JP6037395B2 - 植物におけるタンパク質発現 - Google Patents

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Description

本発明は植物におけるタンパク質発現に関する。特に、本発明は、タバコ植物全体における組換えポリペプチドの大規模産生のための方法に関する。
タバコは植物における異種タンパク質の発現の研究のための宿主植物として使用されてきた。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを使用する様々な異種タンパク質の一過性発現が記述されてきたが、この種は、実験室における試験モデルとして有用である一方、バイオマスは少なく、短い期間内の大量の組換えタンパク質の製造のためのプラットフォームの産業化には適用可能ではない。植物および植物細胞における一過性の遺伝子発現は、主として与えられたタンパク質の少量の産生を実証する迅速手段として、および遺伝的コンストラクトの試験のために開発されている。植物または植物細胞の中へタンパク質のコード配列を導入する方法は、例えば、パーティクルガン送達、バキュームインフィルトレーション、アグロバクテリウム媒介性伝達および植物プロトプラストの中への裸のＤＮＡのポリエチレングリコール媒介性送達を含む。
安定した形質転換は、様々な植物種（例えばＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍを含むタバコ種等）について実証されてきた。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓおよび恐らくＮｉｃｏｔｉａｎａ ｏｔｏｐｈｏｒａのハイブリッドであると考えられる。それは栽培においてのみ見出され、多数の変種および栽培品種は様々な気候および地理領域において商業的に成長される。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの変種および栽培品種の中で、形態的変動、農学的特性および化学的差異がよく認識されている。しかしながら、限定された情報のみが、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの変種および栽培品種の物質的特性と遺伝的多様性との間の関係で利用可能である。組換えタンパク質の産生のための各々のかかる変種および栽培品種の適応性についてはあまり知られていない。組換えタンパク質の産生のための現行の商業的大規模の動物細胞培養は、各々が広範囲に特徴づけられたわずか２・３の宿主細胞株で確立されている。これとは対照的に、かかる情報は、タバコの変種、育種系統および栽培品種に由来した植物細胞、ならびに植物全体について１つもない。
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの安定的形質転換は一般的に組換えタンパク質の産生について確立されたが、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物細胞における外来の遺伝子の一過性発現は複数の実例においてのみ実証された。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおけるこれらの一過性発現研究は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａの若い切断葉内に含まれる植物細胞または葉ディスクのいずれかのインフィルトレーション（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８９：１８８−１９４；Ｐｏｔｕｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，２００８，１７：１９−３２）、または表皮表面直下の葉全体の背軸の空隙の中へ１ｍｌのシリンジを使用して手動で注射することによるまだ植物に付着している葉の注射に限定されている。これらの実験のどれも、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物全体に基づく組換えタンパク質の大規模産生のために技術的に着実で商業上意味のあるシステムを開示していない。
Ｃｏｎｅｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ Ｊ，２０１０ １−１１）による最近の比較分析は、試験した異なるＮｉｃｏｔｉａｎａ品種の少量のサンプル間で一過性発現のレベルが有意に変動し、与えられた品種については一過性発現の収率と安定的発現の収率との間に相関性がないことを示す。この研究は、組換えタンパク質の一過性発現については、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの品種および栽培品種中の収率は並はずれて予測不可能であるという概念を強調する。Ｃｏｎｅｌｙ ｅｔ ａｌ．によって報告された一過性発現の解析は、実験室規模でアグロバクテリウム懸濁物を直接注入した葉で行なわれた。とりわけ方法がスケールアップされる場合、収率に影響を与え得る一過性発現方法の他の多くの側面（インフィルトレーション方法論、発現コンストラクトのデザインおよびバルク増殖／農学的条件等）が、理解されていない。
植物発現システムが組換えタンパク質の大規模産生のための動物細胞培養に対する有望な代替物と判断されていることを考慮すると、工業規模で重要な変数が調べられ至適化されている商業的に実現可能な植物ベースの製造プラットフォームを開発する緊急の必要性がある。
この満たされていない必要性は、独立請求項の特色によって定義されるような方法の提供による本発明によって検討および解決される。好ましい実施形態は従属請求項の対象である。本発明は、前選択された適合性のある組み合わせのＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株を一過性発現による異種ポリペプチドの大規模産生のために使用する方法を提供する。本明細書において以下に記述された結果は、試験した多くのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種中でも、予想外に高レベルの異種ポリペプチド蓄積と低プロテイナーゼ活性との間に相関性（重要な因子として他の研究によって指摘されていた特色）がなかったことを示す。したがって、本発明において提供されるＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種の多くは異種タンパク質の産生のための宿主として判断されていなかった。本発明は、異種ポリペプチドの全収率をさらに促進する、方法に対する様々な改善（最小サイズにしたバイナリーベクターの使用、宿主植物におけるウイルス遺伝子サイレンシングサプレッサーの存在、植物全体のインフィルトレーション、ならびに特異的なバルク増殖の条件および実践）も提供する。本発明の一過性発現ベースの方法に対する１つまたは複数の改善を任意で含む、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株の前選択された組み合わせの使用は、大量の異種ポリペプチドの産生を経済的かつ短い期間（トランスジェニック植物のために必要とされるものと比較して）で可能にする。
本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株の懸濁物により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程であって、前記株が、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を植物において作動可能な調節配列の制御下に含む工程と；
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜２０日の間、特に７日〜１５日の間、しかしとりわけ８日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
を含む方法に関する。
一実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を植物において作動可能な調節配列の制御下に含む０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程と；
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物においてヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜２０日の間、特に７日〜１５日の間、しかしとりわけ８日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
含み、
但し、発現可能なヌクレオチド配列が緑色蛍光タンパク質をコードする場合、緑色蛍光タンパク質の蓄積がインフィルトレーションした植物または植物細胞の全可溶性タンパク質の少なくとも１％であるか；またはポリペプチドの蓄積が、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）において記述されるものと同じ発現可能なヌクレオチド配列を含む選択されたアグロバクテリウム株が使用される場合にＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて得ることができるものの少なくとも２５％のレベルである
方法に関する。
したがって、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の株の選択された組み合わせが、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で定義される方法において使用される場合、その組み合わせは、本発明に従って使用されたとき、発現可能なヌクレオチド配列が緑色蛍光タンパク質をコードする場合、インフィルトレーションした植物の全可溶性タンパク質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％までの緑色蛍光タンパク質の蓄積をもたらすような組み合わせであることが好ましい。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の株の選択された組み合わせは、前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で定義される本発明に記載の方法において、同じ発現可能なヌクレオチド配列および同じ条件が適用される場合にＮ．ｂｅｎｔａｍｉａｎａにおいて得ることができるものの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、もしくは等しいか、または少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、もしくは少なくとも５００％のレベルまでの異種タンパク質の蓄積をもたらすことも好ましい。異種タンパク質の蓄積は、葉の生重量（ＦＷ）の単位質量（ｋｇ等）あたりの異種タンパク質の単位質量（グラム等）、すなわちｇ／ｋｇ ＦＷに換算して表現することができる。
代替の実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉に注入した５日後に、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を植物において作動可能な調節配列の制御下に含む０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程と；
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物においてヌクレオチド配列の発現および組換えタンパク質の蓄積を可能にする条件下で、５日〜２０日の間、特に７日〜１５日の間、しかしとりわけ８日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
含み、
但し、工程ｉｉ）に記載のインフィルトレーションが、２０１０年７月１６日に出願された欧州特許出願１０ １６ ９８８８．４中で記述および請求されたような方法により、特に
（ｉ）アグロバクテリウム細胞と植物全体または植物部分を流体中で接触させ、アグロバクテリウム細胞が異種ペプチドまたはタンパク質をコードする発現可能なコンストラクトを含む工程と；
（ｉｉ）植物全体または植物部分およびアグロバクテリウム細胞を１つまたは複数の圧力サイクルにより処理し、それによってアグロバクテリウム細胞が植物全体または植物部分をインフィルトレーションし、圧力サイクル（複数可）の少なくとも１つが大気圧と比較して圧力の増加を含む工程と
を含む方法により、実行されない
方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、アグロバクテリウム細胞が、バイナリーベクター、特に大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製ならびにタバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移行に必須の配列因子、ならびにさらにＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物において機能的な調節エレメントの制御下にあるペプチドまたはタンパク質のコード配列を含むＴ−ＤＮＡ領域、ならびに任意で植物で選択可能なマーカー遺伝子を含む最小サイズにしたバイナリーベクターを含み、必須の配列因子が最小サイズにしたバイナリーベクター全体の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％を占める、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
特定の実施形態において、本発明は、使用される最小のバイナリーベクターが、以下の核酸エレメント
ａ）大腸菌およびアグロバクテリウム種において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸エレメントと；
ｂ）大腸菌において機能的な第１の複製起点のヌクレオチド配列を含む第２の核酸エレメントと；
ｃ）複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸エレメントと；
ｄ）第１の複製起点とは異なり、アグロバクテリウムにおいて機能的である第２の複製起点のヌクレオチド配列を含む第４の核酸エレメントと；
ｅ）腫瘍誘導Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓプラスミドまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの毛根誘発プラスミドのＴ−ＤＮＡ右境界配列およびＴ−ＤＮＡ左境界配列を含むＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を含む第５の核酸エレメントと
を含むか、それらからなるか、または本質的になり、
上記の核酸エレメントが環状ポリヌクレオチド分子上で提供され、複製、維持または核酸移行において機能を有していないギャップヌクレオチド配列によって分離され、前記ギャップヌクレオチド配列が、全ベクターサイズの２０％、２５％ ３０％、３５％、４０％、４５％未満を占める、
前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。好ましくは、ギャップヌクレオチド配列は、全ベクターサイズの２０％未満を占める。
本発明の一実施形態において、本発明の方法における使用のためのベクター分子は、５９００ｂｐ未満、特に５５００ｂｐ未満、特に５２００ｂｐ未満、特に５１００ｂｐ未満、しかしとりわけ５１３９ｂｐの全サイズを有する。
一実施形態において、本発明は、前記最小のバイナリーベクターが広範囲の宿主範囲のプラスミドｐＲＫ２に基づく、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記最小のバイナリーベクターが、配列番号：１において図示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、しかし特に１００％同一のポリヌクレオチド配列を有し、核酸エレメント（ａ）〜（ｅ）が、配列番号：１において提供されるカウンターパートエレメントと同じ機能性を示す、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
特定の実施形態において、最小サイズにしたバイナリーベクターは、配列番号：１において示される配列を有する。
一実施形態において、本発明は、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列が、大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製ならびにタバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移行に必須の配列因子、ならびに任意で植物で選択可能なマーカー遺伝子を含む最小サイズにしたバイナリーベクター中でクローン化され、必須の配列因子の割合が、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列のない最小サイズにしたバイナリーベクター全体のヌクレオチドの少なくとも７０％を占める、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される場合、遺伝子サイレンシングサプレッサーが、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の前記選択された品種、育種系統または栽培品種において一過性発現される、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、遺伝子サイレンシングサプレッサーがポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）である、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法に関する。
一実施形態において、本発明は、遺伝子サイレンシングサプレッサーが、配列番号：５において記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、遺伝子サイレンシングサプレッサー、特にポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）、特に配列番号：５のポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）が、第１のバイナリーベクター上に位置し、異種ポリペプチドが第２のバイナリーベクター上に位置する、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、第１のバイナリーベクターが第１のアグロバクテリウム株において提供され、第２のベクターが第２のアグロバクテリウム株において提供され、工程（ｉｉ）において、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のバイナリーベクターを含む第１のアグロバクテリウム株の細胞：遺伝子サイレンシングサプレッサー、特にポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）、特に配列番号：５のポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）を含む第２のバイナリーベクターを含む第２のアグロバクテリウム株の細胞の比率が、３：１〜１．６：１の範囲である、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される本発明に記載の方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドの発現を制御する植物において作動可能な調節配列が、プロモーター、特に以下に本明細書において開示されるプロモーターのうちの１つ、しかし特にＨＴ−ＣＰＭＶプロモーターそれ自体、特にＨＴ−ＣＰＭＶプロモーターまたは配列番号：２において示される最小の３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターと組み合わせたものを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドの発現を制御する植物において作動可能な調節配列が、プロモーター、特に以下に本明細書において開示されるプロモーターのうちの１つ、しかし特にＦＬｔプロモーターまたはその機能的断片を含み、ＦＬｔプロモーターが、ＭＭＶ、ＦＭＶまたはＰＣＩＳＶのプロモーター、特に配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４において提供されるＦＬｔプロモーターである、前述の実施形態のいずれか１つの方法に関する。
特定の実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株の懸濁物により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程であって、前記株が、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）、特に配列番号：５のポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）およびポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、任意で圧力サイクル（複数可）の少なくとも１つが大気圧と比較して圧力の増加を含む１つまたは複数の圧力サイクルを適用する工程と、
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
を含む方法に関する。
他の特異的な実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株の懸濁物により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程であって、前記株が、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）、特に配列番号：５のポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）およびポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列をＦＬｔプロモーターまたはその機能的断片の制御下に含み、ＦＬｔプロモーターが、ＭＭＶ、ＦＭＶまたはＰＣＩＳＶのプロモーター、特に配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４において提供されるＦＬｔプロモーターであり；任意で圧力サイクル（複数可）の少なくとも１つが大気圧と比較して圧力の増加を含む１つまたは複数の圧力サイクルを適用する工程と、
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
を含む方法に関する。
任意で、調節配列は、５’非翻訳リーダー配列、ポリアデニル化シグナルまたは１つもしくは複数のエンハンサー、または前述のものの組み合わせを含む。本発明は当業者に公知であるようなおよび以下に本明細書において開示されるような遺伝子サイレンシングサプレッサーを含む他の調節配列をさらに意図する。
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むバイナリーベクターが、タバコ植物において作動可能な調節エレメントと操作可能に結び付けられた遺伝子サイレンシングサプレッサーのコード配列をさらに含む、前述の実施形態のいずれかの方法に関する。
一実施形態において、本発明は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の前記選択された品種、育種系統または栽培品種が、遺伝子サイレンシングサプレッサー、特にウイルス起源の遺伝子サイレンシングサプレッサー、ならびに特にキュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）のｐ１９タンパク質、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）のｐ１タンパク質、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）のｐ２５タンパク質、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパク質およびポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）からなる群から選択される遺伝子サイレンシングサプレッサーを含む、前述の実施形態の方法に関する。
さらなる実施形態において、本発明は、前記方法が、遺伝子サイレンシングサプレッサーのコード配列を含むバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム細胞の第２の懸濁物により、前記選択された品種、育種系統または栽培品種をインフィルトレーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかの方法に関する。アグロバクテリウム細胞の第２の懸濁物は、任意で、選択されたアグロバクテリウム株と同じ株であり得る。アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁物および第２の懸濁物は、任意の連続順序で、または同時にインフィルトレーションすることができる。アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁物および第２の懸濁物は、タバコ植物のインフィルトレーションに使用する前に混合することができる。任意で、アグロバクテリウム細胞の第１の懸濁物および第２の懸濁物は、各々の懸濁物からの細胞数の定義された比率で混合される。
一実施形態において、本発明はアグロバクテリウム細胞の懸濁物が、工程（ｉｉ）において０．１〜１．０、特に０．３〜０．９、特に０．５〜０．８、および特に０．１５〜０．３５の範囲の細胞密度（ＯＤ600）で、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のインフィルトレーションのために使用される、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種が、ＮＣＩＭＢにより寄託されるＮ．ｔａｂａｃｕｍアクセッションＰＭ０１６、ＰＭ０２１、ＰＭ９２、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、ＰＭ２１５、ＰＭ２１６またはＰＭ２１７、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＳｃｏｔｌａｎｄまたはＤＡＣ Ｍａｔａ Ｆｉｎａ、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ ９４４（ＭＮ ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ Ｍａｗａｒ、ＮＣ２９７、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｘａｎｔｈｉ ＮＮ、Ｋａｒａｂａｌｇａｒ、ＤｅｎｉｚｌｉおよびＰＯ１からなる群から選択されるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の品種、育種系統または栽培品種が、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統のＰＭ０１６（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９８下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ、英国に位置するブダペスト条約下の国際寄託当局）に２０１１年１月６日に寄託された）；ＰＭ０２１（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９９下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ０９２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８００下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ１０２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０１下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ１３２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０２下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２０４（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０３下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２０５（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０４下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２１５（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０５下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２１６（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０６下で寄託された）；およびＰＭ２１７（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０７下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）のうちのいずれか１つである、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたアグロバクテリウム株が、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ２２６０およびＧＶ３１０１およびＣｈｒｙ５からなる群から選択されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの株である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたアグロバクテリウム株がアグロバクテリウム株ＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種および選択されたアグロバクテリウム株の組み合わせが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２からなる群から選択された組み合わせである、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種および選択されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株の組み合わせが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ２０４からなる群から選択された組み合わせである、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株が、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）の発現可能なヌクレオチド配列をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、植物、特にＮｉｃｔｏｔｉａｎａ属の植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物において産生するための方法であって、
植物において作動可能な調節配列の制御下にポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列により、特に０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株の懸濁物により、選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体、特にＮｉｃｔｏｔｉａｎａ属の植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物をインフィルトレーションする工程であって、前記株が、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を植物において作動可能な調節配列の制御下に含む工程と；
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、特に５日〜２０日の間、特に７日〜１５日の間、しかしとりわけ８日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
を含む方法に関する。
一実施形態において、本発明は、気孔コンダクタンスが７０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1〜６００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の間、特に１００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1〜５００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の間、特に２００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1〜３００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の間、特に２５０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1〜４５０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の間の範囲であるように、インフィルトレーション前に、植物が光に曝露される、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記インフィルトレーション工程が、植物葉および／または植物花および／または植物茎および／または植物根、しかし特に植物全部を含む、ｉｎ ｓｉｔｕの植物の主要部分を、大気圧よりも低い圧力または真空に曝露することを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記インフィルトレーション工程が、植物葉および／または植物花および／または植物茎および／または植物根、しかし特に植物全部を含む、ｉｎ ｓｉｔｕの植物の主要部分を、大気圧よりも高い圧力に曝露することを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、工程ｉｉｉ）が、植物を１日あたり７〜９時間、好ましくは１日あたり８時間日光条件下でインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。方法は、異種タンパク質の一過性発現のレベルの改善に特に有用である。
