CN106460006A - 用于向种子递送核酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及种子处理和将核酸颗粒引入完整种子中的方法。具体地，所述方法为能够将裸露的DNA质粒递送至种子中的非引发种子处理方案，不使用微生物或任何额外的手段，并且无植物物种限制。

Description

用于向种子递送核酸的方法和组合物
发明背景
本发明涉及种子处理和将核酸颗粒引入完整种子中的方法。具体而言，本发明的方法为能够将核酸递送至种子中而不使用微生物或任何额外手段并且不限植物物种的非引发(non-priming)种子处理方法。本申请中引用的所有出版物通过引用结合到本文中。
携带一个或多个可表达的异源基因的植物具有多个潜在优点。携带基因表达盒的植物可携带赋予期需性状的一个或多个基因，包括例如，耐受除草剂、杀虫剂或昆虫，耐受应激，增强新鲜产品(果实、种子等)的风味和/或贮藏寿命以及合成用于被人和/或动物消耗或用作多种工业(化妆品、药物、营养保健品、食品、纸、纤维，等)中的原材料的有用的植物和外源蛋白、糖、脂肪酸或次级代谢产物的能力。
当前的转化技术提供用期需性状工程改造植物的机会，并且近年来植物转化已经发生了重大进展。最常见的技术由根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导。其它转化方法为直接DNA转移，包括微注射、电穿孔和粒子轰击，以及病毒载体(Birch R G.1997. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:297–326)。除了病毒载体之外，上述技术的应用导致外源DNA穿透进入处理的细胞/组织中，外源DNA整合到处理植物的基因组中，表达和随后选择，转基因植物再生。然而，在许多主要的作物植物中，仍存在严重的基因型限制。
一些农业上重要的作物植物(例如，甜椒)的转化依然困难并且耗时。另外，在所有前述技术中，转化均用营养组织(包括胚)进行，且转化效率差，需要选择标志，并且植物从转化细胞或组织成功再生的百分比相当低。
外源DNA整合入植物基因组中并不总是期需的，特别是当遗传修饰的(GMO)植物引起环境和政治问题时。在这些情况下，使得异源基因能够表达同时基因不并入宿主基因组中的方法是期需的。
对于该效果，已经证明植物病毒可用作基因表达和沉默载体。外源序列已经以这样的方式引入植物病毒基因组(而非植物基因组)中，使得其复制能力保持。结果，外源序列被扩增，导致外源蛋白表达或病毒诱导的内源植物基因沉默。对于病毒载体的使用，一个重要和限制的步骤为用病毒复制子感染植物。已经产生许多RNA植物病毒的全长互补DNA(cDNA)克隆，并且显示在体外用适当RNA聚合酶转录后或当作为DNA在植物特异性启动子控制下驱动体内转录直接施用时均有传染性。
使用农杆菌递送T-DNA上编码的基于DNA和RNA病毒的载体二者拷贝(“农杆菌递送(agrodelivery)”)均提供出色的解决方案，因为农杆菌是极其有效的载体。已经显示在植物中发生“农杆菌递送的”T-DNA转化为功能DNA或RNA复制子所需的所有步骤。“农杆菌感染”已经使用许多年。其也常常比使用病毒颗粒机械接种有效得多，并且比使用DNA或RNA作为感染分子的确更有效(Lomonossoff和Montague, 2008; Gleba, 2008)。然而，病毒载体递送，不管是机械、生物射弹或通过农杆菌，均不能以非常大的规模应用。
因此，开发新的、快速和简单的用于递送DNA至商品种子作物的方法是高度期需的。
发明概述
本发明提供经由简单和有效的非引发种子处理方法引入核酸颗粒，例如dsDNA或ssDNA，特别地异源DNA，其使用特别改良的商业非引发种子处理方案而不使用微生物或任何额外手段，并且不限植物物种。出人意料地，本发明的非引发种子处理方法导致发芽植物中摄入异源DNA。
在一个方面，本发明提供用于使用非引发种子处理将核酸引入植物中的手段和方法。具体地，本发明组合了改良的商业种子处理(例如包衣、薄膜包衣、拌种和丸化)和向植物种子中加载异源DNA。引入的异源DNA预料不到地能够在发芽期间进入和并入种子胚细胞中。特别地，本发明的一个方面提供加载基于病毒的DNA质粒的手段和方法，所述质粒可在发芽植物中系统性复制和传播而不整合到植物基因组。在另一个方面，尽管携带病毒元件，但通过基于病毒的DNA质粒，没有病毒颗粒释放到植物组织中。
在另一个方面，本发明提供不限植物物种的使用非引发种子处理而不使用微生物或任何额外手段向种子中加载裸露DNA质粒的手段和方法。具体地，本发明组合了改良的商业种子处理(例如包衣、薄膜包衣、拌种和丸化)和向植物种子中加载异源DNA。用于种子的包衣可包含任何商业粘合剂和裸露DNA，商业粘合剂可包含选自聚醋酸乙烯酯、甲基纤维素、聚乙烯醇、偏二氯乙烯、丙烯酸、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和多糖的聚合物和共聚物的一种或多种粘合剂，其中粘合剂形成异源DNA的基质。施用的异源DNA预料不到地能够在发芽期间到达种子胚细胞。
在另一个方面，本发明与先前已知的用于植物细胞转化或向植物中引入外源DNA的方法相比，优势在于将核酸颗粒引入天然地能够发育成完整植物的完整作物种子中，而不需再生培养。出人意料地，该过程因此不包括使用微生物，也无病毒颗粒或任何其它生物材料的添加。
在另一个方面，用于DNA引入的本发明不涉及对细胞或整个种子的损伤。另外，本发明的种子处理方法简单有效，不影响种子发芽。所述方法可大规模化以达到商品的商业应用。
在进一步的方面，本发明的非引发种子处理非常迅速且时间短(无论何处约1秒-约60分钟，包括其中的任何整数或分数)，并且包衣/拌种/丸化在种子外部，不触发生理变化。DNA的加载在种皮表面上。相反，引发种子处理为长得多的过程(约12小时-72小时或更长)并且引发期间种子内开始生理过程，例如酶活性。在本发明的非引发处理中，预期核酸仅在将种子播种在田间并灌溉后进入胚细胞，而在引发处理中，核酸将会在引发过程本身期间进入胚细胞。
在本发明进一步的方面，引入的异源DNA可为非整合功能模式，例如在使用植物病毒载体的情况下，该载体不并入植物基因组中，但对于其整个寿命，仍能够在发芽的种子-处理的植物中复制和传播。外源基因可引入病毒载体中，允许其瞬时表达。
在本发明进一步的方面，引入的异源DNA可为基于双生病毒的表达构建体，异源DNA不并入植物基因组中，但对于其整个寿命，仍能够在发芽的种子-处理的植物中复制和传播，不传递给下一代。异源DNA可作为裸露的DNA在合适的表达载体例如质粒中，或在基于病毒载体的DNA构建体中存在，根据本发明优选在基于病毒载体的DNA构建体中存在。
根据某些方面，基于病毒的DNA构建体包含病毒基因或其部分，使得构建体能够复制和无症状传播至相邻植物细胞中。
在本发明进一步的方面，DNA构建体为基于双生病毒的构建体。根据这些实施方案，构建体包含两侧为编码双生病毒复制酶或复制酶相关蛋白的非连续核酸序列的异源DNA。
根据本发明的其它方面，构建体进一步包含编码修饰的双生病毒外壳蛋白(CP)的多核苷酸序列。根据典型的实施方案，编码修饰的双生病毒外壳蛋白的多核苷酸在编码N端100个氨基酸的核苷酸中包含突变或缺失。
根据本发明进一步的典型方面，表达构建体进一步包含编码修饰的双生病毒V2蛋白的多核苷酸序列。
根据本发明额外的典型方面，表达构建体进一步包含编码修饰的双生病毒C4蛋白的多核苷酸序列。根据这些实施方案，修饰的双生病毒C4蛋白包含突变或缺失。根据某些实施方案，表达构建体进一步包含细菌多核苷酸序列。
根据本发明额外的典型方面，表达构建体缺乏编码双生病毒C2和/C3编码序列的多核苷酸序列。
根据本发明某些当前优选的方面，双生病毒为番茄黄曲叶病毒(TYLCV)。根据这些实施方案，基于双生病毒的构建体选自命名为TraitUP的群组，包括IL-60、p1470和其衍生物，包括其可反式激活的和可诱导的pIR卫星样构建体。
