治疗一种由特定革兰氏阳性菌-链球菌(Streptococcus)引起的动物疾病的方法。类似的，美国专利No.6,017,528公开了一种通过使用粗特异性内溶素制备物预防和治疗动物链球菌感染的方法。类似的，WO 01/90331和US 2002/0058027公开了通过使用由特异性内溶素组成的纯化制备物预防和治疗动物链球菌感染的方法。在所有这些例子中，酶制备物必须是纯化的、缓冲的，并制备好以便运输到目的区域并保存在目的地点。此外，该酶必须能接近感染细菌，并有足够的量以杀死生长中的细菌。这些方法中没有可以用于治疗革兰氏阴性细菌的，因为内溶素不能穿过此种细菌的外膜。

已尝试过通过使用裂解酶制备物治疗动物的(而非植物的)革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌疾病，该酶制备物从感染了噬菌体的细菌或表达噬菌体基因的细菌中提取。WO 01/51073、WO 01/82945、WO 01/019385、US2002/0187136和US 2002/0127215公开了通过使用裂解酶预防和治疗动物的多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌感染的方法，所述裂解酶任选地包括特异性“穴蛋白裂解酶”或“穴蛋白酶”。

由于并未已知穴蛋白显示酶功能，且由于这些穴蛋白裂解酶的例子在WO 01/51073、WO 01/82945、WO 01/19385、US 2002/0187136和US2002/0127215中未被阐明或教导，这些酶似乎代表了一种理论上的且未通过定义其期望的特征或性质而被阐明的酶。正如相同的发明人在他处正确地表述“穴蛋白不具有酶活性”(参考WO 01/90331，9页12行)。形成全部这些PCT公开文本中公开的方法之基础的裂解酶，在其中定义为“本发明基于发现了对受特定噬菌体感染的细菌为特异性的噬菌体裂解酶能有效力并有效率的降解所述细菌的细胞壁。同时，酶底物在哺乳动物组织中不存在......”(WO 01/51073的第四页第三段)。“细菌噬菌体产生的裂解酶对杀死选择的细菌是特异性的和有效的”(第7页第2段)。

在WO 01/51073的权利要求3中使用的术语“穴蛋白酶”意指在权利要求1中的定义的酶，其定义为“由裂解酶、修饰的裂解酶及其组合组成的组......”。可在WO 01/82945、WO 01/019385、US 2002/0187136和US2002/0127215的权利要求中发现类似的参考。这些专利申请中无一篇以任何方式公开或要求保护缺少酶活性的穴蛋白或其它噬菌体衍生蛋白质的用途，包括化合物的分子式或治疗动物或植物疾病的方法。

WO 02/102405公开了一种通过包埋纯化制备物预防动物食物中毒的方法，该制备物由特定裂解酶和任选的特定裂解性“穴蛋白酶”组成。同样，由于已知穴蛋白不表现酶活性，不清楚除了一种理论性的且未通过定义期望的特征或性质来阐明的酶之外，在权利要求中还教导或详细描述了什么。

已有人提出的是，若来自攻击革兰氏阴性细菌性植物病原体的噬菌体的内溶素基因被克隆并在植物中表达，其可能能有效提供对该病原体的抗性(Ozawa等.，2001)。这种提议几乎不太可能，由于不知道除T4溶菌酶外的内溶素可穿过细菌的膜，且革兰氏阴性细菌有独特的外膜，即LPS屏障，其提供强有力的环境屏障，对于大多数分子都是不能通过的。

已证明了来自感染茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的噬菌体的基因编码一种裂解肽，该肽能裂解多种茄科雷尔氏菌菌株(Ozawa等.2001)。这些作者提出，这种未公开序列的裂解肽可能能用于增强转基因烟草植株中对茄科雷尔氏菌的抗性。但是，没有教导或提议这种裂解肽对特定茄科雷尔氏菌菌株以外的任何细菌有杀菌或抑菌能力。实际上，这种具有明显种特异性的裂解肽在大肠杆菌中表达而未被报道对生产大肠杆菌菌株有损害(Ozawa等.2001)。这并非不可预料，因为噬菌体对其细菌宿主菌株具有高度特异性，且通常局限在给定宿主种中的一小亚组菌株的范围内。迫切需要增强植物针对比一个病原种的若干菌株更大范围的病原体的抗性的方法。

在所有在先公开的例子中，已报道或提出噬菌体基因用在转基因方法中，该噬菌体基因或者编码酶，或者在一个例子中，编码有高度种特异性的裂解肽。在所有在先公开的掺入、使用或描述噬菌体制备物的例子中，涉及酶和酶制备物。这些酶必须是纯化的、缓冲的、制备好以便运往目的区域并保存在目的地点。

因此，现有技术并未教导或描述对革兰氏阴性细菌具有广泛抗微生物活性的噬菌体蛋白的鉴定或用途。现有技术也没有教导编码对革兰氏阴性细菌具有广泛抗微升物活性的噬菌体蛋白的基因的用途。尤其是，现有技术并未教导为控制植物革兰氏阴性细菌感染而使用能使外菌膜(细菌脂多糖或LPS屏障)丧失稳定性或透化的噬菌体蛋白。

发明简述

如在本文在别处所述，基于一种先前从未描述的这里称为噬菌体外膜破坏(Bacteriophage Outer Membrane Breaching)(BOMB)蛋白的噬菌体蛋白的作用，本发明提供使外膜(LPS屏障)去稳定性和透化的方法。本发明部分基于我们发现了BOMBs不仅破坏且使革兰氏阴性细菌外膜失去稳定性。该作用不但发生在当BOMB合成于细菌细胞内时，并且也发生在当BOMB在外部施用时。推测BOMB的外膜失稳活性使植物和/或其它微生物分泌的天然防御分子也可对靶细胞外膜进行破坏，因此损害(compromise)革兰氏阴性细菌外膜的“屏障作用”。Kingsley等.，(1993)提供了有力的证据，表明植物病原菌外膜在阻止植物防御分子杀死细菌中起屏障作用。本发明也提供了酶促细胞壁解聚的并入(incorporation)，其是基于称为内溶素的肽聚糖降解噬菌体蛋白，并提供了以一系列基因融合和以所述基因融合为模型的全合成基因进行的BOMBs和内溶素功能二者的并入。

本发明提供：1)广谱BOMBs的鉴定方法，其具有高水平非酶活性以对微生物外膜进行破坏并因此增加天然植物防御化合物和人工应用化合物的效力；2)基因融合中维持和增加BOMBs的抗微生物和抗虫效力所需的条件；3)通过使用木质部增强性启动子和将BOMB蛋白引向植物质外体和木质部的前导肽而使在植物中表达的BOMBs有效靶向的方法；4)通过基因融合物的表达来控制植物革兰氏阴性细菌疾病的方法，所述基因融合物包括BOMBs和BOMB片段、C-末端添加和前导肽，和任选的内溶素和/或脂肪酶；5)增加切花贮藏期的方法；和6)用于生产基于BOMBs和BOMB片段的新抗微生物蛋白的转基因植物。

本发明人现已发现特定噬菌体携带编码除穴蛋白和内溶素以外的协助噬菌体破坏宿主细胞(特别是破坏只在革兰氏阴性细菌中发现的细菌外膜或LPS层)的蛋白质的基因。进一步发现了至少一种这样的细菌外膜破坏(BOMB)蛋白从细胞外发挥作用以损害细菌LPS外膜的完整性。进一步发现了在革兰氏阴性细菌中表达BOMB蛋白抑制培养中细菌的生长，并发现当与洗涤剂、裂解蛋白如特定溶菌酶或植物防御化合物例如盐酸小檗碱一起使用时，则发生生长抑制和/或裂解。因此发现了BOMB蛋白不仅能对培养基中的革兰氏阴性细菌具有直接抑制作用，而且其效果与导致裂解的酶或毒性的化合物具有协同作用。进一步发现了BOMB蛋白损害细菌LPS屏障而非内膜的完整性。进一步的，本发明人已经1)鉴定、克隆并在大肠杆菌中表达天竺葵黄单胞菌(Xanthomonas pelargonii)噬菌体Xp15BOMB蛋白BC；2)可操作的将bombBC基因单独与基因表达盒中的植物启动子融合；3)在多个不同转基因植物中表达功能性BombBC，包括单子叶植物和双子叶植物，包括番茄、烟草、天竺葵、柑橘和稻；4)杀死或抑制所述植物的许多不同革兰氏阴性病原体的生长，为所述植物赋予增强的疾病抗性或免疫性。因此也发现了BombBC，和更概括而言BOMBs，在单子叶植物和双子叶植物二者中可以功能性表达以增强植物的天然疾病抵御机制。

本发明因此提供强有力增强植物中对革兰氏阴性细菌的疾病抗性的通用方法，无论该细菌是否是植物病原体，所述方法包括向植物中引入基因表达盒，其可操作的融合了：1)在植物中有功能的启动子；2)BOMB基因或基因片段，其功能是在植物中表达活性BOMB蛋白；3)在植物中有功能的转录终止子区；和4)获得在所述植物中生产BOMB的所述基因的表达。

在一个实施方式中，上述表达盒含有功能为在植物中表达活性BOMB蛋白的BOMB基因或基因片段，该表达盒具有在植物中有功能的植物分泌信号序列，其可操作地融合到所述BOMB基因或基因片段的氨基末端。

本发明进一步提供核酸分子，其可操作地连接到一种或多种表达控制元件上，包括含有分离的核酸分子的载体。本发明的核酸序列可天然产生或使用核酸制备领域技术人员熟知的方法合成产生。

本发明进一步包括含有本发明的核酸分子的转化的宿主细胞，和产生肽、多肽或蛋白质的方法，该方法包括在表达蛋白质的条件下培养用本发明核酸分子转化的宿主细胞的步骤。

本发明提供包含本发明核酸构建物的载体，以及包含本发明的载体的宿主细胞、重组细胞和转基因组织和生物体。更具体地，本发明提供这样的细胞或转基因组织和生物体，其就所述核酸构建体而言是半合子的、杂合的或纯合的，其中如果生物体是植物，其可是单倍体、二倍体或多倍体。本发明的一个目标是提供这样的细胞和转基因组织和生物体，其中它们表达单拷贝或多拷贝的本发明的一种或多种BOMB蛋白或类BOMB(BOMB-like)直向同源蛋白产物。表达多拷贝的BOMB蛋白、或类BOMB蛋白、突变BOMB或类BOMB蛋白、或BOMB或类BOMB直向同源蛋白之一的，或表达多于一种BOMB或类BOMB蛋白，突变BOMB或类BOMB蛋白，或BOMB或类BOMB直向同源蛋白的，或表达携带BOMB或类BOMB蛋白的翻译或转录基因融合体的细胞或转基因组织和生物体可望，例如，产生对许多不同革兰氏阴性细菌的广谱抗性或耐受性，无论是否为病原体，是条件性的还是腐生性的。

革兰氏阴性细菌是特别的具有LPS的细菌，包括但不限于下述属：土壤杆菌属(Agrobacterium)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas)和木杆菌属(Xylella)。

根据本发明，可以向实事上所有植物中赋予对革兰氏阴性细菌(包括但不限于，以上指明的病原菌属)的抗性或增加的抗性。在作物植物中特别需求这种抗性的产生，无论所述作物植物是农学的还是园艺学的，无论用于粮食作物还是观赏植物。也特别需求消除对人类和动物为病原性的、在一些植物中无症状携带的革兰氏阴性细菌，所述植物如新鲜的苜蓿和豆芽、莴苣和菠菜。也特别需要消除在一些植物(例如观赏植物，包括天竺葵)中无症状携带，但能在其它植物(例如作物植物，包括马铃薯)上引发疾病的革兰氏阴性细菌。也特别需求消除可由作物植物(例如柑橘或天竺葵)携带的USDA选择剂。也特别需求延长切花的贮藏期，由于其被腐生的革兰氏阴性细菌攻击。

本发明因此也涉及制备转化的植物细胞和植物(包括种子和植物所有部分)的方法，其对无论是否是植物病原性的革兰氏阴性细菌的感染或侵染具有增加的抗性或免疫性。该方法提供一种或多种BOMB基因，BOMB基因融合物，和将这些基因和融合物导入植物细胞基因组，随后将所述基因导入植物细胞，从所述细胞再生整株转化的植株，为转基因植物提供针对革兰氏阴性细菌的疾病、感染或侵染的抗性和免疫性。本发明描述了使用BOMB基因控制转基因植物中的疾病、感染或侵染，从而：1)控制疾病以其他方式(otherwise)影响所述转基因植物，2)使所述转基因植物避免成为影响其它动植物的疾病(如，医院感染或在动物饲料中)的载体，和3)若植株和根部分离(如，切花，嫁接)，则延长该转基因植株的贮藏期。

为将BOMB基因引入单子叶植物或双子叶植物的植株或植物细胞，本领域技术人员可使用多种方法，包括但不限于，使用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和不同的Ti-质粒变体，使用根瘤菌属菌种(Rhizobium spp)、中华根瘤菌属菌种(Sinorhizobium spp)或中生根瘤菌属菌种(Mesorhizobium spp.)(Broothaerts等.，2005)和不同的Ti-质粒变体，使用电穿孔、粒子轰击、纤维性碳化硅晶须或非纤维性碳化硅粉末。为再生整全转基因植物(包括单子叶植物和双子叶植物二者)，本领域技术人员可采取多种方法。此处所用术语“植物/植株”是指完整植物/植株和植物/植株的部分，包括种子、块茎、插条等。

本发明进一步提供用于在例如植物中检测本发明的BOMB或类BOMB蛋白、或突变体、或同源物(homolog)、或直向同源物的表达的核酸探针，所述植物或是已经被遗传改变以表达至少一种所述蛋白的植物，或是可天然表达BOMB或类BOMB蛋白、或其突变体、同源物或直向源物。

本发明也提供噬菌体P15ORF“BC”(bombBC：SEQ ID No.1)的分离的核酸序列及其补体，及其相应的编码BombBC肽的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。本发明进一步提供SEQ ID No.1的所有可能的变异和重复，包括但不限于其相应的DNA序列，编码序列，基因组序列，RNA序列，干扰RNA(RNAi)序列，双链RNAi(dsRNA)序列，微小RNA(miRNA)序列，小干扰RNA(siRNA)序列，表达RNAi(eRNAi或eiRNA)序列，反义序列，互补DNA(cDNA)序列，反向cDNA序列等。

本发明也提供自SEQ ID No.1制备的引物，其可用于定位和鉴定任何原核或真核生物体中的同源物或直向同源物。本发明也提供使用这些引物获得和分离SEQ ID No.1的这些同源物或直向同源物的方法。

本发明也提供使用全部或部分SEQ ID No.1的序列通过检索核酸序列数据库鉴定同源物或直向同源物的方法。这样的数据库的例子包括但不限于玉米、稻和拟南芥(Arabidopsis)的基因组数据库。这些序列检索方法是本领域技术人员熟知的。

本发明也提供在严紧条件下与SEQ ID No.1杂交的任何核酸序列。该条件为本领域技术人员所熟知，使用由例如Sambrook等(1989)教导的方法，但通常是低于目标分子经计算的解链温度(T_m)大约20摄氏度的温度和盐浓度的组合。解链温度通常使用Bolton和McCarthy(1962)的公式计算。

本发明进一步提供分离的核酸分子及其补体，其编码的序列与SEQ IDNo.1具有至少约65％序列同一性，或至少约70％序列同一性，或至少约75％序列同一性，或至少约80％序列同一性，或至少约85％序列同一性，或至少约86％序列同一性，或至少约87％序列同一性，或至少约88％序列同一性，或至少约89％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约91％序列同一性，或至少约92％序列同一性，或至少约93％序列同一性，或至少约94％序列同一性，或至少约95％序列同一性，或至少约96％序列同一性，或至少约97％序列同一性，或至少约98％序列同一性，或至少约99％序列同一性，或至少约99.5％序列同一性，或至少约99.9％与SEQ ID No.1的序列同一性。本发明也提供编码具有BOMB活性的肽或蛋白质的任何此类核酸。

本发明进一步提供分离的氨基酸，其编码的序列与SEQ ID No.2具有至少约65％序列同一性，或至少约70％序列同一性，或至少约75％序列同一性，或至少约80％序列同一性，或至少约85％序列同一性，或至少约86％序列同一性，或至少约87％序列同一性，或至少约88％序列同一性，或至少约89％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约91％序列同一性，或至少约92％序列同一性，或至少约93％序列同一性，或至少约94％序列同一性，或至少约95％序列同一性，或至少约96％序列同一性，或至少约97％序列同一性，或至少约98％序列同一性，或至少约99％序列同一性，或至少约99.5％序列同一性，或至少约99.9％与SEQ ID No.2的序列同一性。本发明也提供这些氨基酸序列编码的肽和蛋白质，包括具有BOMB活性的。