一実施形態において、本発明は、工程ｉｉｉ）が、直立した位置で、または代替的に転倒させた位置で、前記インフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記異種ポリペプチドが、インフルエンザ赤血球凝集素またはその免疫原性断片である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記方法が、インフィルトレーションした植物全体を転倒させた位置でもしくは１日あたり７〜９時間日光条件下でまたは両方でインキュベーションすることをさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、前記方法が、（ａ）インフィルトレーション前に、植物全体、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物全体、特に選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物を、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で特に１平方メートルあたり２００〜６００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり４００〜５５０の植物の密度で成長させる工程、または（ｂ）インフィルトレーション後に、インフィルトレーションした植物全体を、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり２００〜６００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり４００〜５５０の植物の密度でインキュベーションする工程、または（ｃ）インフィルトレーション前に、植物全体、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物全体、特に選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物全体植物を、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で特に１平方メートルあたり２００〜６００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり４００〜５５０の植物の密度で成長させ、インフィルトレーション後に、インフィルトレーションした植物全体を、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり２００〜６００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり４００〜５５０の植物の密度でインキュベーションする工程をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の方法は、（ａ）インフィルトレーション前に、植物全体、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物全体、特に選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物全体を、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり２００〜６００の植物の密度で、特に１平方メートルあたり４００〜５５０の植物の密度で成長させる工程と、（ｂ）前記植物が高さ３０ｃｍ〜５０ｃｍの間、特に３５ｃｍ〜４５ｃｍの間に到達したときに、インフィルトレーションする工程とを含む。
一実施形態において、本発明は、インフィルトレーションした植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属のインフィルトレーションした植物、特にアグロバクテリウムによりインフィルトレーションしたタバコ植物を、植物細胞壁を分解または消化する１つまたは複数の酵素を含む酵素水溶液によりインフィルトレーションして、異種タンパク質の抽出および精製を支援する、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。特に、酵素溶液はセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼおよびポリガラクツロナーゼからなる群から選択される１つまたは複数の酵素を含む。使用することができるセルラーゼは、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（エキソグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）とも称される）またはβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）とも称される）を含む。酵素によるインフィルトレーション後に、植物は、少なくとも１、２、５、１０、１２、１８〜２４時間にわたる一定の期間の間インキュベーションすることができる。
さらに他の実施形態において、本発明は、植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物、特に選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物において、前述の実施形態のいずれかに記載の方法によって、産生されるインフルエンザ赤血球凝集素５ポリペプチド（Ｈ５）、特に配列番号：８において示されるインフルエンザ赤血球凝集素５ポリペプチド（Ｈ５）を含む組成物を提供する。
さらに他の実施形態において、本発明は、植物全体、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物全体、特に前述の実施形態のいずれかに記載の選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物全体における異種ポリペプチドの産生のためのシステムと、植物において作動可能な調節配列の制御下にポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列、特に前述の実施形態のいずれかに記載の植物において作動可能な調節配列の制御下にポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム種の株の細胞を含む懸濁物と、植物全体を特にアグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションするための手段と、任意で（ａ）インフィルトレーションした植物を転倒させた位置で１日あたり７〜９時間上からの照射と共にインキュベーションする工程、（ｂ）植物全体を１平方メートルあたり少なくとも７５の植物の密度で成長もしくはインキュベーションする工程または（ｃ）両方の工程の支援に適合する、インフィルトレーションした植物のインキュベーションのための温室とを提供する。
一実施形態において、本発明は、前記異種ポリペプチドが、増殖因子、受容体、リガンド、シグナリング分子；キナーゼ、酵素、ホルモン、腫瘍抑制因子、血液凝固タンパク質、細胞周期タンパク質、代謝タンパク質、神経タンパク質、心臓タンパク質、特異的な疾患状態において欠損したタンパク質、抗体、抗原、疾患に対する耐性を提供するタンパク質、ヒト遺伝性疾患の置換療法のためのタンパク質、抗微生物タンパク質、インターフェロン、およびサイトカインである、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。例は、インフルエンザ赤血球凝集素等のウイルス抗原を含むが、これに限定されない。
本発明の他の態様において、ポリペプチド、特に異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む、インフィルトレーションした植物をインキュベーションするための一般的な方法であって、植物を転倒させた位置でインキュベーションすることを含む前記方法が提供される。方法は、異種タンパク質の一過性発現のレベルの改善に特に有用である。好ましくは、転倒させた位置においてインキュベーションされる植物は、ポリペプチド、特に異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションした植物全体である。別の実施形態において、転倒させた位置でインキュベーションされる植物はトランスジェニック植物である。特定の実施形態において、本発明は、前記インキュベーション工程が、転倒させた位置でインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。インフィルトレーションした植物を転倒させた位置で任意の時間長の間インキュベーションすることを支援し、転倒させたインフィルトレーションした植物が上から照射されることに適合する温室も提供される。
本発明のさらに他の態様において、ポリペプチド、特に異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む、インフィルトレーションした植物をインキュベーションするための一般的な方法であって、植物を１日あたり７〜９時間、好ましくは１日あたり８時間日光条件下でインキュベーションすることを含む前記方法が提供される。方法は、異種タンパク質の一過性発現のレベルの改善に特に有用である。好ましくは、インフィルトレーションされる植物は、ポリペプチド、特に異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションした植物全体である。好ましくは、インキュベーションされる植物は、１日あたり７〜９時間、好ましくは１日あたり８時間光があてられる植物である。特定の実施形態において、本発明は、前記インキュベーション工程が、転倒させた位置でインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
本発明のさらに他の態様において、定義された面積内で複数のインフィルトレーションした植物をインキュベーションし、単位面積あたりのインフィルトレーションした植物の数がトランスジェニック植物の成長のために使用される平均よりも高い、一般的な方法が提供される。方法は、１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００のインフィルトレーションした植物、または１平方メートルあたり少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００のインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む。好ましくは、植物は、ポリペプチド、特に異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションした植物全体である。方法は、異種ポリペプチドの産生価格の低下に特に有用である。１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００のインフィルトレーションした植物または１平方メートルあたり少なくとも１００のインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることに適合する温室も提供される。特定の実施形態において、本発明は、前記インキュベーションする工程が、定義された面積において他のインフィルトレーションした植物と共にインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含み、その面積におけるインフィルトレーションした植物の密度が、１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００のインフィルトレーションした植物または１平方メートルあたり少なくとも１００のインフィルトレーションした植物である、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
一実施形態において、本発明は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを含み、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死の壊死を示す組成物に関する。
一実施形態において、本発明は、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を植物において作動可能な調節配列の制御下に含む０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株と、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統、または栽培品種の組み合わせを含む前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
一実施形態において、前記組成物におけるアグロバクテリウム細胞は、少なくとも２．１、少なくとも２．４、少なくとも２．７、少なくとも３．０、少なくとも３．３、少なくとも３．６、少なくとも３．８、少なくとも３．９、少なくとも４．０の細胞密度（ＯＤ600）を有する。
一実施形態において、前記組成物における、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍアクセッションＰＯ２、ＡＳ４４、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、ＰＭ１３２、ＰＭ０９２、ＰＭ０１６、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ ９４４（ＭＮ ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ＰＭ１０２、ＮＣ ２９７、ＰＭ０２１、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｓａｍｓｕｎ、ＰＯ１、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、ＰＭ２１５、ＰＭ２１６およびＰＭ２１７からなる群から選択される。
一実施形態において、前記組成物における、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統のＰＭ０１６（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９８下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ、英国に位置するブダペスト条約下の国際寄託当局）に２０１１年１月６日に寄託された）；ＰＭ０２１（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９９下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ０９２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８００下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ１０２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０１下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ１３２（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０２下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２０４（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０３下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２０５（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０４下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２１５（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０５下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）；ＰＭ２１６（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０６下で寄託された）；およびＰＭ２１７（その種子は２０１１年１月６日にアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０７下でＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ．に寄託された）からなる群から選択される。
一実施形態において、先に記述された組成物のいずれかにおいて選択されるアグロバクテリウム株は、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ２２６０、ＧＶ３１０１およびＣｈｒｙ５からなる群から選択されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの株である。
一実施形態において、先に記述された組成物のいずれかにおいて選択されるアグロバクテリウム株は、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５である。
一実施形態において、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２の組み合わせを含む組成物に関する。
一実施形態において、本発明は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ２０４の組み合わせを含む組成物に関する。
一実施形態において、本発明は、前記アグロバクテリウム株が、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）の発現可能なヌクレオチド配列をさらに含む、前述の実施形態のいずれかに記載の組成物に関する。
定義
本出願の範囲内で使用される専門的および科学的な用語および表現は、概して植物生物学の関連技術において一般に適用される意味が与えられるべきである。当業者に公知の様々な方法論が本明細書において参照される。参照されたかかる公知の方法論を説明する出版物および他の材料は、それらの全体の参照によって完全に説明されるかのように本明細書に援用される。本発明の実行は、特別の指示の無い限り、化学、分子生物学、微生物学、遺伝子工学および植物生物学の従来の技法を用い、これらは当該技術分野の技術内である。
当業者に公知の任意の好適な材料および／または方法を本発明の実行において利用することができるが、好ましい材料および／または方法が記載される。以下の記述および実施例において参照される材料、試薬および同種のものは、特に断りのない限り商業的供給源から得ることができる。
すべての以下の用語の定義は本出願の全部の内容へ適用される。単語「含むこと」は、他のエレメントまたは工程を除外せず、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は複数を除外しない。単工程は請求項中に列挙された複数の特徴の機能を満たすことができる。「本質的に」、「約」、「およそ」という用語および同種のものは、特に属性または値と関連して、正確な属性または正確な値もそれぞれ定義する。「約」という用語は、与えられた数の値または範囲の文脈において、与えられた値または範囲の２０％内、１０％内、または５％内にある値または範囲を指す。
本発明内で使用される時「植物」は、その生活環または発生の任意のステージでの任意の植物およびその子孫を指す。本明細書において使用される時「植物部分」または「植物の部分」は、植物体または培養における植物の任意の部分（すなわち植物器官、植物組織、植物細胞、胚、葉など）を指すように意図される。高圧力もしくは低圧力またはその組み合わせ下の植物イノキュレーションに関する本発明の特定の実施形態において、この用語は植物体における植物部分を指す。
本発明内で使用される時「タバコ植物」は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（またはＮ．ｔａｂａｃｕｍ）を含むがこれらに限定されないＮｉｃｏｔｉａｎａ属に属する種の植物を指す。本発明の特定の実施形態は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに特定せずに「タバコ植物」という用語を使用して本明細書において記載され、かかる記述はＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍを特に含むと解釈される。
本発明内で使用される時「植物細胞」または「タバコ植物細胞」は、植物、特にタバコ植物の構造的単位および生理的単位を指す。植物細胞は、細胞壁のないプロトプラスト、単離された単一細胞もしくは培養された細胞、またはより高度に組織化された単位（植物組織、植物器官または植物全体等であるがこれらに限定されない）の部分としての形態であり得る。
本発明内で使用される時「植物材料」は、植物（葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵子、接合子、種子、切り枝、分泌物、抽出物、細胞もしくは組織培養、または植物の他の部分もしくは産物を含む）から得られるかまたは得ることができる任意の固体、液体もしくは気体の組成物またはその組み合わせを指す。
本明細書において使用される時「植物組織」は、構造的単位または機能的単位へと組織化される植物細胞の群を意味する。植物体または培養における植物の任意の組織が含まれる。この用語は、植物全体、植物器官および種子を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される時「植物器官」は、植物の別個の部分または分化した部分（根、茎、葉、花芽または胚等）に関する。
「光学的密度」または「ＯＤ」という用語は、分光光度計において測定される、既定の波長（例えば６００ｎｍ＝ＯＤ600）での光学素子の吸収の光学的決定に関する。
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書においてヌクレオチドのポリマー（非修飾または修飾されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る）を指すとして使用される。したがって、ポリヌクレオチドは、限定されずにゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物を備えたハイブリッド分子であり得る。加えて、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を含む三本鎖領域からなることができる。ポリヌクレオチドは１つまたは複数の修飾塩基（ホスホチオエート等）を含むことができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。概して、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチドもしくは個々のヌクレオチドの単離またはクローン化された断片、または前述のものの組み合わせから組み立てることができる。
本明細書において使用される時「遺伝子配列」という用語は、タンパク質もしくはポリペプチド、特に異種タンパク質もしくはポリペプチドまたは生物学的に活性のあるＲＮＡをコードする核酸分子またはポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、異種タンパク質の断片のみをコードする部分的なコード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列は、コード配列と比較して上流または下流に位置する遺伝子発現に対して調節機能を有する配列に加えて遺伝子のイントロン配列も含むことができる。
「転写を調節するヌクレオチド配列」または「調節配列」という用語は、各々、結び付けられた（機能的に連結された）転写されるヌクレオチド配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。転写を調節するヌクレオチド配列は、転写されるヌクレオチド配列に関して様々な局在を有することができる。ヌクレオチド配列を調節する転写は、転写される配列（例えばコード配列）の上流（５’非コード配列）、その内、または下流（３’非コード配列）に位置することができる。転写を調節するヌクレオチド配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列およびポリアデニル化シグナル配列を含む群から選択することができる。それらは天然および合成の配列に加えて合成および天然の配列の組み合わせであり得る配列を含む。
「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写の開始を指令する遺伝子の５’末端のヌクレオチド配列を指す。概して、プロモーター配列はそれが作動可能に連結される遺伝子の発現を駆動するのに必要であるが必ずしも十分だとは限らない。発現可能な遺伝子コンストラクトのデザインにおいて、遺伝子は、プロモーターに十分接近して、そしてプロモーターに対して好適な方向で、遺伝子の発現がプロモーター配列によって制御されるように配置される。プロモーターは、遺伝子に対して上流で、そしてその天然の設定におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子の間の距離に近似する転写開始部位からの距離で優先的に配置される。当該技術分野において公知であるように、この距離の若干の変動はプロモーター機能の喪失なしに許容することができる。本明細書において使用される時「作動可能に連結された」という用語は、そのコーディング領域の転写がそのプロモーターによって制御および調節されるような方法で、プロモーターがコーディング領域に連結されることを意味する。プロモーターをコーディング領域へ作動可能に連結するための手段は当該技術分野において周知である。
本発明のコンテキストで使用される「遺伝子サイレンシングサプレッサー」という用語は、サイレンシングＲＮＡに結合することによって、特定のウイルスが転写後遺伝子サイレンシングを回避することを可能にする、ウイルスにコードされたタンパク質を指す。さらに、導入遺伝子は、植物細胞中に導入された場合、かかる遺伝子の低い発現または無発現が確立される結果として転写後遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。
本明細書において使用される時「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」または「ペプチド断片」という用語は交換可能であり、ペプチド結合によって連結される２つ以上のアミノ酸からなり、二次構造、三次構造または四次構造へと折り畳まれて特定の形態を達成することができる生体分子を意味すると定義される。
本明細書において使用される時「異種」という用語は、細胞または生物における特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチドのコンテキスト中で天然に存在しない生物学的配列を指す。本明細書において交換可能に使用される時「組換えタンパク質」または「異種タンパク質」または「異種ポリペプチド」という用語は、細胞によって産生されるが細胞中に天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドを指す。例えば、植物細胞または植物全体で産生された組換えまたは異種タンパク質は、哺乳類タンパク質またはヒトタンパク質であり得る。修飾した植物細胞において発現することができる異種タンパク質は、病原体のタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、原生動物タンパク質、線虫タンパク質を含むがこれらに限定されない抗原（限定されずにワクチンにおいて使用することができる）；酵素（限定されずにヒト疾患の治療においてまたは工業的用途のために使用することができる）を含むがこれらに限定されない酵素；サイトカイン；サイトカイン受容体の断片；血液タンパク質；ホルモン；ホルモン受容体、リポタンパク質の断片；抗体または抗体の断片であり得る。
「抗体」および「複数の抗体」という用語は、単クローン抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬＡ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、および上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性にある断片（すなわち抗原結合部位を含有する分子）を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
本発明のコンテキストにおいて「発現可能」という用語は、葉内に含まれる植物細胞中の遺伝子によってコードされたタンパク質またはポリペプチドの発現を指令する調節エレメントへの遺伝子の作動可能な連結を指す。
本明細書において交換可能に使用される時「壊死」および「壊死反応」という用語は、例えばアグロバクテリウム株による例えば植物組織のイノキュレーションによって引き起こされる植物、特にタバコ植物の組織中の過敏な反応に関する。注入された葉組織が崩壊し、細胞が死滅した場合、壊死が観察される（Ｋｌｅｍｅｎｔ ＆ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５（１９６７）１７−４４を参照されたい）。当業者は、葉組織の崩壊がなく広範囲な細胞死がない状態の黄ばみと、壊死を区別できる。
本明細書において使用される時「Ｔ−ＤＮＡ境界」は、アグロバクテリウム株（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株もしくはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株またはその修飾形態もしく突然変異形態等）の病原性遺伝子産物によって認識することができる約２５ヌクレオチド長の配列を含み、連結されるＤＮＡ配列の真核細胞（好ましくは植物細胞）への移行に十分であるＤＮＡ断片を指す。この定義は、野生型Ｔｉプラスミドからの天然に存在するＴ−ＤＮＡ境界すべてに加えて、その任意の機能的誘導体を含むがこれらに限定されず、化学的に合成されたＴ−ＤＮＡ境界も含む。一態様において、本発明に記載の発現コンストラクトのコード配列および発現制御配列は、２つのＴ−ＤＮＡ境界の間に位置する。
本明細書において使用される時「バキュームインフィルトレーション」という用語は、細胞間または間質空間の中へ病原菌（例えばアグロバクテリウム）の浸透を可能にする方法に関する。物理的に、真空は、植物の組織中の細胞の間の空気空間を減少させる陰性の大気圧を生成する。継続期間が長いほどおよび圧力が低いほど、植物の組織内の空気空間は少ない。後続する圧力の増加は、インフィルトレーションにおいて使用される細菌懸濁液が植物組織の中へ移転することを可能にし、アグロバクテリウム細胞が植物組織内部の植物細胞に接触することを引き起こす。
本明細書において使用される時「一過性発現のレベル」は、植物組織質量の１ｋｇあたり少なくとも約２５０マイクログラム、少なくとも約５００マイクログラム、少なくとも約７５０マイクログラム、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約１０００ｍｇ、少なくとも約１．５ｇ、少なくとも約２ｇ、少なくとも約２．５ｇ、少なくとも約５ｇ、少なくとも約７．５ｇ、少なくとも約１０ｇ、少なくとも約１５ｇ、または少なくとも約２０ｇを発現する能力を指す。
本明細書において使用される時「一過性」は、好適な植物組織からタンパク質の単離を可能にするのに十分に長い時間の期間を指す。好ましくは、タンパク質発現は、植物組織の中への発現コンストラクトの導入後に、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日内は好適に高いレベルである。一態様において、好適に高いレベルは、植物組織の中への発現コンストラクトの導入後に、３〜７日または５〜１０日内およびより好ましくは３〜５日または５〜７日内に得られる。
本発明は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株の前選択された組み合わせに基づく公知の一過性発現ベースの方法に複数の改善を提供し、それは大量の異種タンパク質の産生を経済的に短い期間で（トランスジェニック植物に必要とされるものと比較して）可能にする。
特に、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、
（ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株の組み合わせを提供する工程であって、その品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死を示す工程と；
（ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ600のアグロバクテリウム種の選択された株の懸濁物により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程であって、前記株が、植物において操作可能な調節配列の制御下にポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む工程と；
（ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
を含む方法を提供する。
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ品種
本発明は、一過性発現によって異種ポリペプチドを産生する方法において、宿主植物としての使用のための前選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種を提供する。異種ポリペプチドの収率を至適化するために前選択されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ株によりインフィルトレーションした宿主植物として、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のうちの１つを使用することが特に所望される。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種は、ＮＣＩＭＢにより寄託されるＮ．ｔａｂａｃｕｍアクセッションＰＭ０１６、ＰＭ０２１、ＰＭ９２、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２、ＰＭ２０４、ＰＭ２０５、ＰＭ２１５、ＰＭ２１６もしくはＰＭ２１７、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＳｃｏｔｌａｎｄもしくはＤＡＣ Ｍａｔａ Ｆｉｎａ、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ ９４４（ＭＮ ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ Ｍａｗａｒ、ＮＣ２９７、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｘａｎｔｈｉ ＮＮ、Ｋａｒａｂａｌｇａｒ、ＤｅｎｉｚｌｉおよびＰＯ１、または他のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種からなる群から選択することができ、その品種、育種系統または栽培品種は、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株、特に以下のパラグラフにおいて同定されるアグロバクテリウム株、しかしとりわけアグロバクテリウム株ＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死の壊死を示す。様々な実施形態において、５〜７週齢、好ましくは種子から６週間成長させた前選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種の植物を、本発明のインフィルトレーション工程において使用する。典型的には、かかるＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物は、４０〜６０ｍｍ、および好ましくは４３〜５５ｍｍにわたる高さである。
アグロバクテリウムの種および株