根据本发明的某些方面，DNA构建体设计为表达构建体，以致异源DNA在植物细胞中表达。根据这些实施方案，DNA构建体进一步包含选自增强子、启动子和转录终止序列的至少一个调控元件。
根据本发明的额外方面，DNA构建体进一步包含用于鉴定包含异源DNA的种子和/或植物的标志。
在本发明的一个方面，异源DNA可编码任何期需产物，包括肽、多肽、蛋白质和RNA。蛋白质或RNA可为植物源或其它源，包括细菌和哺乳动物源。根据某些实施方案，所述DNA编码选自反义mRNA、dsRNA、siRNA等的抑制RNA，以致沉默靶基因的表达。根据其它实施方案，异源DNA编码其表达赋予期需农艺学性状的产物，所述性状包括，但不限于，对生物或非生物应激的抗性、增加的产量、增加的产量品质、优选的生长模式等。根据额外的实施方案，编码的蛋白产物可用于化妆品或制药工业。根据又进一步的实施方案，编码的蛋白质增强植物细胞中期需代谢产物的产生。
根据本发明又其它的方面，异源DNA不编码期需产物，而是仅作为种子源或从所述种子生长的植物的标记存在，例如以防止专利种子、植物和组织非法散布。
在本发明的另一个方面，异源DNA可在细胞或从其衍生的细胞中瞬时表达，或其可并入细胞基因组中。异源DNA可作为整合或非整合的DNA序列存在于植物细胞的细胞质中，其细胞器中或细胞核中。
根据本发明某些当前优选的方面，DNA构建体为基于双生病毒的构建体，其设计为使得异源DNA不并入细胞基因组但构建体能够在从包含所述异源DNA的种子生长的植物的细胞中复制和传播。
在另一个方面，本发明的方法可用于任何目的植物的种子，包括双生病毒宿主和非宿主植物，并且其为迅速和有效的方法，可特别地应用于商品种子。
根据又额外的方面，本发明提供通过本发明方法产生的种子，以及从所述种子产生的植物或其部分，所述种子包含异源DNA(裸露的，或在合适的构建体中并且优选在基于病毒的构建体中)。
根据某些方面，植物种子为单子叶植物源。根据其它实施方案，植物种子为双子叶植物源。
本发明的其它目标、特征和优点从下列说明书和附图将会变得清楚。
附图简述
图1A-B. (A)显示通过本发明方法种子处理之前和之后的大豆种子。左侧显示处理之前的大豆种子，右侧显示添加1.5%聚乙二醇(PEG)处理之后的大豆种子。(B) 显示发芽过程期间用本发明方法处理过的大豆种子。子叶仍部分被红色种皮覆盖。
图2. 显示TraitUP质粒号p1470的示意结构。该质粒为包含含有若干TYLCV基因(或部分)的基于病毒的片段的pDrive细菌载体，所述基因理论上如下表述：编码病毒外壳蛋白的基因CP (CP=外壳蛋白= V1)；在其N端具有20个氨基酸缺失；基因V2 (编码所谓的前外壳(pre-coat))，也具有20个氨基酸缺失；和截短的基因C1/C4，编码C1-复制起始蛋白的N端(284 bp/1071 bp)和基因C4的N端(133 bp/291 bp)。另外，该质粒载体包含IR区域：IR，代表TYLCV的中间区域，大小约313个核苷酸。该片段序列包含用于转录病毒-有义ORF (V2和V1)和互补的有义部分ORF C1和C4的启动子序列，其对于病毒DNA复制是关键性的。
图3. 显示PCR分析以验证p1470在用本发明方法处理的大豆种子的幼苗中p1470的存在情况。PCR分析在14日龄的如实施例2中所述种子-处理的大豆幼苗上进行。从真叶提取DNA并用p1470质粒元件的引物进行PCR扩增(PCRI用外壳蛋白基因上的引物A和B，接着PCRII使用外壳蛋白基因上的引物C和D，预期片段大小543 bp)。泳道1显示无DNA的PCRI的PCR混合物，泳道2显示无DNA的PCRII的PCR混合物，泳道3-4显示对照未处理植物，泳道5显示1Kb DNA梯RTU (即用型) (Genedirex)，泳道6-19显示处理的植物，泳道20显示p1470质粒。
图4. 显示表格，概述了在通过本发明方法处理的大豆种子上使用不同包衣介质成功递送dsDNA质粒。
图5. 显示PCR分析以验证通过本发明方法处理的玉米种子的幼苗中p1470的存在情况。PCR分析在12日龄的如实施例4中所述种子处理的玉米幼苗上进行。从真叶提取DNA并用p1470质粒元件的引物进行PCR扩增(E-F，在外壳蛋白基因上，预期片段大小420 bp)。泳道1显示无DNA的PCR混合物，泳道2显示1Kb DNA梯RTU (即用型) (Genedirex)，泳道3-5显示对照未处理植物，泳道6-11显示处理的植物，泳道12显示p1470质粒。
图6 显示PCR分析以验证通过本发明方法处理的油菜(canola)种子的幼苗中p1470的存在情况。PCR分析在5周龄的如实施例5中所述种子处理和在包衣6个月后播种的油菜幼苗上进行。从真叶提取DNA并用p1470质粒元件的引物进行PCR扩增(C-D，在外壳蛋白基因上，预期片段大小543 bp)。泳道1显示无DNA的PCR混合物，泳道2显示1Kb DNA梯RTU(即用型) (Genedirex)，泳道3-5显示对照未处理植物，泳道6-12显示处理的植物，泳道13显示p1470质粒。
图7显示PCR分析以验证通过本发明方法处理的水稻种子的幼苗中p1470的存在情况。PCR分析在1月龄的如实施例6中所述种子处理的水稻幼苗上进行。从根提取DNA并用p1470质粒元件的引物进行PCR扩增(C-D，在外壳蛋白基因上，预期片段大小543 bp)。泳道1显示无DNA的PCR混合物，泳道2显示1Kb DNA梯RTU (即用型) (Genedirex)，泳道3-6显示对照未处理植物，泳道7为空白，泳道8-17显示处理的植物，泳道18显示p1470质粒。
图8显示巢氏PCR分析以验证通过本发明方法处理的甜瓜(melon)种子的幼苗中p1470的存在情况。PCR分析在19日龄的如实施例8中所述种子处理的甜瓜幼苗上进行。从真叶提取DNA并用p1470质粒元件的引物进行PCR扩增(A-B，在外壳蛋白基因上)。泳道1显示无DNA的PCRI的PCR混合物，泳道2显示无DNA的PCRII的PCR混合物，泳道3-4显示对照未处理植物，泳道5显示1Kb DNA梯RTU (即用型) (Genedirex)，泳道6-21显示处理的植物，泳道22显示p1470质粒。
发明详述
在以下说明和表中使用许多术语。为了提供说明书和权利要求的清楚和一致的理解，包括给予这些术语的范围，提供下列定义：
3’非编码序列 “3’非编码序列”指位于编码序列下游的DNA序列，包括多聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多聚腺苷酸化信号常常以影响向mRNA前体的3’末端添加多聚腺苷酸束为特征。Ingelbrecht I L.等人(1989.Plant Cell 1:671680)例示了不同3’非编码序列的使用。
等位基因 等位基因为基因的一个或多个备选形式的任一个，其所有均与一种性状或特征有关。在二倍体细胞或生物中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。
细胞 如本文所使用的细胞包括植物细胞，无论分离的、组织培养中的或并入植物或植物部分中。
包衣颜料(Coating color) 如本文所使用的，指添加至非引发种子处理介质中的用于目测验证种子上种子处理的均匀覆盖的着色。也称为“生物颜料(bio color)”。
商业种子处理 包括但不限于种子处理例如包衣、薄膜包衣、拌种和丸化。
商品种子/商品作物 商品种子或作物为商业上交易和使用的任何种子或作物。一般而言，其相对不易坏、可储存、可运输和无差别。商品作物为通常以大体积和以高密集度生长的作物，特别地用于销售至商品市场目的，与直接消耗或加工相反。一些实例包括，但不限于，玉米、大豆、小麦、棉花、水稻等。