本发明也提供一种权利要求2的DNA编码区，其由bombBC(SEQ ID No.1)或任何由在50个碱基对的序列段(stretch)上具有70％DNA序列同一性的序列段组成的DNA序列组成。这是一个实践性的标准，被Food Allergy ResearchResource Program用于根据蛋白质或DNA编码序列确定一种蛋白质是否可能与任何已知变应原相似。

本发明也提供肽片段，其由BombBC(SEQ ID No.2)中至少8个连续氨基酸组成，或任何肽片段或蛋白质，其在80个氨基酸上与BombBC(SEQ IDNo.2)具有35％或更高相似性。这是一个实践性的标准，被Food AllergyResearch Resource Program用于根据蛋白质或DNA编码序列确定一种蛋白质是否可能与任何已知变应原相似。

本发明提供分离的核酸序列，其包含、其基本上的组成为或其组成为SEQ ID No.1的核酸序列及其保守取代物；核酸序列，其与SEQ ID No.1具有至少70％核酸序列同一性；连续核酸序列，其与SEQ ID No.1至少50个碱基对的连续核酸序列具有至少70％核酸序列同一性；核酸序列，其在严紧杂交条件下与SEQ ID No.1的核酸序列杂交；或编码SEQ ID No.2的氨基酸序列。本发明也提供含有这些核酸序列的核酸构建体、载体、植物细胞、植物部分、植物组织和完整植株。植物可以是任何植物，例如任何单子叶植物或任何双子叶植物。在本发明中有用的此类植物的例子包括但不限于天竺葵、烟草、柑橘和稻。本发明也提供转化植物细胞的方法，包括将本发明分离的核酸序列导入植物细胞。

本发明也可在转化或处理藻类的细菌感染中发现用途，包括用本发明提供的序列转化藻类。

本发明也提供增强植物对革兰氏阴性细菌感染或侵染的抗性的方法，无论所述细菌是否为病原性的，所述方法包括将本发明的核酸序列导入所述植物的基因组中。

本发明也提供分离的肽、多肽或蛋白质，其包含、其基本上的组成为或其组成为SEQ ID No.2的氨基酸序列；具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；在严紧条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

本发明也提供衍生自噬菌体的分离的肽、多肽或蛋白质；缺少细菌分泌信号氨基酸序列；缺少跨膜结构域；当其在细菌中表达时不引起裂解，而是引起“拟裂解”，就此诱导后不久培养物的光密度增加且此后下降到约初始光密度；且当于在植物抗毒素存在下生长的细菌中表达时，其导致“拟裂解”和额外的细胞死亡，就此诱导后不久培养物光密度增加且此后下降到明显低于初始光密度的水平。

本发明的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株也能导致昆虫和线虫不能茁壮成长(thrive)或避免其以所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株为食，这是由于抑制或杀死了对昆虫或线虫的消化或生存重要的共生革兰氏阴性细菌。

本发明也提供了阻止、处理或降低革兰氏阴性细菌感染或侵染植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株的方法，所述方法包括将植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株与本发明分离的肽、多肽或蛋白质相接触。

本发明也提供组合物，其包含本发明的分离的肽、多肽或蛋白质。这样的组合物的例子包括但不限于种子处理，例如种子包被，和这样的组合物的其它形式包括但不限于喷雾剂(spray)、粉末、浆(slurry)、粉尘(dusting)等。

本发明提供阻止、治疗或降低动物细胞、动物组织或完整动物的微生物感染的方法，所述方法包括将动物细胞、动物组织或完整动物与本发明的分离的肽、多肽或蛋白质接触。所述肽、多肽或蛋白质可包括在用于治疗这些动物的组合物中。这些组合物的例子包括但不限于喷雾剂、粉末、浆、补片(patch)、植入物等。

本发明提供阻止、处理或降低表面或设备(例如用于制备食物的工作台或医疗设备)的微生物感染的方法，所述方法包括将该表面或设备与本发明的分离的肽、多肽或蛋白质相接触。所述肽、多肽或蛋白质可包括在用于处理这样的表面和设备的组合物中。这样的组合物的例子包括但不限于涂料、洗涤剂、喷雾剂、粉末、浆、补片、植入物等。

本发明提供增强植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株对革兰氏阴性细菌感染或侵染的抗性的方法，包括向所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株中引入表达盒，该表达盒包括作为可操作连接元件的：a)在植物中有功能的启动子区；b)权利要求1、权利要求2或权利要求3的核酸序列；和c)在植物中有功能的终止子区；随后使该表达盒表达；由此获得植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株体对革兰氏阴性细菌感染或侵染的增强的抗性。这些方法可进一步包括使引入了表达盒的完整植株进行自花传粉或将引入了表达盒的完整植株同与其同种的植株进行异花传粉。此外，这些方法甚至可进一步包括在对完整植株进行自花或异花传粉前，检测通过引入表达盒获得的完整植株中表达盒的存在，或检测其对革兰氏阴性细菌的感染或侵染的增强的抗性。该方法可进一步包括收获任何自花或异花传粉产生的种子。该方法甚至可进一步包括使收获的种子萌发以产生幼苗，并检测萌发的幼苗的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株中表达盒或对革兰氏阴性细菌感染或侵染的增强的抗性的存在。

本发明也提供通过本发明的方法获得的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株的组织培养物，其中如此获得的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株含有所引入的表达盒。

可使依照本发明的方法获得的含有引入的核酸序列的完整植株进一步进行自花传粉或与另一属于同一种的植物进行异花传粉。任何得到的种子可被收获并用于进一步产生用于自花和异花传粉的植物。

本发明的方法既可用于病原性的也可用于非病原性的革兰氏阴性细菌。

本发明的方法可进一步包括向植物基因组引入第二核酸序列，其编码增强植物对植物病原体感染或侵染的抗性的第二肽、多肽或蛋白质。所述第二肽、多肽或蛋白质可包括但不限于非酶促裂解肽、酶促裂解肽或酶促肽聚糖降解肽。例如，第二肽、多肽或蛋白质可以是溶菌酶、内溶素、蛋白酶、胞壁质裂解酶(mureinolytic enzyme)、具有糖基转移酶活性的酶、脂肪酶和酯酶。

附图简述

图1显示考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的第1泳道中的纯化BombBC蛋白(18kDa)和第2泳道中的具有表明的大小的分子量标记。

图2显示用bombBC转化四种植物物种的PCR确认，包括花店天竺葵(Florist’s geranium)(天竺葵(Pelargonium X hortorum))Avenida栽培种(泳道3、4、5)、柑橘(甜橙x枳(Citrus sinensis x Poncirus trifoliate))Carizzo栽培种、烟草(烟草(Nicotiana tobacum))Xanthi栽培种、和稻(Oryza sativa japonica)TP309栽培种每种三个植株。泳道1，1kb DNA梯形标记(ladder)；2，非转基因Avenida对照；3，Av250；4，Av386；5，Av387；6，非转基因Carizzo对照；7，C12；8，C17；9，C18；10，非转基因Xanthi对照；11，X473；12，X480；13，X901；14，非转基因TP309对照，15，TP147；16，TP170；17，TP192；18，1kb DNA梯形标记。使用的PCR引物是IPG872(5′-tca gccact cga tgc cgt c)和IPG911(5′-gca cga ttc aag agt agg)。所有情况下预期的PCR产物是974bp。

图3显示非转基因花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培种″Avenida″叶片上的细菌枯萎病的典型症状，所述叶片通过在叶片上以10⁷集落形成单位每毫升(cfu/ml)的浓度喷雾而接种有天竺葵黄单胞菌细胞，且也使用浸入10⁹cfu/ml天竺葵黄单胞菌细胞的剪刀在多处夹(clip)叶片来接种。接种之后，将植株保持在32℃下。剪去圈出的区域，其包含约10⁵cfu/cm²活的天竺葵黄单胞菌细胞(细节参考下文实施例11)。接种后4周后拍照。

图4显示表达BombBC的转基因花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培种″Avenida″叶片，其接种时间和方式都与图1图例描述的相同。接种后，将植株保持在32℃下。圈出的剪掉的区域不含可检测到的天竺葵黄单胞菌细胞。接种后4周后拍照。

图5显示接种在非转基因天竺葵(Pelargonium X hortorum)栽培种″Avenida″上的天竺葵黄单胞菌菌株CHSC的生长，以及接种于表达BombBC的转基因变种″Avenida″上的菌株CHSC的快速死亡。每天从三片接种的树叶上最可能包含病原体细胞的区域，通过使用木塞钻孔器(cork borer)取下共计1平方厘米(cm2)的圆形切片，进行细胞计数，为期9天(参考图1和2)。用研钵和研棒，将这些叶片的切片浸渍在1毫升缓冲液中，用1∶10的稀释梯度系列进行稀释，将10微升的液滴置于固体生长培养基上计数。接下来，5天后，在非转基因天竺葵变种″Avenida″植株中获得的最大细胞密度为10⁶cfu/ml的天竺葵黄单胞菌，症状平稳并系统性(systemically)发展直到整个植物死亡，通常于接种后12周内。但是，接种后5天，从转基因天竺葵变种″Avenida″植株中并未回收到活的天竺葵黄单胞菌细胞(图3)，而且没有天竺葵黄单胞菌引起的天竺葵枯萎病症状的迹象。这些植物既对天竺葵黄单胞菌感染免疫，也快速使人工接种病原体种群消失。

图6显示接种有茄科雷尔氏菌细胞的非转基因花店天竺葵(PelargoniumX hortorum)栽培种″Avenida″叶片的比较，其中接种通过使用结核菌素注射器的钝头用注射器将10⁶cfu/ml直接浸入叶片的海绵状叶肉中。此外，这些同样通过注射器接种的植株也通过向盆栽天竺葵植株的土壤中直接添加5ml10⁷cfu/ml的液体培养物而接种。接种后，将植株维持在32℃以促进病原体生长和症状发生。接种后四周，对非转基因天竺葵变种″Avenida″(左)和表达BombBC的相同变种″Avenida″的转基因天竺葵(右)都进行拍照。非转基因植株上发生了细菌性枯萎的典型症状，该植株12周后死亡。除了在接种区域中最初发生并保持局限在该区域的症状外，在表达BombBC的转基因变种″Avenida″(右)上未观察到症状发生。

发明详述

除非另有定义，本文所用所有技术与科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与此处描述相似或等同的方法和材料可被用于本发明的实施或试验，还是描述了实例性的方法和材料。本发明使用的DNA克隆技术是常规的并且可由任何本领域技术人员完成，使用由例如Sambrook等(1989)教导的方法。

本发明基于发现了至少一些噬菌体编码先前未知的称为BOMB(细菌外膜破坏)蛋白的蛋白质，其明显地通过降解或影响细菌LPS屏障的结构而强烈抑制培养中至少一些细菌的生长。进一步的，我们发现：1)表面活性剂，2)攻击肽聚糖或细胞壁的酶，和3)植物防御化合物增加表达的BOMBs对培养基中生长的革兰氏阴性菌的效力。进一步的，我们发现当在各种不同转基因植物中表达时，无论植物是单子叶植物还是双子叶植物，来自天竺葵黄单胞菌的噬菌体Xp15的BombBC都对多种革兰氏阴性细菌具有致死或抑制作用。最后，我们发现不仅至少一些BOMBs，例如BombBC，可由植物细胞稳定生产而对植物没有毒性作用，而且所述BOMB基因在植物中的表达提供了一种针对革兰氏阴性细菌保护植物的新方法。

本发明也基于我们发现了至少一些植物分泌信号肽可用作将BOMBs的抗微生物作用靶向植物质外体和木质部的手段，它们在那里积累，提供保护植物免受许多不同革兰氏阴性细菌的新方法。进一步的，我们发现了表达BOMBs的转基因植物可用于产生粗制或纯化的抗微生物化合物的提取物。

下列示例性的实施方式意在对本发明进行更详细的阐述。

1.为鉴定BOMB和/或类BOMB基因，首先有必要分离和纯化对多种目标生物体具有非常强的抗微生物活性的DNA噬菌体。这是通过首先获得攻击目标革兰氏阴性细菌的噬菌体而实现的。攻击特定细菌的噬菌体可使用为本领域技术人员熟知的已完全公开的方法容易的从未处理的污水(rawsewage)、池塘水或来自温室复合物的排水中分离。第二，通过使用本领域技术人员已知的方法将噬菌体与革兰氏阴性宿主细菌一起涂布后形成的噬菌斑大小对多种噬菌斑进行评估。第三，噬菌体通过它们裂解或抑制它们不能感染的其它革兰氏阴性细菌的能力进行选择。这是通过一系列感染测定和覆盖测定实现的。最终，用本领域技术人员熟知的方法，将噬菌体核酸分离并用DNAse处理，再单独用RNAse处理。仅选择基于DNA的噬菌体。

2.噬菌体纯化后，将噬菌体DNA片段化并全长测序，如GenBank中以登录号NC_007024保藏的噬菌体15序列所示例的。本领域技术人员已知，有不同的策略可用于此目的；测序可通过鸟枪文库测序或通过亚克隆、限制性图谱作图和使用引物步移技术测序来实现。表达来自革兰氏阴性细菌的BOMBs的噬菌体基因组区域也许不能轻易在大肠杆菌中克隆，并且是通过以下实事被认识的：它们只能要么在不含其天然启动子情况下克隆，要么克隆在完全被抑制的启动子下游。这些区域可直接从噬菌体DNA测序。

3.对噬菌体基因组进行DNA测序后，转录方向通过使用本领域技术人员熟悉的程序鉴定启动子和转录终止子而决定。噬菌体基因组通常被转录为大段的多顺反子信息。随后使用本领域技术人员熟知的程序鉴定所有开放阅读框(ORFs)，并且也鉴定了可能的功能基因(LFGs)，鉴定是基于ORF的长度、密码子选择、第三位密码子偏爱性、Shine-Delgamo序列的存在与否以及转录背景，包括可能的启动子、转录终止子和转录方向。随后通过与其它基因(通常是编录在诸如

的大型数据库中经表征的基因)进行比较，测定一些LFGs的生化功能。由于BOMBs以前并未被描述过，不太可能通过与公共或私人数据库中的任何已知基因进行比较而发现BOMB基因。

4.编码BOMBs的基因和/或类BOMB基因是通过检查噬菌体的每种LFG而鉴定的，从任何不可亚克隆的DNA片段中存在的LFG开始。BOMB的特征性地是：1)小(20kD或更小)LFGs，具有2)多重螺旋-环-螺旋-环结构域，3)无跨膜结构域其4)无前导序列。具有这些特征的LFGs随后被选作进一步试验，该试验使用功能性基因表达测定法。推定的BOMB基因的预测的肽编码区由噬菌体DNA通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，并在不带启动子的情况下克隆到合适的载体中。随后将这些编码区与强力调节的阻抑性启动子可操作的融合于合适的细菌表达载体中。随后释放可操作的融合有推定BOMB基因的启动子的阻抑作用，其会导致携带该克隆的大肠杆菌菌株生长明显降低或终止。随后进一步测试任何这种克隆对其它细菌的作用。

5.进一步评估了任何在诱导后引起携带该克隆的大肠杆菌菌株生长明显降低或终止的DNA克隆，所述评估通过从诱导时较低但可测量到的OD开始，在24小时的时间段内测量培养物在600纳米(nm)下的光密度OD进行。这些测量是在存在或不存在诸如小檗碱的植物抗毒素或诸如Silwet L77的洗涤剂的条件下进行。对细胞裂解或缺乏裂解的证据进行观察。任何在诱导后引起细胞密度随时间变化(长达24hrs)连续下降的DNA克隆有可能是BOMB候选基因。如果加入的诸如盐酸小檗碱的植物抗毒素或诸如Silwet L77的湿润剂的作用与DNA克隆在随着时间连续降低细胞培养物密度方面的作用相协同(长达24小时)，则这些克隆可被进一步确认为BOMB基因。在一个实施方式中是一种克隆的bombBC。

6.所述BOMB克隆可操作地融合到可用于植物中瞬时基因表达的植物表达载体中的植物基因表达盒内，所述表达盒最低限度含有在植物中有功能的启动子，随后是BOMB克隆，再接着是植物终止子。几种植物启动子和来自植物病毒的在植物中有功能的启动子是可广泛地获得的，其可用于在瞬时表达测定法中在植物中功能性表达外源基因，例如，pCAMBIA系列植物表达载体(Cambia，Canberra，Australia)中存在的CaMV启动子。几种植物终止子也是可得的，包括可广泛获得的NOS终止子，其也存在于pCAMBIA植物表达载体系列。为转移入植物细胞，植物表达载体可选的也可含有T-DNA边界，并具有在根癌土壤杆菌，根瘤菌(Rhizobium spp.)，中华根瘤菌(Sinorhizobium spp.)或中生根瘤菌(Mesorhizobium spp.)中复制的能力，随后将这些菌用于将T-DNA边界之间的DNA区域转移到植物中。