本発明は、発現可能な配列の一過性発現によって異種ポリペプチドを産生する方法における使用のために前選択されたアグロバクテリウム株を提供する。異種ポリペプチドの収率を至適化するために、前選択されたアグロバクテリウム株のうちの１つを使用して前選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種をインフィルトレーションすることは特に有利である。本発明の特定の実施形態において、本発明に記載の方法において使用することができるアグロバクテリウム種は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ、Ａｒｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓを含むが、これらに限定されず、しかし特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓである。一実施形態において、少なくとも１つのアグロバクテリウム株はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを含む。使用するアグロバクテリウム種は野生型（例えば病原性）または安全化株であり得る。アグロバクテリウムの好適な株は、野生型株（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等）または１つもしくは複数の遺伝子を突然変異させて形質転換効率を増加した株、例えば突然変異またはキメラのｖｉｒＡ遺伝子もしくはｖｉｒＧ遺伝子の存在に起因してｖｉｒ遺伝子発現および／またはその誘導が改変されたアグロバクテリウム株等（例えばＣｈｅｎ ａｎｄ Ｗｉｎａｎｓ，１９９１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１１３９−１１４４；ａｎｄ Ｓｃｈｅｅｒｅｎ−Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：６４１８−６２４６）、好ましくは多コピーのプラスミドと連結されたｐＴｉＢｏ５４２に由来するスーパーｖｉｒＧ遺伝子等の過剰のｖｉｒＧ遺伝子コピーを含むアグロバクテリウム株（例えば米国特許第６，４８３，０１３号における記載されるような）を含む。他の好適な株は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ５８Ｃ１（Ｖａｎ Ｌａｒｅｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５２：１６９−１７０（１９７４））、Ａ１３６（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １２３：２５５−２６４（１９７５））；ＬＢＡ４０１１（Ｋｌａｐｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １４１：１２８−１３６（１９８０））、ＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８０（１９８３））；ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃ．１６８：１２９１−１３０１（１９８６））；ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ．２：２０８−２１８（１９９３））；ＡＧＬ１（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：９６３−９６７（１９９１））；Ａ２８１（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、前出（１９８６））を含む、が、これらに限定されない。
本発明の様々な特異的な実施形態において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５を、本発明に記載の方法において使用することができる。
本発明の特定の実施形態において、アグロバクテリウム細胞の複数の懸濁物（各々は異なる遺伝子を発現する）を使用して、個別のタンパク質またはヘテロ多量体タンパク質を産生するかまたは対象となる異種ポリペプチドの発現レベルを促進することができる。かかる例において、アグロバクテリウム細胞の異なる懸濁物中のアグロバクテリウム細胞は、同じ前選択された株または異なる前選択された株であり得ることが意図される。あるいはまたは加えて、単一のアグロバクテリウム株は、異なる遺伝子、特に異種遺伝子を含む複数の配列を含むことができる。異なる遺伝子は、単一の核酸分子（例えば単一のベクター）内に含まれるかまたは異なるベクター中で提供することができる。宿主植物において発現することができる第２の遺伝子の非限定例は、ウイルス起源のサイレンシングサプレッサーをコードする遺伝子である。
壊死試験
本発明は、宿主植物の細胞の中へ異種ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を導入する手段として宿主植物のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株を前選択するための壊死試験を提供し、選択されたかかる組み合わせは異種ポリペプチドの有意量を効率的に産生する。以下のことにより束縛されるものではないが、本発明の壊死試験は、アグロバクテリウム株の細胞による感染に感受性があり、しかもなおアグロバクテリウム細胞による組織の破壊に耐性があり、それによって５〜１０日の範囲の十分な期間の間生き残って、感染した植物細胞において異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする宿主植物の同定を可能にする。かなりの壊死をもたらすＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株の組み合わせは、感染した植物細胞が早期に急速に死滅し、産生された異種タンパク質のいずれかが死細胞中で分解されるかまたは収穫の前に失われるので、異種ポリペプチドの産生が少なく、蓄積が少ないことが予想される。
壊死試験は、シリンジにより０．３２のＯＤ600の細胞密度のアグロバクテリウム細胞の懸濁物の注射によって６週齢のＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種の葉をインフィルトレーションすることを含む。典型的には、インフィルトレーション直後に、細菌懸濁液により充満させた、注射部位付近の葉脈によって範囲が定められた葉のセクターを観察することが可能である。セクターの周囲を後のスコアリングのためにマークする。インフィルトレーションした葉を持つ植物全体を正常な増殖条件下でインキュベーションし、インフィルトレーションの５日後に葉を検査する。壊死はインフィルトレーションしたセクター内の植物組織の崩壊および広範囲な細胞死によって特徴づけられ、当該技術分野において周知の方法によってスコアリングすることができる（Ｋｌｅｍｅｎｔ ＆ Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５（１９６７）１７−４４）。インフィルトレーションした葉が、２０％未満、１０％未満の壊死、５％未満の壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示すならば、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株は、本発明のＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種およびアグロバクテリウム株の前選択された組み合わせである。壊死のパーセンテージ（％壊死）を定量化する方法は当該技術分野において周知であり、例えば壊死した１つまたは複数の葉の面積およびアグロバクテリウム細胞によってインフィルトレーションした１つまたは複数の葉の全面積の測定によって決定することができる。
バイナリーベクター
任意のバイナリーベクターを本発明の方法内で使用することができる。好ましい実施形態において、最小サイズにしたバイナリーベクター（最小のバイナリーベクターとも称される）を、本発明の方法において使用することができる。２０１１年１月１７日に出願された同時係属出願番号ＥＰ１１１５１１８７．９（その開示はその全体が本明細書に援用される）中でこれらの最小サイズにしたバイナリーベクターを開示する。それらは、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチド（それはＴ−ＤＮＡ領域内に配置される）をコードするコード配列のインフィルトレーションしたタバコ植物における一過性発現を駆動するように特異的にデザインされる。大部分の実施形態において、本発明の方法において使用することができるバイナリーベクターは、ウイルスタンパク質またはウイルス機能（インフィルトレーションした植物において配列の全身的な蔓延または細胞間移動を促進する）をコードしない。ベクターの詳細を以下のセクション中で記述する。
したがって、本出願は、本発明に記載の方法におけるアグロバクテリウム媒介性形質転換のためのベクターであって、植物細胞における核酸の発現のために、特に植物細胞、植物組織または植物細胞の特異的なコンパートメントにおけるタンパク質またはポリペプチドの発現のために、植物細胞または植物細胞の部分における１つまたは複数の代謝物質または他の化合物の産生のために、核酸の発現の調節のために、植物細胞における調節機能を持つ配列の同定のために、１つもしくは複数の外来性核酸または内在性核酸のいずれかの遺伝子および核酸の機能の同定のために特に有利なベクターを提供する。
本明細書において提供される最小サイズにしたバイナリーベクターは特に有利であり、それはそれらが最小のサイズであり、細菌細胞中で高コピー数として安定的に維持され、複数の目的のために高度にフレキシブルで有用であり、一過性発現に加えて安定的トランスジェニック植物または植物細胞における異種配列の発現のために使用することができるからである。
本発明の方法内で使用することができる最小サイズにしたバイナリーベクターは、以下の核酸エレメント
ａ）大腸菌およびアグロバクテリウム種において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸エレメントと；
ｂ）大腸菌において機能的な第１の複製起点のヌクレオチド配列を含む第２の核酸エレメントと；
ｃ）複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第３の核酸エレメントと；
ｄ）第１の複製起点とは異なり、アグロバクテリウムにおいて機能的である第２の複製起点のヌクレオチド配列を含む第４の核酸エレメントと；
ｅ）腫瘍誘導Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓプラスミドまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの毛根誘発プラスミドのＴ−ＤＮＡ右境界配列およびＴ−ＤＮＡ左境界配列を含むＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を含む第５の核酸エレメントと
を含むか、それらからなるか、または本質的になることができ、上記の核酸エレメントが環状ポリヌクレオチド分子上で提供され、複製、維持または核酸移行において機能を有していないギャップヌクレオチド配列によって分離され、前記ギャップヌクレオチド配列が、全ベクターサイズの２０％、２５％ ３０％、３５％、４０％、４５％未満を占める。好ましくは、ギャップヌクレオチド配列は、全ベクターサイズの２０％未満を占める。
本発明の特定の実施形態において、最小サイズにしたバイナリーベクターは本発明に記載の方法において使用することができ、そのベクターでは、
（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ左境界配列および選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列（ａ）は、３００ｂｐ以下の第１のギャップヌクレオチド配列によって分離され；
（ｉｉ）選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列（ａ）および第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）は、２００ｂｐ以下の第２のギャップヌクレオチド配列によって分離され；
（ｉｉｉ）第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）および複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ｃ）は、２００ｂｐ以下の第３のギャップヌクレオチド配列によって分離され；
（ｉｖ）複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ｃ）および第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）は、５００ｂｐ以下の第４のギャップヌクレオチド配列によって分離され；
（ｖ）第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）およびＴ−ＤＮＡ右境界配列は、１５０ｂｐ以下の第５のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の特定の実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターは、５９００ｂｐ未満、５５００ｂｐ未満、５２００ｂｐ未満、または５１００ｂｐ未満の全サイズ、しかしとりわけ５１５０ｂｐの全サイズを有する。
本発明の他の特異的な実施形態において、本発明に記載され前述のパラグラフにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ａ）〜（ｅ）は、本発明の第１の実施形態において設定された順序（すなわち（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ））で、ベクター分子上に互いに対して直線的にアレンジされる。
当業者は、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される核酸エレメントａ）〜ｅ）の異なる順序を備えた骨格を含む、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターを容易に生成することができるだろう。
したがって、本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）は、Ｔ−ＤＮＡ左境界配列に近位に位置する。特定の実施形態において、大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）ならびにＴ−ＤＮＡ左境界配列は、３００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）は、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列に近位に位置する。特定の実施形態において、大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）ならびにＴ−ＤＮＡ右境界配列は、１５０ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点のヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｂ）および第２の複製起点は、（ｄ）Ｔ−ＤＮＡ左境界配列およびＴ−ＤＮＡ右境界配列に近位にそれぞれ位置する。
本発明の特定の実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子が提供され、そのベクターでは、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点は（ｄ）互いに直に近接せず、ベクターの少なくとも１つの他の機能要素は第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）を分離する。
本発明の特定の実施形態において、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点は、（ｄ）Ｃｏｌ Ｅ１ ｏｒｉおよびＲＫ２ ｏｒｉＶからなる群からそれぞれ選択される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）を含む核酸エレメントはＴ−ＤＮＡ左境界配列に近位に位置し、第２の複製起点のヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｄ）はＴ−ＤＮＡ右境界配列に近位に位置する。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）を含む核酸エレメントはＴ−ＤＮＡ右境界配列に近位に位置し、第２の複製起点のヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｄ）はＴ−ＤＮＡ左境界配列に近位に位置する。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子が提供され、そのベクターでは、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点は（ｄ）互いに直に近接せず、ベクターの少なくとも１つの他の機能要素は第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）を分離する。
別の実施形態において、第１の複製起点（ｂ）または第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントおよびＴ−ＤＮＡ左境界配列は、３００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。さらに他の実施形態において、第１の複製起点（ｂ）または第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントおよびＴ−ＤＮＡ右境界配列は、１５０ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントは互いに近接し、Ｔ−ＤＮＡ左境界配列に対して近位に位置する。特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）または第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）を含む核酸エレメントおよびＴ−ＤＮＡ左境界配列は、３００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離され、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントは、２００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントは互いに近接し、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列に対して近位に位置する。本発明の特定の実施形態において、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）または第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）を含む核酸エレメントおよびＴ−ＤＮＡ右境界配列は、１５０ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離され、第１の複製起点（ｂ）および第２の複製起点（ｄ）のヌクレオチド配列を含む核酸エレメントは、５００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｃ）は、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）および第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）を含む核酸エレメントが隣接する。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）は、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）および第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）を含む核酸エレメントが隣接する。特定の実施形態において、第１の複製起点のヌクレオチド配列（ｂ）および第２の複製起点のヌクレオチド配列（ｄ）を含む隣接する核酸エレメントはそれぞれ、２００ｂｐおよび５００ｂｐ以下のギャップヌクレオチド配列によって、複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｃ）または大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ａ）から分離される。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ａ）は大腸菌およびアグロバクテリウムの細胞において機能的な選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。選択可能なマーカーは、抗生物質耐性、特にアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびブラストサイジンＳからなる群から選択される抗生物質に対する耐性であり得る。
本発明の特定の実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ｂ）は、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣｏｌＥ１非適合性群に属する複製起点；ｐＭＢ１複製起点、および非適合性群ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＩＪ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、ＴまたはＷのいずれか１つに属する複製起点からなる群から選択される大腸菌において機能的な第１の複製起点のヌクレオチド配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ｂ）は、ＣｏｌＥ１複製起点の核酸を含む。ＣｏｌＥ１複製起点は、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得ることができる。
本発明の他の特異的な実施形態において、本発明は、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターを提供し、そのベクターでは、核酸エレメント（ｂ）は、ｐＭＢ１複製起点の核酸を含む。ｐＭＢ１複製起点は、２つのＲＮＡ（ＲＮＡＩおよびＲＮＡＩＩ）およびＲｏｍまたはＲｏｐとして公知の１つのタンパク質をコードする。例えば、ｐＭＢ１複製起点は、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）またはｐＵＣベクター（ｐＵＣ８（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０８９５９．１）等であるがこれらに限定されない）のものでありえ、高いコピー数をもたらす。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ｃ）は、ＲＫ２ ＴｒｆＡ複製開始タンパク質である複製開始タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、核酸エレメント（ｄ）は、第２の複製起点のヌクレオチド配列を含み、それは第１の複製起点とは異なり、アグロバクテリウムにおいて機能的であり、最小のｏｒｉＶ複製起点、ＲＫ２ ｏｒｉＶ、および非適合性群ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＩＪ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、ＴまたはＷのいずれか１つに属する複製起点からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子が提供され、そのベクターでは、第２の核酸エレメントｂ）または第４の核酸エレメントｄ）は複製起点（ｏｒｉＶ）であり、第３の核酸エレメントｃ）は広範囲の宿主範囲プラスミドＲＫ２のＴｒｆＡ複製開始タンパク質（大腸菌およびアグロバクテリウム種の両方において機能的）である（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ（１９８５）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：４４６−４５５）。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子が提供され、そのベクターでは、第５の核酸エレメントｅ）は２つのＴ−ＤＮＡ境界配列（すなわちＴ−ＤＮＡ左境界配列、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列）を含む。
本発明の特定の実施形態において、核酸エレメントｅ）は、アグロバクテリウム種のノパリンファミリーの株（ノパリン、ノパリン酸、ロイシノピン、グルタミノピンまたはスクシナモピンを触媒できる）のＴ−ＤＮＡ境界配列を含む。
本発明の代替の実施形態において、核酸エレメントｅ）は、オクトピンファミリーのアグロバクテリウム株（オクトピン、オクトピン酸、リソピンまたはヒストピンを触媒できる）のＴ−ＤＮＡ境界配列を含む。本発明の他の特定の実施形態において、核酸エレメントｅ）は、マンノピン、マンノピン酸、アグロピンまたはアグロピン酸を触媒するマンニチルファミリーのアグロバクテリウム株のＴ−ＤＮＡ境界配列を含む。
本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義される方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターが提供され、そのベクターでは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ腫瘍誘導プラスミドまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ毛根誘発プラスミドのＴ−ＤＮＡ右境界配列およびＴ−ＤＮＡ左境界配列を含むＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を含む核酸エレメント（ｅ）は、少なくとも１つのユニークな制限酵素切断部位、特に少なくとも２、３、４または５のユニークな制限酵素切断部位を含有する。
制限酵素切断部位は、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｌＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｏＩ、ＡｐａＢＩ、ＡｐａＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｆｒＢＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｌＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＥｃｏＩＣＲＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＲＩ、ＦａｌＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＡＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、Ｍ．ＡｃｌＩ、Ｍ．ＡｆｌＩＩＩ、Ｍ．ＡｌｏＩ、Ｍ．ＡｐａＩ、Ｍ．ＢａｅＩ、Ｍ．ＢａｎＩＩ、Ｍ．ＢｂｖＣＩＡ、Ｍ．ＢｂｖＣＩＢ、Ｍ．ＢｎａＩ、Ｍ．ＢｓａＡＩ、Ｍ．ＢｓｔＩ、Ｍ．ＢｓｔＶＩ、Ｍ．ＤｒａＩＩＩ、Ｍ．ＥｃｏＡＩ、Ｍ．ＥｃｏＫＩ、Ｍ．ＥｃｏＲ１２４Ｉ、Ｍ．ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍ．ＨｐａＩ、Ｍ．ＫｐｎＢＩ、Ｍ．ＫｐｎＩ、Ｍ．ＭｕｎＩ、Ｍ．ＰａｅＲ７Ｉ、Ｍ．ＰｈｉＢｓｓＨＩＩ、Ｍ．ＰｓｈＡＩ、Ｍ．Ｒｒｈ４２７３Ｉ、Ｍ．ＳａｃＩ、Ｍ．ＳａｌＩ、Ｍ．Ｓａｕ３２３９Ｉ、Ｍ．ＳｎａＢＩ、Ｍ．Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｍ．ＶｓｐＩ、Ｍ．ＸｂａＩ、Ｍ．ＸｈｏＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｈｅＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ１０Ｉ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｒＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳａｎＤＩ、ＳａｐＩ、ＳｃｉＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍｎＩおよびＺｒａＩからなる群から選択される切断部位であり得る。かかる切断部位は、適合性のある５’末端、適合性のある３’末端または１もしくは２の平滑断端を含む任意のＤＮＡ（発現カセット等）の挿入物に適応することができる。
一実施形態において、前記発現カセットは、植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属の植物において機能的な調節エレメントおよび対象となるヌクレオチド配列を含む。
当該技術分野における当業者は、ベクターの特性を改変せずに、前記認識部位を含む核酸の１つまたは複数の塩基対を突然変異または改変することによって、１つまたは複数箇所で切断するエンドヌクレアーゼ認識部位を容易に除去することができる。コード配列、調節配列またはベクターに必須の機能を備えた他の配列の外部の任意のかかる制限酵素認識部位を、ベクターの特性および機能に影響を与えずに改変できることが認識されるだろう。同様に、サイレント突然変異の導入によって、前記タンパク質の機能を改変せずに、タンパク質をコードする断片内に含まれる配列を突然変異できることが認識されるだろう。当業者はクローニングの目的のためにユニークな制限部位もしくは任意の制限部位または部位の組み合わせを必要としないだろうことが認識されるが、それは、植物細胞における発現のための核酸配列または他の核酸配列を、デザインして化学的に合成することによって、ベクターのＴ−ＤＮＡ領域の中へまたは他のところへ、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子の核酸エレメントａ）〜ｅ）と一緒に、制限酵素の使用を必要とせずに直接取り込むことができるからである。
本発明は、本発明に記載の方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターをさらに提供し、そのベクターでは、第５の核酸エレメント（ｅ）は、形質転換された植物または植物細胞において機能的な調節エレメントであり、かかるヌクレオチド配列がベクター分子中に挿入される場合に対象となる産物をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたものを、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列とＴ−ＤＮＡ左境界配列との間にさらに含む。かかるベクター分子は、対象となるヌクレオチド配列の挿入のために容易に使用することができる。１つまたは複数のユニークな制限切断部位は、調節エレメントとＴ−ＤＮＡ境界配列のうちの１つとの間に存在して、対象となるヌクレオチド配列の挿入の促進することができる。したがって、特定の実施形態において、本発明は、本発明に記載の方法における使用のための最小サイズにしたバイナリーベクターをさらに提供し、そのベクターでは、第５の核酸エレメント（ｅ）は、植物細胞において機能的であり、対象となるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される調節エレメントを、Ｔ−ＤＮＡ権利およびＴ−ＤＮＡ左境界配列との間にさらに含む。
本発明の様々な実施形態において、Ｔ−ＤＮＡ領域中に存在する調節エレメントは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、修飾したカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、二重カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、最小の３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、ササゲモザイクウイルスプロモーター、ＨＴ−ＣＰＭＶプロモーター、タバココパリルシンターゼＣＰＳ２ｐプロモーター、ジヒドリニン（ｄｉｈｙｄｒｉｎｉｎ）プロモーター、プラストシアニンプロモーター、３５Ｓ／ＨＴ−ＣＰＭＶプロモーター、およびカリモウイルスに由来する他の多くのプロモーター（オシロイバナモザイクウイルス（ＭＭＶ）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）、ピーナッツ退緑条斑ウイルス（ＰＣＬＳＶ）、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ×２）、二重ＭＭＶプロモーター（ＭＭＶ×２）、および二重ＦＭＶプロモーター（ＦＭＶ×２）等であるがこれらに限定されない）からなる群から選択されるプロモーターである。本発明の特定の実施形態において、植物調節エレメントの制御下のヌクレオチド配列は、植物細胞において機能的な選択可能なマーカー、特に抗生物質耐性、除草剤耐性、および視覚的に識別可能な特徴を産生するリポータータンパク質またはポリペプチドからなる群から選択された選択可能なマーカーをコードする。
本発明の方法内で使用されるバイナリーベクター、特に本明細書において先に記述される最小サイズにしたバイナリーベクター中に存在する植物で選択可能なマーカーは、アミノグリコシド系抗生物質（カナマイシンまたはネオマイシン等）、除草剤（ホスフィノトリシンまたはグルホシネート等）に対する耐性を提供するマーカーであり得る。代替のものにおいて、選択可能なマーカーは、スクリーニング可能なマーカー（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質）であり得る。
しかしながら、一過性発現の目的のために、植物における使用のための選択可能なマーカーの有用性は最小であり、ベクターから省略することができる。これはベクターのサイズのさらに有意な低下を可能にする。例えば、実施例セクション１．３中で示されるように、ｐＰＭＰ１は、カナマイシン耐性をコードするｐＢＩＮ６１由来ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）をｐＣ１００から欠失させることによって構築された。したがって、ｐＰＭＰ１は、植物で選択可能なマーカーを欠く本発明のベクターの一例である。
したがって、本発明の一実施形態において、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子が提供され、そのベクターでは、植物で選択可能なマーカー遺伝子は存在しないかまたは省略される。
実施例２中で例示されるように、本発明は、細菌細胞における複製および安定的維持に影響を与えずに、大腸菌およびアグロバクテリウムの種において高いコピーのプラスミドとして維持することができる最小の骨格およびＴ−ＤＮＡ領域を含む５１５０塩基対未満の最小のバイナリーベクターをさらに提供し、それは本発明に記載の方法内で使用することができる。最小のｐＰＭＰ１バイナリーベクターの配列は配列番号：１において提供される。
したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号：１において図示されるポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のポリヌクレオチド配列を有し、核酸エレメント（ａ）〜（ｅ）が、本発明に記載の方法において、配列番号：１において提供されたカウンターパートエレメントと同じ機能性を示す、ベクター分子の使用を意図する。