包含异源DNA 当参考植物或种子使用时，术语“包含异源DNA”指在其一个或多个细胞中包含至少一种异源DNA的植物或种子。如本文所使用的，该术语指在其至少一个细胞中包含至少一种异源DNA的植物、植物结构、植物组织、植物种子或植物细胞。该术语包括引入DNA的原代细胞和从该细胞衍生的培养物和植物，不考虑转移数目。所有子代在DNA含量上可能不严格相同，因为有意或无意的突变。具有与引入DNA的原始细胞中所筛选的相同功能性的突变体子代包含在该术语中。
构建体 如本文所使用的术语“构建体”指人工装配或分离的包含目的异源DNA的核酸分子。一般而言，构建体可包含异源DNA，通常为目的基因、标志基因和适当的调控序列，在一些情况下标志基因也可为目的基因。应理解构建体中包含调控序列是任选的，例如，在使用宿主细胞的调控序列的情况下可能不需要这样的序列。术语构建体包括载体，但不应视为限于载体。
子叶 子叶是一种类型的种子叶。子叶包含种子的食物贮藏组织。
二倍体 具有两组染色体的细胞或生物。
胚 胚为成熟种子中包含的小植物。
增强子 如本文所使用的，术语“增强子”指可刺激启动子活性的DNA序列，其可为启动子的固有元件或插入以提高启动子的水平或组织特异性的异源元件。
表达 如本文所使用的，指功能终产物例如，mRNA或蛋白质的产生。
基因 术语“基因”指包含产生RNA或多肽所需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。该术语包括天然的以及人定制的(合成的)基因。多肽可由全长编码序列或由其任何部分编码。当参考基因使用时，术语“其部分”指该基因的大小从几个核苷酸到完整基因序列减一个核苷酸的片段。因此，“包含至少基因的一部分的核酸序列”可包括基因的片段或完整基因。
术语“基因”还包括结构基因的编码区，并且包括位于编码区5’和3’两个末端附近距任一末端约1 kb距离的序列。位于编码区的5’并且在mRNA上存在的序列称为5’非翻译(或不翻译)序列(5’ UTR)。位于编码区的3’或下游并且在mRNA上存在的序列称为3’非翻译(或不翻译)序列(3’ UTR)。
基因沉默 在转录或翻译水平的基因表达中断或抑制。
基因型 指细胞或生物的基因组成。
单倍体 具有二倍体中两组染色体的一组的细胞或生物。
异源DNA 术语“异源DNA”或“外源DNA”指在其天然环境中不存在的多核苷酸(即，已经被人为改变)。例如，异源DNA包括从一个物种引入另一个物种的多核苷酸。如本文所使用的，异源DNA也包括对于生物天然的多核苷酸，其可能以一些方式改变或可能未以一些方式改变(例如，突变、以多拷贝添加、连接至非天然启动子或增强子序列，等)。异源DNA可包含植物、细菌和哺乳动物源的基因序列。所述基因序列可包括cDNA形式的基因；cDNA序列可以以有义(以产生mRNA)或反义取向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)表达。异源植物基因与内源植物基因不同之处在于异源基因序列通常连接到包含调控元件例如启动子的核苷酸序列，所述调控元件发现天然与异源基因所编码蛋白的基因或与染色体中的植物基因序列不相关，或与天然不存在的染色体部分(例如，在正常不表达该基因的基因座表达的基因)相关。
基因座 DNA的限定区段。
裸露DNA 指缺乏蛋白质外壳或包含在微生物中的DNA。对于基因转移，裸露DNA通常由含有或不含植物病毒元件并且包含待转移的序列或基因的细菌质粒组成。如本文所使用的，“裸露DNA”可为合成的或从微生物纯化，并且还可与一些化学品相关联以帮助其穿透到发芽的胚中。
非引发介质 指本发明的非引发种子包衣、薄膜包衣、拌种和种子丸化种子处理中使用的介质。
非引发种子处理 非引发种子处理包括但不限于，拌种、种子包衣和薄膜包衣，和种子丸化。除了异源DNA外，这些处理中还可添加农业中使用的化学剂，例如除草剂、杀虫剂、生长激素等，其被从种子形成的植物摄取，增加保护或生长势。本发明的非引发种子处理向种子添加大约0.5% - 5% w/w的水化；然而，如本文所使用的，非引发种子处理也包括最高20% w/w的水化。例如，本发明的非引发处理方法期间，可向种子添加0.5%、1%、1.5%、2.3%、3.7%、4.5%、6.7%、9.5%、11.4%、13.6%、15.9%、17.2%、18.8%、19.4%或20% w/w，包括其间的任何整数或分数，包括0.5%-20% w/w之间添加的任何水化。相反，引发种子处理使种子含水量增加大约25%-45% w/w。非引发种子处理非常迅速且时间短(大约1秒-大约60分钟，例如，1.0秒、2.3秒、3.1秒、6.2秒、11.7秒、59.0秒、84.5秒、118.3秒、169.4秒、214.1秒、240.0秒、5分钟、12分钟、28分钟、46分钟或60分钟，包括其间的任何整数或分数)，并且包衣/拌种/丸化在种子外部，不触发生理变化。相反，引发种子处理为长得多的过程(约12小时-72小时或更长)并且引发期间种子内开始生理过程，例如酶活性。在本发明的非引发处理中，质粒将会仅在将种子播种在田间并灌溉后进入胚细胞，而在引发处理中，质粒将会在引发过程本身期间进入胚细胞。
核酸 如本文所使用的术语“核酸”指线性或分枝或环形的、单链或双链的DNA，或其杂交体。
操作性连接 术语“操作性连接”指核酸序列结合到单一核酸片段上以致一个的功能受另一个调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与该编码序列操作性连接。编码序列可与调控序列以有义或反义取向操作性连接。
病原体 可赋予植物或种子疾病的许多微生物，例如细菌、真菌和病毒中的任一种。
植物 如本文所使用的，术语“植物”包括对未成熟或成熟完整植物的提及，包括已去除种子、谷粒或花药的植物。将产生植物的种子或胚也认为是植物。
植物部分 如本文所使用的，术语“植物部分”(或植物器官，或其部分)包括但不限于原生质体、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊、种子、谷粒、胚、花粉、胚珠、子叶、下胚轴、荚、花、枝、组织、叶柄、细胞、分生细胞等。
植物组织 术语“植物组织”包括分化的和未分化的植物组织，包括根、枝、叶、花粉、种子和瘤中存在的那些，以及培养中的细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)。植物组织可在植物内、在器官培养、组织培养或细胞培养中。
子代 如本文所使用的，包括两株植物杂交产生的F1植物，其中至少一株植物包括，但不限于，后续F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9和F10代与轮回亲本系的杂交。
启动子 如本文所使用的术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”，指位于DNA聚合物编码区5’末端(即在其之前)的DNA序列。大多数天然已知的启动子的位置在转录区域之前。启动子充当开关，激活基因表达。如果基因被激活，其称为被转录，或参与转录。转录涉及从基因合成mRNA。因此，启动子用作转录调控元件，并且还提供基因向mRNA转录的起始位点。启动子可全部从天然基因衍生，或由从天然存在的不同启动子衍生的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员理解，不同的启动子可在不同组织或细胞类型中，或不同发育阶段，或响应不同环境条件，指导基因表达。进一步认识到的是，由于多数情况下未完全确定调控序列的精确边界，具有一些变异的DNA片段可具有同一的启动子活性。导致基因在多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常称为“组成型启动子”。植物细胞中可用的不同类型的新启动子不断被发现；许多实例可在Okamuro J K和Goldberg R B (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82中找到。