7.在另一个实施方式中，可选的可使用内含子以增加基因表达。已知内含子是植物(包括双子叶植物和观赏植物和尤其是单子叶植物)中许多基因大量表达所需的，其可能是通过增强转录物稳定性或促进mRNA成熟(CaIMs等.，1987；Mun，J.H.等.2002；Rose & Beliakoff，2000；Rose，2002，Simpson &Filipowicz，1996)。

8.在一个实施方式中，将植物分泌信号加入BOMB编码区。已发现一些植物胁迫相关和/或疾病相关蛋白在植物木质部中优先并最大量的积累，推测其需要特异性分泌信号序列。只在木质部中发现了非常少数的几种蛋白；它们如何穿过植物细胞壁分泌到达木质部还不清楚。这些蛋白质具有可用于将抗微生物化合物靶向植物质外体和木质部的分泌信号肽；我们将这些称作“木质部分泌信号肽”。将所述木质部分泌信号肽序列从合适的植物来源通过PCR扩增并克隆到BOMB序列的上游。一个实施方式是源自一种此类蛋白即P12(GenBank登录号AFO15782；Ceccardi等.，1998)的24个氨基酸的植物信号肽。

9.使用瞬时基因表达，在几种植物物种的任一种中证实了有活性的正确折叠的BOMB的植物表达(Wroblewski等.2005)。携带克隆于基因表达盒中的BOMB基因的植物表达载体被转化入根癌土壤杆菌，并且通过用稀释的细胞培养物浸没(flood)叶片组织的某个面积可测的区域而将所得的转化细胞接种到植物中。也接种了由植物表达载体组成但不含克隆于表达盒中的BOMB基因的空载体对照，优选接种在同一叶片上。3-4天后，从经接种的植物组织提取蛋白质并用于Western印迹分析。将接种了BOMB克隆的组织中的BOMB蛋白水平与接种了空载体对照的组织中的BOMB水平进行比较。

10.然后使用合适的革兰氏阴性细菌病原性种，在宿主植物瞬时表达攻击(challenge)测定法中测试最具活性的DNA构建体；例如，将天竺葵黄单胞菌接种入天竺葵或将茄科雷尔氏菌接种入烟草、天竺葵、番茄或椒(pepper)。倘若非宿主植物对攻击病原体产生可见的过敏反应(HR)，也可使用非宿主植物瞬时表达攻击测定法。在上述两种情况中，都通过用携带BOMB基因表达载体的根癌土壤杆菌的稀释培养物浸没来接种植物叶片组织，如上述实施方式5所阐述的完全一样，并标记接种面积的范围。3-4天后，已被接种的植物组织在相同组织区域被再次超-接种(super-inocluate)，这次使用具有与所用根癌土壤杆菌菌株的标记不同的抗生素抗性标记的植物病原体或目标革兰氏阴性细菌。如果是一种病原体，在空载体对照组织上观察到可见的病原性症状或HR反应与在BOMB克隆组织上观察到的比较。无论病原体或非病原体，从超-接种区域中取1cm叶盘，置于培养基中，并进行细胞计数分析，将接种空载体对照组织的区域的细胞计数与接种BOMB克隆的区域的细胞计数进行比较。

11.接下来进行植物细胞的永久转化，既有单子叶植物也有双子叶植物，其后对感兴趣的期望的双子叶植物或单子叶植物物种的转化植株进行再生和繁殖。

本发明的又一目的是通过杀死任何感染植物或以植物为食并引起植物疾病的革兰氏阴性细菌来预防性地阻止单子叶植物或双子叶植物疾病。在本发明的一个实施方式中，实现了对多种疾病的预防性和治疗性处理，这些疾病由黄单胞菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、土壤杆菌属、韧皮部杆菌属、木杆菌属、雷尔氏菌属和伯克霍尔德氏菌属的多种菌种或致病变型引起。转基因植物使用是指明的病原体属的宿主的植物来创建，所述宿主植物携带一个或多个BOMB、或类BOMB肽，其融合有木质部分泌信号肽，可操作地连接有植物启动子以使所述类BOMB肽由所述植物产生。

本发明的目的还有阻止双子叶植物和单子叶植物中人类和动物经食物传播的疾病，其通过预防性地杀死任何感染植物或以植物为食并引起人类和/或动物经食物传播的疾病的革兰氏阴性细菌而实现。在本发明的一个实施方式中，实现了预防性和治疗性消除粪便细菌，所述细菌可感染新鲜蔬菜例如菠菜和豆芽，并引起多种肠道疾病，包括埃希氏菌属、志贺氏菌属和沙门氏菌属。转基因植物的创建使用是指明的病原体属的宿主的植物，所述宿主植物携带一个或多个BOMB或类BOMB肽，其融合有木质部分泌信号肽，其可操作地连接有植物启动子以使所述类BOMB肽由植物产生。

在本发明的另一个实施方式中，创建了作为所指明属的宿主的转基因植物，所述宿主植物携带一个或更多BOMB或类BOMB肽，其融合有木质部分泌信号肽以及酯酶、裂解肽或裂解酶，全部与植物启动子可操作地连接以使所述BOMB和/或类BOMB肽和裂解酶由所述植物宿主产生。裂解肽或酶可以是线性的或紧凑球状的，并且包括但不限于溶菌酶、杀菌肽、天蚕抗菌肽、爪蟾抗菌肽、穴蛋白、渗透性增强蛋白等。

本发明的一个进一步的目的是通过将这些转基因植物作为“诱捕”植物种植在环境中，从而通过以该转基因植物为食来减小感染性细菌、真菌、线虫或昆虫的种群，由此阻止或抑制(dampen)流行病或瘟疫。这种环境可包括商品化农作物(包括与转基因诱捕植物为相同或不同植物种的非转基因作物)、园林和内部建筑物。

本发明的目的还有通过杀死任何可能污染饲料或食物的革兰氏阴性细菌来预防性地阻止家畜饲料和人类食品的污染。在本发明的另一个实施方式中，家畜饲料可掺入或其组成为表达BOMB和/或类BOMB酶或肽片段的转基因完整植株、转基因植物部分或转基因植物的粗制、半纯化或纯化提取物。在本发明的另一个实施方式中，诸如蛋或芽/苗的人类食物可用由转基因植物制成的BOMB和/或类BOMB酶或肽片段的喷雾制剂处理。

定义

如此处所用，术语″BOMB″意思包含任何噬菌体衍生蛋白：1)不具有细菌分泌信号序列；2)不具有跨膜结构域，并且3)能够负面影响、破坏、透化或降解革兰氏阴性细菌外LPS屏障。在大肠杆菌中表达BOMB蛋白导致″拟裂解″一在诱导时，细胞培养物的光密度以一种与未诱导的培养物相似的方式持续增加1到2小时，但随后光密度降回诱导时的起始水平。BOMBs缺乏导致裂解的能力-在诱导时，细胞培养物的光密度突然下降。BOMBs也缺乏以与穴蛋白在细菌细胞内产生或过量产生时相似的方式破坏细菌内膜的能力。细菌内膜的破坏通过在细菌细胞内同时表达BOMB基因和内溶素基因而测定；同时过表达BOMB基因和内溶素基因在数小时或更短时间内不会导致细胞裂解。

如此处所用，术语″穴蛋白″意指任何这样的噬菌体衍生蛋白质，其具有至少一个跨膜结构域，并且当在细菌细胞内不伴随前导肽产生时具有破坏细菌内膜的能力。细菌内膜的破坏通过在细菌细胞内同时表达穴蛋白基因和内溶素基因而测定；同时过表达穴蛋白基因和内溶素基因在数小时或更短时间内不会导致细胞裂解。

如此处所用，术语″内溶素″意指任何能使胞壁质或肽聚糖细胞壁解聚的酶。该术语包括：1)葡萄糖胺酶(溶菌酶)，其攻击肽聚糖的氨基糖之间的糖苷键；2)酰胺酶，其攻击聚糖链和交联肽之间的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺键；和3)内肽酶，其攻击肽内(interpeptide)桥联(Sheehan等.，1997)。合成的内溶素不带有可使其进入肽聚糖(胞壁质)层的输出信号序列，因此内溶素通常积累在被噬菌体感染的细菌的细胞质中直到其通过穴蛋白的活性释放。

如此处所用，术语″拟裂解″意指在诱导时，细胞培养物的光密度以一种与未诱导的培养物相似的方式持续增加1到2小时，但随后光密度降回诱导时的初始水平。

如此处所用，术语″裂解″意指在诱导时，细胞培养物的光密度突然下降。

如此处所用，术语″酯酶″意思包含任何归类为羧酸酯水解酶(EC 3.1.1.1)或三酰基甘油酰基水解酶(EC 3.1.1.3)的酶。

如此处所用，术语″羧酸酯水解酶″(EC 3.1.1.1)意指“羧酸酯酶”，并且其催化羧酸酯+H₂O到醇加羧酸的反应。羧酸酯水解酶的其它通用名有：脂族酯酶；B-酯酶；单丁酸酯酶(monobutyrase)；可卡因酯酶；普鲁卡因酯酶；甲基丁酯酶(methylbutyrase)；维生素A酯酶；丁酰酯酶(butyryl esterase)；羧基酯酶(carboxyesterase)；羧酸酯酶(carboxylate esterase)；羧化酯酶(carboxylic esterase)；甲基丁酸酯酶(methylbutyrate esterase)；醋酸甘油酯酶(triacetinesterase)；羧基酯水解酶(carboxyl ester hydrolase)；丁酸酯酶(butyrate esterase)；甲基丁酯酶(methylbutyrase)；羧酯酶(carboxylesterase)；丙酰酯酶(propionyl esterase)；非特异性羧酯酶；酯酶D；酯酶B；酯酶A；丝氨酸酯酶；羧酸酯酶(carboxylic acid esterase)；可卡因酯酶。

如此处所用，术语″脂肪酶″意指任何甘油三酯酰基水解酶(EC 3.1.1.3)，通常称为“三酰基甘油脂肪酶”，并且催化三酰基甘油加H₂O到二酰基甘油加羧酸的反应。脂肪酶的其它通用名有：三丁酸酶(tributyrase)；丁脂酶(butyrinase)；甘油酯水解酶(glycerol ester hydrolase)；丁酸甘油酯酶(tributyrinase)；吐温水解酶；胰脂酶；三乙酸甘油酯酶(triacetinase)；丁酸甘油酯酶(tributyrin esterase)；吐温酶；氨基N-AP；Takedo 1969-4-9；Meito MY30；吐温酯酶；GA 56；Capalase L；甘油三酯水解酶(triglyceride hydrolase)；油酸甘油酯水解酶(triolein hydrolase)；吐温水解酯酶；Amano CE酶；cacordase；甘油三酯酶；三酰基甘油酯水解酶；Amano P酶；Amano AP酶；PPL；甘油-酯水解酶(glycerol-ester hydrolase)；GEH；meito Sangyo脂肪酶；肝脂酶；lipazin；后肝素血浆抗鱼精蛋白脂肪酶；抗盐后肝素脂肪酶；肝素可释放肝脂酶；Amano CES酶；Amano B酶；三丁酸酶；甘油三酯脂肪酶；肝脂肪酶；肝单酰甘油酰基转移酶。

如此处所用，术语″革兰氏阴性细菌″意指任何产生脂多糖(LPS)的细菌。

如此处所用，术语″疾病抗性/抗病性″意指与未处理植物或材料的可比试验中得知的最易感的表型性症状或病原体数量相比，在检测的植物或材料中任何由处理引起的疾病症状或病原体数量的减少。

如此处所用，术语对细菌的″抗性″意指与未处理的植物或材料相比，由处理引起的所检测植物或材料中细菌数量的任何减少。

如此处所用，术语对细菌的″免疫性″意指与未处理的植物或材料相比，由处理引起的所检测植物或材料中可检测到的细菌细胞计数的消失。

如此处所用，术语″等位基因″是指基因的几种可选形式中的任一种。

如此处所用，术语″氨基酸″是指作为蛋白质和肽的组分的氨基羧酸。氨基酸的缩写如下：A(Ala)；C(Cys)；D(Asp)；E(GIu)；F(Phe)；G(Gly)；H(His)；I(Iso)；K(Lys)；L(Leu)；M(Met)；N(Asn)；P(Pro)；Q(Gln)；R(Arg)；S(Ser)；T(Thr)；V(Val)；W(Trp)和Y(Tyr)。

如此处所用，″同源的″是指两个聚合物分子之间的亚单位序列相似性，如两核酸分子之间，如两DNA分子或两RNA分子之间，或两多肽分子之间。当两分子中的某亚单位位置都由相同单体亚单位所占据，例如，如果某个位置在两个DNA分子的每一个中都由腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的。两序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数，例如，如果两化合物序列的一半位置是同源的(如，长度为10个亚单位的多聚体中的5个位置)，则所述两序列50％同源，如果90％的位置，例如，10个中的9个是匹配的或同源的，则两序列享有90％同源性。例如，DNA序列3′A TTGCC5′和3′TATGGC享有50％同源性。

如此处所用，″同源性″与″同一性″同义使用。此外，当术语″同源性″或″同一性″用于此处意指核酸和蛋白质时，其应理解为适用于核酸和氨基酸序列两种水平上的同源性或同一性。如果两条寡核苷酸在只有至少约60％，更优选至少约65％，甚至更优选至少约70％，还更优选至少约80％，且优选至少约90％或，更优选，至少约95％互补的寡核苷酸彼此退火的条件下退火，则第一寡核苷酸与第二寡核苷酸以“高严紧性”或“在高度严紧条件下”退火。用于退火两条寡核苷酸的条件的严紧性是温度、退火培养基离子强度、培养期、寡核苷酸长度、寡核苷酸G-C含量、和两寡核苷酸间预期的非同源性程度等因素(如果已知)的函数。调整退火条件严紧性的方法是已知的(参见例如Sambrook et al.，1989，In：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)。

两核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性的测定可使用数学算法完成。例如，一种用于比较两序列的数学算法是Karlin and Altschul算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268)，其如Karlin and Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)中进行了修改。该算法整合入Altschul等(1990，J.MoI.Biol.215：403-410)的NBLAST和XBLAST程序，其可在例如国立卫生研究院(NIH)的国家药物图书馆(NLM)的生物技术信息国家中心(NCBI)万维网站点的BLAST站点上进入。BLAST核酸检索可使用NBLAST程序进行(在NCBI网站上定名为″blastn″)，使用如下参数：gap penalty(缺口罚分)＝5；gap extension penalty(缺口延伸罚分)＝2；mismatch penalty(错配罚分)＝3；match reward(匹配得分)＝1；expectation value(期望值)10.0；和word size(字长)＝11，以获得与此处描述的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可用XBLAST程序(NCBI网站上定名为″blastn″)或NCBI″blastp″程序进行，使用下列参数：expectation value(期望值)10.0，BLOSUM62 scoring matrix(BLOSUM62得分矩阵)，以获得与此处描述的蛋白分子同源的氨基酸序列。

为获得有缺口的比对用于比较的目的，如Altschul et al.(1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)中所描述，可利用Gapped BLAST。或者，PSI-Blast或PHI-Blast可用于进行迭代搜索，其检测分子间的远缘关系(id.)和享有共同结构(pattern)的分子间的关系。当利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast和PHI-Blast程序时，各程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数可按照国立卫生研究院的国家药物图书馆的生物技术信息国家中心站点上可获得的参数使用。

可使用与上述那些类似的技术测定两序列之间的百分比同一性，在允许或不允许缺口的条件下。在计算百分比同一性中，通常对精确匹配进行计数。

“分离的核酸”是指核酸区段或片段，其与在天然存在状态下在其侧翼的序列已分开，例如，DNA片段，其已从通常与该片段相邻的序列(例如，在该片段天然存在于其中的基因组中与该片段相邻的序列)移开。该术语也适用于从其它天然伴随该核酸的组分(例如，RNA或DNA或蛋白质)中已经基本上纯化的核酸。该术语因此包括，例如，并入载体中、自主复制质粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立分子(如，作为cDNA或通过PCR或限制性酶消化产生的基因组或cDNA片段)而不依赖其它序列的重组DNA。其也包括作为编码额外多肽序列的杂合基因的部分的重组DNA。