本発明のベクター、および前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義され、かかるベクター内に含まれる核酸エレメントａ）〜ｅ）は、環状ＤＮＡプラスミド上の共有結合で連結された天然に存在する核酸配列、化学的に合成された核酸配列、またはその混合物であり得る。化学的に合成された場合、核酸エレメントａ）〜ｅ）は、細菌または対象となる他の生物の天然に存在する核酸およびタンパク質またはポリペプチドの配列に基づくことができ、天然に存在する配列と同じ機能性を示す。
特定の実施形態において、ベクター分子は配列番号：１において図示されるようなポリヌクレオチド配列を有する。
ｐＰＭＰ１およびその誘導体の使用は、実施例１０において例示されるようなＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの形質転換された植物細胞において、核酸、タンパク質またはペプチドの良好な安定的発現に加えて一過性発現をもたらした。さらに、ｐＰＭＰ１およびその誘導体（植物で選択可能な最小のバイナリーｐＣ１００ベクター等）による形質転換は、好ましくは植物核ゲノムにおいて単一コピー数またはそうでなければ低コピー数が組み込みまれること、およびベクター骨格配列の組み込みがほとんどまたは全くないという結果をもたらした。
プロモーター／エンハンサー／ターミネーター
植物細胞において機能的で、タバコ植物において対象となる遺伝子の発現を駆動および／または制御するために本発明の方法内で使用できる植物発現ベクターは、所望されるならば、プロモーター調節領域（例えば、誘導可能もしく構成的な発現、環境的もしくは発生的に調節される発現、または細胞特異的もしくは組織特異的な発現を与えるもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルも含有することができる。本発明の方法内で使用される調節エレメントは、発現カセットの一部であり、対象となるタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ベクター分子、特にバイナリーベクター、しかしとりわけ本明細書において記述される前述の実施形態のいずれか１つに記載の最小サイズにしたバイナリーベクター中に存在することができる。
本発明の様々な実施形態において、調節エレメントは、バイナリーベクター、特に本明細書において記述される前述の実施形態のいずれか１つに記載の最小サイズにしたバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域中に存在する。前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法内の使用のための好ましいプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、修飾したカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、二重カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、最小の３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、ササゲモザイクウイルスプロモーター、ＨＴ−ＣＰＭＶプロモーター、タバココパリルシンターゼＣＰＳ２ｐプロモーター、ジヒドリニン（ｄｉｈｙｄｒｉｎｉｎ）プロモーター、プラストシアニンプロモーター、３５Ｓ／ＨＴ−ＣＰＭＶプロモーター、およびＣａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するＤＮＡウイルスに由来する他の多くのプロモーター（全長転写（ＦＬｔ）プロモーターまたはサブゲノム転写プロモーターのいずれか）である。かかるＤＮＡウイルスの例は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、オシロイバナモザイクウイルス（ＭＭＶ）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）、ピーナッツ退緑条斑ウイルス（ＰＣＬＳＶ）を含み、これらに限定されない。
前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法における使用のために特に好ましいものは、ＦＭＶプロモーター（ＷＯ１９９８０００５３４およびＵＳ５９９４５２１中で記述されたもの等）、ＭＭＶプロモーター（ＵＳ６４２０５４７およびＵＳ６９３０１８２中で記述されたもの等）、およびＰＣＩＳＶプロモーター（ＷＯ１９９８００５１９８、ＵＳ５８５００１９およびＥＰ９２９２１１での記述されたもの等）を含むがこれらに限定されない、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するＤＮＡウイルスの全長転写（ＦＬｔ）プロモーターである。
多くのかかるプロモーターは、タンデムでそのエンハンサー配列の多コピー（例えば２コピー）を連結すること（二重ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（３５Ｓ×２）、二重ＭＭＶプロモーター（ＭＭＶ×２）、二重ＦＭＶプロモーター（ＦＭＶ×２）等であるがこれらに限定されない）によって修飾してプロモーター活性を促進することができる。引用された参照中で既知であるかまたは記述されたこれらのプロモーターの機能的断片は、本発明のベクターにおいて使用することができる。かかるプロモーターの具体的な例が作成され、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位が末端で含まれて本発明の最小のベクターの中へのクローニングを促進する。これらの配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、操作可能に連結されたヌクレオチド配列の植物における発現を可能にすることにおいて機能的なヌクレオチド配列も、本発明のベクターにおいて使用することができる。
本発明の特定の実施形態において、１つまたは複数の以下のプロモーター配列は、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述されるベクター内で使用することができる。
本発明の特定の実施形態において、１つまたは複数の以下のプロモーター配列は、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述されるベクター内で使用することができる。
＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の単一促進されたｐＭＭＶ
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＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の二重の促進されたｐＭＭＶ
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＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の単一の促進されたｐＦＭＶ
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＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の二重の促進されたｐＦＭＶ
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＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の単一の促進されたｐＰＣＩＳＶ
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＞ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の二重の促進されたｐＰＣＩＳＶ
gaattcgtcaacgagatcttgagccaatcaaagaggagtgatgtagacctaaagcaataatggagccatgacgtaagggcttacgcccatacgaaataattaaaggctgatgtgacctgtcggtctctcagaacctttactttttatgtttggcgtgtatttttaaatttccacggcaatgacgatgtgacccaacgagatcttgagccaatcaaagaggagtgatgtagacctaaagcaataatggagccatgacgtaagggcttacgcccatacgaaataattaaaggctgatgtgacctgtcggtctctcagaacctttactttttatatttggcgtgtatttttaaatttccacggcaatgacgatgtgacctgtgcatccgctttgcctataaataagttttagtttgtattgatcgacacggtcgagaagacacggccataagctt（配列番号：１４）
２シリーズのｐＣ１００由来ベクターを、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ科からのこれらのＤＮＡウイルスのうちの１つからのＦＬｔプロモーターをＴ−ＤＮＡ領域の中へ挿入することによって作成した。図７は、１シリーズの９つのベクター（すなわちｐＣ１４１、ｐＣ１９０、ｐＣ１９１、ｐＣ１９２、ｐＣ１９３、ｐＣ２４１、ｐＣ２４２、ｐＣ２４３、ｐＣ２６５）のＴ−ＤＮＡ領域を示す。これらのベクター中のＦＬｔプロモーターの下流に存在する複数のクローニング部位は、植物細胞、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属、特にＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍの植物の植物細胞における発現のための対象となるヌクレオチド配列の挿入を可能にする。第２のシリーズのより小さなベクターは、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩにより第１のシリーズにおけるベクターの各々を消化しプラスミドを再環状化することによる植物で選択可能なマーカー（ｎｐｔＩＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットの除去によって作成した。これらのベクター（すなわちｐＣ２７７、ｐＣ２７８、ｐＣ２７９、ｐＣ２８０、ｐＣ２８１、ｐＣ２８２）は、植物細胞または植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの植物における対象となるポリペプチドの一過性発現のために特に好適である。したがって、前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述される本発明のバイナリーベクターは、そのＴ−ＤＮＡ領域中に、ＭＭＶ、ＦＭＶまたはＰＣＩＳＶからのＤＮＡウイルスのＦＬｔプロモーターの１つまたは２つ以上のコピー（例えば配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４）、および任意で植物で選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含ことができる。
本発明の一実施形態において、異種ポリペプチドの遺伝子配列の発現のためのベクター、特にバイナリーベクター、しかしとりわけ前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述される最小サイズにしたバイナリーベクターは、１つまたは複数の調節配列、この実例において、ササゲモザイクウイルス（ＨＴ−ＣＰＭＶ；ＷＯ０７／１３５４８０、その全体は参照として本明細書に援用される）に由来する非翻訳領域を含むことができる。好ましくは、バイナリーベクターは最小の３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターも含む。ＨＴ−ＣＰＭＶシステムは、最小のプロモーター、過剰翻訳可能な（ＨＴ）エレメントを含有する修飾した５’−ＵＴＲ、および植物における組換えタンパク質の翻訳促進および高蓄積を可能にするＣＰＭＶ ＲＮＡ−２からの３’−ＵＴＲに基づく。
最小の３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーター（配列番号：２）
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５’ＵＴＲ ＨＴ−ＣＰＭＶ（配列番号：３）
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３’ＵＴＲ ＨＴ−ＣＰＭＶ（配列番号：４）
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プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは多くの場合エンハンサーと称される。したがって、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの生来のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を促進するために挿入された異種エレメントであり得る。それは両方の向き（正常または反転）で作動することができ、プロモーターから上流または下流のいずれかに移動したときでさえ機能することができる。エンハンサーおよび他の上流プロモーターエレメントの両方は、それらの効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質を結合する。プロモーターはその全部が生来の遺伝子に由来し得るか、または異なるエレメントから構成され得るか、天然において見出された異なるプロモーターに由来するか、もしくは合成ＤＮＡセグメントからなり得る。プロモーターは、生理条件または発生条件に応答して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列も含有することができる。
エンハンサーの例は、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、オクトピンシンターゼ遺伝子（Ｅｌｌｉｓ ｅｌ ａｌ．，１９８７）、コメアクチンＩ遺伝子、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｃａｌｌｉｓ １９８７）、トウモロコシシュランケンＩ遺伝子（Ｖａｓｉｌ １９８９）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）オメガ翻訳エンハンサー（Ｇａｌｌｉｅ １９８９）ならびに非植物真核生物からのプロモーター（例えば酵母；Ｍａ １９８８）からのエレメントを含む。本発明に記載の使用のためのベクターを、かかるエンハンサーエレメントを含むように構築することができる。エンハンサーエレメントの使用および特にエレメントの多コピーは、植物形質転換のコンテキストにおいて適用された場合、隣接するプロモーターからの転写のレベルを増加するように作用できる。
終結領域は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、栄養体貯蔵タンパク質（ｖｓｐ）またはプロテイナーゼ阻害剤２（ｐｉｎ２）の終結領域からなる群から選択することができる。
シグナルペプチド
植物発現ベクター、特にバイナリーベクター、およびとりわけ本明細書において記述される前述の実施形態のいずれか１つに記載の最小サイズにしたバイナリーベクター（植物細胞において機能的であり本発明の方法内で使用することができる）は、新しく発現されたタンパク質を細胞レベル以下の場所へ標的化するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。かかるベクター分子内で使用できるシグナルペプチドは、例えば液胞標的化配列、葉緑体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、植物細胞においてタンパク質顆粒の形成を誘導する配列、または植物細胞において油体の形成を誘導する配列からなる群から選択されるものである。
本発明の一実施形態において、標的化配列は、タンパク質の小胞体へのインポートのためのシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、タンパク質の非常にＮ末に位置し、小胞体膜を横切る移動の間に翻訳と同時に切断される移行ペプチドである。本発明に記載のベクター分子において使用することができるシグナルペプチドは、ＩｇＧの軽鎖または重鎖配列のＮ末で天然に存在するもの、またはＥＰ２００２８０７５６６およびＷＯ２００７ＥＰ１６０６中で記述されるパタチンシグナルペプチド、特に実施例９において記述されるｐＣ１４８のパタチンシグナルペプチドであり、それらに限定されない。パタチンシグナルペプチド配列をコードできる任意のヌクレオチド配列を使用することができる。
一実施形態において、ＭＡＴＴＫＳＦＬＩＬＦＦＭＩＬＡＴＴＳＳＴＣＡ（配列番号：１５）からなるパタチンシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明に記載され前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述されるベクター内で使用することができる。
さらにシグナルペプチドは例えばＳｉｇｎａｌＰ予測ツールによって予測することができる（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２：９５３−９７１）。
本発明の別の実施形態において、標的化配列は小胞体保持ペプチドであり得る。小胞体保持標的化配列はタンパク質の非常にＣ末で起こり、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬまたはＤＤＥＬ等の４つのアミノ酸配列（配列中、Ｋはリジンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｅはグルタミン酸であり、Ｌはロイシンであり、Ｈはヒスチジンである）であり得る。
本発明のさらに他の実施形態において、標的化配列は、タンパク質へ融合した場合に小胞体における非分泌性貯蔵オルガネラの形成をもたらす配列（ＷＯ０７／０９６１９２、ＷＯ０６／０５６４８３およびＷＯ０６／０５６４８４中で記述されたもの等であるがこれらに限定されず、それらの全体は参照として本明細書に援用される）であり得る。本発明の特定の実施形態において、標的化配列は、液胞標的化配列、葉緑体標的化配列、ミトコンドリア標的化配列、またはその添加がそれへ融合したタンパク質の植物もしくは植物細胞内の特異的オルガネラへの特異的標的化をもたらす他の配列であり得る。
一実施形態において、本発明に記載され、前述の実施形態のいずれか１つにおいて定義されるベクター分子は、Ｔ−ＤＮＡ領域内に部位特異的組換えのための部位特異的組換え部位をさらに含む。一実施形態において、部位特異的組換え部位は植物調節エレメントの下流に位置する。別の実施形態において、部位特異的組換え部位は植物調節エレメントの上流に位置する。本発明の特定の実施形態において、組換え部位はＬｏｘＰ部位であり、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ部位特異的組換えシステムの一部である。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ部位特異的組換えシステムは、Ｃｒｅのための特異的な結合部位を含有する特異的な部位（ＬｏｘＰ）間の組換えを触媒する環状リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）を使用する。
他の特異的な実施形態において、組換え部位はＧａｔｅｗａｙデスティネーション部位である。例えば、対象となる核酸は、商業的に入手可能な「エントリーベクター」の中へ最初にクローン化し、続いて「デスティネーションベクター」の中への組換えられる。デスティネーションベクターは、与えられた核酸配列のプロモーター活性または配列の数の分析のために、機能の分析のために、タンパク質局在化のために、タンパク質−タンパク質相互作用のために、与えられた遺伝子のサイレンシングのために、または親和性精製実験のために使用することができる。ＧａｔｅｗａｙクローニングテクノロジーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．、ＵＳＡから購入することができる。
遺伝子サイレンシングサプレッサー
様々な実施形態において、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法における使用のために選択されたタバコ品種は、遺伝子サイレンシングサプレッサー、特にウイルス起源の遺伝子サイレンシングサプレッサー、および特にキュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）、ハーフェル川ウイルス（ＨａＲＶ）、西洋ナシ潜在ウイルス（ＰｅＬＶ）、トルコギキョウ壊死ウイルス、ブドウアルジェリア潜在ウイルス、テンジクアオイ壊死スポットウイルス（ＰｅＮＳＶ）、シンビジウム・リングスポットウイルス（ＣｙｍＲＳＶ）、アーティチョーク斑紋クリンクルウイルス（ＡＭＣＶ）、カーネーションイタリアリングスポットウイルス（ＣＩＲＶ）、レタス壊死スタントウイルス、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）またはトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）からなる群から選択されるポチウイルスまたはウイルスの遺伝子サイレンシングサプレッサーを含むことができる。
別の実施形態において、前記遺伝子サイレンシングサプレッサーは、キュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）のｐ１９タンパク質、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）のｐ１タンパク質、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）のｐ２５タンパク質、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパク質およびタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）からなる群から選択される。
ＨｃＰｒｏを含む遺伝子サイレンシングサプレッサーの詳述は、ＷＯ９８／４４０９７、ＷＯ０１／３８５１２およびＷＯ０１／３４８２２（それらの全体は参照として本明細書に援用される）中で提供される。配列番号：５において記載されるように、ＨｃＰｒｏをコードするヌクレオチド配列の例は本明細書において提供され、Ｐ１−ＨｃＰｒｏ−Ｐ３とも称される。この配列は当該技術分野において公知のバイナリーベクターまたは本発明の最小サイズにしたバイナリーベクター中に挿入することができる。したがって、非限定例において、発現可能なＨｃＰｒｏ遺伝子配列は、タバコ植物における異種タンパク質の収率の促進に機能的な以下の配列またはその断片を含む。
Ｐ１−ＨｃＰｒｏ−Ｐ３（配列番号：５）
atggcactcatctttggcacagtcaacgctaacatcctgaaggaagtgttcggtggagctcgtatggcttgcgttaccagcgcacatatggctggagcgaatggaagcattttgaagaaggcagaagagacctctcgtgcaatcatgcacaaaccagtgatcttcggagaagactacattaccgaggcagacttgccttacacaccactccatttagaggtcgatgctgaaatggagcggatgtattatcttggtcgtcgcgcgctcacccatggcaagagacgcaaagtttctgtgaataacaagaggaacaggagaaggaaagtggccaaaacgtacgtggggcgtgattccattgttgagaagattgtagtgccccacaccgagagaaaggttgataccacagcagcagtggaagacatttgcaatgaagctaccactcaacttgtgcataatagtatgccaaagcgtaagaagcagaaaaacttcttgcccgccacttcactaagtaacgtgtatgcccaaacttggagcatagtgcgcaaacgccatatgcaggtggagatcattagcaagaagagcgtccgagcgagggtcaagagatttgagggctcggtgcaattgttcgcaagtgtgcgtcacatgtatggcgagaggaaaagggtggacttacgtattgacaactggcagcaagagacacttctagaccttgctaaaagatttaagaatgagagagtggatcaatcgaagctcacttttggttcaagtggcctagttttgaggcaaggctcgtacggacctgcgcattggtatcgacatggtatgttcattgtacgcggtcggtcggatgggatgttggtggatgctcgtgcgaaggtaacgttcgctgtttgtcactcaatgacacattatagcgaccatcaccatcaccatcacgcgtccgacaaatcaatctctgaggcattcttcataccatactctaagaaattcttggagttgagaccagatggaatctcccatgagtgtacaagaggagtatcagttgagcggtgcggtgaggtggctgcaatcctgacacaagcactttcaccgtgtggtaagatcacatgcaaacgttgcatggttgaaacacctgacattgttgagggtgagtcgggaggaagtgtcaccaaccaaggtaagctcctagcaatgctgaaagaacagtatccagatttcccaatggccgagaaactactcacaaggtttttgcaacagaaatcactagtaaatacaaatttgacagcctgcgtgagcgtcaaacaactcattggtgaccgcaaacaagctccattcacacacgtactggctgtcagcgaaattctgtttaaaggcaataaactaacaggggccgatctcgaagaggcaagcacacatatgcttgaaatagcaaggttcttgaacaatcgcactgaaaatatgcgcattggccaccttggttctttcagaaataaaatctcatcgaaggcccatgtgaataacgcactcatgtgtgataatcaacttgatcagaatgggaattttatttggggactaaggggtgcacacgcaaagaggtttcttaaaggatttttcactgagattgacccaaatgaaggatacgataagtatgttatcaggaaacatatcaggggtagcagaaagctagcaattggcaatttgataatgtcaactgacttccagacgctcaggcaacaaattcaaggcgaaactattgagcgtaaagaaattgggaatcactgcatttcaatgcggaatggtaattacgtgtacccatgttgttgtgttactcttgaagatggtaaggctcaatattcggatctaaagcatccaacgaagagacatctggtcattggcaactctggcgattcaaagtacctagaccttccagttctcaatgaagagaaaatgtatatagctaatgaaggttattgctacatgaacattttctttgctctactagtgaatgtcaaggaagaggatgcaaaggacttcaccaagtttataagggacacaattgttccaaagcttggagcgtggccaacaatgcaagatgttgcaactgcatgctacttactttccattctttacccagatgtcctgagtgctgaattacccagaattttggttgatcatgacaacaaaacaatgcatgttttggattcgtatgggtctagaacgacaggataccacatgttgaaaatgaacacaacatcccagctaattgaattcgttcattcaggtttggaatccgaaatgaaaacttacaatgttggagggatgaaccgagatatggtcacacaaggtgcaattgagatgttgatcaagtccatatacaaaccacatctcatgaagcagttacttgaggaggagccatacataattgtcctggcaatagtctccccttcaattttaattgccatgtacaactctggaacttttgagcaggcgttacaaatgtggttgccaaatacaatgaggttagctaacctcgctgccatcttgtcagccttggcgcaaaagttaactttggcagacttgttcgtccagcagcgtaatttgattaatgagtatgcgcaggtaattttggacaatctgattgacggtgtcagggttaaccattcgctatccctagcaatggaaattgttactattaagctggccacccaagagatggacatggcgttgagggaaggtggctatgctgtgacctctgcagatcgttcaaacatttggcaataa
異種タンパク質
様々な実施形態において、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法内のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種のインフィルトレーションは、増殖因子、受容体、リガンド、シグナリング分子；キナーゼ、酵素、ホルモン、腫瘍抑制因子、血液凝固タンパク質、細胞周期タンパク質、代謝タンパク質、神経タンパク質、心臓タンパク質、特異的な疾患状態において欠損したタンパク質、抗体またはその断片、免疫グロブリン、抗原、疾患に対する耐性を提供するタンパク質、抗微生物タンパク質、インターフェロンおよびサイトカインからなる群から選択される異種タンパク質またはポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム種の選択された株により実行することができる。様々な実施形態において、異種タンパク質またはポリペプチドは、ヒトのタンパク質またはポリペプチド、修飾したヒトのタンパク質またはポリペプチド、キメラのタンパク質またはポリペプチドである。様々な実施形態において、異種のタンパク質またはポリペプチドは植物病原体のタンパク質またはポリペプチドではなく、またはより具体的には、真菌性植物病原体、ウイルス性植物病原体、細菌性植物病原体、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅの種の病原体、Ｎｉｃｏｔｉａｎａの病原体またはタバコの病原体のタンパク質またはポリペプチドでない。
発現可能なヌクレオチド配列は、植物細胞における、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属、特にＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍの植物の植物細胞における発現のために至適化された配列を含むことができる。発現可能なヌクレオチド配列は生来のヒトコード配列とは異なり得るが、翻訳された産物のアミノ酸は同一である。発現可能なヌクレオチド配列中の１つまたは複数のコドンを、植物、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ属、特にＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍの植物の既知のコドン使用に従う好ましいコドンと置き換え、植物またはタバコ植物における発現の増加を可能にする発現可能なヌクレオチド配列中で同じアミノ酸をコードする好ましいコドンのパターンを生じさせる（生来のコード配列の使用と比較して）。かかる目的のためのヌクレオチド配列の修飾のための技法は周知であり、例えばＵＳ５，７８６，４６４、ＵＳ６，１１４，１４８を参照されたい。
一態様において、抗原をコードする配列は、防御免疫反応の誘導のための配列を含む前述の実施形態のいずれか１つにおいて本明細書で記述されるような本発明の方法内で使用される（例えばワクチン処方において）。かかる好適な抗原は、微生物抗原（ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、寄生虫性抗原および同種のものを含む）；多細胞生物（多細胞寄生動物等）からの抗原；アレルゲン；およびヒトまたは動物の病理学（例えば癌、自己免疫疾患および同種のもの等）と関連する抗原を含むが、これらに限定されない。１つの好ましい態様において、ウイルス性抗原は、ＨＩＶ抗原；インフルエンザへの防御免疫反応を与えるための抗原；ロタウイルス抗原；炭疽菌抗原；狂犬病抗原；および同種のものを含むが、これらに限定されない。ワクチン抗原は多価のペプチドまたはポリペプチドとしてコードすることができ、例えば発現コンストラクト中で反復される異なるかまたは同じ抗原をコードする配列を含み、任意で１つまたは複数のリンカー配列によって分離される。
一実施形態において、発現可能なヌクレオチド配列は、抗体の軽鎖、抗体の重鎖または抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードする。特定の実施形態において、重鎖または軽鎖は、ヒトＣＤ２０を結合する抗体のものである。他の特異的な実施形態において、重鎖または軽鎖は、リツキシマブの抗体結合部位を持つヒトＣＤ２０を結合する抗体のものである。
様々な実施形態において、発現可能なヌクレオチド配列はインフルエンザウイルス抗原、特に赤血球凝集素（ＨＡ）からなる群から選択された異種タンパク質またはポリペプチドをコードする。インフルエンザウイルスは、感染した哺乳類細胞の原形質膜から出芽するエンベロープに包まれたウイルスである。それらは核タンパク質および提示されるマトリックスタンパク質抗原に基づいて、タイプＡ、Ｂ、またはＣへと分類される。インフルエンザタイプＡウイルスは、提示された赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質の組み合わせに従って１５のサブタイプへとさらに分割され得る。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合および透過する能力を支配する。
現在、１６のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）サブタイプが認識されている。タイプＡインフルエンザウイルスは各々１タイプのＨＡおよび１タイプのＮＡ糖タンパク質を提示する。本発明の方法によって産生することができるＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６またはその断片もしくは一部分を含む。かかるＨＡタンパク質を含むサブタイプの例は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５１２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５、Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００、Ａ／キタオナガガモ／ＴＸｌ８２８１８９／０２、Ａ／トルコ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０１７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グリエフ／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１Ｉ２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ科／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）を含む。