种子包衣 如本文所使用的，指用包含用少量水稀释的粘合剂和，在本发明中，裸露或基于病毒的DNA质粒形式的异源DNA的介质外部覆盖种子。种子包衣中可加入农业中使用的化学剂，例如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、生长激素等，其被从种子形成的植物摄取，增加保护或生长势。包衣介质可由在水中稀释的粘合剂(粘合剂可为介质的30 - 100%)、引入的质粒(一种或多种) (以0.1 - 10 µg DNA/种子的一定剂量)、包衣颜料或生物颜料(0-30%)构成，加入或不加添加剂，例如，但不限于，多糖(例如，PEG)、研磨材料(例如，金刚砂粉末)、促凝剂材料(例如，氯化铁、氢氧化钠、壳聚糖)和/或其它化学剂。本发明的种子包衣使种子鲜重增加大约0.5%-5% w/w，但范围可高达20% w/w。例如，在本发明的种子包衣处理方法期间，可向种子添加0.5%、1%、1.5%、2.3%、3.7%、4.5%、6.7%、9.5%、11.4%、13.6%、15.9%、17.2%、18.8%、19.4%或20% w/w，包括其间的任何整数或分数，包括0.5%-20% w/w之间添加的任何水化。本发明的种子包衣非引发处理非常迅速且时间短(大约1秒-大约60分钟，例如，1.0秒、2.3秒、3.1秒、6.2秒、11.7秒、59.0秒、84.5秒、118.3秒、169.4秒、214.1秒、240.0秒、5分钟、12分钟、28分钟、46分钟或60分钟，包括其间的任何整数或分数)，并且包衣在种子外部，不触发生理变化。种子薄膜包衣通常包含比种子包衣更少稀释的结合剂介质。
拌种 拌种是最常见的种子处理方法。在拌种中，用包含少量粘合剂(通常浆体组合物的10%或更少)连同，在本发明中，裸露或基于病毒的DNA质粒形式的异源DNA的浆体或液体介质外部覆盖种子。拌种中可加入农业中使用的化学剂，例如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、生长激素等，其被从种子形成的植物摄取，增加保护或生长势。拌种介质可由在水中稀释的粘合剂(粘合剂小于介质的10%)、引入的质粒(一种或多种) (以0.1 - 10 µg DNA/种子的一定剂量)、颜料或生物颜料(0-30%)组成，加入或不加添加剂，例如，但不限于，多糖(例如，PEG)、研磨材料(例如，金刚砂粉末)、促凝剂材料(例如，氯化铁、氢氧化钠、壳聚糖)和/或其它化学剂。本发明的拌种使种子鲜重增加大约0.5%-5% w/w，但范围可高达20% w/w。例如，在本发明的拌种处理方法期间，可向种子添加0.5%、1%、1.5%、2.3%、3.7%、4.5%、6.7%、9.5%、11.4%、13.6%、15.9%、17.2%、18.8%、19.4%或20% w/w，包括其间的任何整数或分数，包括0.5%-20% w/w之间添加的任何水化。本发明的拌种非引发处理非常迅速且时间短(大约1秒-大约60分钟，例如，1.0秒、2.3秒、3.1秒、6.2秒、11.7秒、59.0秒、84.5秒、118.3秒、169.4秒、214.1秒、240.0秒、5分钟、12分钟、28分钟、46分钟或60分钟，包括其间的任何整数或分数)，并且包衣在种子外部，不触发生理变化。
种子丸化 指向种子添加惰性材料以改变其尺寸和形状用于改善适种性的过程。除了添加核酸外，种子丸化组合物中可加入农业中使用的化学剂，例如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、生长激素等，其被从种子形成的植物摄取，增加保护或生长势。种子丸化介质可包含裸露或基于病毒的DNA质粒形式的异源DNA。本发明的种子丸化使种子含湿量增加大约0.5%-5% w/w，但范围可高达20% w/w。例如，在本发明的种子丸化处理方法期间，可向种子添加0.5%、1%、1.5%、2.3%、3.7%、4.5%、6.7%、9.5%、11.4%、13.6%、15.9%、17.2%、18.8%、19.4%或20% w/w，包括其间的任何整数或分数，包括0.5%-20% w/w之间添加的任何水化。本发明的种子丸化非引发处理非常迅速且时间短(大约1秒-大约60分钟，例如，1.0秒、2.3秒、3.1秒、6.2秒、11.7秒、59.0秒、84.5秒、118.3秒、169.4秒、214.1秒、240.0秒、5分钟、12分钟、28分钟、46分钟或60分钟，包括其间的任何整数或分数)，并且丸化在种子外部，不触发生理变化。
种子生活力 指种子样品的百分比发芽潜能。
稳定转化 稳定的DNA引入称为“稳定转化”，导致“稳定转化的”细胞或组织，并且指一种或多种外源多核苷酸引入或整合到细胞的基因组中。术语“稳定转化体”指已经稳定整合一种或多种外源多核苷酸到基因组或细胞器DNA (叶绿体和/或线粒体)中的细胞。包含稳定转化外源DNA的细胞的植物或其部分通常称为“转基因植物”、“转基因植物细胞”或在本发明的情况下为“转基因种子”。
系统性无症状传播 本发明优选实施方案的基于病毒的DNA构建体能够在引入其的植物中系统性无症状传播。如本文所使用的，术语“系统性无症状传播”指植物质粒载体，例如，从胚细胞向发育中的叶细胞传播而不诱导病毒的特征性致病症状的能力。
瞬时转化 异源DNA引入到细胞中可为稳定或瞬时的。术语“瞬时”指一种或多种外源多核苷酸在外源多核苷酸不整合到宿主细胞基因组时引入到细胞中。该DNA引入类型也可称为“瞬时转化”。术语“瞬时转化体”因此指已经瞬时并入一种或多种外源多核苷酸的细胞。瞬时转化的细胞一般称为“非转基因”或“非遗传修饰(非-GMO)”。
处理植物 指已经向其中引入异源DNA的植物，不管其是否整合入植物基因组中、其细胞器中，或保持游离在细胞质中，或作为附加体存在于核中而不整合。
真叶 除子叶之外的任何植物叶。
基于病毒的载体 携带源自植物病毒的任何野生型或突变元件或其部分，例如启动子、编码序列或非编码序列如外壳蛋白(CP)或基因间隔区(IR)的任何质粒载体。基于病毒的载体包括具有允许一些水平的复制和/或传播的元件的载体。
在描述本发明的语境中(特别是在所附权利要求书的语境中)，术语“一个”和“一种”和“所述”以及相似指示物的使用应解释为涵盖单数和复数二者，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)，除非另外指出。本文数值范围的叙述仅意在用作逐一提及落入范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另有说明，并且每个单独值如同其在本文中逐一叙述结合到本说明书中。例如，如果公开范围10-15，那么也公开了11、12、13和14。本文所描述的所有方法可以以任何合适的次序进行，除非本文另有说明或上下文另有明显矛盾。本文所提供的任何和所有实例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用，仅意在为了更好地阐明本发明，不应构成对本发明范围的限制，除非另有要求。说明书中的语言不应解释为指示任何非要求保护的要素对实践本发明必不可少。
遗传修饰植物的农业应用是一个公开争论的问题，并且在许多国家不被法律或法规接受。表示反对使用转基因植物的主要考虑为担忧转基因谱系的不适当选择(由于掩蔽的有害位置效应)、可能与杂草和其它作物异体受精、重组引起的进一步的基因组变更(特别是当加入内源基因拷贝时)和可能的外源序列转导至植物和土壤微生物。抗生素抗性基因向食品和环境的引入也是一个主要的担心。
生物安全和环境方面仅可在实际的、小心控制的经一段时间的田间试验之后得出结论。许可进行这种实验取决于基于强有力的实验室数据的评估。本发明方法的一个优点源自这一发现：基于TYLCV的构建体显示出对环境友好并且可方便用于生物安全-评估田间试验。双生病毒不可由种子传播(Kashina等人 2003. Phytoparasitica 31:188-199)。载体形式IL-60、p1470和pIR不可由昆虫传播，即使当大量昆虫媒介定居植物时。因此，基于TYLCV的构建体高度适合于植物转化。