如此处所用，术语″作物/作物植物″是指为任何商业目的种植的任何植物，包括但不限于下述目的：种子生产、干草生产、观赏用途、水果生产、浆果生产、蔬菜生产、油料生产、蛋白质生产、饲料生产、动物牧草、高尔夫球场、草坪、花卉生产、园林美化、侵蚀控制(erosion control)、绿肥、改进土壤耕作/健康、生产药学产品/药物、生产食品或食品添加剂、吸烟产品、纸浆生产和木材生产。

如此处所用，术语“异花受粉”或“杂交育种”是指这样的过程，通过该过程将一种植物上的一种花的花粉施于(人工地或天然地)另一种植物的花的胚珠(柱头)上。

如此处所用，术语“栽培种”是指通过园艺或农学技术产生且在野生种群中少见的植物的变种、品系或品种(race)。

如此处所用，术语“双子叶植物”(“dicotyledon”and“dicot”)是指具有包含两半种子或两片子叶的胚的开花植物。其实例包括柑橘、天竺葵、烟草、番茄、包括豌豆(pea)、苜蓿(alfalfa)、三叶草(clover)和大豆(soybean)的豆类(legumes)、栎树(oaks)、槭树(maples)、蔷薇(roses)、薄荷(mints)、南瓜(squashs)、雏菊(daisies)、胡桃(walnuts)、仙人掌(cacti)、堇菜(violet)和毛茛(buttercup)。

如此处所用，术语“ER保留信号”是指这样的氨基酸序列(ER保留信号肽)，其附接在于多肽并导致该多肽在内质网中保留并积累。

如此处所用，术语“雌株”是指产生胚珠的植物。雌株通常在受精后产生种子。指定为“雌株”的植物可同时含有雄性和雌性性器官。或者，“雌株”可仅含雌性性器官，要么是天然的(如，在雌雄异株的种中)，要么由于去雄(如，玉米去雄(detasselling))。

如此处所用，术语“子代”是指细胞、组织或生物体在特定亲代以后的任何世代。由亲本交配产生的世代是第一子代(指定为“F1”或“F₁”)，而由F1个体杂交产生的世代是第二子代(指定为“F2”或“F₂”)。

如此处所用，术语“配子”是指生殖细胞，其细胞核(通常还有细胞质)与另一相似来源但相反性别的配子的细胞核融合以形成合子，合子具有发育成新个体的潜力。配子是单倍体并分化成雄性或雌性。

如此处所用，术语“基因”是指任何与生物功能相关的DNA区段。所以，基因包括但不限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因也可包括不表达的DNA区段，例如，其形成其它蛋白质的识别序列。基因可从多种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可包括经设计而具有期望参数的序列。

如此处所用，术语“基因型”是指个体细胞、细胞培养物、组织、生物体(如植株)或生物群体的遗传构成。

如此处所用，术语“半合子的”是指这样的细胞、组织或生物体，其中基因在基因型中只出现一次，如单倍体细胞或生物体中的基因，异配性别中的性连锁基因，或已经缺失了基因的配偶体区段的二倍体细胞或生物体的染色体区段中的基因。

如此处所用，术语“异源多核苷酸”或“异源核酸”或“外源DNA区段”是指这样的多核苷酸、核酸或DNA区段，其来源于对于特定宿主细胞而言是外源的来源，或者，如果来自相同来源，其相对于其原始形式是经修饰的。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞来说是内源的但是经过修饰的基因。所以，该术语是指这样的DNA区段，其对于细胞是外源或异源的，或对该细胞是同源的但在宿主细胞核酸中的某个位置上的元件并非通常所见的。外源DNA区段表达产生外源多肽。

如此处所用，术语“异源性状”是指由外源DNA区段、异源多核苷酸或异源核酸而赋予经转化的宿主细胞或转基因生物体的表型。

如此处所用，术语“杂合子”是指二倍体或多倍体个体细胞或植物，其在至少一个基因座存在不同的等位基因(给定基因的多种形式)。

如此处所用，术语“杂合的”是指在特定基因座存在不同等位基因(给定基因的多种形式)。

如此处所用，术语“同源物”或“同源体”是指与来自另一物种的核酸或肽序列具有共同起源和相似功能的核酸或肽序列。

如此处所用，术语“纯合子”是指在一个或多个基因座具有相同等位基因的个体细胞或植物。

如此处所用，术语“纯合的”是指在同源染色体区段的一个或多个基因座上存在相同的等位基因。

如此处所用，术语“杂合体”是指由一个或多个基因不同的亲本之间杂交产生的任何个体细胞、组织或植株。

如此处所用，术语“近交”或“近交系”是指相对纯育的品系。

如此处所用，术语“系/株系”用于广泛的包括但不限于，从单独亲本植株通过组织培养技术无性繁殖的植物群体，或由于繁衍自共同亲本而在遗传上非常类似的近交植物群体。称一种植株“属于”特定的株系，若其(a)是再生自该株系材料的初代转化体(T0)植株；(b)具有含该株系的T0植株的谱系；或(c)由于共同的祖先而在遗传上非常类似(如，通过近交或自交)。在本文上下文中，术语“谱系”表示植物的世系，例如根据完成的有性杂交以使基因或基因的组合在杂合(半合子)或纯合的条件下将期望的性状赋予植物。

如此处所用，术语“基因座”是指已在遗传上定义的任何位点。基因座可以是基因、或基因的部分、或具有某种调控作用的DNA序列，且可以由不同的序列占据。

如此处所用，术语“裂解蛋白”是指任何酶的整体或部分，或裂解肽，其：1)降解或穿入形成革兰氏阳性或阴性细菌的细菌细胞壁的肽聚糖或胞壁质层，并且2)能透化或破坏细菌内膜。所述蛋白质可以是线性的、部分降解的或紧密球状的，且包括但不限于溶菌酶、杀菌肽、天蚕抗菌肽、爪蟾抗菌肽、渗透性增强蛋白等。

如此处所用，术语“雄株”是指产生花粉粒的植株。“雄株”通常是指为授精卵产生配子的性别。指定为“雄株”的植株可含有雄性和雌性性器官。或者，“雄株”可仅含雄性器官，要么是天然的(如，雌雄异株的种)，要么是由于去雄(如，通过去除子房)。

如此处所用，术语“混合选择”是指这样的选择形式，其中个体植物被选择，并且其下一代繁衍自它们种子的聚集物。

如此处所用，术语“单子叶植物”(“monocotyledon”or“monocot”)是指任何具有只含一片子叶的胚且通常具有平行脉的叶片、花的部分为三的倍数、且根和茎无次生生长的开花植物的亚类(单子叶类(Monocotyledoneae))。实例包括百合(lilies)；兰(orchids)；稻(rice)；玉米(corn)，草(grasses)，例如高羊茅草(tall fescue)、山羊草(goat grass)和草地早熟禾(Kentucky bluegrass)；谷物(grains)，例如小麦(wheat)、燕麦(oats)和大麦(barley)；鸢尾根(irises)；洋葱(onions)和棕榈(palms)。

如此处所用，术语“突变体”或“突变”是指具有可导致变体表型的异常遗传组成的基因、细胞或生物体。

如此处所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除非具体限定，该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性且其代谢方式与天然存在的核苷酸类似。除非另有指示，特定的核酸序列也隐含涵盖其保守修饰变体(如简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，实现简并密码子取代可通过产生这样的序列实现，在所述序列中将一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等.(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等.(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；Cassol等.(1992)；Rossolini等.(1994)Mol.Cell.Probes8：91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA替换使用。术语“核酸”也涵盖实验室中使用本领域技术人员熟知的步骤合成的多核苷酸。

如此处所用，当DNA区段处于与另一DNA区段的功能性关系中时，将其称作“可操作地连接”。例如，若信号序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白(preprotein)，则该信号序列的DNA与编码该多肽的DNA是可操作地连接的；若启动子或增强子刺激编码序列的转录，则其与该序列是柯傲佐地连接的。总的来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，且在信号序列的情况中，其既是连续的且处于可读状态。但是，增强子不必与它们控制转录的编码序列连续。连接通过在方便的限制性位点连接或通过插入该处的衔接子或接头实现。

如此处所用，术语“自由传粉”是指自由暴露给一些基因流的植物种群，正与具有对基因流的有效屏障的闭花授粉相反。

如此处所用，术语“自由传粉种群”或“自由传粉变种”是指通常能至少有一些异花受精的植物，按这样的标准选择，即其可以显示变异，但也具有一个或多个基因型或表型特征使该种群或变种能区别于其它。对异花传粉没有屏障的杂合体是自由传粉种群或自由传粉变种。

如此处所用，术语“直向同源物”和“直向同源体”是指与来自另一物种的核酸或肽序列功能相似的核酸或肽序列。例如，来自一种植物物种的一种基因与来自另一植物物种的另一基因具有高核酸序列相似性并编码具有相似功能的蛋白质，在这种情况下这些基因是直向同源物。

如此处所用，当讨论植物时，术语“胚珠”是指雌性配子体，而术语“花粉”是指雄性配子体。

如此处所用，术语“表型”是指由个体遗传组成(如基因型)和环境之间的相互作用而产生的个体细胞、细胞培养物、生物体(如植物)或生物体群体的可观察到的特征。

如此处所用，术语“植物抗毒素”是指由植物产生的任何抗微生物化合物，无论是预形成还是响应于微生物的存在而产生的。

如此处所用，术语“植物株系/植物品系”用于广泛包括但不限于，从单独亲本植株通过组织培养技术无性繁殖的植物群体，或由于繁衍自共同的一个或多个亲本而在遗传上非常类似的近交植物群体。称一种植株“属于”特定的株系，若其(a)是再生自该株系的材料的初代转化体(T0)植株；(b)具有含该株系的T0植株的谱系；或(c)由于共同的祖先(如，通过近交或自交)而在遗传上非常类似。在本文上下文中，术语“谱系”表示植物的世系，例如根据完成的有性杂交以使基因或基因的组合在杂合(半合子)或纯合的条件下将期望的性状赋予植物。

如此处所用，术语“植物组织”是指植物的任何部分。植物器官包括，但不限于叶、茎、根、块茎、种子、枝、短柔毛(pubescence)、瘤(nodule)、叶腋(leaf axil)、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣(petal)、梗(peduncle)、柄(stalk)、柱头(stigma)、花柱(style)、苞片(bract)、果实、干(trunk)、心皮(carpel)、萼片(sepal)、花药(anther)、胚珠(ovule)、花梗(pedicel)、针叶(needle)、球果(cone)、根状茎(rhizome)、匍匐茎(stolon)、枝条/苗(shoot)、果皮(pericarp)、胚乳(endosperm)、胎座(placenta)、浆果(berry)、雄蕊和叶鞘(leaf sheath)。

如此处所用，术语“启动子”是指结合RNA聚合酶以起始转录中涉及的DNA区域。

如此处所用，术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”是指氨基酸残基及其聚合物。除非具体限定，该术语涵盖含有天然氨基酸残基已知类似物的氨基酸，其与参考氨基酸具有类似的结合特性且以与天然存在的氨基酸残基类似的方式代谢。除非另有指示，特定的氨基酸序列也隐含涵盖其保守修饰变体(如保守取代)以及明确表明的序列。术语“多肽”也涵盖实验室中使用本领域技术人员熟知的步骤合成的多肽。

如此处所用，术语“重组体”是指经过用重组DNA的转化的细胞、组织或生物体。称原始重组体为″R0″或″R₀.″。R0自交产生的第一个转化世代称为″R1″或″R₁.″。

如此处所用，术语“分泌信号”是指附接于多肽的N-末端的氨基酸序列(分泌信号肽)，其是成熟多肽从细胞分泌所需的。

如此处所用，术语“自花传粉的”或“自花传粉”是指一种植物的一朵花的花粉被传(人工地或天然地)到同一植物的相同或不同花的胚珠(柱头)。

如此处所用，术语“转录物”是指转录过程的产物。

如此处所用，术语“转化”是指将核酸(即核苷酸聚合物)转移到细胞中。如此处所用，术语“遗传转化”是指将DNA尤其是重组DNA转移并整合到细胞中。

如此处所用，术语“转化体”是指经过转化的细胞、组织或生物体。原始转化体被指定为″T0″或″T₀″。T0自交产生被指定为″T1″或″T₁″的第一转化世代。

如此处所用，术语“转基因”是指以保证其功能的方式插入生物体、宿主细胞或载体的核酸。

如此处所用，术语“转基因的”是指细胞、细胞培养物、生物体(如植物)和后代通过不同转化方法之一接受了外源的或经修饰的基因，其中所述外源的或经修饰的基因来自与接受该外源的或经修饰的基因的生物体的物种相同或不同的物种。

如此处所用，术语“转座事件”是指转座子从供体位点移动到目标位点。

如此处所用，术语“变种”是指种的细分，由一组该种中的与其它相似个体组的形式或功能不同的个体组成。

如此处所用，术语“非翻译区”或“UTR”是指一种mRNA分子中任何不编码蛋白质的部分(如真核细胞中的poly(A)尾)。

如此处所用，术语“载体”广泛地指任何编码外源核酸的质粒或病毒。该术语也应理解为包括协助核酸转入病毒体或细胞的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物等等。载体可以是适合作为将核酸或其变体递送到细胞的递送运载体的病毒载体，或载体可以是适合于同样目的的非病毒载体。病毒和非病毒载体用于将DNA递送到细胞或组织的例子是本领域所熟知的，并且描述于，例如，Ma等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：12744-12746)中。病毒载体的例子包括，但不限于，重组痘苗病毒、重组腺病毒、重组逆转录病毒、重组腺相关病毒、重组禽痘病毒等等(Cranage等.，1986，EMBO J.5：3057-3063；专利国际申请No.WO94/17810，公开于1994年8月18日；专利国际申请No.WO94/23744，公开于1994年10月27日)。非病毒载体的例子包括但不限于，脂质体、DNA的聚胺衍生物等等。

植物转化

如此处讨论，本发明的几种实施方式使用表达单元(或表达载体或系统)以在植物中表达外源提供的核酸序列。产生在植物中使用的表达单元/系统/载体的方法是本领域熟知的，且能容易的为适应目前发明的使用而改变。熟练技术人员根据此处提供的概要能容易的在本方法中使用任何合适的植物/载体/表达系统。

用于调节蛋白质表达的表达控制元件要么可以是通常发现与编码序列相关的表达控制元件(同源表达元件)，要么可以是异源表达控制元件。多种同源和异源表达控制元件为本领域所知晓并可容易地用于制备本发明中使用的表达单元。例如，转录起始区域可包括多种冠瘿碱起始区域中的任一，例如在根癌土壤杆菌Ti质粒中发现的章鱼碱(octopine)、甘露碱(mannopine)、胭脂碱(nopaline)等。或者，也可使用植物病毒启动子，例如用于控制植物中基因表达的花椰菜花叶病毒19S和35S启动子(分别为CaMV 19S和CaMV35S启动子)(例如美国专利Nos.5,352,605；5,530,196和5,858,742)。也可以利用衍生自CaMV的增强子序列(例如美国专利Nos.5,164,316；5,196,525；5,322,938；5,530,196；5,352,605；5,359,142；和5,858,742)。最后，也可使用植物启动子，如RUBISCO大小亚基启动子、增殖启动子(prolifera promoter)、果实特异性启动子、Ap3启动子、热休克启动子、种子特异性启动子等。

使用本领域知晓的标准技术，通常将配子特异性启动子、组成型启动子(例如CaMV或Nos启动子)、器官特异性启动子(例如来自番茄的E8启动子)或诱导型启动子连接到蛋白质或反义编码区。表达单元可以通过使用诸如转录终止子和/或增强元件的补充元件进一步优化。

因此，为在植物中表达，除蛋白质序列外，表达单元会通常含有植物启动子区，转录起始位点和转录终止序列。在表达单元的5′和3′末端通常包括独特的限制酶位点以允许容易地插入预成载体。

在异源启动子/结构基因或反义组合的构建中，启动子优选位于距异源转录起始位点与在其天然设置中距转录起始位点大约相同的距离之处。但是，如本领域所知晓，在该距离中可以容纳一些变异而不丧失启动子的功能。

除启动子序列外，表达盒还可含有位于结构基因下游的用以提供有效终止的转录终止区。终止区可以与启动子序列获得自相同的基因，或可以获得自不同的基因。若要使由结构基因编码的mRNA得到有效加工，通常向载体构建体加入指导RNA聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列包括但不限于，土壤杆菌章鱼碱合酶信号(Gielen等.，EMBO J 3：835-846(1984))或胭脂碱合酶信号(Depicker等.，Mol.and Appl.Genet.1：561-573(1982))。