上で言及されたＨサブタイプの１つを有するインフルエンザウイルスのいくつかはヒトにおいて感染を引き起こし、その起源故にパンデミックに引き起こし得ることが意図される。これらのサブタイプ（Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６）の抗原の多くは、したがって新型インフルエンザワクチンにおいて使用することができる。サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３はヒトインフルエンザ感染に関与する主要なサブタイプであり、かかるサブタイプの抗原は季節性インフルエンザワクチンにおける使用のために意図される。インフルエンザ赤血球凝集素またはその免疫原性断片をコードする任意のヌクレオチド配列を、赤血球凝集素ポリペプチドまたはその断片が宿主Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ品種において産生されるように本発明の方法において使用できることが意図される。例えば、公開データベース中で報告されたインフルエンザ赤血球凝集素の生物学的配列のいずれか（Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４ Ｊａｎ １；３２（１）：２３−６）またはインフルエンザ研究データベース（ＩＲＤ；ｗｗｗ．ｆｌｕｄｂ．ｏｒｇまたはＳｑｕｉｒｅｓ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＨｅａｌｔｈＢａｓｅ：ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｈｏｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）ｖｏｌ．３６（データベース号）ｐｐ．Ｄ４９７を参照されたい）等）を、本発明に従って使用することができる。
対象となる異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の例は、以下に提供され、配列番号：８において記載される。このヌクレオチド配列は、成熟インフルエンザ赤血球凝集素５（Ｈ５）をコードし、コドンは植物における配列の発現のために至適化されている。したがって、本発明は、配列番号：８に少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を示す成熟インフルエンザ赤血球凝集素５をコードするヌクレオチド配列を、Ｔ−ＤＮＡ領域中でおよび植物調節エレメントへの作動可能に連結して、上記のように含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを意図する。
至適化された成熟ＨＥＩ（Ｈ５）
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イノキュラム調製および細胞密度
本発明の一実施形態において、異なるアグロバクテリウム株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの細菌）は、実施例１において例示されるようなイノキュラムの調製のために使用することができる。アグロバクテリウム株は、植物調節エレメントの制御下に対象となる遺伝子を持つＴ−ＤＮＡを含有するバイナリーベクターを含むことができ、ＯＤ600が１．６を超えるまで増殖される。アグロバクテリウム株を遠心分離によって集め、少なくとも２．１、少なくとも２．４、少なくとも２．７、少なくとも３．０、少なくとも３．３、少なくとも３．６、少なくとも３．８、少なくとも３．９、少なくとも４．０の細胞密度（ＯＤ600）でインフィルトレーション溶液中に再懸濁することができる。特定の実施形態において、インフィルトレーション溶液のＯＤ600は２を超える。
本発明の別の実施形態において、アグロバクテリウム株をインフィルトレーション溶液中でさらに希釈することができ、オプションの手段としてアセトシリンゴンを添加して毒性を誘導することができる。
本発明のさらなる実施形態において、２つ以上のアグロバクテリウム懸濁物を本発明に従っておよび本明細書において記述されるように調製することができる。次いで前記２つ以上の懸濁物を、適合性のあるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のインフィルトレーションのために別々に使用することができるか、または代替のアプローチにおいて、インフィルトレーション前に最初に混合することができる。特に、本明細書において記述されるように、第１の発現可能な遺伝子（例えばタンパク質またはポリペプチド、特に先のセクションにおいて言及されたもの等の異種タンパク質またはポリペプチドをコードするコード配列）を持つ第１のバイナリーベクターを保有する第１のアグロバクテリウム懸濁物を調製し、第２の発現可能な遺伝子（例えば遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードするコード配列）を持つ第２のバイナリーベクターを保有する第２のアグロバクテリウム懸濁物と混合することができる。本発明の別の実施形態において、本明細書において記述されるように調製したイノキュラムは、使用の前に４〜６℃で１週間までの間保存することができる。
それぞれ実施例１１、１２および１４中で例示されるように、本発明は、異種ポリペプチドの全収率をさらに促進する、イノキュラム調製の上記述の方法へのさらなる改善も提供する。
本発明の一実施形態において、アグロバクテリアを増殖させ、次いで遠心分離によって収穫し、溶液中に、好ましくはインフィルトレーション溶液中に、好ましくは２．０を超えるＯＤ600に再懸濁して、濃縮イノキュラムを生成する。あるいは、アグロバクテリアを遠心分離なしでおよび再懸濁なしで培養培地中で保存する。特定の実施形態において、インフィルトレーションのために培養したアグロバクテリウム細胞を抗生物質による選択なしに所望される光学的密度まで増殖させる。イノキュラムは直ちに使用するか、または後の使用のために保存することができる。インフィルトレーションの日に、本明細書において記述されるようなアグロバクテリウムの異なる株または異なるタンパク質コード配列を持つバイナリーベクターを含むアグロバクテリウムの同一の株を含む異なる濃縮イノキュラムを、異なる比率または比率の組み合わせで（例えば３：１、１．６７：１、１：３、１：１の比率で）ともに混合し、次いで定義された最終ＯＤ600までインフィルトレーション溶液中で希釈することができる。例えば、一実施形態において、細菌性溶液は０．３２または０．８５の最終ＯＤ600を有することができる。イノキュラムは、定義された期間の間（例えば３０分間）室温へ平衡化することができる。イノキュラムをインフィルトレーション溶液中でＯＤ600へ連続して希釈して、より低い細菌密度を得ることができる。
本発明の好ましい実施形態において、アグロバクテリウム株（ＡＧＬ１）は遺伝子または遺伝子のコンストラクト、例えばレポーター遺伝子（例えばｔＧＦＰ）またはサイレンシングサプレッサー（例えばＨｃＰｒｏ）を保有することができる。
本発明の好ましい実施形態において、アグロバクテリウム株はＡＧＬ１である。イノキュラムの最終ＯＤは０．７であり、対象となる発現可能な遺伝子を含むＡＧＬ１細胞：ＨｃＰｒｏの発現可能な配列を含むＡＧＬ１細胞のイノキュラム中の比率は、２．５：１であり、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種はＰＭ１３２である。
植物インフィルトレーション
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム株の適合性のある組み合わせはいったん上記のように同定された。任意の公知の植物インフィルトレーション法を本発明に記載の方法内で使用することができ、発現可能な様式で所望されるタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子のパーティクルガン送達、発現可能な遺伝子を含むバイナリーベクターのアグロバクテリウム媒介性送達、プロトプラストの電気穿孔、および植物プロトプラストの中への裸のＤＮＡのポリエチレングリコール媒介性送達等であるがこれらに限定されない。パーティクルの砲撃は通常少数の細胞のみに到達し、ＤＮＡは転写が遂行される細胞核に到達し、したがって一過性の発現にあまり能率的ではない。
インフィルトレーション（アグロ−インフィルトレーション）によって送達されるアグロバクテリウムの使用は、有意に高い数の細胞へ外来遺伝子を送達することができる。一過性の発現のためのアグロバクテリウムインフィルトレーションのオリジナルのシステムはＫａｐｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１２２：１０１−１０８（１９９７）によって記載され、植物の組織の耐病性に有用と考えられるタンパク質の機能性の迅速試験のために開発された。
本発明の様々な実施形態において、低気圧または真空への曝露によって、アグロバクテリウム細胞と接触される、インタクトな植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）を処理するシステムが提供される。本発明に記載の方法において使用されるシステムは、植物全体、特にインタクトな植物全体もしくは植物部分（植物器官または植物組織等）または複数のかかる植物全体もしくは植物部分の収容のためのチャンバー、ならびに低い流体圧力環境を生成し、任意で陰性もしくは陽性の流体圧力または陰性および陽性の流体圧力の組み合わせを送達するための手段を含むことができる。
本発明の一実施形態において、低気圧または真空への曝露に際して、アグロバクテリウム細胞と接触されるインタクトな植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）を処理するシステムが提供される。本発明に記載の方法において使用されるシステムは、植物全体、特にインタクトな植物全体もしくは植物部分（植物器官または植物組織等）または複数のかかる植物全体もしくは植物部分の収容のためのチャンバー、ならびに低い流体圧力環境を生成し、任意で陽性の流体圧力を送達するための手段を含むことができる。
別の実施形態において、本発明は、２０１０年７月１６日に出願された共係属中の出願番号ＥＰ １０ １６ ９８８８．４（その開示はその全体が本明細書に援用される）中で開示される、植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）の中へアグロバクテリウム細胞を導入するための改善された方法を使用することを意図する。方法は、真空または陰圧を使用する当該技術分野において公知の方法とは異なり、液体の陽圧または液体の陽圧および陰圧の組み合わせを与え、アグロバクテリウム細胞が、植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）をインフィルトレーションすることを促進する。本発明は、アグロバクテリウム細胞と接触されるかまたは接触されてきた、植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）へ陽性の流体圧力を送達するための本発明に記載の方法で使用されるシステムおよび手段も提供する。
植物全体、特にインタクトな植物全体または植物部分および細菌が、閉鎖条件下で１つまたは複数の圧力サイクルによる処理にさらされる場合、陽性の流体圧力が送達される。流体圧力は、流体（水または空気等）内のいくつかのポイントでの圧力である。例えば、閉鎖条件下で流体が含まれる体積は一定である。本発明の様々な実施形態において、流体圧力は固定された体積のチャンバー内の気圧である。
したがって本発明において有用な陽圧値は周囲気圧のパーセンテージ値に換算して表現することができ、例えばそして限定されずに、１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、３５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、１０５０％、１１１０％、１１５０％、１２００％、または任意の中間値、または前述のものを超える任意の値である。類似した慣例を周囲気圧よりも低い圧力値である陰圧の記載のために使用することができる。
あるいは陽圧は絶対値に換算して表現することができ、例えばそして限定されずに、１．１ａｔｍ、１．５ａｔｍ、２ ａｔｍ、２．５ａｔｍ、３ａｔｍ、３．５ａｔｍ、４ａｔｍ、４．５ａｔｍ、５ａｔｍ、５．５ａｔｍ、６ａｔｍ、６．５ａｔｍ、７ａｔｍ、７．５ａｔｍ、８ａｔｍ、８．５ａｔｍ、９ａｔｍ、９．５ａｔｍ、１０ａｔｍ、１０．５ａｔｍ、１１ａｔｍ １１．５ａｔｍ １２ａｔｍなど；または１．１ｂａｒ、１．５ｂａｒ、２ ｂａｒ、２．５ｂａｒ、３ｂａｒ、３．５ｂａｒ、４ｂａｒ、４．５ｂａｒ、５ｂａｒ、５．５ｂａｒ、６ｂａｒ、６．５ｂａｒ、７ｂａｒ、７．５ｂａｒ、８ｂａｒ、８．５ｂａｒ、９ｂａｒ、９．５ｂａｒ、１０ｂａｒ、１０．５ｂａｒ、１１ｂａｒ、１１．５ｂａｒ、１２ｂａｒ、または任意の中間値、または前述のものを超える任意の値である。周囲気圧が記述中で比較のために本明細書において提供されない場合、周囲気圧は海面での地球上の標準大気圧であることが意図される。
本明細書において使用される「圧力サイクル」という用語は、一定の時間の期間にわたる圧力における１シリーズの変化を指す。一実施形態において、圧力サイクルは標的圧力（すなわち、与えられた期間内で到達されるべき圧力）を含む。例えば、チャンバー中の所望される圧力は、圧力サイクルの間に周囲気圧と平衡な状態から開始し標的圧力へ変化し周囲気圧に戻る。したがって、本発明において使用されるチャンバーは、大気より上に圧力を増加させることによって圧力サイクルを開始し、大気と平衡化することによって圧力サイクルを終えることができる。
本発明の方法において、複数の異なる圧力サイクルを適用することができ、各々を１つまたは複数回（２、３、４、５、６、７、８、９または１０回等であるがこれらに限定されない）を適用することができる。したがって、本発明の方法または圧力サイクルにおいて、圧力の変動は、経時的にグラフまたは波形（正弦波、矩形波、三角波もしくはのこぎり波または前述のものの１つに近似する任意の波形）によって表現することができる。
特に、圧力サイクルは陽圧である標的圧力を含むことができる。特定の実施形態において、本発明の方法は陰圧である標的圧力の使用を含まない。他の実施形態において、陽圧である第１の標的圧力に加えて陰圧である第２の標的圧力の使用が意図される。他の実施形態において、第１の標的圧力は陰圧であり、第２の標的圧力は陽圧である。休止期間を圧力サイクルの間に含むことができる。
特定の実施形態において、発現コンストラクトを含むアグロバクテリウム細胞を、植物全体、特にインタクトな植物全体またはインタクトな植物全体の部分（植物器官または植物組織等）の中へインフィルトレーションする。一実施形態において、インフィルトレーションは、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤を含む界面活性剤の存在下において実行される。使用できる界面活性剤の非限定例は、トリトンＸ−１００またはＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７（植物に対して比較的低い毒性を示す強い界面活性剤）である。
一実施形態において、インタクトな植物全体をチャンバーの内部で上下逆さまで配置し、葉をアグロバクテリウム細胞を含む液体中に完全に浸漬する。チャンバーは注入口バルブを介して低気圧源へ連結される。例えば、低気圧（約５０ｍｂａｒ）を生成するために。
上記の機器に加えて、本発明に記載の方法で使用されるシステムは、複数の植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）をある場所からチャンバーへ輸送するための手段、アグロバクテリウム細胞と複数の植物全体または植物組織の接触を促進するための手段、チャンバー中の複数の植物全体または植物組織を収容するための手段、チャンバー中の複数の植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）を配置および再配置するための手段、チャンバーから複数の植物全体または植物部分を回収するための手段を任意でさらに含むことができる。好ましくは、１つまたは複数の前述の手段は、自動化された電気的機械システムであり、モーターによる輸送システム、工場自動化システム、セキュリティーシステム、プロセス制御システム、データ通信システム、データ保存システムおよび計算システムを含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、遺伝子（複数可）、特に異種遺伝子（複数可）を持つ発現コンストラクトを保有するアグロバクテリウムの細胞を使用して、植物または植物部分の細胞および／または細胞外空間における一過性発現のために、インタクトな植物全体または植物部分（植物器官または植物組織等）へ遺伝子（複数可）を送達する。一般的に、好適な発現コンストラクトは、少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列、発現調節配列（例えば誘導可能または構成的なプロモーター、その活性が組織特異的かまたは組織バイアスのあるプロモーター）、および発現調節配列へ作動可能に連結された遺伝子を含む。特定の実施形態において、発現コンストラクトは、１つまたは複数の複製起点（アグロバクテリウム種における発現コンストラクトを含むベクターを複製するのに好適な少なくとも１つの複製起点）を含むベクターの一部である。
陽圧インフィルトレーション法は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の種）、レタス、アルファルファ、緑豆、ホウレンソウ、タンポポ、赤チコリー、ルッコラ、エンダイブ、キクヂシャ、チコリー、アーティチョーク、トウモロコシ、ジャガイモ、コメ、ダイズ、綿、小穀物穀物、コムギ、オオムギ、ソルガム、サトウダイコン、キャノーラ、アブラナ科（例えばアブラナ、シロイヌナズナ）、ウキクサおよびトマトを含むがこれらに限定されない植物の多くの種の一過性発現を得るために使用することができる。
好適な植物器官または組織は一般的に植物の任意の部分であり得る。１つの好ましい態様において、植物組織は葉組織である。一態様において、植物組織は少なくとも１つの次元において少なくとも約７〜８ｃｍの葉を含む植物からの葉組織である。
温室実行
転倒させた位置におけるインキュベーション
本発明の他の態様において、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含む細菌懸濁液によるインフィルトレーション後に植物をインキュベーションするための一般的な方法であって、植物を転倒させた位置でインキュベーションすることを含む前記方法が提供される。好ましくは、転倒させた位置でインキュベーションされる植物は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションした植物全体である。別の実施形態において、転倒させた位置でインキュベーションされる植物はトランスジェニック植物である。
特定の実施形態において、本発明は、前記インキュベーション工程が、転倒させた位置でインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。インフィルトレーションした植物を転倒させた位置で任意の時間長の間、特に５日〜１０日の間の期間の間インキュベーションすることを支援し、転倒させたインフィルトレーションした植物が上から照射されることに適合する温室も提供される。本発明の一態様において、植物は２４時間あたり７〜９時間、特に２４時間あたり８時間照射される。
この方法は、実施例１３において示されるように組換えタンパク質の発現の増加を引き起こす。
本発明の一実施形態において、転倒させた位置での植物のインキュベーションを含む方法は、前述の態様または実施形態のいずれかに記載の方法内で、特に本明細書において記述されるようなインキュベーション工程（ｉｉｉ）内で使用することができる。
本発明の一実施形態において、転倒させた位置での植物のインキュベーションに対する修飾を、前述の態様または実施形態のいずれかを考慮して、本発明に記載の方法に、特に本明細書において記述されるようなインキュベーション工程（ｉｉｉ）のコンテキストに適用することができる。
照射
本発明のさらに他の態様において、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含む細菌懸濁液によるインフィルトレーション後に植物をインキュベーションするための一般的な方法であって、植物を１日（２４時間）あたり５時間〜１５時間、５時間〜１０時間、７〜９時間、好ましくは１日（２４時間）あたり８時間日光条件下でインキュベーションすることを含む前記方法が提供される。方法は、実施例１５において例示されるような異種タンパク質の一過性発現のレベルの改善に特に有用である。
一実施形態において、インフィルトレーションされる植物は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含むアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションし、１日あたり７〜９時間、好ましくは１日あたり８時間日光条件下でインキュベーションした植物全体である。特定の実施形態において、本発明は、前記インキュベーション工程が、転倒させた位置でインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。
本発明の一実施形態において、１日あたり７〜９時間、好ましくは１日あたり８時間日光条件下での植物のインキュベーションに対する修飾を、前述の態様または実施形態のいずれかを考慮して、本発明に記載の方法に、特に本明細書において記述されるようなインキュベーション工程（ｉｉｉ）のコンテキストに適用することができる。
植え付け密度
本発明のさらに他の態様において、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含む細菌懸濁液による前記植物のインフィルトレーション前に、定義された面積内で高密度で複数の植物を成長させることを含む一般的な方法が提供される。インフィルトレーション後に、インフィルトレーションした植物を定義された面積内で高密度でインキュベーションすることも意図される。複数の植物がインフィルトレーション前後の両者で高密度で植え付けられる方法も包含される。
特に、方法は、１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００の植物、１平方メートルあたり少なくとも５０〜４００の植物、１平方メートルあたり少なくとも１００〜３００の植物、１平方メートルあたり少なくとも１５０〜２５０の植物、１平方メートルあたり少なくとも１００〜９００の植物の密度で複数の植物を成長させることを含む。一実施形態において、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で植物を成長させる。別の実施形態において、１平方メートルあたり少なくとも５００の植物の密度で植物を成長させる。複数の植物を、種蒔き後３０日〜５０日間、特に種蒔き後に４０日〜５０日の間の期間の間、しかし特に種蒔き後４６日の間上記の条件で成長させた後に、前述のパラグラフ中で同定されたタンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含むＯＤ600のアグロバクテリウム細胞の懸濁物によりインフィルトレーションする。
一実施形態において、インフィルトレーション後に、植物を直立させた位置でインキュベーションする。
他において、インフィルトレーション後に、植物を転倒させた位置でインキュベーションする。特に、インフィルトレーションした植物は、任意の時間長の間、特に５日〜１０日の間の期間の間転倒させた位置でインキュベーションされ、転倒させたインフィルトレーションした植物は上から照射される。本発明の一態様において、植物は２４時間あたり７〜９時間、特に２４時間あたり８時間照射される。
この方法は、実施例１４において示されるように組換えタンパク質の発現の増加を引き起こす。
方法は、異種タンパク質の産生価格の低下に特に有用である。１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００の植物または１平方メートルあたり少なくとも１００のインフィルトレーションした植物の密度で植物を成長させることに適合する温室も提供される。
一実施形態において、本発明は、前記方法が、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドの発現可能なヌクレオチド配列を含む細菌懸濁液による前記植物のインフィルトレーション前に、定義された面積内で高密度で複数のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物を成長させる工程を含むように修飾される、前述の実施形態のいずれかに記載の方法に関する。特に、複数のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物を、１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００の植物、１平方メートルあたり少なくとも５０〜４００の植物、１平方メートルあたり少なくとも１００〜３００の植物、１平方メートルあたり少なくとも１５０〜２５０の植物、しかし特に１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で成長させる。
本発明の一実施形態において、定義された面積内で複数のインフィルトレーションした植物をインキュベーションするための方法は、前述の態様または実施形態のいずれかに記載の方法内で、特に本明細書において記述されるようなインキュベーション工程（ｉｉｉ）内で使用することができる。
本発明の一実施形態において、インフィルトレーション前の複数の植物の定義された面積による高密度での成長に対する修飾を、前述の態様または実施形態のいずれかを考慮して、本発明に記載の方法に適用することができる。
インフィルトレーションした植物の細胞壁の酵素による破壊
本発明のさらに他の態様において、アグロバクテリウムによりインフィルトレーションしたインタクトな植物全体を、植物細胞壁を分解または消化する１つまたは複数の酵素により処理して異種タンパク質の抽出を支援することを含む一般的な方法が提供される。一実施形態において、方法は、陽性の流体圧力下で、シリンジインフィルトレーション、バキュームインフィルトレーションおよびインフィルトレーションを含むがこれらに限定されない当該技術分野において公知の技法によって、アグロバクテリウムによりインフィルトレーションした植物を１つまたは複数の酵素によりインフィルトレーションすることを含む。インフィルトレーション技法は、アグロバクテリウムによりインフィルトレーションした植物を機械的に破壊する前に、アポプラスト空間への消化酵素（それは大部分の細胞含有物を放出せずに細胞壁の破壊をもたらす）の送達を可能にする。このインフィルトレーション工程は、アグロバクテリウム細胞懸濁物による全体のインタクトな植物のインフィルトレーションを可能にする類似の機器を使用して実行することができる。この方法は、前述の実施形態の任意の１つにおいて記述されるような対象となる異種タンパク質を産生するための様々な方法における任意の工程として使用することができる。実施例１７は、インフルエンザ赤血球凝集素５（Ｈ５）を産生するアグロバクテリウムによりインフィルトレーションしたタバコ植物による本発明のこの態様の有用性を実証する実験を記述するものである。
植物の細胞壁を破壊するために工業プロセスにおいて使用される多くの酵素を使用することができ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼおよびポリガラクツロナーゼが含まれるがこれらに限定されない。使用することができるセルラーゼは、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（エキソグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）とも称される）またはβ−グルコシダーゼ（セロビアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）とも称される）を含む。エンドグルカナーゼはセルロース鎖に沿って内部でβ−グリコシド結合をランダムに加水分解するが、セロビオヒドロラーゼは鎖の還元末端および非還元末端からセロビオース分子を除去する。β−グルコシダーゼはセロビオースを２分子のグルコースへ加水分解し、したがってセロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼに対するセロビオースの阻害を消失させる。ポリガラクツロナーゼ活性を有する酵素は、１，４結合α−Ｄ−ガラクツロン酸およびメトキシル化された誘導体の鎖として植物細胞壁において一般に見出されるポリガラクツロン酸鎖中のグリコシド結合を加水分解する。キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）は、ポリマーのキシラン（植物ヘミセルロースの主要なコンポーネント）を形成するＤ−キシロース間のβ，１−４連結を切断する。これらの酵素の多くは、菌類（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属の種およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の種）および微生物から得られ、混合物として市販で購入することができ、例えばＭａｃｅｒｏｚｙｍｅ（商標）（セルラーゼ０．１Ｕ／ｍｇ、ヘミセルラーゼ、０．２５Ｕ／ｍｇ、ペクチナーゼ０．５Ｕ／ｍｇ、ｂｉｏＷＯＲＬＤ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）；およびＤｒｉｓｅｌａｓｅ（商標）（ラミナリナーゼ、キシラナーゼおよびセルロース、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）である。
酵素によるインフィルトレーション後に、植物は、少なくとも１、２、５、１０、１２、１８〜２４時間にわたる一定の期間の間インキュベーションすることができる。
収率
一実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを前述の態様または実施形態に記載のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生するための方法であって、但し、発現可能なヌクレオチド配列がＴｕｒｂｏ緑色蛍光タンパク質（ｔＧＦＰ）または赤血球凝集素Ｈ５等のタンパク質をコードする場合、タンパク質の蓄積がインフィルトレーションした植物の全可溶性タンパク質の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％または少なくとも２０％であるか；またはポリペプチドもしくはタンパク質の蓄積が、それぞれ実施例１４および１５において例示されるように、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）において記述されるものと同じ発現可能なヌクレオチド配列を含む選択されたアグロバクテリウム株が使用される場合にＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて得ることができるものの少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％のレベルである、方法に関する。当該技術分野において公知の方法を使用して、方法および対照の収率を測定および比較することができる。
植物におけるタンパク質の工業規模産生のためのシステム
一実施形態において、本発明は、タンパク質またはポリペプチド、特に異種タンパク質またはポリペプチドを、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物において産生するためのシステムであって、（ａ）前述の実施形態のいずれかに記載の選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種の植物全体と、（ｂ）エレメント（ａ）のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種の選択された植物に適合性があり、前記植物が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種、育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、２０％未満の壊死、１０％未満の壊死、５％の未満壊死、２％未満の壊死、１％未満の壊死を示すような、アグロバクテリウム株の細胞を含む前述の実施形態のいずれかに記載の細菌懸濁液と（ｃ）前述の実施形態のいずれかに記載のアグロバクテリウム細胞による植物全体のインフィルトレーションのための手段と、（ｄ）任意で（ｉ）前述の態様のいずれかに記載され実施例１４において例示されるように、１平方メートルあたり少なくとも２５〜５００の植物、または１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で複数の植物を成長させる工程；（ｉｉ）インフィルトレーションした植物を、前述の態様のいずれかに記載され実施例１３において例示されるように、転倒させた位置で、前述の態様のいずれかに記載され実施例１５において例示されるように、１日あたり７〜９時間上からの照射と共にインキュベーションする工程の支援に適合する、高密度での植物の成長およびインフィルトレーションした植物のインキュベーションのための温室と、のエレメントを含むシステムに関する。
医薬組成物
発現コンストラクトが複数の植物細胞においてペプチドまたはタンパク質を発現することを可能にする好適な条件下で植物または植物の組織のインキュベーション後に、植物または植物部分（植物器官または植物組織等）またはその細胞においてタンパク質を検出し定量することができる。収穫後に、ペプチドまたはタンパク質の単離は当該技術分野においてルーチンの方法を使用して実行することができる。例えば、少なくともバイオマスの一部分をホモジナイズし、組換えペプチドまたはタンパク質を抽出し、さらに精製することができる。抽出は好適な溶媒中にホモジネートを浸すかまたは浸漬することを含み得る。精製法は、免疫親和性精製、ならびにペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体の特異的サイズ、単離されるべきペプチドもしくはタンパク質の電気泳動移動度、生物学的活性および／もしくは正味電荷に基づくか、またはタンパク質におけるタグ分子の存在に基づく精製手順を含むが、これらに限定されない。単離されたペプチドまたはタンパク質の特徴づけは免疫アッセイまたは当該技術分野において公知の他の方法によって行うことができる。例えば、ペプチドまたはタンパク質は、ウエスタンブロットによって、またはペプチドまたはタンパク質が実質的に精製される場合はクマシーブルー染色することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析することができる。
本発明の方法によって産生された組換えタンパク質は、これらの産物がヒトへの直接的な摂取、注入または適用（例えば局所投与）のために使用されるので、医薬品として使用することができ、栄養補助食品および薬用化粧品としてのそれらの有用性のために発現させることができる。同様に調節された動物用産物の産生において有用である組換えタンパク質も発現され得る。
本発明の方法を使用して、化学物質合成または工業プロセスのための酵素経路を再現するために１つまたは複数の遺伝子を発現することができる。
本発明の医薬組成物は好ましくは薬学的に許容されるキャリアーを含む。「薬学的に許容されるキャリアー」によって、非毒性の固体、半固体もしくは液体フィラー、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの処方補助物が意味される。本明細書において使用される時「非経口的」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および点滴を含む、投与のモードを指す。キャリアーは非経口的キャリアー、より特にレシピエントの血液と等張の溶液であり得る。かかるキャリアーベヒクルの例は水、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む。さらに、非水溶性ベヒクル（固定油およびオレイン酸エチル等）に加えてリポソームは、本明細書において有用である。キャリアーは好適には少量の添加物（等張性および化学安定性を促進する物質等）を含有する。かかる材料は、用いられた投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー（リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩等）；抗酸化剤（アスコルビン酸等）；低分子量（約１０残基未満）の（ポリ）ペプチド（例えばポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸またはアルギニン等）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート試薬（ＥＤＴＡ等）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール等）；カウンターイオン（ナトリウム等）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリソルベート、ポロキサマーまたはＰＥＧ等）を含む。