在本发明的方法中，无论瞬时表达或稳定整合，处理种子的细胞中异源DNA的存在情况可通过使用如本领域技术人员所已知的任何适当方法验证。细胞的稳定转化可通过如下检测：分离基因组DNA和用与能够结合一种或多种外源多核苷酸的核酸序列进行Southern blot杂交或用适当引物进行聚合酶链反应以扩增外源多核苷酸序列。转化DNA的表达可通过例如，酶联免疫吸附测定(ELISA) (其检测一种或多种外源多核苷酸编码的多肽的存在情况)或通过检测外源多核苷酸编码的蛋白的活性而检测。
或者，在本发明的另一个实施方案中，外源DNA可包含标志。标志提供表达该标志的细胞、植物和/或种子的鉴定和/或选择。标志可编码当以足够水平表达时赋予对选择剂的抗性的产物。这样的标志和其相应的选择剂包括，但不限于，除草剂抗性基因和除草剂、抗生素抗性基因和抗生素，以及其它化学品抗性基因与其相应的化学剂。细菌药物抗性基因包括，但不限于，赋予卡那霉素、巴龙霉素、新霉素和G418抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptll)，和赋予潮霉素B抗性的潮霉素磷酸转移酶(hph)。也可从几个组赋予除草剂抗性，包括氨基酸合成抑制剂、光合作用抑制剂、脂质抑制剂、生长调节剂、细胞膜破坏剂、色素抑制剂、幼苗生长抑制剂，包括但不限于咪唑啉酮、磺酰脲类、三唑并嘧啶类、草甘膦、烯禾啶(sethoxydim)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、草铵膦(glufosinate)、草丁膦(phosphinothricin)、三嗪类、溴苯腈(bromoxynil)等。
一个额外类型的标志为其表达可通过在提供适当底物时在生化反应，优选产生颜色之后检测的标志。实例为GUS (β-葡萄糖苷酸酶)报告系统、荧光素(luciderin)-萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)系统等。
根据某些实施方案，DNA构建体进一步包含调控元件，包括，但不限于，启动子、增强子和终止信号。
最常使用的启动子为胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人, 1987 Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 84:5745-5749)、章鱼碱(octapine)合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒组启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV) 19S启动子(Lawton等人, 1987 Plant MoI Biol.9:315-324)、CaMV 35S启动子(Odell等人, 1985 Nature 313:810-812)和玄参花叶病毒35S启动子、来自核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基的光诱导启动子、Adh启动子(Walker等人, 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6624-66280)、蔗糖合酶启动子(Yang等人, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:41444148)、R基因复合体启动子(Chandler等人, 1989 Plant Cell 1:1175-1183)、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。其它常用的启动子为，洋芋ADPGPP基因的启动子、蔗糖合酶启动子、颗粒结合型淀粉合酶启动子、谷蛋白基因启动子、玉米蜡质启动子、Brittle基因启动子，和Shrunken 2启动子、酸几丁质酶基因启动子和玉米醇溶蛋白基因启动子(15 kD、16 kD、19 kD、22 kD和27 kD;Perdersen等人 1982 Cell 29:1015-1026)。国际专利申请出版号WO 00/18963中描述了许多启动子。
本发明的方法出乎意料地可用于引入其存在和/或表达为有利的任何多核苷酸，包括给予植物期需性质例如(a) 对生物和非生物应激条件，例如对昆虫、线虫、由病毒、细菌、真菌和其它致病害虫引起的疾病的抗性，对特定除草剂的抗性；(b) 对恶劣条件的适应例如盐耐受、干旱耐受、冷和热耐受；(c) 改善的产量品质性状，包括但不限于色素沉着、硬度、成分包括糖、挥发物、油、脂肪酸和/或酸的类型和含量、尺寸、生长速率、矮化生长习性、发芽期(emergence time)、果实出现和成熟时间、营养或商业价值；(d) 改善的用于生物药剂学和化妆品工业的蛋白质、次级代谢产物形式的食品产量或次级代谢产物产生，和(e)获得期需生长习性，包括定型，半定型和不定型(例如对于番茄)、矮化和正常(例如对于玉米)和植物活力。引入的DNA也可赋予基因沉默以致异源DNA编码反义RNA、siRNA、dsRNA；或额外地，所述方法可用于产生用于工业的原材料，包括但不限于纤维、木材、油、树脂等，以及受遗传因素和/或基因与环境相互作用支配的其它植物性状。
在本发明的一个实施方案中，表达的多核苷酸序列可编码会保护植物免受非生物应激因素例如干旱、热或寒冷的分子。实例包括来自短角床杜父鱼(Myoxocephalus Scorpius) (WO 00/00512)或多刺床杜父鱼(M. octodecemspinosus)的抗冻多肽、拟南芥(Arabidopsis thaliana)转录激活因子CBFl、谷氨酸脱氢酶(WO 97/12983, WO 98/11240)、钙依赖性蛋白激酶基因(WO 98/26045)、钙依赖磷酸酶(WO 99/05902)、来自酵母的酪蛋白激酶(WO 02/052012)、法尼基转移酶(WO 99/06580)、铁蛋白(Deak M.等人 1999.Nature Biotechnology 17:192-196)、草酸氧化酶(WO 99/04013)、DREBlA因子(Kasuga M.等人 1999. Nature Biotech 17:276-286)、甘露醇或海藻糖合成基因例如海藻糖-磷酸合酶或海藻糖-磷酸磷酸酶(WO 97/42326)或通过抑制基因例如海藻糖酶(WO 97/50561)。
表达的多核苷酸序列可为食品和饲料部门使用的代谢酶。实例包括植酸酶(GenBank登录号：A 19451)和纤维素酶。
在本发明的另一个实施方案中，通过直接攻击病原体、开启宿主防御或通过引起某些代谢产物或蛋白质累积，表达的多核苷酸序列可赋予对病毒、真菌、昆虫、线虫和其它病原体和疾病的抗性。实例包括硫代葡萄糖酸盐(抵御食草动物)、几丁质酶或葡聚糖酶和破坏寄生虫细胞壁的其它酶，核糖体失活蛋白(RIPS)和植物创伤或受微生物攻击或受例如，水杨酸、茉莉酸或乙烯化学攻击时诱导的植物抗性和应激反应的其它蛋白，或来自非植物源的溶菌酶例如T4-溶菌酶或来自各种哺乳动物的溶菌酶、杀虫蛋白例如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、α-淀粉酶抑制剂或蛋白酶抑制剂(豇豆胰蛋白酶抑制剂)、凝集素例如麦胚凝集素、siRNA、反义RNA、RNA酶或核酶。进一步的实例为编码哈茨木霉(Trichoderma harzianum) chit42 内切几丁质酶(GenBank登录号：S78423)或来自高粱(Sorghum bicolor)的N-羟基化多功能细胞色素P-450 (CYP79)蛋白(GenBank登录号：U32624)或其功能等同物的核酸。