将产生的表达单元连接到或以其它方式构建从而包括在适于高等植物转化的载体中。该载体也可以含有选择性标记基因，通过该基因能够鉴别培养物中经转化的植物细胞。通常也包含细菌或病毒来源的复制序列，以允许载体克隆到细菌或噬菌体宿主中，优选包括广泛宿主范围的原核复制起点。也应包括用于细菌的选择性标记，以允许选择含有期望构建体的细菌细胞。合适的原核选择性标记也包括对抗生素(例如氨苄青霉素、卡那霉素或四环素)的抗性。

如本领域所知，其它编码额外功能的DNA序列也可存在于载体中。例如，在土壤杆菌、根瘤菌、中生根瘤菌(Mesorhizobium)和中华根瘤菌(Sinorhizobium)转化的情况中，也会包含T-DNA序列用以随后转移至植物染色体。

本发明的序列也可融合至多种其它核酸分子，例如表达序列标签(ESTs)、表位或荧光蛋白标记。

ESTs是基因片段，长度通常是300到400个核苷酸，从互补-DNA(cDNA)克隆的3′或5′末端测序。一个法国和美国的合伙团体已生产了将近30,000个拟南芥ESTs(Delseny等.，FEBS Lett.405(2)：129-132(1997)；Arabidopsisthaliana Database，http://genome.www.stanford.edu/Arabidopsis)。关于对衍生自EST大数据库的基因表达模式的分析的讨论，参见例如M.R.Fannon，TIBTECH 14：294-298(1996)。

要通过常规方法引入期望的基因或一组基因，需要在两个系之间进行有性杂交，然后在杂合后代和一个亲本之间反复回交直到获得具有期望特征的植株。但是，该过程限于能进行有性杂交的植物，而且除期望基因之外的基因也会被转移。

重组DNA技术使植物研究者规避了这些限制，这是通过使植物遗传学家能鉴定并克隆理想性状(诸如对虫害的抗性)的特定基因并将这些基因导入已有用途的植物变种而实现的。一旦外源基因导入植物，植物随后即能用于常规植物育种方案(如谱系育种、单颗种子后代育种方案、相互反复选择)以生产也含有感兴趣基因的后代。

基因可使用同源重组以位点定向的方式导入。同源重组允许内源基因中的位点特异性修饰并由此使遗传的或获得的突变可得到修正，和/或可把新的改变设计入基因组。植物中的同源重组和位点定向整合在例如美国专利Nos.5,451,513；5,501,967和5,527,695中有所讨论。

生产转基因植物的方法为本领域普通技术人员所熟知。目前转基因植物可由各种不同转化方法生产，包括但不限于，电穿孔；显微注射；微粒轰击、也称为粒子加速或生物弹射轰击；病毒介导的转化；土壤杆菌、根瘤菌、中生根瘤菌和中华根瘤菌介导的转化。参见例如，美国专利Nos.5,405,765；5,472,869；5,538,877；5,538,880；5,550,318；5,641,664；5,736,369；5,736369；US 2005/0289672；US 2005/0289667，PCT公开WO 2006/004914；Watson等.，Recombinant DNA，Scientific American Books(1992)；Hinchee等.，Bio/Tech.6：915-922(1988)；McCabe等.，Bio/Tech.6：923-926(1988)；Toriyama等.，Bio/Tech.6：1072-1074(1988)；Fromm等.，Bio/Tech.8：833-839(1990)；Mullins等.，Bio/Tech.8：833-839(1990)；Hiei等.，Plant Molecular Biology 35：205-218(1997)；lshida et al.，Nature Biotechnology 14：745-750(1996)；Zhang等.，Molecular Biotechnology 8：223-231(1997)；Ku等.，Nature Biotechnology17：76-80(1999)；Raineri等.，Bio/Tech.8：33-38(1990)和Broothaerts等.，Nature433：629-633(2005)，将每篇整体通过述及并入本文。

根癌土壤杆菌是一种自然发生的细菌，其可将其DNA(遗传信息)插入植物，对植物产生一种称为冠瘿的损伤。其也可将外源DNA插入植物，通过使用其修饰的或“去攻击的”天然DNA插入系统，但不形成冠瘿病。目前大多数植物物种可用该方法转化。参见例如，Wang等，Australian Journal of Plant Physiology 23(3)：265-270(1996)；Hoffman等.，Molecular Plant-Microbe Interactions 10(3)：307-315(1997)；和Trieu等，Plant Cell Reports 16：6-11(1996)。

根瘤菌、中生根瘤菌和中华根瘤菌是天然存在的细菌，其也能将外源DNA(遗传信息)插入植物。目前许多植物物种可用该方法转化。参见例如，Broothaerts等.，Nature 433：629-633(2005)。

微粒轰击也称为粒子加速、生物弹射轰击和基因枪法(

Gene Gun)。基因枪用于将涂有基因(例如期望性状的基因)的弹丸射入植物种子或植物组织中，以获得随后表达该新基因的植物细胞。基因枪使用实际的炸药(.22口径间隙)来推进材料。也可使用压缩空气或蒸汽作为推进剂。

基因枪是由John Sanford、Edward Wolf和Nelson Allen在康奈尔大学于1983-1984发明的。目前基因枪及其商标为E.I.du Pont de Nemours and Company所有。已使用此方法转化过大多数植物物种，包括苜蓿(美国专利No.5,324,646)和三叶草(Voisey等.，Biocontrol Science and Technology 4(4)：475-481(1994)；Quesbenberry等.，Crop Science 36(4)：1045-1048(1996)；Khan等.，Plant Physiology 105(1)：81-88(1994)；和Voisey等.，Plant Cell Reports13(6)：309-314(1994))。

WHISKERS^TM是其它将DNA插入植物细胞的方法(如Gene Gun、根癌土壤杆菌、″鸟枪″法等)的替代方案，其由ICI Seeds Inc.(Garst Seed Company)于1993年开发；其由碳化硅针状结晶(″晶须″)组成。将纤维和植物细胞一起放入容器中，随后高速混合，导致结晶以极微小的(microscopic)“孔”(通道)刺入植物细胞壁。随后加入新DNA(基因)，导致DNA流入植物细胞。随后植物细胞整合该新基因；从而使其被遗传工程操作。

WHISKERS^TM技术的精髓是将小针状碳化硅″晶须″(直径0.6微米而长度5-80微米)以下述方式使用。将一个装有由DNA(例如农作物基因加选择性标记基因)、胚发生性玉米组织和碳化硅″晶须″组成的“转化混合物(cocktail)”的容器在银汞合金混合器(dental amalgam mixer)或涂料振荡器(paint shaker)中以强力方式混合或振荡。随后的胚发生性玉米细胞和锋利碳化硅″晶须″的碰撞导致在植物细胞壁上产生小孔，认为DNA(农作物基因)通过该小孔进入细胞。接受并纳入了新基因的那些细胞随后被诱导而生长并最终发育成可繁殖的转基因植物。

不奇怪的，碳化硅的纤维状、针状″晶须″形式是一种肺部健康危险，因此必须用与处理不含晶须的非纤维状碳化硅粉末非常不同的方式来处理。两种碳化硅形式，粉末和纤维状晶须，受到非常不同的管制，British Columbian(加拿大)Occupational Health and Safety(OHS)管制纤维形式与石棉相同，暴露极限是0.1纤维每cc(f/cc)；而普通的非纤维形式的暴露极限是3-10mg/立方米。显示碳化硅晶须以与石棉相似的方式产生致突变的活性羟基并导致DNA链断裂；碳化硅粉末不导致这样的作用(Svensson等.，1997)。

用碳化硅粉末对植物细胞壁进行破坏并不引导任何与该粉末相关的DNA进入植物细胞核，尽管这也会以低频率发生。如果DNA被引导至细胞核，正如根癌土壤杆菌或通过特定病毒的天然感染那样，则该问题就可克服。核定位信号序列(NLSs)指导蛋白质和任何相关核酸进入植物细胞核。

使用重组DNA方法成功导入植物的基因包括但不限于，编码下述性状的基因：种子贮藏蛋白，包括修饰的7S豆类种子贮藏蛋白(参见例如美国专利Nos.5,508,468、5,559,223和5,576,203)；除草剂耐受或抗性(参见例如，De Greef等.，Bio/Technology 7：61(1989)；美国专利No.4,940,835；美国专利No.4,769,061；美国专利No.4,975,374；Marshall等.(1992)Theor.Appl.Genet.83,435；美国专利No.5,489,520；美国专利No.5,498,544；美国专利No.5,554,798；Powell等.，Science 232：738-743(1986)；Kaniewski etal，.Bio/Tech.8：750-754(1990))；Day等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：6721-6725(1991))；肌醇六磷酸酶(参见例如，美国专利No.5,593,963)；抗细菌、真菌、线虫和虫害的抗性，包括Bt基因带来的对鳞翅目昆虫的抗性(参见例如，美国专利Nos.5,597,945和5,597,946；Johnson等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9871-9875(1989)；Perlak等.，Bio/Tech.8：939-943(1990))；凝集素，(美国专利No.5,276,269)；花的颜色(Meyer et a1.，Nature 330：677-678(1987)；Napoli等.，Plant Cell 2：279-289(1990)；van der Krol等.，Plant Cell 2：291-299(1990))；Bt基因(Voisey等.，同上文)；新霉素磷酸转移酶II(Quesbenberry等.，同上文)；豌豆凝集素基因(Diaz等.，Plant Physiology 109(4)：1167-1177(1995)；Eijsden等.，Plant Molecular Biology 29(3)：431-439(1995))；生长素应答启动子GH3(Larkin等.，Transgenic Research 5(5)：325-335(1996))；来自向日葵的种子白蛋白基因(Khan等.，Transgenic Research 5(3)：179-185(1996))；和编码膦丝菌素乙酰转移酶、编码对

除草剂的抗性的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、新霉素磷酸转移酶几种酶和α-淀粉酶抑制剂(Khan等.，同上文)的基因，将以上每种都整体通过述及并入本文。

为了特定目的，可优选不同抗生素或抗除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括nptII基因，其赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(参见例如，Messing & Vierra，Gene 19：259-268(1982)；Bevan等.，Nature 304：184-187(1983))；bar基因，其赋予对抗除草剂膦丝菌素的抗性(White等.，Nucl Acids Res 18：1062(1990)，Spencer等，Theor Appl Genet 79：625-631(1990))；和dhfr基因，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Bourouis等，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))。

使用土壤杆菌、根瘤菌、中生根瘤菌或中华根瘤菌转化方法形成的转基因植物通常在一个染色体上含有一个单独基因，尽管多拷贝也有可能。这样的转基因植物可被称为对于加入的基因来说是半合子的。这样植物的更准确的名字是独立分离子，因为每个转化植物代表一个独特的T-DNA整合事件(美国专利No.6,156,953)。转基因基因座通常通过转基因的存在与否进行表征。将其中一个等位基因与转基因的缺失相对应的杂合基因型也指定为半合子的(美国专利No.6,008,437)。

假设处于正常半合子状态，那么自交会导致第一代自交重组世代(也称为R1或R₁代)的最大基因型分离。R1代通过原始重组系(也称为R0或R₀代)的自交产生。由于在不存在连锁且假设耐受性表达仅需一个半合子插入物时，每个插入物都充当显性等位基因，所以一个插入物会分离为3∶1，两个插入物为15∶1，三个插入物为63∶1，等等。因此，为了发现至少一种抗性表型所需要培养的R1植物相对较少(美国专利Nos.5,436,175和5,776,760)。

如上所述，半合子转基因再生植株的自花传粉会产生等同于F2的子代，其中约25％会是纯合转基因植物。F2子代自花传粉和测交到非转化的对照植物可用于鉴定纯合转基因植物并保持该系。如果为得到再生植株而最初获得的子代来自异花传粉，则鉴定纯合转基因植物会需要增加一个自花传粉世代(美国专利5,545,545)。

育种方法

自由传粉种群。作物例如黑麦、多种玉米和甜菜、草本草(herbage grass)、豆类例如苜蓿和三叶草、和热带乔木作物例如可可、椰子、油棕榈树和一些橡胶树，上述作物的自由传粉种群的改良本质上依靠向固定有利等位基因的方向改变基因频率，同时保持高度(但远不是最高)杂合性。这些种群中的一致性是不可能的，且在自由传粉变种中的类型真实性(trueness-to-type)是整个种群的统计学特征，并不是个体植株的特征。因此，自由授粉种群的异质性与近交系、克隆和杂合体的同质性(或实事上这样)形成对比。

种群改良方法自然分成两组，基于通常称为混合选择的纯粹基因型选择的方法以及基于子代测定选择的方法。种群间改良利用自由育种种群的概念；使基因从一个种群向另一种群流动。一个种群(栽培种、株、生态型或任何种质资源)的植株与来自其它种群的植株天然地(如通过风)、或通过人工或通过蜜蜂(通常为蜜蜂(Apis mellifera L.)或苜蓿切叶蜂(Megachile rotundataF.))杂交。使用选择，通过从两种来源分离具有理想性状的植株来改良一个(或有时是两个)种群。

基本上有两种主要方法进行自由传粉种群改良。第一种，有种情况是种群通过选定的选择程序一同改变。结果是产生改良的种群，其可通过孤立条件下自体随机杂交进行不确定的传播。第二种，合成变种与种群改良获得了同样的最终结果，但不能同样地自体传播；其必需从亲本系或克隆进行重建。这些用于改良自由传粉种群的植物育种程序为本领域技术人员所熟知，很多文章和论文提供了用来改良异花传粉植株的常规育种程序的广泛综述，包括：Allard，Principles of Plant Breeding，John Wiley & Sons，Inc.(1960)；Simmonds，Principles of Crop Improvement，Longman Group Limited(1979)；Hallauer and Miranda，Quantitative Genetics in Maize Breeding，Iowa StateUniversity Press(1981)；和Jensen，Plant Breeding Methodology，John Wiley &Sons，Inc.(1988)。

混合选择。在混合选择中，选择并收获理想的个体植株，种子不进行子代检验而复合以产生后代。由于选择仅基于母本，且没有控制传粉，混合选择总体上是随机杂交并选择的形式。如上文所述，混合选择的目的是增加种群中优良基因型的比例。

合成物。合成变种是通过将多种在所有可能的杂交组合中选择的具有良好配合力的基因型相互(inter se)杂交并随后通过自由传粉保持该变种而产生的。无论亲本是(或多或少是近交的)种子繁殖系，如在某些甜菜和豆类(蚕豆(Vicia))中，还是克隆，如在草本草、三叶草和苜蓿中，原理上并无不同。亲本根据总体配合力选择，有时通过测交或顶交，更通常的是通过多系杂交。亲本种子系可以是有意近交的(如通过自交或近交)。但是，即使亲本不是有意近交的，株系维持过程中在系内进行选择会保证一些近交的发生。当然，无性系亲本会保持不变并高度杂合。

合成物是否能从亲本种子生产试验田(plot)直接到农民处或必须首先经历一或两个循环的增殖取决于种子生产和对种子的需求规模。在实践上，草和三叶草通常增殖一次或两次从而可观地从原初合成物中移出。

虽然有时使用混合选择，通常优选进行子代检验来实现多系杂交，这是由于它们操作简便且与目标具有明显相关性，即合成物中总体配合力的开发。

亲本系或克隆进入合成物的数量差异显著。实际中，亲本系的数量范围从10到几百，平均100-200。在种子增殖过程中，由100或更多克隆形成的广基的合成物可望比窄基合成物更加稳定。

杂合体。杂合体是不同基因型亲本之间杂交产生的个体植株。商业化杂合体目前在许多作物上广泛使用，包括玉米(玉蜀黍)、高梁、甜菜、向日葵和绿花椰菜(broccoli)。杂合体可通过许多不同的方式形成，包括通过两亲本的直接杂交(单交杂合体)，通过使单交杂合体与另一亲本杂交(三方或三交杂合体)，或通过两个不同杂合体的杂交(四方或双交杂合体)。

严格的说，远交(out breeding)(即自由传粉)种群中大多数个体是杂合体，但该术语通常也适用于以下情况：亲本是基因组有足够的不同而被认为是不同的种或亚种的个体。杂合体可以是可育的或不育的，这取决于两亲本基因组中的的定性和/或定量差异。杂种优势或杂种活力(hybrid vigor)，通常与杂合性增加相关，杂合性增加导致杂合体生长活力、存活和生育力与用于形成该杂合体的亲本系相比有所增加。最大杂种优势通常通过两个遗传上不同的、高度近交系的杂交来实现。

杂合体生产是发展成熟的产业，涉及亲本系和由那些亲本系杂交而产生的杂合体二者的单独生产。对杂合体生产过程的详细讨论，参见例如Wright，Commercial Hybrid Seed Production 8：161-176，In Hybridization of Crop  Plants。