本発明は、以下の非限定的な図、表および実施例への参照によってさらに記載される。
植物で選択可能な最小のバイナリーベクターｐＣ１００の概略図を示した図である。 最小のバイナリーベクターｐＰＭＰ１の概略図を示した図である。 様々な遺伝子サイレンシングサプレッサーを使用する緑色蛍光タンパク質の発現についての様々なＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種（ＰＭ６７、ＰＭ８１、ＰＭ９２、ＰＭ１２８、ＰＭ１３２、ＰＭ１３３およびＰＭ２０４）の試験結果を示した図である。植物をＡ９１（植物で発現可能なｔＧＦＰカセットを含有するｐＣ９１遺伝子コンストラクトを含有するＡＧＬ１株）の細菌懸濁液によりインフィルトレーションし、ＡＧＬ１は遺伝子サイレンシングサプレッサーｐ１（Ａ１８）、ｐ２５（Ａ１９）、ＡＣ１（Ａ２０）、２ｂ（Ａ２１）、ＣＮＶからのｐ１９（Ａ３２）およびＨｃＰｒｏ（Ａ１２０）を含有する。インフィルトレーションの６日後での発現を、葉の凍結生重量１ｋｇあたりのｍｇで表示する。 ｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクター中にｔＧＦＰ発現カセットを保有する様々なアグロバクテリウム株によりインフィルトレーションされているタバコ品種のＳｉｍｍａｂａ、ＰＭ１３２、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１６、ＰＭ２１、Ｋ １４９、ＰＯ１およびＰＯ２を示した図である。すべてのものを、ＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを含有するＡＧＬ１（ｐＣ１２０）と組み合わせて試験する。植物を、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１（Ａ９１）、ＥＨＡ１０５（Ｅ９１）、ＧＶ２２６０（Ｇ９１）、ＬＢＡ４４０４（Ｌ９１）、ＧＶ３１０１（Ｖ９１）およびＣｒｙ−５（Ｙ９１）ならびにＡＧＬ１（ｐＣ１２０）によりバキュームインフィルトレーションする。ＴｕｒｂｏＧＦＰ濃度をインフィルトレーションの６日後に決定し、葉の凍結重量１ｋｇあたりのｍｇで提示する。 ｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクター中にｔＧＦＰ発現カセットを保有する様々なアグロバクテリウム株によりインフィルトレーションされているタバコ品種のＰＭ９２、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３およびＰＭ２０４を示した図である。すべてのものを、ＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを含有するＡＧＬ１（ｐＣ１２０）と組み合わせて試験する。植物を、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１（Ａ９１）、ＥＨＡ１０５（Ｅ９１）、ＧＶ２２６０（Ｇ９１）、ＬＢＡ４４０４（Ｌ９１）、ＧＶ３１０１（Ｖ９１）およびＣｒｙ−５（Ｙ９１）ならびにＡＧＬ１（ｐＣ１２０）によりバキュームインフィルトレーションする。ＴｕｒｂｏＧＦＰ濃度をインフィルトレーションの６日後に決定し、葉の凍結重量１ｋｇあたりのｍｇで提示する。 Ｈ５を一過性発現するＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの粗製抽出物中のＨ５のウエスタンブロット分析を示した図である。予想されるサイズ（７５ｋＤａ）のバンドはＨ５を一過性発現するＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて検出され、モック対照または野生型対照において検出されない。全可溶性タンパク質は、２ｍｌの抽出バッファーに対して１ｇの凍結重量の比率で、１×のＤｕｂｅｌｃｏのＰＢＳ中で凍結粉末葉材料から抽出する。等容量の抽出物（１ウェルあたりの４５〜５５μｇの全タンパク質に対応する）およびＨ５対照タンパク質をＳＤＳ含有ローディングバッファー＋還元剤中で変性し、４〜１２％のＢｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥゲルにロードする。タンパク質はｉＢｌｏｔ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＶＤＦ膜に転写する。Ｈ５の検出は以下の通りである。１）１／１０００希釈の一次抗体による４℃で一晩のインキュベーション［ウサギ抗Ｈ５、Ｉｍｍｕｎｅｔｅｃｈ ＃ＩＴ−００３−００５Ｖ、１ｍｇ／０．５ｍｌ］；２）１／１００００希釈の二次抗体による室温で１時間のインキュベーション［ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｃａｔ．＃１１−０３５−０４６、０．４ｍｇ／ｍｌ］；ＨＲＰ−基質ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（ＧＥ ＃ＲＰＮ２１３２）による室温で５分間のインキュベーション、４）Ｃｈｅｍｉｓｍａｒｔによる化学発光の検出（曝露２分、口径８）。 タバコ品種Ｂｕｒｌｅｙ ２１のインフィルトレーションの６日後のＴｕｒｂｏＧＦＰ発現レベル（凍結重量１ｋｇあたりのｍｇで；白色ボックス中に示した値）に対する、アグロバクテリウム密度（ＯＤイノキュラム）およびイノキュラム中のＡ９１：Ａ１２０の比率（ＣＯＩ：ＳｏＳ）の予測効果の２Ｄ等高線図を示した図である。 タバコ品種ＰＭ１３２のインフィルトレーションの６日後のＴｕｒｂｏＧＦＰ発現レベル（凍結重量１ｋｇあたりのｍｇで；白色ボックス中に示した値）に対する、アグロバクテリウム密度（ＯＤイノキュラム）およびイノキュラム中のＡ９１：Ａ１２０の比率（ＣＯＩ：ＳｏＳ）の予測効果の２Ｄ等高線図を示した図である。 タバコ品種ＰＭ２０４のインフィルトレーションの６日後のＴｕｒｂｏＧＦＰ発現レベル（凍結重量１ｋｇあたりのｍｇで；白色ボックス中に示した値）に対する、アグロバクテリウム密度（ＯＤイノキュラム）およびイノキュラム中のＡ９１：Ａ１２０の比率（ＣＯＩ：ＳｏＳ）の予測効果の２Ｄ等高線図を示した図である。 イノキュラム調製における遠心分離工程の除去のタバコの一過性発現に対する効果を示した図である。タバコ品種のＢｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４の植物は、遠心分離しインフィルトレーション溶液中で再懸濁した培養物またはインフィルトレーション溶液中で直接希釈した培養物いずれかから調製したＡ９１およびＡ１２０により共インフィルトレーションされる。ｔＧＦＰ発現の蛍光分析測定はインフィルトレーションの６日後に実行される。バーは平均の標準誤差を示す。 正常に直立または上下逆さまで維持されるＰＭ１３２タバコ植物におけるインフィルトレーションの４および６日後のｔＧＦＰ発現を、ｍｇ／ｋｇ生重量葉バイオマスで示した図である。 長い２０時間の光に比較して、少ない８時間の光下でインキュベーションしたインフィルトレーション後のタバコ植物における、ｍｇ ｔＧＦＰ／ｋｇ新鮮葉バイオマスでのｔＧＦＰ発現の時間経過を示した図である。
表１は、試験したＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種をすべてリストする。
表２は、免疫ドットブロットによって決定される、対照のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの２５％より上のＣ５−１単クローン抗体の発現を持つ２６のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種をリストする。＋＋：対照のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの２５〜５０％の間のシグナルおよび＋＋＋：対照のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの５０％以上のシグナル。インフィルトレーションした植物の表現型が示され、同じ品種のインフィルトレーションしなかった植物に比較される。
表３は、２５または１００の植物／ｍ2で成長させた、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのＰＭ１３２およびＰＭ２１７の植物の特徴をリストする。高さはｃｍで、気孔コンダクタンスはμｍｏｌ／ｍ2ｓで、葉緑素含有量指標（ＣＣＩ）はＣＣＭ−２００葉緑素メーター（Ｏｐｔｉ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）のセンサーからの読み取りとして、葉厚みはｍｍでおよび水分含有量は％である。
表４は、インフィルトレーション前に１平方メートルあたり２５または１００の植物で成長させ、インフィルトレーション後に直立または上下逆さまの位置で５日間インキュベーションした、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのＰＭ１３２およびＰＭ２１７の植物の葉における、ｔＧＦＰおよびＨ５発現を示す。
表５は、インフィルトレーション後の短日および長日のインキュベーションの効果の決定に使用した、１平方メートルあたり７５の植物で成長させたＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２の植物の特徴を示す。高さはｃｍで、気孔コンダクタンスはμｍｏｌ／ｍ2ｓで、葉緑素含有量指標（ＣＣＩ）はＣＣＭ−２００葉緑素メーター（Ｏｐｔｉ−Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）のセンサーからの読み取りとして、葉厚みはｍｍでおよび水分含有量は％である。
記述および実施例において、配列リストで示される以下の配列が参照される。
配列番号：１は、ベクターｐＰＭＰ１のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：２は、最小の３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターのヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：３は、５’ＵＴＲ ＨＴ−ＣＰＭＶのヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：４は、３’ＵＴＲ ＨＴ−ＣＰＭＶのヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：５は、Ｐ１−ＨｃＰｒｏ−Ｐ３のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：６は、フォワードプライマーＰＣ２０１Ｆのヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：７は、リバースプライマーＰＣ２０２Ｒのヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：８は、至適化されたインフルエンザ赤血球凝集素５のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：９は、ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＭＭＶ単一の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１０：ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＭＭＶの二重の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１１：ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＦＭＶの単一の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１２：ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＦＭＶの二重の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１３：ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＰＣＩＳＶの単一の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１４：ＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｐＰＣＩＳＶの二重の促進されたプロモーター断片のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１５：パタチンシグナルペプチドのアミノ酸配列を図示する。
配列番号：１６：Ｃ１４８中（重鎖の前）としてのパタチンのタバコ至適化されていない配列（わずかに修飾される）を図示する。
配列番号：１７：Ｃ１４８中（軽鎖の前）としてのパタチンのタバコ至適化された配列を図示する。
配列番号：１８：Ｃ１４８中としてのリツキシマブ成熟重鎖（タバコ至適化された）配列のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：１９：リツキシマブ成熟重鎖のアミノ酸配列を図示する。
配列番号：２０：Ｃ１４８中としてのリツキシマブ成熟軽鎖（タバコ至適化された）配列のヌクレオチド配列を図示する。
配列番号：２１：リツキシマブ成熟軽鎖のアミノ酸配列を図示する。
以下の実施例は限定としてではなく例証として提供される。特別の指示の無い限り、本発明は、分子生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡテクノロジー、植物生物学、植物育種およびタンパク質産生の従来の技法および方法を用いる。
実施例１：タバコ植物のアグロインフィルトレーション
この実施例は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの選択された品種、育種系統または栽培品種をアグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションする様々な方法を記述する。植物全体または植物組織は、真空によって、高い圧力によって、または針のないシリンジによって支援される、アグロバクテリウムによるインフィルトレーションを行なうことができる。インフィルトレーションの前に、タバコ植物は、２０時間の明期間および４時間の暗期間、２６℃／２０℃昼／夜および７０％／５０％相対湿度（昼／夜）で、ロックウールブロックにおいて温室中で成長させる。植物に地下灌水により肥料を与える。
イノキュラムの調製
植物調節エレメントの制御下で対象となる遺伝子を持つＴ−ＤＮＡを含有するバイナリーベクターを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの細菌を、それぞれのアグロバクテリウム株およびバイナリーベクターの選択のために、ロータリーシェーカー上で、２８℃および２５０ｒｐｍでエルレンマイヤーフラスコ中の２ｇ／Ｌ牛肉エキス、０．４ｇ／Ｌ酵母エキス、２ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、２ｇ／Ｌショ糖、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4および好適な抗生物質を含むＹＥＢ培地中で、ＯＤ600が１．６を超えるまで増殖させる。次いで、培養物を１０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および好適な抗生物質を含有する新鮮なＬＢブロスＭｉｌｌｅｒ培地中で１：１００に希釈し、ＯＤ600 が２を超えるまで２８℃および２５０ｒｐｍのロータリーシェーカー上でさらに増殖させた。細菌を８０００ｇおよび４℃で１５分間の遠心分離によって回収する。ペレットにした細菌を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および５ｍＭ ＭＥＳを含むインフィルトレーション溶液（本明細書においてインフィルトレーション溶液と称される）中に、最終的に５．６のｐＨおよび２．０を超えるＯＤ600で再懸濁する。任意で、細菌はインフィルトレーション溶液中でさらに希釈することができ、アセトシリンゴンを添加して毒性を誘導することができる。任意で、上記のように調製された第１のアグロバクテリウム細菌懸濁液を、第２の発現可能な遺伝子を持つ第２のバイナリーベクターを保有する第２のアグロバクテリウム懸濁物と混合する。かかる第２の遺伝子の非限定例は、遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードするコード配列である。任意で、イノキュラムは、使用の前に４〜６℃で１週間までの間保存することができる。
シリンジインフィルトレーション
標準的な２ｍｌシリンジ寸法を有するシリンジを細菌インフィルトレーション溶液で充填し、針なしで葉の背軸側に対して圧迫する。ピストンを押し下げ、葉組織の中へ細菌懸濁液を強制的に出す。大部分葉表面がインフィルトレーションされるまで、これを反復する。インフィルトレーション後に、植物を最小８時間の少ない光で維持し、第１日の間は日光から完全に保護する。翌日、植物を収穫まで正常な光条件下に配置する。
バキュームインフィルトレーション
細菌イノキュラムにより充填された１０Ｌのビーカー中で地上部を浸漬することおよび感染した植物または感染した植物部分の全体を大幅に低下させた大気圧（一般的に本明細書において真空と称される）に曝露することによって、植物をインフィルトレーションする。バキュームインフィルトレーションは、Ｖ−８５５調節器に連結したＶ−７１０ Ｂｕｃｈｉポンプを使用してガラスの鐘形ジャー（Ｓｃｈｏｔｔ−Ｄｕｒａｎ Ｍｏｂｉｌｅｘ ３００ｍｍ）中で実行し、圧力を３〜４分間で大気圧（１ｂａｒ）から５０ｍｂａｒまで低下させる。一旦到達したならば、鐘形ジャー中で真空を１分間維持し、続いておよそ２秒で大気圧に戻す。人工照明（８０〜１００μｍｏｌ光子／ｃｍ2）をインフィルトレーションプロセス全体の間で維持して一貫した光条件を保証する。インフィルトレーション後に、植物は、インフィルトレーションしなかった対照植物と共に収穫まで温室中に置く。成長条件（施肥、光周期および温度等）は、インフィルトレーション前に使用されたものと同じである。水および肥料は、ドリップ灌水システムを使用して植物に与える。
収穫および試料採取
サンプリングは１６時間後に開始することができるが、典型的には、インフィルトレーションした葉またはインフィルトレーションした葉のエリアは温室中での６日のインキュベーション後に収穫される。葉材料をヒートシール可能なパウチ中に置き、シールし、ドライアイスの層の間に少なくとも１０分間置く。収穫後に、すべての葉サンプルをさらなるプロセッシングまで−８０℃で保存する。収穫した葉をドライアイス上でコーヒーグラインダーを使用して細粉にホモジナイズし、（ｉ）５０ｍＭトリスベース、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％トリトンＸ−１００（最終ｐＨ７．５）を含有する３体積／重量の抽出バッファー中で各々２０秒間２工程のボルテックスで撹拌することおよび（ｉｉ）２００００ｇで１５分間遠心分離することによって抽出する。可溶性抽出物は分析まで冷凍する。
実施例２：一過性発現のためのバイナリーベクター
この実施例は、形質転換された植物細胞を選択するためのカナマイシン耐性遺伝子を含有しており、この出願中で使用される、ｐＰＭＰ１ベクターおよび最小のｐＣ１００バイナリーベクターのデザインおよび開発を記述する。
Ｔ−ＤＮＡ領域および骨格断片の構築
約１３５００塩基対長のマルチコピーバイナリーベクターｐＢＩＮ６１（Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２１：７３−８１）のヌクレオチド配列は、複製、維持、トランスジェニック細胞の選択およびＴ−ＤＮＡの移行における機能を有する核酸について分析される。新規ヌクレオチド配列は、上記のような機能を有する核酸のみを含んで開発される。生じたヌクレオチド配列を２つのパートで化学的に合成する。Ｔ−ＤＮＡ右（ＲＢ）およびＴ−ＤＮＡ左（ＬＢ）境界配列が境界となるＴ−ＤＮＡ領域、ノパリンシンターゼ（ｐＮＯＳ）プロモーターおよびｔＮＯＳターミネーターの制御下のｐＢＩＮ６１の植物で選択可能なカナマイシン耐性（ｎｐｔＩＩ）遺伝子ならびにユニークなＳｔｕＩ、ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する第１の断片を、隣接するＰｖｕＩＩ制限部位と共に化学的に合成し、ＣｏｌＥ１複製起点（Ｃｏｌ Ｅ１ ｏｒｉ）および細菌カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）をさらに含有するｐＵＣ由来ｐＭＫベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）のＰｖｕＩＩ部位中にクローン化し、ｐＧＡ１３を生じる。ＣｏｌＥ１ ｏｒｉおよび最小のＲＫ２ ｏｒｉＶ複製起点を持つ骨格領域ならびにｐＢＩＮ６１のＲＫ２由来ＴｒｆＡ複製開始タンパク質をコードする遺伝子を含有する第２の断片を、ユニークなＡｓｃＩ、ＳｔｕＩおよびＰｖｕＩＩ制限部位と共に化学的に合成し、アンピシリン（ＡｐＲ）耐性遺伝子をさらに含有するｐＵＣ由来ｐＭＡベクター（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）中にクローン化し、ｐＧＡ１４を生じる。
ｐＣ１００のデザインおよび開発
植物で選択可能な最小のバイナリーベクターｐＣ１００（図１Ａ）は、デノボに合成した２つの断片（第１の断片および第２の断片）を組み合わせることによって作製する。第１の断片は、１、大腸菌およびアグロバクテリウムにおいて機能的であり、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子を含むカナマイシン薬物耐性遺伝子と；２、ＣｏｌＥ１複製起点と；３、最小のｏｒｉＶ複製起点（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，５７（５）：１４３９−１４４９）と；４、ｏｒｉＶを活性化するＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子（Ｋｏｎｇｓｕｗａｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００６，１８８（１５）：５５０１−５５０９）と、５、前記断片１および断片２を組み合わせて最小のバイナリーベクターｐＣ１００を生成するための断片の非常に末端のユニークなＡｓｃＩおよびＳｔｕＩ制限酵素認識部位とを含有する。第２の断片は、６、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ左境界配列を含有するＴ−ＤＮＡ領域と；７、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ右境界配列と；８、任意で、トランスジェニック植物細胞の選択のために選択可能であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンプラスミドのノパリンシンターゼプロモーターおよびノパリンシンターゼターミネーター配列の制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子を含むマーカー遺伝子と；９、外来の遺伝子のクローニングのためであり、７、Ｔ−ＤＮＡ右境界と８、選択可能なマーカー遺伝子との間に位置するユニークなＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位と、１０、前記断片２および断片１を組み合わせて最小のバイナリーベクターｐＣ１００を生成するための断片の非常に末端のユニークなＡｓｃＩおよびＳｔｕＩ制限酵素認識部位とを含有する。
ｐＰＭＰ１最小のバイナリーベクターの構築
ｐＣ１００から植物で選択可能なｎｐｔＩＩ遺伝子を欠失させることによってｐＰＭＰ１（５１３９ｂｐ；図１Ｂ）を構築し、配列番号：１を持つ最小のバイナリーベクターｐＰＭＰ１を生成する。ｐＰＭＰ１は、位置＋１でのユニークなＥｃｏＲＩ制限部位；位置＋６９〜＋９４でのＬＢ；２５０ｂｐの第１のギャップ配列（ギャップ配列は、ｐＰＭＰ１の複製、細菌細胞中での維持、または植物細胞へのＴ−ＤＮＡ領域の移行における機能を有していない）；＋６５３〜＋１４５４のＫｍＲ遺伝子コード配列ならびにコード配列の上流および下流のおよそ３００ｂｐの調節配列を含有するおよそ１１００ｂｐの第１の配列；およそ１５０ｂｐの第２のギャップ配列；＋１６０２〜＋２２６９のＣｏｌＥ１ ｏｒｉを含有する第２の配列；およそ１５０ｂｐの第３のギャップ配列；＋３６６２〜＋２５１７のａＴｒｆＡコード配列ならびにコード配列の上流および下流のおよそ３５０ｂｐの調節配列を含有するおよそ１５００ｂｐの第３の配列；およそ４５０ｂｐの第４のギャップ配列；＋４９３２〜４３０３のＲＫ２ ｏｒｉＶを含有する第４の配列；１０９ｂｐの第５のギャップ配列；位置５０４１〜５０６６でのＲＢならびに位置＋５１３９でのユニークなＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。
実施例３：タバコにおける一過性発現の可視化のためのレポーターアッセイ
この実施例は、前記植物細胞における異種遺伝子の形質転換効率および発現を決定するために植物細胞で使用される様々なレポーターアッセイを記述する。
β−グルクロニダーゼアッセイ
β−グルクロニダーゼをレポーターとして使用し、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９８７，６：３９０１−３９０７において記載されていた方法に従ってアッセイする。
緑色蛍光タンパク質アッセイ
（ｉ）遺伝子サイレンシングサプレッサーｐ１９、および別々に（ｉｉ）橈脚類Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔａからの緑色蛍光タンパク質の改善されたバリアント（ＴｕｒｂｏＧＦＰとして商業的に入手可能（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、カタログ番号ＦＰ５５２））を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１の細胞により、タバコ植物を共インフィルトレーションする。ｐ１９の発現は二重カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターによって駆動される。ＴｕｒｂｏＧＦＰの発現は、最小のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびササゲモザイクウイルス（ＨＴ−ＣＰＭＶ）の５’ＵＴＲによって駆動される。インフィルトレーション混合物の細菌濃度を、２つの細菌懸濁液（１つはＴｕｒｂｏＧＦＰのコード配列および他はｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーを含む）の各々についてＯＤ600＝０．１６に調整する。インフィルトレーションのための植物は、２０時間の明期間および４時間の暗期間、２６℃／２０℃昼／夜の温度および７０％／５０％の相対湿度（昼／夜）で、ロックウールブロックにおいて温室中で成長させる。植物に地下灌水により肥料を与える。標準的なインフィルトレーションプロトコルに従って、または実施例１中で記述されるようなシリンジインフィルトレーションによって、植物を５０ｍｂａｒで１分間インフィルトレーションする。
バキュームインフィルトレーション直後に、植物は、葉の残存する過剰なインフィルトレーション溶液を減少させるためにラック上で２、３分間で上下逆さまで吊り下げ、次いで実験の残りのパートのために温室ベンチ上に配置する。インフィルトレーション後の肥料処方は前インフィルトレーションと同じに維持し、液肥灌漑はドリップ灌水システムを介して１日２回４５秒間供給する。植物におけるＧＦＰ発現を定性的および定量的に解析する。ＧＦＰの定性的な推測は、ＴｕｒｂｏＧＦＰ（励起波長＝４８２ｎｍおよび放射波長＝５０２ｎｍ）の励起の範囲内で光を放射する青色光（ＨＬ３２Ｔハンドランプ、Ｃｌａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ）下で実行する。葉におけるＧＦＰの定量分析は、ブルーオプティカルキット（励起波長＝４９０ｎｍおよび放射波長＝５１０〜５７０ｎｍ）による蛍光モードにおいてモジュラスマイクロプレートリーダー（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光測定によって決定する。任意の与えられた収穫ポイントで、およそ８０ｍｇの葉ディスクを、１処理あたり３植物から、１植物あたりの５枚の葉（位置１〜５から完全に伸びた葉が０であることは茎頂端分裂組織および１は第１の葉を示す）から葉ディスクパンチャーにより回収する。サンプルを液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存し、次いで５０ｍＭトリス、２ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００および４Ｍの尿素、ｐＨ７．４を含む１ｍｌの抽出バッファーの存在下においておよそ２．５分間ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中で粉砕する。粉砕後に、サンプルを微量遠心分離機中で最高速度で１０分間遠心分離し、５００μｌの上清を回収し、分析まで−２０℃で保存する。単一植物の５枚の葉からサンプルは、単一の微量遠心機用チューブ中の各々の抽出物から２００μｌの上清を回収することによってプールする。プールした抽出物を４℃で１０分間再び遠心分離し、７００μｌの上清を新鮮なチューブに移す。蛍光の定量化のために、５μｌの上清を１９５μｌの抽出バッファー中で希釈し、マイクロプレートリーダーにおいて測定する。ＧＦＰの濃度は、市販の組換えＴｕｒｂｏＧＦＰタンパク質により作製した標準曲線を使用して計算する。対照タバコ植物の抽出物に異なる量の組換えＴｕｒｂｏＧＦＰタンパク質を添加し、抽出バッファー中で１：４０に希釈することによって、標準曲線を準備する。
実施例４：一過性発現によるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種の比較
この実施例は、（ｉ）アグロインフィルトレーション後の９０を超えるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種における単クローン抗体Ｃ５−１の発現および（ｉｉ）インフィルトレーションの前後の植物の表現型の特徴の比較を記述する。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種