对害虫例如，水稻植物中的水稻害虫稻褐飞虱(Nilaparvata lugens)的抗性可通过表达雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素取得(Rao等人 1998. Plant J 15(4):469-77)。
合成的cry/A(b)和cry/A(c)基因(编码鳞翅目特异性的苏云金杆菌δ-内毒素)的表达可在多种植物中产生对害虫的抗性(Goyal R K.等人 2000. Crop Protection 19(5):307312)。
在本发明的另一个实施方案中，适合病原体防御的额外的基因包括“多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白”(PGIP)、奇异果甜蛋白、转化酶和抗微生物肽例如乳铁蛋白(Lee T J.等人 2002. J Amer Soc Horticult Sci 127(2):158-164)。表达的多核苷酸序列可产生化学品例如生育酚类、生育三烯酚类或类胡萝卜素的累积。这样的多核苷酸的一个实例为八氢番茄红素去饱和酶。优选编码黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号：X78815)或其功能等同物的核酸。表达的多核苷酸序列可用于通过脂肪酸延伸酶和/或去饱和酶产生营养制品(nutraceuticals)例如，多不饱和脂肪酸(花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸)，或用于产生具有提高的营养价值的蛋白，例如，具有高必需氨基酸含量(例如巴西坚果的高甲硫氨酸2S白蛋白基因)。优选编码巴西果(Bertholletia excelsa)高甲硫氨酸2S白蛋白(GenBank登录号：AB044391)、小立碗藓(Physcomitrella patens) δ-6酰基脂质去饱和酶(GenBank登录号：AJ222980)、高山被孢霉(Mortierella alpina) δ-6-去饱和酶 (Sakuradani等人 1999. Gene 238:445-453)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) δ-5-去饱和酶(Michaelson等人 1998, FEBSLetters 439:215-218)、秀丽隐杆线虫A5-脂肪酸去饱和酶(des-5) (GenBank登录号：AF078796)、高山被孢霉δ-5-去饱和酶(Michaelson等人 JBC 273: 19055-19059)、秀丽隐杆线虫δ-6-延伸酶(Beaudoin等人 2000. PNAS 97:6421-6426)、小立碗藓δ-6-延伸酶(Zank等人 2000. Biochemical Society Transactions 28:654-657)或这些的功能等同物的多核苷酸序列。
另一个优选的构建体为PRN操纵子。PRN为细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)和其它细菌例如洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)的某些菌株产生的抗真菌和抗细菌化合物(Chernin等人 (1996) Current Microbiology 32:208-212和Mozes-Koch等人, (2012) Plant Physiology, Vol. 158, 1883–1892)。
在本发明的一个实施方案中，表达的多核苷酸序列可用于产生用于工业目的(例如酶，例如脂肪酶)或作为药物(例如，抗体、凝血因子、干扰素、淋巴因子、集落刺激因子、纤溶酶原激活剂、激素或疫苗，如，例如，Hood E E.等人 1999. Curr Opin Biotechnol 10(4):382-60和Ma J K.等人 1999. Curr Top Microbiol Immunol 236:275-92所述)的高质量蛋白和酶。例如，在转基因玉米植物中大规模产生重组鸡卵白亲合素和细菌P-葡萄糖苷酸酶(GUS)已成为可能(Hood等人 1999. Adv Exp Med Biol 464: 127-47; Review)。
在本发明的另一个实施方案中，表达的多核苷酸序列也可用于在正常包含较少的贮存蛋白或贮存脂质的细胞中获得增加的贮藏能力，目的在于增加这些物质的产量，例如乙酰-CoA羧化酶。优选的多核苷酸序列为编码紫花苜蓿(Medicago sativa)乙酰-CoA羧化酶(accase) (GenBank登录号：L25042)或其功能等同物的那些。
可表达的多核苷酸的额外的实例包括乙肝表面抗原(Kumar GBS等人 2005.PLANTA 222 (3):484-493)、除草剂抗性(Duke, S O. 2005. Pest Management Science61(21):1-218)、干扰素(Edelbaum, O.等人1992. J. Interferon Res. 12:449-453)、T7-RNA聚合酶(Zeitoune等人 1997. Plant Science 141:59-65)。
可在本发明的转化植物中表达的多核苷酸序列的进一步实例在例如Dunwell JM. 2000. J Exp Bot. 51:487-96中提及。
下面提供应用的非限制实例，其中减少基因表达可通过用适当的异源DNA根据本发明的教导转化植物种子获得。
延迟的果实成熟或改良的成熟表型(延长的成熟，更迟的衰老)可例如通过减少选自以下的基因的基因表达取得：多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、β-1,4)葡聚糖酶(纤维素酶)、β-半乳聚糖酶(β-半乳糖苷酶)，或乙烯生物合成的基因，例如1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、腺苷甲硫氨酸水解酶(SAMase)、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，类胡萝卜素生物合成的基因，例如前-八氢番茄红素生物合成或八氢番茄红素生物合成的基因例如八氢番茄红素去饱和酶，和O-甲基转移酶、酰基载体蛋白(ACP)、延伸因子、生长素诱导基因、半胱氨酸(巯基)蛋白水解酶、淀粉磷酸化酶、丙酮酸脱羧酶、查耳酮还原酶、蛋白质激酶、生长素相关基因、蔗糖转运体、分生组织模式基因。进一步有利的基因在例如，国际(PCT)申请公开号WO 91/16440、WO 91/05865、WO 91/16426、WO 92/17596、WO 93/07275或WO 92/04456中描述。特别优选减少多聚半乳糖醛酸酶表达，用于防止植物和果实例如番茄的细胞降解和成糊状(mushiness)。对于该目的，可优选使用核酸序列例如番茄多聚半乳糖醛酸酶基因(GenBank登录号：x14074)或其同源物的核酸序列。
编码贮存蛋白的基因的基因表达减少具有许多优点，例如，减少过敏可能或改良其它代谢产物的组成或量，例如油或淀粉含量。
在本发明的一个实施方案中，对植物病原体例如蛛形动物、真菌、昆虫、线虫、原生动物、病毒、细菌和疾病的抗性可通过减少特定病原体的生长、存活、某些发育阶段(例如蛹化)或增殖所必需的基因的基因表达取得。这样的减少可产生上述步骤的完全抑制，或另外上述步骤的延迟。其可采取例如植物基因(例如使病原体可能穿入的植物基因)的形式，但也可为同源的病原体基因。转化和表达的异源核酸序列(例如双链RNA)针对病原体基因，以致病原体生命周期中断。
在本发明的另一个实施方案中，病毒抗性可例如通过减少病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒蛋白酶等的表达取得。技术人员已知许多植物病毒和合适的靶基因。