应该理解的是，本发明描述实施例和实施方式的目的只是用作说明，而其各种修改或变化会暗示给本领域技术人员，将这些修改和变化包括在本申请的主旨和范围内。

实施例

实施例1：使用植物病原体来分离能够感染革兰氏阴性植物病原体天竺 葵黄单胞菌(Xanthomonas pelaraonii)的噬菌体。

在PYGM培养基中(蛋白胨，酵母提取物，甘油和吗啉代丙磺酸；DeFeyter等。1990)在30℃适度摇动下培养野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(X.campestris pv.Pelargonii)(同物异名天竺葵黄单胞菌)CHSC菌株的过夜培养物。将5ml这种过夜培养物加上50ml从农业环境中大池塘的边缘取得的未经消毒的水一起加入到50ml的PYGM加2.5g CaCO₃，并允许在30℃下不摇动温育48小时。温育后，将1ml这种富集培养物以5000g离心1分钟以去除大多数细菌和碎片，将500μl上清液移出并用一滴氯仿消毒。将上清液的小滴置于在上层琼脂中含有菌株CHSC的覆盖平板顶部。覆盖平板是这样的PYGM琼脂平板，其用加有200μl过夜CHSC培养液的在50℃保持的3ml 0.7％水琼脂覆盖并允许其冷却和固化。温育24小时后观察噬菌斑；其通过从平板上刮去噬菌斑来收集，根据标准程序(Sambrook等.，1989)滴定和保存。然后将这些噬菌体混合物从单一的噬菌斑中纯化出来，并对个体噬菌体针对柑橘黄单胞菌菌株B21.2、野油菜黄单胞菌(X.campesths)菌株528和茄科雷尔氏菌菌株G2的细菌宿主范围进行检测。所有噬菌体都只能特异性地攻击天竺葵黄单胞菌菌株CHSC而不感染其他菌株。

实施例2：使用琼脂平板覆盖测定法来表征噬菌体宿主范围并用杀死它 们不能感染的细菌宿主的能力来鉴定噬菌体。

将PYGM平板用天竺葵黄单胞菌CHSC覆盖，并将从实施例1获得的多种纯化的噬菌体样品小滴加到所述平板，在30℃下温育48小时。所有噬菌体都能感染CHSC并产生裂解的亮区。将柑橘黄单胞菌B21.2、野油菜黄单胞菌528和茄科雷尔氏菌G2的过夜培养液的细胞悬液加入如实施例1中所述的0.7％水琼脂，并单独地覆盖在噬菌体感染的CHSC平板上。

将平板在30℃下再温育48小时，并评估噬菌体杀死它们从外面不能感染的革兰氏阴性细菌的能力。一些噬菌体显示了存在对于所有被检测细菌的强力的、明显为可扩散的杀伤因子。选择噬菌体分离物15(P15)进行测序和进一步的评估。

实施例3：使用基因组测序和注释技术从噬菌体P15鉴定编码能从外部 杀死细菌的蛋白质的基因候选物。

将P15基因组完全测序以鉴定表达可扩散的杀伤因子的基因。P15DNA是使用天竺葵黄单胞菌菌株CHSC作为宿主细菌根据标准步骤来制备的。将P15DNA用EcoRV消化，产生了11个片段，大小范围为从12.4kb到357bp。大多数片段得到了克隆，虽然进行了反复尝试，但有些片段未被克隆，最有可能是由于限制性内切核酸酶和穴蛋白的存在。将克隆的DNA片段直接用于测序，最初使用基于载体的引物，随后进行引物步移直到每个片段都完成。使用P15基因组DNA对未克隆的片段测序。片段组装用P15基因组DNA和每个片段在二个方向上向外延伸的引物来完成。P15有长度为55,770bp的双链DNA基因组(GenBank NC_007024)。

经测序噬菌体的ORF分析用几个程序的组合完成，包括PromScan，Terminator(终止子)(GCG)、GeSTer(Unniraman等.2001，2002)、Glimmer、Genie、Codon preference(密码子偏好)(GCG)、ORF finder(ORF搜索器)(NCBI)以及Blast(NCBI)分析。潜在的Shine-Delgarno序列通过检查序列手动鉴定。使用缺省的Glimmer设定，只鉴定了32个ORF；这些ORF中没有和之后通过功能分析鉴定为穴蛋白或BOMB的功能基因对应的，虽然鉴定了预测为编码内溶素的lysY。在基因组中鉴定了启动子和终止子之后，使用Codon preference(GCG)对所有ORF的手动分析允许鉴别出额外的52个ORF，包括那些预测为编码穴蛋白的。所述基因组编码84个推定的ORF(GenBank NC_007024)。还有几个不知功能的推测ORF。噬菌体P15 ORF“BC”(bombBC；SEQ ID No.1)被预测为编码在中性pH带-0.5电量的17.9kD蛋白质(BombBC；SEQ ID No.2)。这个ORF属于几个经克隆、表达并对于其对大肠杆菌外膜作用的证据进行了功能性评估的噬菌体P15ORF。

实施例4：使用植物抗毒素和诱导型基因表达系统来鉴别编码能够从外 部进行杀伤的蛋白质的候选基因。如上文所述，已知噬菌体编码能够降解细菌细胞壁的蛋白质(内溶素)和能够降解或破坏细菌内膜的蛋白质(穴蛋白)。直到现在仍不知道具有降解或破坏细菌外膜的能力的噬菌体蛋白(即，″BOMB″蛋白)，也不知道描述过任何鉴定这样的蛋白质的测定法。将P15推定穴蛋白的预测肽编码区holZ(美国申请流水号10/556,563和PCT/US2004/015099中的SEQ ID No.27)，其内溶素的预测肽编码区lysY(美国申请流水号10/556,563和PCT/US2004/015099中的SEQ ID No.26)，及其BOMB的预测肽编码区bombBC(美国申请流水号10/556,563和PCT/US2004/015099中的SEQ ID No.82)通过聚合酶链反应(PCR)从P15噬菌体DNA扩增并克隆至不含启动子的pGemT内。将这些编码区在一种使用大肠杆菌菌株BL21DE3(Novagen)的改良型pET27b表达载体系统中与阻抑型启动子可操作地融合。在bombBC的情况中，产生了两个版本，它们之中一个有pelB前导序列，而另一个没有pelB前导序列。这个前导序列保证了bombBC跨过内膜输出到细菌周质。进行实验通过与空载体比较而比较了液体培养中这三个基因在pET27b中表达的效果。此外，进行实验比较了BL21 DE3细胞中穴蛋白holZ的表达效果与BOMB bombBC的表达效果，所述BL21 DE3细胞也组成型表达一种内溶素基因，lysS。将细胞在葡萄糖抑制下在琼脂平板上培养，接着在没有抑制的液体培养基中培养。然后通过添加1mM IPTG来诱导细胞，并比较在诱导后的不同时间培养物在600nm的光密度(OD)。结果显示在下面的表格1.

穴蛋白HolZ(没有内溶素LysS)的诱导表达引起了拟裂解；培养物的光密度有所增加，接着降低到初始密度。没有在这些培养物中有细胞碎片的证据。相反地，有LysS的HolZ诱导表达引起了立即裂解，在清亮的裂解物中有明显的细胞碎片。这些效果是穴蛋白的特性，其通过破坏内膜杀死细胞，但是不能降解细菌细胞壁，使得细胞内容物保持在内且培养物中没有出现裂解物。

内溶素LysY的诱导表达引起了细胞密度缓慢降低(没有显示)，且与单独表达HolZ的效果相比，细胞裂解碎片在这些培养物中是明显的。由于LysY是在没有前导序列的情况下克隆的，这种内溶素似乎表现得和溶菌酶类似，显示了一些穿透或透化细菌内膜的能力，使其到达并降解细菌细胞壁，引起裂解。

BOMB蛋白BombBC的诱导表达引起了拟裂解，其看起来和由HolZ引起的类似；培养物的光密度有一些增加，接着降低到初始密度。也没有发现在这些培养物中有细胞碎片的证据。然而，与HolZ和LysS的组合相比，BombBC和LysS的组合不引起裂解，而是BombBC和LysS的组合看上去没有裂解效果，提示内细菌膜是完整的且LysS不能到达周质并攻击细胞壁。这强烈表明BombBC的活性和穴蛋白在性质上不同，穴蛋白对内膜进行破坏，其也与内溶素在性质上不同，内溶素降解胞壁质或者肽聚糖细胞壁。

此外，盐酸小檗碱，一种商业制备的、植物来源的抗菌化合物(一种“植物抗毒素”)，和BombBC协同作用降低培养物密度。在穴蛋白或内溶素上都没看到这种协同作用。小檗碱可用于检测LPS屏障的缺损和/或植物病原细菌外流泵送能力(Reddy等.，2007)。细菌对小檗碱的敏感性是浓度依赖性的。为了细菌存活，任何从LPS泄漏的小檗碱一定要主动泵出(外流)；如果是LPS被破坏或者外流泵能力丧失，细菌都无法在小檗碱存在下生存。当在这些实验中将小檗碱(5，6-二氢-9，10-二甲氧基苯并-1，3-苯并二氧杂环戊烯喹嗪(5，6-dihydro-9，10-dimethoxybenzo-1，3-benzodioxolo quinolizimium)，一种生物碱DNA插入剂；Schmeller等.，1997)加至(5微克/ml)携带bombBC的细胞并在液体培养中培养时，当BombBC表达时细胞死亡快很多。向只携带pET载体的BL21DE3细胞加入相同浓度的小檗碱几乎没有效果。小檗碱和表达的BombBC的协同效果证明了BombBC作用在细菌细胞的外膜或LPS保护层上，指示了小檗碱等必需要从细菌细胞中主动地流出的试剂可作为附加基因表达测定法的一部分，所述测定法将Bomb基因区别于其它在表达时杀死细菌细胞的噬菌体基因(如内溶素和穴蛋白基因)。

表1.存在或者不存在植物抗毒素小檗碱的情况下，从噬菌体P15克隆的穴蛋白HolZ、内溶素LysY和BOMB BombBC基因的表达对液体培养基中大肠杆菌BL21DE3细胞生长的影响。PI，接种后；ND，尚未确定。

实施例5：使用P3rpoH::lacZ报告基因确定BOMB蛋白对细菌LPS 的作用。大肠杆菌菌株ADA410携带P3rpoH::lacZ报告基因，其在细胞的LPS或外膜受损时被选择性激活(Shapiro和Baneyx，2002)。将bombBC编码区再克隆到pMAL表达载体(New England Biolabs，Ipswich，MA)中，在大肠杆菌BL21DE3细胞中过表达，并纯化(图1)。将10微升纯化的蛋白制剂液滴滴到铺板于含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-呋喃半乳糖苷(X-gal)的LB琼脂上的新鲜ADA410细胞悬液上，同时以再悬浮缓冲液作为对照。在ADA410细胞周围蓝色缓慢地呈现出来并在24hr的生长期内加强，这确认了BombBC对细菌LPS的有害作用。

实施例6.在植物表达载体中构建BombBC表达盒。将来自pBI221(Clontech，Palo Alto，CA)的CaMV启动子通过酶再克隆到pCAMBIA0390(Cambia，Canberra，AU)的多接头克隆位点(该质粒具有T-DNA左边界、多接头位点、NOS转录终止子和T-DNA右边界)中构建了pIPG700。将噬菌体P15bombBC基因通过酶再克隆到pIPG700中CaMV启动子下游和NOS终止子的上游，从而构建了pIPG780。使用来源于一种已知在柑橘木质部积累的蛋白质的24个氨基酸的植物信号多肽P12(GenBank登录号AF015782；Ceccardi等.，1998)来构建木质部分泌信号前导序列(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)。所述木质部分泌信号肽序列是从甜橙(Citrus sinensis)(sweet orange)中通过PCR扩增的，并将其克隆到bombBC基因的上游，得到了pIPG780上P12和BombBC之间的翻译基因融合物(SEQ ID No.5)。克隆pIPG780接着用于在以下双子叶植物中的瞬时表达测定法：辣椒，柑橘和天竺葵。

将P12::BombBC基因(SEQ ID No.5)通过酶从pIPG780再克隆到pCAMBIA1305.2(Cambia，Canberra，AU)，这样使所述基因由pCAMBIA1305.2的反义CaMV启动子(reverse CaMV promoter)驱动，形成了pIPG787。pCAMBIA1305.2携有用于植物选择的由双CaMV启动子驱动的潮霉素抗性基因。将P12::BombBC(SEQ ID No.5)基因也通过酶从pIPG780再克隆到pCAMBIA2301(Cambia，Canberra，AU)，这样使BombBC基因由pCAMBIA2301的反义CaMV启动子驱动，形成了pIPG786。

pCAMBIA2301携有用于植物选择的由双CaMV启动子驱动的卡那霉素抗性基因。将pIPG786用于转化和再生烟草和柑橘，而pIPG787用于转化天竺葵和稻。

实施例7：使用甜椒植株中bombBC的瞬时表达证明对黄单胞菌和雷尔 氏菌的增强抗性。对于瞬时表达分析，将植物转化和表达载体pIPG780移入根癌土壤杆菌GV2260菌株，其通过电穿孔或者所描述的细菌结合(Kapila等.，1997)实现。将携有pIPG780的GV2260用于在椒和天竺葵植株中按描述(Kapila等.1997；Duan等.，1999；Wroblewski等.2005)作瞬时表达。包含感兴趣的构建体的土壤杆菌培养物在诱导土壤杆菌vir基因的乙酰丁香酮的存在下于基本培养基上生长。椒和天竺葵的培养物的光学密度分别保持在0.008和0.25。首先使携有pIPG780或者空白载体对照的GV2260菌株通过开放的气孔浸入甜椒(辣椒(Capsicum))叶的质外体空间，其通过使用没有针头的结核菌素注射器注射来实现。叶的2到10cm²的区域被浸没，接着用永久标记圈出该接种的区域。在这之后三天，接着在之前接种的区域内再次通过注射器注射进行攻击接种，这次无论是天竺葵黄单胞菌菌株CHSC还是茄科雷尔氏菌都用约2×10⁶集落形成单位(cfu)，都在液体培养基中过夜培养。这得到了每种病原体大约2×10⁴cfu/cm²的接种物密度。使用的两种菌株都是公开的参考菌株，具有经确认的对其宿主的病原性：天竺葵黄单胞菌只攻击天竺葵并引发天竺葵的细菌性枯萎病(bacterial blight disease)，而茄科雷尔氏菌主要攻击茄科(Solanaceae family)(马铃薯和番茄)的植物。甜椒对两种病原体都不是非宿主。(在自然界中被攻击的植物被认为是指定病原体的“宿主”。所有其他植物被认为是该指定病原体的“非宿主”。当将这些相同的病原体以指定的密度接种到携有特定抗性(R)基因的宿主植物或者非宿主植物时，观察到快速过敏反应(HR)。HR在24-48小时内，在接种位点表现为汇合的、坏死的、萎陷的区域。)。

根据48小时后观察到存在或者不存在HR症状对结果进行视觉上的评定。在所有情况下，“使用分裂叶子(split leaf)”实验，其中将pIPG780接种到半片叶子上，并将空白载体对照接种到相同叶片的另外一半上。在重复实验中；在pIPG780上瞬时表达的BombBC的存在下，在无论是经天竺葵黄单胞菌还是茄科雷尔氏菌接种的叶片的对照侧引发的HR症状都被消除了。

由于实施例4中BombBC在中和大肠杆菌的LPS屏障以允许植物抗毒素小檗碱穿入和杀死细菌方面的效果以及实施例5中损害大肠杆菌的LPS屏障的间接证据，我们推断椒类植物的天然植物抗毒素，结合在椒类植物中瞬时表达的BombBC，杀死或抑制黄单胞菌和雷尔氏菌的生长，由此防止了这些实验中的HR。

实施例8：使用在天竺葵(Pelargonium X hortorum)植株中bombBC的瞬 时表达来证明对雷尔氏菌增强的抗性。为了测定雷尔氏菌属病原体是否也受在宿主植物中表达的BombBC影响(与非宿主植物如椒相反)，实施了和上述实施例7类似的实验，这次使用花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)。完成这个实验以确认杀伤或废除该病原体的对非宿主引发HR的能力也延及易感宿主植物的病原体。使用花店天竺葵植株实施和实施例7描述的相同的实验，但是对于这些在对由所述病原体引起的疾病高度易感的植物中的致病性实验，在攻击接种后2到7天的时期，每天检查结果。再一次，结果和实施例7中描述的HR的结果类似。由天竺葵黄单胞菌引起的致病症状在使用pIPG780时显著降低。此外，来自这些区域的细胞计数证明和对照叶相比，在表达BombBC的植物叶片中集落形成单位的数量具有100×下降。这些结果确认以下观念和并将其扩展到包括宿主植物，即可以为了杀伤革兰氏阴性致病细菌或使革兰氏阴性致病细菌丧失功能的目的在植物中表达BombBC，这最有可能是由于由宿主植物产生的天然植物抗毒素和BombBC的瞬时表达的综合效果使病原体的LPS屏障失去功能。