表１中でリストされるような９０を超える（＞９０）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種が、組換えタンパク質の一過性発現のための好適なタバコ系統を同定することを目的として試験される。タバコ系統は、世界中で栽培されるタバコタイプの可能な限りの多様性を含むように（熱気送管乾燥タバコ、Ｂｕｒｌｅｙタバコ系統、オリエンタルタバコ系統、セミオリエンタルタバコ系統および葉巻きラッパータバコ系統を含む）選択される。以下のタバコ品種を試験する。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＡＡ ３７−１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂ １３Ｐ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ−Ｍｏｒ）、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤ＃３ Ｈｙｂｒｉｄ １０７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂｅｌ−Ｗ３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ７９−６１５、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＢＵ２１×Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤＣ＃２ Ｈｙｂｒｉｄ ４９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤＣ＃４ Ｈｙｂｒｉｄ １１０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ０１６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤＣ＃５ ＫＹ １６０ ＳＩ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤＣ＃７ ＦＣＡ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＴＲＤＣ＃６ ＴＮ ８６ ＳＩ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ０２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ １４９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ３２６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ３４６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ３５８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ３９４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ３９９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋ ７３０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １６０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ ８９５９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ ９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ ９０７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ ６０９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭｃＮａｉｒ ３７３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ２０００、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＧ ０１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＧ ０４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＯ１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＯ２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＯ３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＲＧ １１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＲＧ １７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＲＧ ８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ−２８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＮ ８６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＮ ９０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＶＡ ５０９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＡＳ４４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｔｅｋ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｃ１０４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ０９２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｄｊｅｂｅｌ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＤＶＨ ４０５ ８１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＨＢ０４Ｐ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１０２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １４ｘＬ８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＹ １７１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＬＡ ＢＵ ２１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭｃＮａｉｒ ９４４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ２３２６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ７１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ２９７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＶＨ ０３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＶＨ ０９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＶＨ １９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＶＨ ２１１０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｐｌａｋ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｓｉｍｍａｂａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｔａｌｇａｒ ２８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＮＣ ４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＲ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ−７２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２−２／１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｙａｋａ ＪＫ−４８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＩ−１０６８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＫＤＨ−９６０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＩ−１０７０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＷ１３６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２０４、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２０５、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｓｍａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＫＦ ４０２８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｌ８、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＫＦ ２００２、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＴＮ９０、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＧＲ１４１、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＧＲ１４９、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２１６、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２１７、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＧＲ１５３、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２１５。
タバコ品種は、ノースカロライナ州立大学、作物学部（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）のＮｉｃｏｔｉａｎａコレクションから得ることができる。すべての系統について、農学的パラメータ（バイオマス、繁殖性、均質性）および分析パラメータ（全可溶性タンパク質、全プロテアーゼ、全アルカロイド）を測定する。この目的のために、タバコ植物を温室において従来のフロートベッドシステム下で１２ｃｍのポット中で個別に成長させる。農学的パラメータおよび分析パラメータを収穫時に測定する。一過性発現研究は第１および第２のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁物のシリンジ共インフィルトレーションによって実行される。第１のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁物は、植物調節エレメントの制御下に単クローン抗体のコード配列を含むバイナリーベクターを保有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１細菌である。第２のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁物は、植物調節エレメントの制御下にキュウリ壊死ウイルスのｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーのコード配列を保有するＡＧＬ１細菌である。すべてのインフィルトレーション実験を３植物各々において三重で実行する。１つの追加の植物を各々のタバコ系統についての対照として維持する。
遺伝子コンストラクト
遺伝子コンストラクトＣ７は、プラストシアニンｐＰＣプロモーターおよびターミネーター配列の制御下に単クローン抗体Ｃ５−１の重鎖および軽鎖を含む２本の発現カセットを含有するｐＣａｍｂｉａ由来バイナリーベクターである。遺伝子コンストラクトＣ３２は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御下にキュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）のｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーを含む発現カセットを含有するｐＫＹＬＸ７由来バイナリーベクターである。すべてのバイナリーベクターはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１中にある。
Ｃ５−１単クローン抗体の一過性発現
タバコ植物を温室において１２ｃｍのポット中で個別に成長させる。各々のタバコ品種の３植物を、実施例１中に記述されるようなシリンジを使用して細菌懸濁液によりインフィルトレーションする。インフィルトレーションの６日後に、１つの植物からすべてのインフィルトレーションした葉をヒートシール可能なバッグ中に回収し、−８０℃に凍結し、次いで細粉に粉砕し、完全にホモジナイズする。各々の植物の全可溶性タンパク質は、３ｍｌの抽出バッファー中でおよそ１ｇの凍結重量の粉砕葉粉末から抽出する。抽出バッファーは、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、４Ｍ尿素および２ｍＭ ＤＴＴである。参照として、同じアグロバクテリウム懸濁物により同時にインフィルトレーションしたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物について、同一の抽出物を調製する。Ｃ５−１の発現の分析のために、植物抽出物を２００倍希釈し、連続希釈物を、Ｅａｓｙ−ｔｉｔｅｒ ＥＬＩＦＡドットブロット免疫アッセイシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してニトロセルロース膜上にスポットする。ニトロセルロース膜は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（カタログ番号＃１１５−０．５−２０５）からのＨＲＰ標識抗体により１：５０００希釈でインキュベーションする。膜上のシグナルを視覚的に分析し、参照のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ抽出物の連続希釈物のものと比較したシグナル強度の視覚的解釈に基づいて、各々の植物にスコアを与える。スコアリングは以下のとおりである。
＋＝検出可能であるが、参照サンプルのシグナルの２５％未満のスポット、
＋＋＝参照サンプルのシグナルの２５〜５０％の間、
＋＋＋ ＝参照サンプルのシグナルの５０〜１００％の間。
結果
シグナルは対照植物において検出されず、試験した９０品種から２６品種が適切な発現を示し、＋＋スコアを有する。６４品種が発現を示さないか、またはわずかな発現しか示さない。単クローン抗体Ｃ５−１の発現を示す２６品種のリストを表２中に提示する。
実施例５：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおける緑色蛍光タンパク質の一過性発現に対する遺伝子サイレンシングサプレッサーの効果
この実施例において、アグロインフィルトレーションを使用する多数のタバコ品種におけるレポーター遺伝子コンストラクトの発現に対する様々な遺伝子サイレンシングサプレッサーの効果の比較が記述される。（ｉ）遺伝子サイレンシングサプレッサーの発現を駆動するプロモーター、および（ｉｉ）標的タンパク質対遺伝子サイレンシングサプレッサーの比率の効果も記述される。
レポーターおよび遺伝子サイレンシングサプレッサーコンストラクト
緑色蛍光タンパク質遺伝子はＥｖｒｏｇｅｎのＴｕｒｂｏＧＦＰ（ｔＧＦＰ）遺伝子である（実施例３を参照されたい）。ＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターおよびＨＴ−ＣＰＭＶ配列およびＮＯＳターミネーター配列の制御下にｐＢＩＮＰＬＵＳ中にクローン化され、遺伝子コンストラクトｐＣ９１を生じる。以下の遺伝子サイレンシングサプレッサーを試験する。キュウリ壊死ウイルス（ＣＮＶ）のｐ１９タンパク質、コメ黄色斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）のｐ１タンパク質、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）のｐ２５タンパク質、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）のＡＣ２タンパク質、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の２ｂタンパク質およびタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）。遺伝子サイレンシングサプレッサー、ＲＹＭＶのｐ１、ＰＶＸのｐ２５、ＡＣＭＶのＡＣ２、ＣＭＶの２ｂ、ＣＮＶのＰＶＹおよびｐ１９のＨｃＰｒｏを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびターミネーター配列の制御下にセンスの向きで、ｐＢＩＮ６１（Ｂｅｎｄａｈｍａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ，２０００，２１：７３−８１）のＳｍａＩ部位において平滑末端でクローン化して、それぞれ遺伝子コンストラクト、ｐＣ１８、ｐＣ１９、ｐＣ２０、ｐＣ２１、ｐＣ１２０およびｐＣ３２を生成する。すべての配列は公的に利用可能である。
プロモーター遺伝子コンストラクト
遺伝子サイレンシングサプレッサーの発現を駆動する様々なプロモーターの効果を試験するために、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御下で遺伝子コンストラクトｐＣ３２中に存在するようなＣＮＶのｐ１９を、（ｉ）ノパリンシンターゼｐＮＯＳプロモーターの制御下にも配置し（遺伝子コンストラクトｐＣ２２４）、（ｉｉ）Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ栽培品種ＷＬ３５７ＨＱプラストシアニンプロモーターｐＰＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＦ６２８５０６．１）の制御下にも配置し、ｐＢＩＮ６１関連遺伝子コンストラクトｐＣ２２６を生じる。
植物材料
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍのＰＭ６７、ＰＭ８１、ＰＭ９２、ＰＭ１２８、ＰＭ１３２、ＰＭ１３３およびＰＭ２０４植物を、実施例４中で記述されるような温室において成長させる。
発現のインフィルトレーションおよび分析
６および７週間齢の植物を実施例１中で記述されるようなバキュームインフィルトレーションによってインフィルトレーションする。すべての遺伝子コンストラクトはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１中である。Ａ１８はＡＧＬ１（ｐＣ１８）であり、Ａ１９はＡＧＬ１（ｐＣ１９）であり、Ａ２０はＡＧＬ１（ｐＣ２０）であり、Ａ２１はＡＧＬ１（ｐＣ２１）であり、Ａ３２はＡＧＬ１（ｐＣ３２）であり、Ａ１２０はＡＧＬ１（ｐＣ１２０）であり、Ａ２２４はＡＧＬ１（ｐＣ２２４）であり、Ａ２２６はＡＧＬ１（ｐＣ２２６）であり、Ａ９１はＡＧＬ１（ｐＣ９１）である。緑色蛍光タンパク質の発現の分析は実施例３中で記述された通りである。
様々なＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種および遺伝子サイレンシングサプレッサーの試験結果
タバコにおけるｔＧＦＰ発現を促進する様々な遺伝子サイレンシングサプレッサーの効率をＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物中のものに比較する。２つの品種、ＰＭ９２およびＮ．ｔａｂａｃｕｍ Ｗｉｓｌｉｃａがより明らかな壊死および白化を提示した。遺伝子サイレンシングサプレッサーのどれもＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて目視可能なストレス病徴を引き起こさなかった。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるｔＧＦＰの発現をインフィルトレーションの６日後に青色光下でチェックし、最も良好な結果は、非常に強いＧＦＰ蛍光シグナルを産生したｐＣ１２０遺伝子コンストラクトにより共トランスフェクションした植物により得られる。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ葉におけるｔＧＦＰ蛍光は、試験した７つの品種すべてのタバコ植物でｐＣ１２０中のＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーにより共トランスフェクションされる場合、最も高い（図２）。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２０４がＲＹＭＶのｐ１遺伝子サイレンシングサプレッサー（Ａ１８におけるｐＣ１８；図２）およびＡＣＭＶのＡＣ２遺伝子サイレンシングサプレッサー（Ａ２０におけるｐＣ２０；図２）により共インフィルトレーションされた場合も、適切な発現が見出される。最も良好な結果は試験した遺伝子サイレンシングサプレッサーの３つについてＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ２０４で得られ、最も高い発現はＨｃＰｒｏ（ｐＣ１２０）により共インフィルトレーションされた場合に見出され、続いてＡＣ２（ｐＣ２０）およびｐ１（ｐＣ１８）である。
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２および２０４ならびに遺伝子サイレンシングサプレッサーの試験結果
ＰＭ１３２およびＰＭ２０４におけるｔＧＦＰ発現に対するＴＥＶのＨｃＰｒｏ、ＡＣＭＶのＡＣ２およびＣＮＶのｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーの効果を、６週齢の植物において試験する。加えて、ＣＮＶのｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーを駆動する３つの異なる植物発現可能なプロモーターの効果を試験する。以下のプロモーターを試験する。ｐＣ３２中のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびターミネーター、ｐＣ２２４中のノパリンシンターゼプロモーターおよびターミネーター、ならびにｐＣ２２６中のｐＰＣプラストシアニンプロモーターおよびターミネーター。インフィルトレーションの６日後のｔＧＦＰ発現レベルの定量化から、ＨｃＰｒｏサイレンシングサプレッサーがｔＧＦＰ遺伝子コンストラクトを保有するＡ９１と組み合わせて使用される場合のみに、高い発現が得られることが示された。ＰＭ１３２およびＰＭ２０４における発現レベルは他の遺伝子サイレンシングサプレッサーについて得られたものよりも３倍以上高い。顕著なことには、６週間齢のタバコ植物をインフィルトレーションする場合、７週間齢の植物に比較して、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４におけるｔＧＦＰ発現レベルの最大１０倍の増加が観察される。
実施例６：タバコ品種のバイオマス産生性、アルカロイド、全可溶性タンパク質および全プロテイナーゼ活性の比較
この実施例は、多数のＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種のバイオマス産生性、全可溶性タンパク質含有量、プロテイナーゼ含有量およびアルカロイド含有量の比較を提供する。
植物材料
表１中でリストされ実施例５中で記述されたタバコ品種はすべて、従来のフロートベッドシステムを使用して、２８８セルスタイロフォームトレー（０．２５ｍ2／トレー）中で成長させる。タバコ品種は温室中で乱塊法デザインを使用して２つの重複で成長させる。様々なステージで葉を収穫して、葉の全可溶性タンパク質含有量、全プロテアーゼおよびアルカロイド含有量を決定する。温室で成長させたタバコ植物の葉を温室中で回収し、液体窒素中で迅速に凍結し、細粉に粉砕し、５０ｍｌのチューブに移し、アッセイが実行されるまで−８０℃で保存する。
酵素アッセイのための葉材料の抽出
粉砕タバコ葉粉末を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５へＮａＯＨにより緩衝）、１％不溶性ＰＶＰおよび０．１％ β−メルカプトエタノールを含有する４体積の抽出バッファーと混合する。ホモジネートを１２００ｇで１０分間遠心分離し、プロテアーゼ酵素活性の決定および全可溶性タンパク質含有量の決定のために上清を使用する。
酵素アッセイ
アゾコールを消化する活性（アゾコラーゼ）は、Ｒａｇｓｔｅｒ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７９，６４：８５７−８６２によって記述されるように、アゾコール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）からの赤色色素の放出の測定によって決定される。２０ｍｇのアゾコール基質を２ｍｌの全体積の２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）バッファー中で５０〜１００μｌの酵素抽出物と混合し、３７℃で１５分間ウォーターバス中でインキュベーションする。反応はチューブを２℃まで１５分間冷却することによって終了させ、次いで２０００ｇで１０分間遠心分離する。上清を分光光度計中に置き、消光を５２０ｎｍで測定する。
アルカロイドの決定
０．１ｇの粉砕タバコ葉粉末をガラスバイアルの中へ移し、０．５ｍｌの水酸化ナトリウム溶液（２Ｎ ＮａＯＨ）を加える。１５分間後に、０．４ｍｇ／ｍｌのキノリンを含有する５ｍｌのメチル−ｔｅｒｔブチルエーテル溶液を添加し、サンプルを２．５時間振盪する。最上層の流体を新しいガラスシンチレーションバイアルに移し、測定のためにＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ＸＬガスクロマトグラフオートサンプラー上にロードする。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｉｔｒａｇｅ ｚｕｒ Ｔａｂａｋｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００５，２１：３６９−３７９によって記述されるように、アルカロイドの量を測定する。
全可溶性タンパク質
葉抽出物中の全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，７２：２４８−２５４中で記述されるように、５９５ｎｍのマイクロプレートリーダー上の吸光度測定によって、クマシー−プラスアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定する。抽出物を超純水中で１：１０に希釈し、１０μＬを平底マイクロプレートに三重でロードする。
結果
Ｃｏｋｅｒ ３４７、ＰＭ１３２、ＰＭ０９２、ＰＭ２０４、ＰＭ１０２およびＳａｐｌａｋの抽出物のプロテアーゼ活性は、それぞれ１４５．６、１１８．４、１１６．６、１０９．８、３９．７および１５．１であった。Ｆ４（ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ）／９７、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２、ＰＭ２０４、ＰＭ０９２の葉バイオマス産生性（ｇ／ｍ2）は、それぞれ４００９３８、３１８３０６、１９０５０６、１８７４４２および１８７４２２であった。ＰＭ０１６、ＰＭ０２１、ＰＭ０９２、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４のアルカロイド含有量（ｍｇ／ｇ葉組織）は、それぞれ３．５７、１．７９、０．４１、３．２、０．７９および０．６６である。ＰＭ０１６、ＰＭ０２１、ＰＭ０９２、ＰＭ１０２、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４の抽出物のタンパク質含有量（μｇ／ｍＬ抽出物）は、それぞれ５２５、３７４、３１７、２８８、２６１および３１１である。
実施例７：一過性発現に対するアグロバクテリウム株の効果
この実施例において、標的タンパク質の発現に対する、６つの異なるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株をタバコ品種のアグロインフィルトレーションのために使用する効果が記述される。
アグロバクテリウム株およびバイナリーベクター
一過性発現に対するアグロバクテリウム株の効果を試験するために、各々が遺伝子コンストラクトｐＣ９１を保有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ２２６０、ＧＶ３１０１、Ｃｒｙ５およびＬＢＡ４４０４により、実施例１中で記述されるように、タバコ植物をバキュームインフィルトレーションする。ｐＣ９１は、ｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクター中にカリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターおよびＨＴ−ＣＰＭＶリーダー配列およびノパリンシンターゼターミネーター配列の制御下のｔＧＦＰ遺伝子を含有していた。すべてのものは、ＨｃＰｒｏの発現可能な配列を含むｐＣ１２０を保有するＡＧＬ１により共インフィルトレーションする。Ａ９１はＡＧＬ１（ｐＣ９１）であり、Ｅ９１はＥＨＡ１０５（ｐＣ９１）であり、Ｇ９１はＧＶ２２６０（ｐＣ９１）であり、Ｌ９１はＬＢＡ４４０４（ｐＣ９１）であり、Ｖ９１はＧＶ３１０１（ｐＣ９１）であり、Ｙ９１はＣｈｒｙ５（ｐＣ９１）であり、Ａ１２０はＡＧＬ１（ｐＣ１２０）である。
イノキュラムの調製
アグロバクテリウム培養は、２．０を超える最終光学的密度（ＯＤ600）まで、適切な抗生物質を補足したＬＢ Ｍｉｌｌｅｒ ＭＥＳ ｐＨ５．６中で増殖させる。細菌を遠心分離によって収穫し、インフィルトレーション溶液（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．６）中に再懸濁する。各々の実験において、コンストラクトｐＣ９１を保有するアグロバクテリウム懸濁物を、サイレンシングサプレッサーのために遺伝子を保有するアグロバクテリウム懸濁物と等容量で混合して、６×濃縮イノキュラムを生成する。インフィルトレーションの日に、濃縮イノキュラムをインフィルトレーション溶液中で１×の最終濃度（約０．３のＯＤ600に対応する）まで希釈し、室温に平衡化する。
植物材料
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのＢｕｒｌｙ、ＰＭ１６、ＰＭ２１、Ｋ１４９、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＭ９２、Ｓｉｍｍａｂａ、ＰＭ１３２、Ｗｉｓｌｉｃａ ２１、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３およびＰＭ２０４植物は、２０時間の明および４時間の暗の光周期レジーム、２６℃／２０℃昼／夜の温度および７０％／５０％昼／夜の相対湿度下で、１２ｃｍのポットにおいて温室中で成長させる。
植物のインフィルトレーション
植物を実施例１中で記述されるような真空下でインフィルトレーションする。人工照明（８０〜１００μｍｏｌ光子／ｃｍ2）をインフィルトレーションプロセス全体の間で維持して一貫した光条件を保証する。インフィルトレーション後に、植物は収穫まで温室中に戻す。白化（葉の黄ばみ）および壊死病変（「死んだ」スポット）等のストレス病徴の出現を、インフィルトレーションしなかった対照に対してインフィルトレーションした植物を比較することによって、視覚的にモニタリングする。成長条件（施肥、光周期および温度等）は、インフィルトレーション前に使用されたものと同じであるが、ここでは水および肥料はドリップ灌水システムを使用して植物に与える。インフィルトレーションの４〜６日後に、植物を青色光下に置き、蛍光を示すインフィルトレーションした葉をすべて回収し、ジップバッグ中に置き、分析のためにプロセシングするまで−８０℃で保存する。
Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰのイメージングおよび定量化
収穫された葉におけるｔＧＦＰの蓄積を、暗チャンバー中で青色光下でモニタリングする。収穫した葉をドライアイス下で細粉にホモジナイズし、１．００ｇ±０．０５ｇの粉末の凍結重量のサンプルを、３ｍｌの抽出バッファー（５０ｍＭトリスベース；１００ｍＭ ＮａＣｌ；ＥＤＴＡ １ｍＭ；０．２％トリトンＸ−１００；ｐＨ７．５）中で、２工程の２０秒間のボルテックス、続いて２００００ｇで１５分間の遠心分離によって抽出する。可溶性抽出物を分析のために冷凍する。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ抽出物を抽出緩衝液中で１：５０に希釈し、２００μＬを黒色９６ウェルプレートに三重でロードする。抽出物中のＴｕｒｂｏＧＦＰ濃度は、ブルーオプティカルキット（励起波長：４９０ｎｍ／放射波長：５１０〜５７０ｎｍ）によりモジュラスマイクロプレートリーダー（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光測定によって決定する。サンプルの蛍光は、インフィルトレーションしなかった対照植物の抽出物の自己蛍光を引くことによって補正する。抽出バッファー中で最終的に１：５０で希釈したインフィルトレーションしなかった抽出物に、４０００〜１２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でＴｕｒｂｏＧＦＰ対照タンパク質（ｒＴｕｒｂｏ ＧＦＰ、Ｅｖｒｏｇｅｎ ＃ＦＰ５５２）を添加することによって、標準曲線を準備する。
結果
植物を２つのバッチでインフィルトレーションする。最初に、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのＢｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ０１６、ＰＭ２１、Ｋ１４９、ＰＯ１、ＰＯ２、ＳｉｍｍａｂａおよびＰＭ１３２をｔＧＦＰの発現のためにインフィルトレーションし、分析する。インフィルトレーションの６日後に、アグロバクテリウム株Ｃｒｙ５およびＧＶ２２６０が、試験した大部分のタバコ品種の葉上に白化および壊死病変を含む重篤なストレス反応を引き起こしたことを観察できた。加えて、タバコ品種ＰＭ０１６、ＰＭ２１およびＫ１４９はアグロインフィルトレーションに極めて感受性が高いようであり、強い壊死が試験した多くの株で観察される。試験したすべての株について最も高い発現が一貫してＰＭ１３２にある（図３Ａ）。意外にも、２倍以上高い発現は、ｐＣ９１遺伝子コンストラクトを保有するアグロバクテリウム株ＡＧＬ１およびＥＨＡ１０５について得られ、それはおよそ７００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量に到達し、比較するとＧＶ２２６０は４００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量、ＧＶ３１０１は２００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量ならびにＣｒｙ−５およびＬＢＡ４４０４は１００ｍｇ未満のｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量である。タバコ品種のＢｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ０１６、ＰＭ２１、Ｋ１４９、ＰＯ１、ＰＯ２およびＳｉｍｍａｂａは、使用されるアグロバクテリウム株に依存して、０〜およそ２００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量最大値で変動するはるかに少ないｔＧＦＰを産生した。両方の遺伝子コンストラクトを送達するためにＡＧＬ１を使用する場合、タバコ品種のＰＭ９２およびＰＭ２０４は最大４００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量を産生した。顕著なことには、ＰＭ２０４はＥＨＡ１０５を使用する場合も最大４００ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ凍結葉重量を産生するが、他のタバコ品種のＰＭ９２およびＰＭ１８１は同じ細菌を送達のために使用すると、この量の２分の１しか産生しない（図３Ｂ）。
結論
対象となるコンストラクト（ＨＴ−ＣＰＭＶベースの発現カセット中でｔＧＦＰレポーター遺伝子により示される）を保有するＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＡＧＬ１またはＥＨＡ１０５およびサイレンシングサプレッサー（ＨｃＰｒｏ）を保有するＡＧＬ１からなる組み合わせは、この実験中でｔＧＦＰの最も高い蓄積を引き起こした。２つのタバコ品種ＰＭ１３２およびＰＭ２０４は最も高いレベルのｔＧＦＰを蓄積したものであり、ＰＭ１３２をインフルエンザ赤血球凝集素Ｈ５ポリペプチドの組換え産生に関してさらに試験する（実施例８を参照されたい）。
実施例８：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおける赤血球凝集素Ｈ５の一過性発現
この実施例において、アグロインフィルトレーションを使用するＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種における赤血球凝集素Ｈ５の一過性発現が記述される。
アグロバクテリウム株、遺伝子コンストラクトおよび植物
遺伝子コンストラクトｐＣ７１は、最小のカリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターおよびＨＴ−ＣＰＭＶの５’ＵＴＲならびに３’末端にノパリンシンターゼターミネーターおよびＨＴ−ＣＰＭＶの３’ＵＴＲの制御下に配置したインフルエンザＨ５Ｎ１株の赤血球凝集素５（Ｈ５）遺伝子のコード配列を含む、ｐＢＩＮ６１由来バイナリーベクターである。ｐＣ１２０を上記のように共インフィルトレーションして、ＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを提供する。ｐＣ７１およびｐＣ１２０の両方は同じＡＧＬ１株中に存在する。１４のＰＭ１３２植物を、実施例７中で前述されるように成長させ、ＡＧＬ１（ｐＣ７１）およびＡＧＬ１（ｐＣ１２０）によりインフィルトレーションする。
抽出およびウエスタン分析
前述されるように、葉をすべて収穫し、−８０℃に凍結し、粉末に粉砕し、ホモジナイズする。組換えにより産生されたＨ５タンパク質の検出は、インフィルトレーションしたＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２の粗製抽出物、および同じアグロバクテリアによりインフィルトレーションしＨ５タンパク質を一過性発現する対照Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を使用する、ウエスタンブロットによる。図４は、粗製抽出物のウエスタン分析の結果、およびＨ５について予想される分子量（７５ｋＤａ）のバンドを示す。図４から、Ｈ５の強度がＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２およびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの抽出物について同等であることも明らかである。７５ｋＤａのバンドはインフィルトレーションしなかった野生型対照中で検出されない。