在本发明的一个实施方案中，对植物病原体例如，真菌和细菌的抗性可通过表达编码吡咯尼群的完整操纵子(PRN)取得(Mozes-Koch等人, (2012) Plant Physiology,Vol. 158, 1883–1892)。
在本发明的另一个实施方案中，也可取得不期需、过敏或毒性植物组分例如，硫代葡糖酸盐或马铃薯糖蛋白的减少。合适的靶基因已有描述(特别是在WO 97/16559中)。优选用于减少变应原性蛋白的靶基因例如由Tada Y等人 (1996) FEBS Lett 391(3):341-345或Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60(8):1215-1221描述。
延迟的衰老迹象可通过本发明方法取得。合适的靶基因为，特别是，肉桂酰-CoA:NADPH还原酶或肉桂酰-醇脱氢酶。其它靶基因已有描述(特别是在WO 95/07993中)。
通过减少苏氨酸生物合成，例如通过减少苏氨酸合酶表达而增加甲硫氨酸含量(Zeh M等人 2001.Plant Physiol 127(3): 92-802)也可通过本发明方法取得。
根据本发明教导转化入植物细胞中的异源DNA也可用于减少(抑制)靶基因转录和/或翻译。因此，DNA构建体可包含其表达引起PTGS (转录后基因沉默)或TGS (转录沉默)作用并因此减少内源基因表达的异源DNA。这样的减少可例如通过表达反义或双链RNA (其各自与待抑制的内源靶基因的具有同源性)取得。同样，合适的有义RNA的表达可通过称为共抑制的方法导致内源基因表达减少(EP申请公开号0465572)。特别优选表达双链小干扰RNA (siRNA)，用于经由RNA干扰(RNAi)减少靶基因的基因表达。本领域技术人员已知用于使用具有双链结构的RNA抑制单个靶基因的方法，其中靶基因与RNA双链体的区域具有至少部分同一性。
本发明提供用于使用非引发种子处理将核酸引入植物中的手段和方法。具体地，本发明组合了改良的商业种子处理(例如包衣、薄膜包衣、拌种和丸化)和向植物种子中加载异源DNA。出乎意料地，施用的异源DNA能够在种子发芽期间到达种子胚细胞。特别地，本发明提供加载裸露的和/或基于病毒的DNA质粒的手段和方法，其可在发芽植物中系统性复制和传播而不整合入植物基因组中。
根据本发明，种子用包含裸露形式的异源DNA质粒的非引发处理介质覆盖。在本发明的一个实施方案中，所述质粒为基于病毒的载体DNA。
在本发明的一个实施方案中，基于病毒的载体为基于双生病毒的表达构建体。发芽时稳定附着于种皮的引入的质粒进入小植株细胞并到达其细胞核。本发明的方法中不需要使用微生物。
根据本发明，处理种子的组合物和方法包括，但不限于，非引发种子处理方法例如拌种方法、种子包衣和薄膜包衣方法以及种子丸化方法。
本发明的非引发处理介质由水(70%-99%)、引入的质粒(一种或多种) (以0.1 -10 µg DNA/种子的一定剂量)、包衣颜料或生物颜料(0-30%)构成，加入或不加添加剂，例如，但不限于，多糖(例如，PEG)、研磨材料(例如，金刚砂粉末)、促凝剂材料(例如，氯化铁、氢氧化钠、壳聚糖)和/或其它化学品。本发明的非引发种子处理向种子添加大约0.5%-5%w/w水化；然而，如本文所使用的，非引发种子处理也可包括最高20% w/w的水化。例如，在本发明的非引发处理方法期间，可向种子添加0.5%、1%、1.5%、2.3%、3.7%、4.5%、6.7%、9.5%、11.4%、13.6%、15.9%、17.2%、18.8%、19.4%或20% w/w水化，包括其间的任何整数或分数，包括0.5%-20% w/w之间添加的任何水化。相反，在引发方法中种子通过添加大约25%-45% w/w水化。
本发明的非引发种子处理非常迅速且时间短(大约1秒-大约60分钟，例如，1.0秒、2.3秒、3.1秒、6.2秒、11.7秒、59.0秒、84.5秒、118.3秒、169.4秒、214.1秒、240.0秒、5分钟、12分钟、28分钟、46分钟或60分钟，包括其间的任何整数或分数)，并且包衣/拌种/丸化在种子外部，不触发生理变化。相反，引发种子处理为长得多的过程(约12小时-72小时或更长)并且引发期间种子内开始生理过程，例如酶活性。在本发明的非引发种子处理中，质粒将会仅在将种子播种在田间并灌溉后进入胚细胞，而在引发处理中，质粒将会在引发过程本身期间进入胚细胞。在本发明方法中，种子与非引发处理介质混合然后干燥。种子可储存一段时间或立即播种。
实施例
提供下列实施例以进一步说明本发明，不意在超出所附权利要求中阐明的限制之外限制本发明。
实施例1. 无外源DNA的大豆种子包衣
大豆种子用下文列出的不同包衣介质包覆。通过涡旋混合数批25粒大豆种子(各10.5g)与0.3 mL包衣介质(3%种子重量) 30秒，接着空气中干燥24小时。该介质由70%自来水、30%包衣颜料构成，添加或不添加1.5%聚乙二醇(PEG)、3% PEG或1%金刚砂。
包衣种子处理的均匀度通过种子上均匀覆盖红色证明(图1A，其代表用1.5% PEG处理)。将干燥的处理种子播种在蛭石上，10天后记录发芽率(图1B)。相同品种、相同种子批的未处理干燥种子用作对照。结果显示对照种子和通过本发明方法处理的种子之间发芽%无差异。
实施例2. 使用包衣处理将质粒载体引入大豆种子中
如实施例1中所描述的，大豆种子用70%自来水、30%包衣颜料构成的包衣介质包覆，并向每一批(各包含25粒种子)添加25 μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒。图2中说明专利申请中以名称IR-V2-CP (公开号2010/004561)描述的质粒构建体。以相同程序和用相同包衣介质但不添加DNA质粒构建体处理的种子用作对照。
处理种子经发芽并对从14日龄幼苗的真叶提取的DNA进行巢氏PCR分析。使用的引物设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列的片段 (PCRI用引物A-B，接着PCRII用引物C-D)。
引物A:GCAGTCCGTTGAGGAAACTTACG
引物B:CATACACTGGATTAGAGGCATGC
引物C:GTGACTATGTCGAAGCGACCAG
引物D:GCCTGTTCCTTCATTCCAGAGG
如图3中所示，阳性PCR反应证实质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例3. 使用改良的包衣处理将质粒载体引入大豆种子中
大豆种子用实施例1中列出的不同包衣介质并且还用1.5%或3% PEG或用1%金刚砂包覆。
处理种子经发芽并对从12日龄幼苗的真叶提取的DNA进行PCR分析。使用的引物与实施例2中相同。
阳性PCR反应证实质粒引入发芽的通过本发明方法处理的种子中(图4)。
实施例4. 使用拌种处理将质粒载体引入玉米种子中
将200粒玉米种子(54 g)与11 mL拌种介质(20%种子重量)混合30秒，然后在空气中干燥24小时。
拌种介质包含10 mL自来水、1 mL包衣颜料、0.3 g PEG和130 μg质粒(p1470)。对照组用相同的介质但无质粒包覆。
将干燥的拌种种子种植在蛭石上。12天后，对幼苗取样用于PCR检验。使用的引物E-F设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列的片段。
引物E:TCACGGTTGCGGTACTGGGCT
引物F:CCACGCCCGTCTCGAAGGTTC
阳性PCR反应证实质粒引入发芽的通过本发明方法处理的种子中(图5)。
实施例5. 使用包衣处理将质粒载体引入油菜种子中