实施例9：使用bombBC在柑橘植物中的瞬时表达证明对柑橘黄单胞菌 增强的抗性。

为了证明黄单胞菌属病原体是否也受宿主植物中表达的BombBC影响(与非宿主植物如椒相反)，实施和上述实施例7和8所描述的类似的实验，这次使用接种了柑橘溃疡病的病原体柑橘黄单胞菌的葡萄柚(Citrus paradisi)植株。该病原体是一种受管制的病原体，而这些接种必须在严格的隔离下实施。

完成这些实验是为了确认降解或破坏黄单胞菌的LPS并进一步杀死所述病原体，影响其在非宿主上引发HR的能力，也扩展到易感宿主植物的病原体。使用柑橘实施与实施例7和8所描述的相同的实验，但是对于这些在对由这种病原体引起的疾病高度易感的植物中进行的致病性实验，在攻击接种后6到14天的时间内每天检查结果。再一次，结果和实施例7中关于HR的描述或实施例8的致病反应类似。由柑橘黄单胞菌引起的致病症状在使用pIPG780时显著降低。这些结果证明了以下观念并将其扩展至包括宿主植物：即可以为了杀伤革兰氏阴性致病细菌或使革兰氏阴性致病细菌丧失功能的目的在植物中表达BombBC，这最有可能是由于由宿主植物产生的天然植物抗毒素和BombBC的瞬时表达的综合效果使病原体的LPS屏障失去功能。

实施例10：使用bombBC构建转基因天竺葵(Pelargonium X hortorum)。使用根癌土壤杆菌和根瘤菌使用克隆在pIPG787中的bombBC基因来构建转基因天竺葵(Pelargonium X hortorum)Avenida栽培种。最有效的生产转基因天竺葵的方法是使用根癌土壤杆菌实现的(Robichon等.，1995)。确认了大约9％PCR阳性的天竺葵叶柄外植体(在进行转化方案的总共360个叶柄中)。基于对bombBC基因的PCR扩增，总共获得33个转基因天竺葵(图2)。将选出的植株进行无性繁殖，并如下所述使用不同病原体进行攻击接种。这些结果证明了bombBC基因(在瞬时表达实验中显示为表达的)可以稳定地转化并推测其在天竺葵中的表达效率与那些使用空载体或另外的基因构建体获得的效率相当，指明BombBC对天竺葵植株不是有害的。

实施例11.使用bombBC构建转基因烟草(Nicotiana tabaccum)。使用根癌土壤杆菌和根瘤菌使用克隆在pIPG786中的bombBC基因来构建转基因烟草Xanthi栽培种(Nicotiana tabaccum cv.Xanthi)植株。最有效的生产转基因烟草的方法是按描述使用叶盘法用根癌土壤杆菌实现的(Horsch等.1985)。将转化体在含有100μg/ml卡那霉素的MS培养基(Murashige和Skoog 1962)上选择。确认了约21％PCR阳性烟草外植体(在进行转化方案的总共235个叶盘中)。基于对bombBC基因的PCR扩增，总共获得了50个转基因烟草植株(图2)。对选出的植株进行有性和无性繁殖，并如下文所述使用不同病原体进行攻击接种。这些结果证明了bombBC基因(在瞬时表达实验中显示为表达)可以稳定地转化并推测其在烟草中的表达效率与那些使用空载体或另外的基因构建体获得的效率相当，指明BombBC表达对烟草植物不是有害的。

实施例12：使用bombBC构建转基因柑橘(甜橙x枳)。使用根癌土壤杆菌和根瘤菌使用克隆在pIPG786中的bombBC基因来构建转基因柑橘(甜橙x枳)Carizzo栽培种植株。最有效的生产转基因柑橘的方法是按描述使用适用于黄化柑橘茎段的根癌土壤杆菌实现的(Moore等.，1992)。确认了约6％PCR阳性的柑橘茎外植体(在进行转化方案的总共650个茎段中)。基于对bombBC基因的PCR扩增，总共获得40个转基因柑橘植株(图2)。将选出的植株进行无性繁殖，并如下文所述使用不同的病原体进行攻击接种。这些结果证明了bombBC基因(在瞬时表达实验中显示为表达)可以在柑橘中稳定地转化并推测其在柑橘中的表达效率与那些使用空载体或另外的基因构建体获得的效率相当，指明BombBC对柑橘植物不是有害的。

实施例13：使用bombBC构建转基因稻(Oryza sativa iaponica)。使用根癌土壤杆菌和根瘤菌使用克隆在pIPG787中的bombBC基因来构建转基因稻(Oryza sativa japonica)TP309栽培种。最有效的生产转基因稻的方法是按描述使用适用于由种子产生的稻愈伤组织的根癌土壤杆菌实现的(Hiei等.，1997)。确认了大约20％PCR阳性的稻外植体(在进行转化方案的总共305个愈伤组织中)。基于对bombBC基因的PCR扩增，总共获得60个转基因稻植株。对选出的植株进行有性繁殖，并如下所述使用不同的病原体进行攻击接种。这些结果证明了bombBC基因(在瞬时表达实验中显示为表达)可以在稻中稳定地转化并推测其表达效率与那些使用空载体或另外的基因构建体获得的效率相当，指明BombBC对稻植株不是有害的。

实施例14.使用转基因天竺葵、柑橘和烟草植株的无性繁殖子代获得克 隆的bombBC植株。转基因天竺葵、柑橘和烟草植株如实施例10、11和12所示获得。对所述转基因天竺葵、柑橘和烟草植株进行无性繁殖以生产子代克隆，其使用天竺葵、柑橘和烟草繁殖领域技术人员熟知的技术进行。对于天竺葵、烟草、柑橘以及其他通常通过取得插条来繁殖的植物品种，从一个母本植物切下有2个节的节间部并使其生根，通常使用含有或不含根诱导激素的支持培养基，为每一个这样的克隆或“插条”产生一个单一新植株。插条在所有的情况下均和母本植株是遗传学上相同的(即，BombBC为100％PCR阳性)。对于柑橘和类似繁殖的木本品种，从转基因枝干部分取带叶的“接穗(scion)”插条，并将其嫁接或拼接(splice)到非转基因根茎上，这样根和下部的主干由非转基因根茎组成，而上部主干和枝条由转基因接穗组成。接穗插条在所有情况下和母本植物是遗传学上相同的(即BombBC为100％PCR阳性)；母本植物内实施的遗传修饰是稳定的。这些结果证实了经过至少一个无性世代在母本植物内实施的遗传修饰是稳定的。

实施例15：使用转基因稻和烟草植株的有性繁殖子代获得克隆的 bombBC植株。转基因二倍体稻和烟草植株如实施例11和13所示的获得。转基因(T₀代)稻和烟草植株是自花传粉的且从所述自花传粉的植株收获种子(T₁代)，对种子进行处理、种植，且子代植株由该自花传粉的种子长成。使用PCR实验测定T₁子代植株都有经典的遗传学3∶1比例，其中3/4植株(1/4为纯合转基因而1/2为杂合转基因植株)通过PCR测试发现为转基因的，而1/4的植株为非转基因的。这些测试显示使用本发明的方法引入的编码bombBC的核酸分子稳定地整合到稻和烟草中，且bombBC是可遗传的。

实施例16：使用在转基因天竺葵(Pelargonium X hortorum)宿主植株中表 达的bombBC赋予对天竺葵黄单胞菌和茄科雷尔氏菌的抗性。用天竺葵黄单胞菌和茄科雷尔氏菌来实施对表达活性BombBC的转基因花店天竺葵(Pelargonium X hortorum)植株和无性繁殖的表达活性BombBC的转基因花店天竺葵的病原体攻击接种。所述转基因亲本或者从该转基因亲本植株获得的无性繁殖的子代克隆减少了疾病症状。

用液体培养生长的天竺葵黄单胞菌细胞实施接种，以每次每毫升10⁷集落形成单位(cfu/ml)的浓度喷在叶片上。还使用在10⁹cfu/ml细胞中浸过的剪刀在经喷雾的相同植株的几个地方夹(clip)叶片来接种天竺葵黄单胞菌。用天竺葵黄单胞菌接种后，将植株保持在32℃以促进病原体的生长和症状的发展。接种后四周，给接种了天竺葵黄单胞菌的非转基因天竺葵变种″Avenida″(图1)，和接种了天竺葵黄单胞菌的表达BombBC的同一变种″Avenida″的转基因天竺葵(图2)拍照，用木塞钻孔器从三片叶最有可能包含病原体细胞的区域中取下共1平方厘米(cm²)的圆形切片(参考图1和2)。结果，在接种后四周时从非转基因天竺葵变种″Avenida″植株回收了10⁵cfu/ml的天竺葵黄单胞菌(图3)，且症状系统地发展直到整个植株死亡，通常是接种后12周。然而，在接种后的5天后没有从转基因天竺葵变种″Avenida″中获得存活的天竺葵黄单胞菌(图3)，且没有证据显示由天竺葵黄单胞菌引起的天竺葵枯萎病。这些植物对天竺葵黄单胞菌的感染免疫。

在另外的实验中，将茄科雷尔氏菌菌株Rsp673(最初从天竺葵中分离而得且已知对天竺葵有强致病性)通过使用钝头结合菌素注射器直接用注射器浸入106cfu/ml到叶的海绵状叶肉中来进行接种。此外，这些相同的注射接种的植株也通过直接将5ml含有10⁷cfu/ml所述细胞的液体培养物加入盆栽天竺葵植株的土壤来进行接种(参考图4)。接种后，将植株保持在32℃以促进病原体的生长和症状的发展。用细菌性萎蔫病的病原体茄科雷尔氏菌接种的转基因BombBC天竺葵变种″Avenida″的症状未能发展超过叶上病原体直接浸入的区域，且所述疾病决不会成为系统性的。除了抑制疾病，BombBC表达明显地杀死病原体，因为在转基因BombBC″Avenida″植株上在接种茄科雷尔氏菌后十二周时没有检测到茄科雷尔氏菌细胞。相反地，在非转基因″Avenida″植株上的症状正常和系统化地发展；在接种茄科雷尔氏菌之后十二周，所有非转基因″Avenida″植株均死于这种病原体引起的萎蔫病(图4).

这些测试确认了使用本发明的方法，已经将引入的编码BombBC蛋白的核酸分子稳定地整合到天竺葵中，并证明了转基因天竺葵，无论是否是无性繁殖的，其对由天竺葵黄单胞菌和茄科雷尔氏菌引起的疾病具有抗性或者对其免疫。

这些结果进一步证实了转基因天竺葵，无论是否是无性繁殖的，其都杀死天竺葵黄单胞菌和茄科雷尔氏菌。这些结果也确认和拓展了这样的实证，即如从测试在培养基中生长的细胞所预期的对革兰氏阴性细菌LPS的破坏，并且如从瞬时表达实验所预期的，这样的LPS破坏导致了对疾病的抗性。

实施例17：使用在转基因烟草宿主植株中表达的bombBC来赋予对茄 科雷尔氏菌的抗性。用茄科雷尔氏菌来实施对表达BombBC的转基因烟草(烟草栽培种Xanthi(Nicotiana tabaccum cv.Xanthi))的病原体攻击接种。将有性繁殖(播种的，实施例15的T₁代；下面表格的Exp 3)以及无性繁殖(插条的，实施例11的T0代；下面表格的Exp 1和2))的烟草植株都进行接种并比较，因为无性繁殖的方法提供了愈合的、但是在土壤线下仍然有显著扩大了的切面，其可能有利于土生的病原体的进入。

将茄科雷尔氏菌Rsp446菌株(对烟草有强致病性)通过直接向盆栽烟草植株的土壤加入5ml包含5×10⁷到2×10⁸cfu/ml细胞的液体培养物来进行接种。接种后，将植株保持在32℃以促进病原体的生长和症状的发展。每天检测植株并将显示出黑色叶脉症状的萎蔫植株记录下来并丢弃。68天后记录下的存活数/测试总数的结果如下：

	接种物水平	对照插条	对照播种	BombBC插条	BombBC播种
						Exp.1	5×107	7/19(37％)		10/15(63％)
Exp.2	1×108	4/20(20％)		9/20(45％)
						Exp.3	2×108		9/24(38％)		0/21(100％)

这些结果证明BombBC给烟草提供了对茄科雷尔氏菌的抗性，以及在播种的烟草中是100％有效的。这些结果，结合实施例16中针对两种不同的病原体属从转基因天竺葵得到的结果，确认了使用BombBC控制疾病的应用，不仅是在天竺葵中，也在一般性地用在转基因植物中。

实施例18：使用在转基因柑橘和烟草宿主植株中表达的BombBC来赋 予对柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)的抗性。

柑橘黄龙病(citrus greening disease)或Huanglongbin，是由柑橘黄龙病菌(Ca.Liberibacter asiaticus)引起的。这种未培养的细菌病原体是一种USDA选择剂。已知它攻击烟草植株，其可以用作一个代理宿主来在转基因烟草中检测细菌抗性的基因(Francischini等.，2007)。将菟丝子(Cuscuta)(dodder)用于从已知的受阳性感染的来源(一株甜橙植株)将黄龙病(greening)传送到6棵健康的烟草栽培种Xanthi的每一棵。其中2棵烟草植物是BombBC转基因的(使用实施例11和15的方法构建)而其他四棵是对照。允许烟草植株与菟丝子保持连接4周，并按描述通过嵌套式PCR来测定所述植株的黄龙病(Zhou等.，2007)。结果是4棵对照植株里面的3棵具有黄龙病症状，这3棵均为PCR阳性，而2棵转基因BombBC植株都没有症状，而它们也都不是PCR阳性。将这些植株保持了三周，接着再检测。结果还是一样，这表明BombBC提供了针对柑橘黄龙病的抗性。

使用六棵健康柑橘Carizzo植株进行类似测试。再一次，将菟丝子(dodder)用于从一个已知受阳性感染的来源(一株甜橙植株)将黄龙病传送到6棵健康的甜橙x枳栽培种Carizzo的每一棵。其中2棵柑橘植株是转基因BombBC的(使用实施例12的方法构建的)，而其他四棵是对照。允许柑橘植株与菟丝子保持连接4周，并按描述通过嵌套式PCR来测定所述植株的黄龙病(zhou等.，2007)。结果是没有Carrizo植株有黄龙病症状，和仅有一棵对照植株是PCR阳性的，而2棵转基因BombBC都不是PCR阳性。将这些植株保持了三周，接着再检测。结果还是一样，并再次表明了BombBC提供了针对柑橘黄龙病的抗性。

实施例19：使用在转基因柑橘宿主植株中表达的BombBC来赋予对柑 橘溃疡病的抗性。将6棵健康的甜橙x枳栽培种Carizzo如下接种，将9-12英寸高的植株的顶部3英寸全部浸入包含200ppm Silwet L-77以及10⁵cfu/ml的柑橘黄单胞菌的溶液中。所有植株症状都在二周后显现，并允许其继续再发展四周。其中2棵柑橘植株是转基因BombBC的(使用实施例12的方法构建的)，而其他四棵是对照。由柑橘黄单胞菌引起的致病症状在二棵转基因BombBC植株中极大地减少了，无论是疱的数量(在BombBC植株中出现的少得多)还是疱的尺寸(在BombBC植株中疱保持微小并发育得差很多)。

这些结果确认了以下观念和将其扩展至包括宿主植物，即可以为了杀伤革兰氏阴性致病细菌或使革兰氏阴性致病细菌丧失功能而在植物中表达BombBC，这最有可能是因为由宿主植物产生的天然植物抗毒素和BombBC的表达的综合效果中和了病原体的LPS屏障。

实施例20：使用转基因稻植株表达酶活性的BombBC。表达BombBC的转基因稻植株是使用携有克隆到pIPG787中的bombBC基因的根癌土壤杆菌构建的(Hiei等.，1997)。这些植株对革兰氏阴性细菌病原体(包括稻黄单胞菌(X.oryzae)和水稻黄单胞菌菌(X.oryzicola))具有抗性。

实施例21.使用在转基因植株中表达的Bomb蛋白来延长切花保质期的 方法。Bomb蛋白，当在通常作为切花上市的转基因植株(如蔷薇、康乃馨、菊花、唐菖蒲(gladiolas)等)中产生时，延长所述转基因切花的保质期，其是通过抑制由随机细菌或软腐细菌如胡萝卜软腐欧文氏菌和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)引起的花瓶水里的细菌生长来实现的。之后将会作为切花上市的转基因植株用上述实施例所述的方法来产生。

实施例22.使用Bomb蛋白作为添加剂来延长切花和动物饲料保质期的 方法。Bomb蛋白(可以和裂解蛋白组合)，当加到通常作为切花上市的非转基因植物(如蔷薇、康乃馨、菊花、唐菖蒲(gladiolas)等)的花瓶或运输容器的水里时，通过抑制花瓶水里真菌和细菌的生长来延长所述转基因切花的寿命。典型的缩短切花保存期的微生物种类为胡萝卜软腐欧文氏菌和菊欧文氏菌。例如，将干燥的蛋白加入保持切花的水里，导致所述切花与在同样来源但不添加所述干燥蛋白的水中保持的切花相比有更长的保存期。

Bomb蛋白最有可能在转基因植株中产生。收获蛋白的粗提物，并将其使用粒状添加剂干燥或使其悬浮在合适的液体里并进行包装。在另一个实例中，当将干燥的蛋白加入动物饲料时，其会控制微生物污染，包括可能引起食物中毒的微生物。可以将Bomb蛋白的干燥或液体制品通过混合在工厂生产期间加入动物饲料或其后由动物主人加入动物饲料。无论哪种方式，结果都是饲料保质期延长和能引起食物中毒的微生物的生长几率降低。

实施例23：使用转基因植物中的Bomb蛋白控制革兰氏阴性细菌的方 法，无论该细菌是否为植物的致病剂。当将产生Bomb蛋白(可以和裂解蛋白一起生产)的转基因植物在田间环境种植时，它们不仅会通过杀死或抑制革兰氏阴性细菌的生长来显示植株对所述革兰氏阴性细菌疾病的抗性，而且它们会杀死或者抑制可能感染所述植株但是不引起植物疾病的革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌、志贺氏菌(Shigella spp.)和沙门氏菌(Salmonella spp.)的生长。这样的转基因植株可能成为食品安全项目的部分，目的是减少通过食物供应污染而传播人类疾病的可能性。在所有情况下抗性是通过所述转基因植株产生的天然防御化合物，和Bomb蛋白，连同转基因植株产生的任何裂解酶的组合作用达到的。

必须注意的是，在本说明书和附加的权利要求中使用的单数形式“一个”，“和”以及“这个/所述”包括复数的指示物，除非上下文语境清楚的另有指明。因此，例如，提到“Bomb蛋白”时包括任何一种、两种或更多种所述Bomb蛋白或者其片段，不管其来源；当提到“(一株/一棵)转基因植物”包括大量的转基因植物和其混合物，还有提到“所述方法”时包括这里描述的范本中一个或多个方法或其步骤。

除非另有界定，这里所有的技术和科学术语含义，和本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义是相同的。虽然和这里所述的类似或者等价的任何方法和材料，可以在本发明的实践或者实验中使用，但是此处也描述了实例性的方法和材料。所有这里引用的出版物作为参考整合于此，目的是为了揭露和描述引用了公开文献的本发明的具体方面。

提供这里讨论的出版物只是因为其公开于本申请的申请日之前。其不能被理解为承认由于在先发明而使本发明提前公开。

虽然结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但是应理解能够对其进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖整体上遵循本发明的原理的任何变型、应用或适应性修改，并且包括在本发明所述领域内已知或惯用的实践中产生的对本发明的背离情况，并且可能是对如本发明所附权利要求范围中和如前所述的必要技术特征产生的背离。

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序列表

<110>综合植物遗传股份有限公司(Integrated Plant Genetics，Inc.)佛罗里达大学研究基金会(UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION，INC.)

 

<120>植物中表达的噬菌体外膜破坏蛋白用于控制革兰氏阴性细菌的应用

 

<130>INTE-004/01WO

 

<150>US 60/950,749

<151>2007-07-19

 

<160>5

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>510

<212>DNA

<213>天竺葵黄单胞菌噬菌体P15

 

<400>1

atgtccgacc agaccgatac cacccagacc acgccggccg agaaggcgcc gcccaaggaa     60

atcatccgcg gtcgtatgcc gatcgcagtg gtcgccctgg cccgcttcgg cagccagtcc    120

accaccacca ccaaggccgc agcggatgcc ctgggcacca ccgtcggcaa gatcgacgac    180

atccgcaaga accgcaactt cgcctacgtc accgccgact tcaagccgac cgaagcccag    240

aaggccgacg gcatcgagtg gctgaagcgt catccggtcg gtgcggatgc cctgatcgaa    300

gagctgcaga acctgccggt cgccaccgcc gaagagtcgg ccgcattcga gcaggtccgc    360

gcatcggctc gcggccagaa cgccaagacc gccgagggtg aagtcgctca ggccggcggt    420

ggcaatcgtc gcaagaagaa ggaaaagccg gccgaagccg gtgaagtgca gaacccgccg    480

gccgccgatg gcgactcgct cctgagctaa                                     510

 

<210>2

<211>169

<212>PRT

<213>天竺葵黄单胞菌噬菌体P15

 

<400>2

 

Met Ser Asp Gln Thr Asp Thr Thr Gln Thr Thr Pro Ala Glu Lys Ala

1               5                   10                  15

Pro Pro Lys Glu Ile Ile Arg Gly Arg Met Pro Ile Ala Val Val Ala

            20                  25                  30

Leu Ala Arg Phe Gly Ser Gln Ser Thr Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ala

        35                  40                  45

Asp Ala Leu Gly Thr Thr Val Gly Lys Ile Asp Asp Ile Arg Lys Asn

    50                  55                  60

Arg Asn Phe Ala Tyr Val Thr Ala Asp Phe Lys Pro Thr Glu Ala Gln

65                  70                  75                  80

Lys Ala Asp Gly Ile Glu Trp Leu Lys Arg His Pro Val Gly Ala Asp

                85                  90                  95

Ala Leu Ile Glu Glu Leu Gln Asn Leu Pro Val Ala Thr Ala Glu Glu

            100                 105                 110

Ser Ala Ala Phe Glu Gln Val Arg Ala Ser Ala Arg Gly Gln Asn Ala

        115                 120                 125

Lys Thr Ala Glu Gly Glu Val Ala Gln Ala Gly Gly Gly Asn Arg Arg

    130                 135                 140

Lys Lys Lys Glu Lys Pro Ala Glu Ala Gly Glu Val Gln Asn Pro Pro

145                 150                 155                 160

Ala Ala Asp Gly Asp Ser Leu Leu Ser

                165

 

<210>3

<211>75

<212>DNA

<213>未知的

 

<220>

<223>P12前导序列DNA序列

 

<400>3

atgggtgtag gcacaaaagt tctggtgatc acgaccatgg caatatgcct aattagctca    60

gctgcatatg cccat                                                     75

 

<210>4

<211>25

<212>PRT

<213>未知的

 

<220>

<223>P12前导序列翻译产物

 

<400>4

 

Met Gly Val Gly Thr Lys Val Leu Val Ile Thr Thr Met Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Leu Ile Ser Ser Ala Ala Tyr Ala His

            20                  25

 

<210>5

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>BombBC和P12前导序列，翻译产物

 

<400>5

 

Met Gly Val Gly Thr Lys Val Leu Val Ile Thr Thr Met Ala Ile Cys

1               5                   10                  15

Leu Ile Ser Ser Ala Ala Tyr Ala Met Ser Asp Gln Thr Asp Thr Thr

            20                  25                  30

Gln Thr Thr Pro Ala Glu Lys Ala Pro Pro Lys Glu Ile Ile Arg Gly

        35                  40                  45

Arg Met Pro Ile Ala Val Val Ala Leu Ala Arg Phe Gly Ser Gln Ser

    50                  55                  60

Thr Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ala Asp Ala Leu Gly Thr Thr Val Gly

65                  70                  75                  80

Lys Ile Asp Asp Ile Arg Lys Asn Arg Asn Phe Ala Tyr Val Thr Ala

                85                  90                  95

Asp Phe Lys Pro Thr Glu Ala Gln Lys Ala Asp Gly Ile Glu Trp Leu

            100                 105                 110

Lys Arg His Pro Val Gly Ala Asp Ala Leu Ile Glu Glu Leu Gln Asn

        115                 120                 125

Leu Pro Val Ala Thr Ala Glu Glu Ser Ala Ala Phe Glu Gln Val Arg

    130                 135                 140

Ala Ser Ala Arg Gly Gln Asn Ala Lys Thr Ala Glu Gly Glu Val Ala

145                 150                 155                 160

Gln Ala Gly Gly Gly Asn Arg Arg Lys Lys Lys Glu Lys Pro Ala Glu

                165                 170                 175

Ala Gly Glu Val Gln Asn Pro Pro Ala Ala Asp Gly Asp Ser Leu Leu

            180                 185                 190

Ser

Claims (51)

1.一种分离的核酸序列，包含：

a.SEQ ID No.1的核酸序列及其保守取代物；

b.与SEQ ID No.1具有至少70％核酸序列同一性的核酸序列；

c.连续核酸序列，其与SEQ ID No.1的至少50个碱基对的连续核酸序列具有至少70％核酸序列同一性；

d.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.1的核酸序列杂交的核酸序列；或

e.编码SEQ ID No.2的氨基酸序列。

2.一种分离的核酸序列，其基本上由以下组成：

a.SEQ ID No.1的核酸序列及其保守取代物；

b.与SEQ ID No.1具有至少70％核酸序列同一性的核酸序列；

c.连续核酸序列，其与SEQ ID No.1的至少50个碱基对的连续核酸序列具有至少70％核酸序列同一性；

d.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.1的核酸序列杂交的核酸序列；或

e.编码SEQ ID No.2的氨基酸序列。

3.一种分离的核酸序列，其由以下组成：

a.SEQ ID No.1的核酸序列及其保守取代物；

b.与SEQ ID No.1具有至少70％核酸序列同一性的核酸序列；

c.连续核酸序列，其与SEQ ID No.1的至少50个碱基对的连续核酸序列具有至少70％核酸序列同一性；

d.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.1的核酸序列杂交的核酸序列；或

e.编码SEQ ID No.2的氨基酸序列。

4.包含权利要求1、2或3的核酸序列的核酸构建体。

5.包含权利要求1、2或3的核酸序列的载体。

6.植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其包含权利要求1、2或3的核酸序列。

7.权利要求6的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物是单子叶植物。

8.权利要求6的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物是双子叶植物。

9.权利要求6的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物选自由天竺葵、烟草、柑橘和稻组成的组。

10.一种转化植物细胞的方法，包括将权利要求1、2或3的分离的核酸序列导入植物细胞。

11.一种增强植物对病原性的或非病原性的革兰氏阴性细菌感染或侵染的抗性的方法，包括将权利要求1、2或3的核酸序列导入所述植物的基因组。

12.一种权利要求1、2或3的分离的核酸序列，其可操作的连接至包含SEQ ID No.3的核酸序列。

13.一种编码肽、多肽或蛋白质的分离的核酸序列，其包含：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

14.一种编码肽、多肽或蛋白质的分离的核酸序列，其基本上由以下组成：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

15.一种编码肽、多肽或蛋白质的分离的核酸序列，其由以下组成：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

16.一种编码肽、多肽或蛋白质的分离的核酸序列，所述肽、多肽或蛋白质具有以下特征：

a)其衍生自噬菌体；

b)其缺乏细菌分泌信号氨基酸序列；

c)其缺乏跨膜结构域；

d)当在细菌中表达时，其不导致裂解，而是导致“拟裂解”，从而使培养物的光密度在诱导后立刻增加并随后降低到约初始光密度；和

e)当在于植物抗毒素存在下生长的细菌中表达时，其导致“拟裂解”和额外的细胞死亡，从而使培养物光密度在诱导后立刻增加并随后降低到显著低于初始光密度的水平。

17.权利要求13、14、15或16的分离的核酸序列，其进一步包含SEQID No：3的核酸。

18.包含权利要求13、14、15、16或17的核酸序列的核酸构建体。

19.包含权利要求13、14、15、16或17的核酸序列的载体。

20.植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其包含权利要求13、14、15、16或17的核酸序列。

21.权利要求20的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株由于抑制或杀死了对昆虫或线虫的消化或生存重要的共生革兰氏阴性细菌而导致所述昆虫和线虫不能茁壮成长或避免以所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株为食。

22.权利要求20或21的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物是单子叶植物。

23.权利要求20或21的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物是双子叶植物。

24.权利要求20的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株，其中所述植物选自由天竺葵、烟草、柑橘和稻组成的组。

25.一种阻止、处理或降低植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株的革兰氏阴性细菌感染或侵染的方法，所述方法包括将植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株与具有以下序列的分离的肽、多肽或蛋白质接触：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

26.一种组合物，其包含具有以下序列的分离的肽、多肽或蛋白质：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

27.一种组合物，其基本上由具有以下序列的分离的肽、多肽或蛋白质组成：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

28.一种组合物，其由具有以下序列的分离的肽、多肽或蛋白质组成：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

29.一种阻止、处理或降低动物细胞、动物组织或完整动物的微生物感染的方法，所述方法包括将所述动物细胞、动物组织或完整动物与具有以下序列的分离的肽、多肽或蛋白质接触：

a.SEQ ID No.2的氨基酸序列；

b.具有SEQ ID No.2的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列；

c.在严紧杂交条件下与SEQ ID No.2的氨基酸序列杂交的氨基酸序列；或

d.与SEQ ID No.2的氨基酸序列在至少80个氨基酸上具有35％或更高的氨基酸序列相似性的氨基酸序列。

30.一种增强植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株对革兰氏阴性细菌感染或侵染的抗性的方法，包括向所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株引入表达盒，该表达盒包含可操作连接的下述元件：

a)在植物中有功能的启动子区；

b)权利要求1、2或3的核酸序列；和

c)在植物中有功能的终止子区；

其使所述表达盒能够表达；并由此获得所述植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株对革兰氏阴性细菌感染或侵染的增强抗性。

31.权利要求30的方法，其进一步包括使具有所述引入的表达盒的完整植株进行自花传粉或使具有所述引入的表达盒的完整植株与其同种的植株进行异花传粉。

32.权利要求31的方法，其进一步包括在完整植株进行自花或异花传粉前，检测通过引入表达盒获得的完整植株中表达盒的存在或对革兰氏阴性细菌感染或侵染的增强抗性。

33.权利要求31的方法，其进一步包括收获任何作为自花或异花传粉的结果产生的种子。

34.权利要求32的方法，其进一步包括使收获的种子萌发以生成幼苗，并检测萌发幼苗的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株中表达盒的存在或对革兰氏阴性细菌感染或侵染的增强抗性。

35.由权利要求30的方法获得的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株的组织培养物，其中获得的植物细胞、植物部分、植物组织或完整植株含有所述引入的表达盒。

36.根据权利要求30产生的完整植株，其中所述完整植株包含所述表达盒。

37.一种植物育种方法，包括将权利要求36的完整植株进行自交，允许从所述自交形成种子并收获所得的自交种子。

38.一种植物育种方法，包括将权利要求36的完整植株与同种的另一植株杂交，允许种子形成并收获所得的杂交种子。

39.权利要求30的方法，其中所述革兰氏阴性细菌对所述植株不是病原性的。

40.权利要求30的方法，其中权利要求1、2或3的核酸序列位于所述启动子区的下游。

41.权利要求30的方法，其中所述终止子区位于权利要求1、2或3的核酸序列的下游。

42.权利要求30的方法，其中在植物中有功能的分泌信号与权利要求1、2或3的核酸序列可操作地连接。

43.权利要求30的方法，其中在植物中有功能的内质网(ER)保留信号与权利要求1、2或3的核酸序列可操作地连接。

44.权利要求30的方法，其进一步包括向植物基因组引入第二核酸序列，该第二核酸序列编码增强所述植物对植物病原体感染或侵染的抗性的第二肽、多肽或蛋白质。

45.权利要求44的方法，其中将所述第二核酸序列包含在权利要求30的方法中使用的表达盒中。

46.权利要求44的方法，其中所述植物病原体是革兰氏阴性细菌。

47.权利要求44的方法，其中所述第二肽、多肽或蛋白质是非酶促裂解肽、酶促裂解肽或酶促肽聚糖降解肽。

48.权利要求44的方法，其中所述第二肽、多肽或蛋白质选自下组：溶菌酶、内溶素、蛋白酶、胞壁质裂解酶、具有糖基转移酶活性的酶、脂肪酶和酯酶。

49.权利要求30的方法，其中所述植物是单子叶植物。

50.权利要求30的方法，其中所述植物是双子叶植物。

51.权利要求30的方法，其中所述植物选自由天竺葵、烟草、柑橘和稻组成的组。

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