通过与6%种子重量的由360 μL水、214 μL粘合剂、15 μL PEG-6000、25μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒构成的包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆2500粒油菜种子(10 g)。
包衣1周后和包衣6个月后播种处理的种子并对从播种后5周的真叶提取的DNA进行PCR分析。使用的引物设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列的片段(C-D)。如图6中所示，阳性PCR反应证实质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例6. 使用包衣处理将质粒载体引入水稻种子中
通过与8.5%种子重量的由70%包含25 μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒的水和30%粘合剂构成的300 μL包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆150粒水稻种子(3.5 g)。
播种处理的种子并在播种1月后对从根提取的DNA进行PCR分析。使用的引物设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列的片段(C-D)。如图7中所示，阳性PCR反应证实质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例7. 使用改良的包衣处理将质粒载体引入水稻种子中
通过与3%种子重量的由70%水(包含25 μg基于病毒的载体的裸露dsDNA质粒和携带35S启动子驱动的GFP基因的质粒)和30%粘合剂构成的103 μL包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆150粒水稻种子(3.5 g)。
播种处理的种子并在播种2天后通过共焦显微镜检查监测GFP表达，其显示处理的水稻种子样品中GFP表达；植物还通过PCR成功检验(未示出)。
实施例8. 使用包衣处理将质粒载体引入甜瓜种子中
通过与10%种子重量的由70%包含75 μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒的水和30%粘合剂构成的240 μL包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆75粒甜瓜种子(2.4 g)。
播种处理的种子并在播种19天后对从真叶提取的DNA进行巢氏PCR分析。使用的引物设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列的片段(PCRI用引物 A-B，接着PCRII用引物C-D)。如图8中所示，阳性PCR反应证实质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例9. 使用包衣处理将质粒载体引入番茄种子中
通过与10%种子重量的由70%包含1.6 μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒以及1.6 μg相关的“卫星样”IR-35GUS (35S启动子驱动的GUS)或IR-PRN (IR作为激动子驱动的PRN操纵子)裸露dsDNA质粒的水和30%粘合剂构成的16 μL包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆50粒番茄种子(0.160 g)。
播种处理的种子并在播种3周后对从真叶提取的DNA进行PCR分析。使用的引物设计为扩增p1470中TYLCV外壳蛋白序列或“卫星样”序列的片段。阳性PCR反应证实两种质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例10. 使用包衣处理将质粒载体引入鹰嘴豆种子中
通过与2.4%种子重量的由70%包含30 μg基于病毒的载体p1470的裸露dsDNA质粒以及30 μg相关的“卫星样”IR-35GUS (35S启动子驱动的GUS)裸露dsDNA质粒的水、30%粘合剂构成的172.2 μL包衣介质涡旋混合30秒，然后空气中干燥24小时，包覆30粒鹰嘴豆种子(7.2g)。
播种处理的种子并在播种3周后对从真叶提取的DNA进行实时PCR分析。阳性PCR反应证实两种质粒引入从通过本发明方法处理的种子形成的植物中。
实施例11. 通过本发明方法处理的植物种子类型关于其已知的对TYLCV感染的易 感性的概述
对用基于病毒的载体p1470的dsDNA质粒和其衍生物通过拌种(前述实施例中所述)或包衣进行种子处理的作物类型关于其已知的对TYLCV感染的易感性的概述在下表1中示出。除了番茄，已知所有描述的物种对TYLCV不敏感，特别是单子叶植物，例如水稻或玉米，不被TYLCV感染。另外，TYLCV不通过种子感染植物。因此，本发明方法具有通用适用性。表1中的星号指示不受TYLCV感染的单子叶植物。
表
。

Claims (20)

1. 用于将核酸引入植物种子胚的至少一个细胞的方法，所述方法包括使植物种子与包含含有异源DNA的裸露核酸构建体或基于病毒的DNA构建体的非引发介质接触小于60分钟，这导致小于20% w/w的种子含水量增加，从而获得加载核酸的种子。
2.权利要求1的方法，其中所述核酸存在于种皮的表面上。
3.权利要求1的方法，其中所述非引发介质选自种子包衣、薄膜包衣、拌种和种子丸化介质。
4. 权利要求1的方法，其中植物种子与非引发介质接触导致小于10% w/w的种子含水量增加。
5. 权利要求1的方法，其中植物种子与非引发介质接触导致小于5% w/w的种子含水量增加。
6.权利要求1的方法，其中植物种子与非引发介质接触小于5分钟。
7.权利要求1的方法，其中所述基于病毒的DNA构建体包含使构建体能够复制和/或无症状传播至相邻植物细胞中的病毒基因或其部分。
8.权利要求7的方法，其中所述基于病毒的DNA构建体为基于双生病毒(Geminivirus)的构建体，并且其中所述异源DNA构建体包含编码修饰的双生病毒外壳蛋白的多核苷酸序列，其中所述修饰的双生病毒外壳蛋白在编码N端100个氨基酸的核苷酸中包含突变或缺失。
9.权利要求8的方法，其中所述DNA构建体进一步包含编码修饰的双生病毒V2蛋白的多核苷酸序列。
10.权利要求7的方法，其中所述DNA构建体进一步包含细菌多核苷酸序列。
11.权利要求8的方法，其中所述双生病毒为选自IL-60、IL-60-BS、p1470及其衍生物包括其可反式激活和可诱导的pIR卫星样构建体的番茄黄曲叶病毒。
12.权利要求1的方法，其中所述基于病毒的DNA构建体进一步包含用于鉴定含有异源DNA的种子和植物的标志。
13.权利要求1的方法，其中所述异源DNA编码选自肽、多肽、蛋白质和RNA分子的产物。
14.权利要求13的方法，其中所述RNA分子为选自反义RNA、dsRNA和siRNA的抑制RNA。
15.权利要求13的方法，其中所述编码产物赋予选自对生物或非生物应激的抗性、产量增加、产量品质增加和优选的生长模式的期需农艺学性状。
16.权利要求1的方法，其中所述异源DNA在发芽种子胚的至少一个细胞和从其衍生的细胞中瞬时表达。
17.权利要求1的方法，其中所述异源DNA并入发芽种子胚的至少一个细胞和从其衍生的细胞的基因组中。
18.通过权利要求1的方法产生的种子，其中所述种子包含含有异源DNA的基于病毒的DNA构建体。
19.通过生长权利要求18的种子产生的植物或其部分，其中所述植物或其部分包含含有异源DNA的基于病毒的DNA构建体。
20.权利要求1的方法，其中所述种子选自单子叶植物、双子叶植物和含有球果的来源。
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