抽出物の赤血球凝集素活性
赤血球凝集素は赤血球において赤血球の表面上に存在する単糖シアル酸に結合する能力を有する。赤血球凝集を使用して赤血球凝集素タンパク質の相対的活性を決定することができ、これを使用してＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２粗製抽出物および前述されるようにＨ５を一過性発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの中に存在する組換えＨ５の生物学的活性を決定する。植物抽出物の１．５倍の連続希釈物を調製し、９６ウェルマイクロプレート中で赤血球と混合する。赤血球凝集素に結合されない赤血球は沈降し積もって緊密なボタンを形成する。赤血球凝集素に結合される赤血球はウェルをコートする格子を形成する。正確に集合したホモ三量体赤血球凝集素のみが赤血球を結合するだろう。Ｈ５タンパク質を一過性発現する前述のタバコ植物の抽出物で実行された赤血球凝集アッセイは、ＰＭ１３２の抽出物が赤血球凝集活性を有することを示し、正確に折り畳まれた三量体Ｈ５がバキュームインフィルトレーションしたＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２において産生されることが指摘された。
実施例９：リツキシマブ単クローン抗体の一過性発現
リツキシマブ単クローン抗体発現ベクターの構築
リツキシマブは、ヒトＣＤ２０を結合するマウス／ヒトキメラ単クローンＩｇＧ１抗体である。リツキシマブは、多くのリンパ腫、白血病、移植拒絶およびいくつかの自己免疫疾患の治療において使用される。ＣＡＳ登録番号１７４７２２−３１−７またはＷＯ０２／０６０９５５中のようなリツキシマブ単クローン抗体軽鎖および重鎖の全コード配列を含む発現カセットを、タバコ植物細胞における発現に至適化されたコドンで、化学合成によって作製する。
＞Ｃ１４８中としてのリツキシマブ成熟重鎖（タバコ至適化された）配列
caagttcaacttcaacaaccaggtgctgaacttgttaagcctggtgcttctgttaagatgtcttgcaaggcttctggatacactttcacatcctacaacatgcattgggttaagcaaactccaggacgtggacttgaatggattggagctatctaccctggaaacggtgatacttcctacaaccagaagttcaagggaaaggctactcttactgctgataagtcctcttccactgcttacatgcaactttcttcactcacttccgaggattctgctgtttattactgcgctaggtccacttattatggtggagattggtacttcaatgtttggggagctggaactactgttactgtgtctgctgcttctactaagggaccatctgtttttccacttgctccatcttctaagtctacttccggtggaactgctgctcttggatgccttgtgaaggattatttcccagagccagtgactgtttcttggaactctggtgctcttacttctggtgttcacactttcccagctgttcttcagtcatctggactttactccctttcttctgttgttactgtgccatcttcttcacttggaactcagacttacatctgcaacgttaaccacaagccatctaacacaaaagtggataagaaggcagagccaaagtcttgtgataagactcatacttgtccaccatgtccagctccagaacttcttggtggtccatctgttttcttgttcccaccaaagccaaaggatactctcatgatctctaggactccagaagttacttgcgttgttgtggatgtttctcatgaggacccagaggttaagttcaactggtacgtggatggtgttgaagttcacaacgctaagactaagccaagataggaacagtacaactctacttaccgtgttgtgtctgtgcttactgttcttcaccaggattggcttaacggaaaagagtacaaatgcaaggtttccaataaggctttgccagctccaattgaaaagactatctccaaggcaaaaggacagcctagagagccacaggtttacactcttccaccatctagagatgagcttactaagaaccaggtttcccttacttgtcttgtgaagggattctacccatctgatattgctgttgagtgggagtcaaacggacagcctgagaacaactacaagactactccaccagtgcttgattctgatggttccttcttcctctactccaaactcactgtggataagtctagatggcagcagggaaatgttttctcttgctccgttatgcatgaggctctccataatcactacactcagaagtccctttctttgtctcctggaaagtga（配列番号：１７）

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR*EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*（配列番号：１８）
成熟重鎖配列はパタチンシグナルペプチドを備えて合成され、特許ＷＯ０９／０８７３９１中のＨＴ−ＣＰＭＶプロモーターならびにＨＴ−ＣＰＭＶの非翻訳５’および３’ＵＴＲ配列ならびにカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター配列の制御下に配置される。
配列番号：１６：ａｔｇｇｃｃａｃｔａｃｔａａａｔｃｔｔｔｔｔｔａａｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａｔｇａｔａｔｔａｇｃａａｃｔａｃｔａｇｔｔｃａａｃａｔｇｔｇｃｔは、ｐＣ１４８中の免疫グロブリン重鎖遺伝子コード配列の５’末端に挿入されるパタチンシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の一例である。
パタチンシグナルペプチドを持つ軽鎖は、特許ＷＯ０１／２５４５５中のようなプラストシアニンプロモーターおよびターミネーター配列の制御下に配置される。
＞Ｃ１４８中としてのリツキシマブ成熟軽鎖（タバコ至適化された）配列
cagattgtgctttctcagtctccagctattctttctgcttccccaggtgaaaaggttacaatgacttgccgtgcttcttcttctgtgtcctacattcattggttccaacagaagccaggatcttctccaaagccatggatctacgctacttctaaccttgcttctggtgttccagttaggttttctggatctggatctggtacttcttactcccttactatttctagagtggaggctgaagatgctgctacttactactgccaacagtggacttctaatccaccaactttcggaggtggaactaagcttgagatcaagaggactgttgctgctccatctgtgtttattttcccaccatctgatgagcaacttaagtctggaactgcttctgttgtgtgccttctcaacaatttctacccaagggaagctaaggttcagtggaaagtggataatgctctccagtctggaaattctcaagagtctgtgactgagcaggattctaaggattccacttactccctttcttctactcttactctctccaaggctgattatgagaagcacaaggtttacgcttgcgaagttactcatcagggactttcttcaccagtgacaaagtccttcaaccgtggagagtgttga（配列番号：２０）

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*（配列番号：２１）
ｐＣ１４８中の免疫グロブリン軽鎖コード配列の５’末端は、パタチンシグナルペプチドをコードする配列番号：１７のヌクレオチド配列に連結され、コドン使用はタバコにおける発現に至適化される。
ａｔｇｇｃｃａｃｔａｃｔａａｇｔｃｃｔｔｃｃｔｔａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｔｃａｔｇａｔｃｃｔｔｇｃｔａｃｔａｃｔｔｃｔｔｃｔａｃａｔｇｔｇｃｔ（配列番号：１７）
両方の発現カセットを実施例２において記述されるようなｐＣ１００のＴ−ＤＮＡ部分中にクローン化して、ｐＣ１４８を生成する。ｐＣａｍｂｉａ−２３００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２３４３１５．１；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：９８９−９９４）を、プライマーＰＣ２０１Ｆ（５’− ＡＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴＣＡＧ−３’；配列番号：６）およびＰＣ２０２Ｒ（５’−ＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＧＡＴＣＡ−３’；配列番号：７）を使用して、ＰＣＲによって増幅し、ユニークなＳｔｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素切断部位を生じさせる。ｐＣａｍｂｉａ−２３００断片をリツキシマブ発現カセットを含むｐＣ１４８のＳｔｕＩ／ＡｓｃＩ断片にライゲーションして、ｐＣａｍｂｉａ−リツキシマブを生成する。
本発明は、前述の実施形態の任意の１つに記載され上記のようなベクターであって、配列番号：１８に少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を示すヒトＣＤ２０を結合する免疫グロブリンの成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を、Ｔ−ＤＮＡ領域中で植物調節エレメントに作動可能に連結して含むベクターを意図する。
本発明は、前述の実施形態の任意の１つに記載され上記のようなベクターであって、配列番号：２０に少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％の配列同一性を示すヒトＣＤ２０を結合する免疫グロブリンの成熟軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、Ｔ−ＤＮＡ領域中で植物調節エレメントに作動可能に連結し含むベクターも意図する。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物のインフィルトレーション
この研究中で使用されるバイナリーベクターはすべてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１中に導入される。それぞれのアグロバクテリウム株およびバイナリーベクターの選択のために、２８℃および２５０ｒｐｍのロータリーシェーカー上で、エルレンマイヤーフラスコ中の２ｇ／Ｌ牛肉エキス、０．４ｇ／Ｌ酵母エキス、２ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、２ｇ／Ｌショ糖、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4および適切な抗生物質を含むＹＥＢ培地中で、ＯＤ600が１．６を超えるまで、細菌を増殖させる。次いで、培養物を１０ｍＭ ＭＥＳおよび好適な抗生物質を含有する新鮮なＬＢブロスＭｉｌｌｅｒ培地中で１：１００に希釈し、ＯＤ600が２を超えるまで２８℃および２５０ｒｐｍのロータリーシェーカー上でさらに増殖させた。増殖後に、細菌を８０００ｇおよび４℃で１５分間の遠心分離によって回収する。ペレットにした細菌をインフィルトレーション溶液中で２を超えるＯＤ600で再懸濁する。４週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、１つは（ｉ）発現可能なトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）ｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサー（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ５０６２５）；および他は（ｉｉ）ｐＣ１４８またはｐＣａｍｂｉａ−リツキシマブを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系統ＡＧＬ１により、１：１の比率および最終ＯＤ600＝０．３で、共インフィルトレーションする。ＴＢＳＶ ｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーのコード配列は、ｐＢｉｎ１９中の二重カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターおよびターミネーター配列の制御下にある（Ｂｅｖａｎ ＭＷ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）。抽出バッファーが５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、４Ｍ尿素および２ｍＭ ＤＴＴを含む以外は、実施例１中で記述されるように、バキュームインフィルトレーション、収穫および試料採取を実行する。リツキシマブ単クローン抗体の発現はＥＬＩＳＡによって可溶性抽出物中で定量化される。マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を、２．５μｇ／ｍｌの濃度で捕捉抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１重鎖特異的、Ｓｉｇｍａ、＃Ｍ８７７０）により４℃で一晩コートする。標準曲線（４〜８０ｎｇ／ｍｌ）を、モック抽出物（ｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサー細菌懸濁液のみによりインフィルトレーションした葉材料から調製した）中のマウスＩｇＧ１対照タンパク質（Ｂｅｔｈｙｌ、＃ＭＩ１０−１０２）を使用して準備する。可溶性抽出物を希釈バッファー（５０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００）中で１：１０００に希釈し、スタンダードおよびサンプルを三重でロードし、３７℃で１時間インキュベーションする。検出のための抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（＃１１５−０３５−２０５）からのＦｃ特異的ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧであり、１：４００００の希釈で使用して、３７℃で１時間インキュベーションする。抽出物中の全可溶性タンパク質をＰｉｅｒｃｅ（＃２４２３６）からのクマシープラスアッセイ試薬を使用して決定する。各々の組み合わせ（ｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーとｐＣ１４８およびｐ１９遺伝子サイレンシングサプレッサーとｐＣａｍｂｉａ−リツキシマブ）についての６つの実験の結果は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉中のリツキシマブの平均発現は、ｐＣａｍｂｉａ−リツキシマブについての１２２６０ｍｇ／ｋｇ生重量（ＦＷ）葉に比較して、ｐＣ１４８については１３６３０ｍｇ／ｋｇ ＦＷ葉であることを示す。
実施例１０：タバコにおけるインフルエンザＨ５ウイルス様粒子の一過性発現
遺伝子コンストラクト
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）分離株ＴＥＶ７ＤＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ９８６２８８．１）のＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードする遺伝子をｐＣ１００のユニークなＥｃｏＲＩ部位中にクローン化して、ｐＣ１２０を生成する。コード配列は、二重カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＴＥＶ７ＤＡの５’非翻訳領域およびノパリンシンターゼターミネーター配列の制御下にある。成熟赤血球凝集素Ｈ５のコード配列を含む赤血球凝集素Ｈ５Ｎ１ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ５４１３９４．１）のセグメント４を、最小のカリフラワーモザイクウイルス３５プロモーター、ＨＴ−ＣＰＭＶの５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、ならびにノパリンシンターゼターミネーター配列の制御下で、ｐＰＭＰ１のユニークなＥｃｏＲＩ部位中にクローン化して（実施例２を参照）、ｐＣ２２９を生じる。
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物のインフィルトレーションおよびサンプル調製
すべての遺伝子コンストラクトはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１中に導入される。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物を、２０時間の明期間、４時間の夜期間、２６℃／２０℃昼／夜の温度および７０％／５０％の昼／夜の相対湿度で、ロックウールブロックにおいて温室中で成長させる。実施例９中に記述されるように細菌を３．５の最終ＯＤ600まで成長させる。ｐＣ２２９遺伝子コンストラクトおよびｐＣ１２０遺伝子サイレンシングサプレッサーコンストラクトを含有するアグロバクテリウム培養を３：１の比率で混合し、インフィルトレーション溶液中でＯＤ600＝０．８まで希釈する。植物は、１５秒内に大気圧より下の９００ｍｂａｒまで気圧を低下させること、６０秒の保持時間、続いておよそ２秒で大気圧に戻ることによってインフィルトレーションする。インフィルトレーションした植物の葉をインフィルトレーション５日後に１０の植物から回収し、ねじプレス（Ｇｒｅｅｎ Ｓｔａｒ Ｃｏｒｒｕｐａｄ、ＧＳ、Ｋｏｒｅａ Ｃｏ．１０００）を使用してホモジナイズする。メタ重亜硫酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度に添加してサンプル酸化を還元する。抽出物のｐＨをｐＨ５．３に調整し、続いて撹拌せずに２０〜３０分間室温でインキュベーションする。次いでＣｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０％）を抽出物に添加し、１分間混合する。溶液を、Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００（１０ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウム中の１０％Ｃｅｌｐｕｒｅ Ｐ３００スラリー）により前コートされたＷｈａｔｍａｎの濾紙を通して濾過する。超遠心のために、３層のショ糖クッションを超遠心分離機チューブ中に以下のように調製する。１）３ｍｌの８０％ショ糖；２）各々１．５ｍｌの６０％および４５％のショ糖；および３）各々１ｍｌの６０、４５および３５％のショ糖。清澄化および濾過した抽出物サンプル（最大１３ｍｌ）をショ糖勾配の上に穏やかに置き、スイングバケットタイプローター（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｓｕｒｅｓｐｉｎ ６３０；Ｋｅｎｄｒｏ）中で４℃で１時間２４０００ｒｐｍ（１３５０００ＲＣＦ最大値）で超遠心を行なう。ショ糖濃縮サンプルを０．４５μｍフィルターを使用して前濾過し、自動化ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムにて定組成条件下でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行なう。ランニングバッファーはＴＢＳ（ｐＨ７．５）であり、サンプルサイズは、ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１０６９−０１）で１ｍｌ／分のフロー率下で４ｍｌである。精製したＨ５を含有する画分をプールし、３０ｋＤａカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎ 限外濾過膜装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約０．３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さらに分析する。
ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
プールした画分のサンプルを、標準的な技法を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングおよび Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにかける。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上である。対照（Ｃｔｒｌ＋）として、商業的に入手可能な組換えＨ５（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、カタログ＃ＩＴ−００３−００５２ｐ）を使用する。分離後に、タンパク質をＩｍｐｅｒｉａｌ Ｍタンパク質染色（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２４６１５）により染色する。ウエスタンブロットについては、一次抗体はウサギ抗ＨＡ抗体（Ｈ５Ｎ１ ＶＮ１２０３／０４ ＃ＩＴ ００３−００５Ｖ、Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）である。検出のために、ＨＲＰ標識ａｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ ＦＣ断片を使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃１１１−０３５−０４６）。検出は、Ｉｍｍｕｎｏ−ｓｔａｒ ＨＲＰの化学発光キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１７０−５０４０）を使用する化学発光によって行なう。結果をＣｈｉｍｉｏ−Ｃａｐｔ ３０００を使用して捕捉し、それはｐＣ２２９遺伝子コンストラクトによりインフィルトレーションした植物の抽出物中でのＨ５の存在を示す。分子量は市販の組換えＨ５の分子量に類似する。ネイティブ−ＰＡＧＥを４〜１６％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）上で実行する。ローディングのために、サンプルをネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）サンプルバッファー中でジギトニンにより処理し、４℃で１時間インキュベーションする。続いて、ネイティブ−ＰＡＧＥ Ｇ−２５０サンプル添加物（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を０．５％の最終濃度に添加し、サンプルを４〜１６％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＰＡＧＥゲルにロードし、泳動する。ゲルを最初の６０分間１５０Ｖ定圧で４℃で泳動する。続いて、電圧を次の３０分間２５０Ｖに増加し、ゲルをＩｍｐｅｒｉａｌ Ｍタンパク質染色により染色する。ネイティブ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットの結果は、タバコにおける一過性発現後にＨ５の発現が成功したことを示す。
赤血球凝集
Ｈ５タンパク質等の天然の三量体赤血球凝集素（ＨＡ）は単糖シアル酸に結合する能力を有し、それは赤血球の表面上に存在する。赤血球凝集として公知のこの特性は迅速アッセイの基本原理であり、ここで組換えタンパク質の生物学的活性を決定するために使用される。タバコで産生されたＨ５の赤血球凝集活性は、植物抽出物の１．５倍の連続希釈物に加えて、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した抽出物を、特異的な量の赤血球と共に９６ウェルプレート中でインキュベーションすることによって測定する。Ｈ５に結合されない赤血球はウェルの底部に沈み、沈殿物を形成する。ホモ三量体として正確に集合したＨ５のみが赤血球を結合することを指摘することが重要である。赤血球凝集活性は、ｐＣ２２９遺伝子コンストラクトによりインフィルトレーションしたタバコ植物の抽出物に加えて、サイズ排除クロマトグラフィーによって濃縮したｐＣ２２９の画分中で観察される。
実施例１１：タバコトランスフェクションのためのイノキュラム密度の最適化
以下の実験は本発明の方法の最適化を記述する。以下の３つの因子を解析する。（ｉ）イノキュラム中の細菌の最終濃度（０．０５〜０．８５の範囲で）、（ｉｉ）対象となるコンストラクト（ＣＯＩ）およびサプレッサーサイレンシングＳｏＳの比率、すなわちＣＯＩ：ＳｏＳ（３．００〜０．３３の範囲で）；（ｉｉｉ）発現において使用されるタバコ品種（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４）。インフィルトレーションした葉におけるＴｕｒｂｏＧＦＰ発現のレベルをインフィルトレーションの６日後（ＤＰＩ）に測定する。実験は、４つの中心点（ＯＤ600＝０．４５、比率ＣＯＩ：ＳｏＳ＝１．６７：１）および３つの重複測定による外接中心複合計画を合計４８の実行のために使用した。対照として、各々の品種のインフィルトレーションしなかった３植物を、インフィルトレーションした植物と同じコンパートメントおよび条件において成長させる。
イノキュラム調製
ＣＯＩとしてレポーター遺伝子ｔＧＦＰ（Ａ９１）およびＳｏＳとしてサイレンシングサプレッサーＨｃＰｒｏ（Ａ１２０）についての発現カセットを保有する２つのＡＧＬ１のアグロバクテリウム培養を、カルベニシリンおよびカナマイシンを補足した「動物質不含有」ＬＢ Ｍｉｌｌｅｒ（１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ＋１０ｇ／Ｌ植物性トリプトン＋５ｇ／Ｌ酵母エキス）中で、２．０の最終光学的密度（ＯＤ600）まで、成長させる。細菌を遠心分離によって収穫し、上記のインフィルトレーション溶液中で再懸濁する。インフィルトレーションの日に、Ａ９１およびＡ１２０の濃縮イノキュラムを、３つの異なる比率（３：１、１．６７：１および１：３）でともに混合し、０．８５の最終ＯＤ600までインフィルトレーション溶液中で各々希釈する。３つのイノキュラムを室温に３０分間平衡化する。ＯＤ600＝０．８５の３つのイノキュラムをインフィルトレーション溶液中でＯＤ600＝０．４５および０．０５にさらに連続希釈して、より少ない細菌密度を使用する効果を査定する。
アグロバクテリウム媒介性インフィルトレーションおよびバイオマス収穫
タバコ植物を、実施例１中で記述されるように、インフィルトレーションし、インキュベーションし、収穫する。ｔＧＦＰの抽出および定量化を、実施例３中で記述されるように実行する。抽出バッファー中で最終的に１：５０で希釈したインフィルトレーションしなかった抽出物に、４０００〜１２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でＴｕｒｂｏＧＦＰ対照タンパク質（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を添加することによって、標準曲線を準備する。
結果
アグロバクテリウムＯＤ600およびＣＯＩ：ＳｏＳがＮ．ｔａｂａｃｕｍ品種におけるｔＧＦＰ発現レベルに影響を及ぼすかどうか決定するために、両方の因子を同時に変動させる限定された実験のセットを実行する。品種Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４のタバコ植物は、０．８５、０．４５および０．０５のＯＤ600ならびに３．００、１．６７および０．３３のＣＯＩ：ＳｏＳ比率で、Ａ９１およびＡ１２０によりインフィルトレーションする。以前の実験から予想されるように、葉の黄ばみというアグロインフィルトレーションに対するストレス反応が、試験した３つのタバコ品種においてインフィルトレーションの６日後に観察される。病徴はイノキュラム中の細菌密度とともに増加した。品種Ｂｕｒｌｅｙ ２１は、最低の密度ででさえより明らかな葉の黄ばみを提示した。小さな壊死病変は、ＯＤ600＝０．８５のイノキュラムによりインフィルトレーションしたＰＭ１３２およびＰＭ２０４の葉上で目視可能であるが、病変の多くは葉の基部部分に限定されている。ストレス病徴は主にイノキュラム密度のためであり、ＣＯＩ：ＳｏＳ比率の明らかな効果は観察されない。
次に、３つのタバコ品種すべてについて信頼できる回帰モデルを使用して、実験空間内のｔＧＦＰ発現を補間する。結果は統計的に妥当であると示される。観察された病徴にもかかわらず、ＴｕｒｂｏＧＦＰの蛍光定量からは、光学的密度の増加に対する植物ストレス反応と試験した範囲内の発現レベルとの間で負の相関性は示されない。高いＯＤで強い黄ばみまたは壊死病変を提示する葉は、それでもなお少ないＯＤでのものよりも高いｔＧＦＰレベルを発現する。イノキュラム密度およびＣＯＩ：ＳｏＳ比率に対する予測された反応は、３つのタバコ品種すべてについて、ならびにイノキュラム中の高いアグロバクテリウム光学的密度および高いＣＯＩ：ＳｏＳ比率で達成することができる３つのすべての最大発現について類似しており（図５）、両方の因子が一過性組換えタンパク質発現に影響を及ぼすことが確認される。最も高い発現レベルはＰＭ１３２およびＰＭ２０４について観察された（図５ＢおよびＣ）。
３つの品種の各々について同定される最適パラメータは以下のとおりである。Ｂｕｒｌｅｙ ２１についてＯＤ600＝０．６９；ＣＯＩ：ＳｏＳ＝２．４０、ＰＭ１３２についてＯＤ600＝０．７４２８；ＣＯＩ：ＳｏＳ＝２．８０５８およびＰＭ２０４についてＯＤ600＝０．６７２９；ＣＯＩ：ＳｏＳ＝２．０８０５。これらのパラメータで、１ｋｇ凍結重量あたり２１５、６９８および６０３ｍｇのｔＧＦＰをそれぞれ産生した。しかしながら、ＰＭ１３２について予測される至適値は、この実験について選択された条件のほとんど外側である（図５Ｂ）。したがって、第２の実験を、０．６〜１．２にわたるイノキュラムの最終ＯＤ600および２．０〜４．５にわたるＣＯＩ：ＳｏＳ比率を使用して実行する。この事例において、モデル再現性は低く、高いノイズによる大きな純誤差があることを意味するが、最初の実験において予測された至適条件の周囲にプラトーが存在することを指摘する。
すべての可能なペアのレベル手段を比較する一般線形モデル手順によるＡＮＯＶＡを使用して、相互作用を含む最も良好なモデルおよび試験は、ＰＭ１３２におけるｔＧＦＰ発現のレベルがＢｕｒｌｅｙ ２１およびＰＭ２０４におけるものよりも有意に高いことを示した。
至適化の前に、使用した標準的な条件はＯＤ600＝０．３２およびＣＯＩ：ＳｏＳ＝１．００の比率である。２．０〜２．５倍高い組換えタンパク質発現は、イノキュラム中のアグロバクテリウム細胞の濃度およびサイレンシングのサプレッサーに対する対象となるコンストラクトの比率の両方の増加によって達成される。
実施例１２：アグロバクテリウム媒介性一過性発現のためのイノキュラム調製の改善されたスケール拡大性
植物材料
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物のＢｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４の一般的なバッチを、２０時間の明期間、２６℃／２０℃昼／夜の温度および７０％／５０％昼／夜の相対湿度で、ロックウールブロックにおいて温室コンパートメントＡ中で３５植物／ｍ2で成長させる。植物は地下灌水によって液肥灌漑される。
アグロバクテリウムイノキュラム調製
レポーター遺伝子ｔＧＦＰ（Ａ９１）またはサイレンシングサプレッサーＨｃＰｒｏ（Ａ１２０）についての発現カセットを保有するＡＧＬ１のアグロバクテリウム培養のいずれかを、カルベニシリンおよびカナマイシンを補足した「動物質不含有」ＬＢ Ｍｉｌｌｅｒ（１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ＋１０ｇ／Ｌ植物性トリプトン＋５ｇ／Ｌ酵母エキス）中で、２．０を超える最終ＯＤ600まで成長させる（特別に明示されないならば）。以下に記述されるような試験した条件に応じて、細菌を遠心分離によって収穫しインフィルトレーション溶液中で２．０を超えるＯＤ600に再懸濁するか、または細菌を培養培地中で維持して濃縮イノキュラムを生成するかのいずれかを行なう。インフィルトレーションの日に、Ａ９１およびＡ１２０の濃縮イノキュラムを１：１の比率で混合し、インフィルトレーション溶液中で０．３２の最終ＯＤ600に希釈し、室温に３０分間平衡化する。
アグロバクテリウム媒介性インフィルトレーションおよびバイオマス収穫
タバコ植物を、実施例１中で記述されるように、インフィルトレーションし、インキュベーションし、収穫する。ｔＧＦＰの抽出および定量化を、実施例３中で記述されるように実行する。抽出バッファー中で最終的に１：５０で希釈したインフィルトレーションしなかった抽出物に、４０００〜１２５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でＴｕｒｂｏＧＦＰ対照タンパク質（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を添加することによって、標準曲線を準備する。
全可溶性タンパク質含有量の決定
抽出物中の全可溶性タンパク質（ＴＰＳ）を、マイクロプレートリーダーで５９５ｎｍの吸光度測定によってクマシー−プラスアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定する。抽出物を超純水中で１：２０に希釈し、１０μＬを平底マイクロプレートに三重でロードする。
結果
最初に、インフィルトレーション溶液中でアグロバクテリウム培養を直接希釈することによって最終イノキュラムを調製する可能性を調べる。図６中で示されるように、インフィルトレーションしたタバコＢｕｒｌｅｙ ２１、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４におけるｔＧＦＰの一過性発現は、遠心分離／再懸濁の工程の省略によって影響を受けない。さらに、液体培養から直接調製したイノキュラムによりインフィルトレーションしたＰＭ１３２およびＰＭ２０４の植物は、有意により高いｔＧＦＰ発現でさえも引き起こした。顕著なことに、ＰＭ１３２およびＰＭ２０４における発現レベルは両方の条件において類似しており、したがって追加実験はＰＭ１３２のみを使用して実行する。
遠心分離および非栄養的なインフィルトレーション溶液中の再懸濁後に、イノキュラムは、トランスフェクション効率および一過性発現レベルにおいて有意な変化なしに４℃で最大６日間通常保存される。さらに、遠心分離および再懸濁の工程を省略することは、保存条件および保存時間期間について疑問を提起する。ＬＢ培地中で保存されたアグロバクテリウム細胞は、細菌増殖が促進され続ける豊かな栄養的な環境において原則的に放置され、結果として培養の分解を引き起こすと一般に憶測される。次の工程において、遠心分離されていないイノキュラムの保存安定性を試験する。２．０を超えるＯＤ600のＡ９１（ｔＧＦＰ）およびＡ１２０（ＳｏＳ）の濃縮培養液を４℃で５〜０日間保存し、インフィルトレーション直前に希釈する。遠心分離された培養から調製したイノキュラムを陽性対照として使用する。インフィルトレーションの６日後のｔＧＦＰレベルの定量化から、１日間保存したイノキュラムと比較して、遠心分離してないイノキュラムは発現効率の変化なしに４℃で５日間安定的であることが示される。意外にも、保存した培養と比較した場合、新鮮な培養から調製したイノキュラムの使用はｔＧＦＰのより低い発現をもたらし、アグロバクテリウム毒性および至適トランスフェクションの誘導のために４℃での短い保存時間が必要とされることが示唆される。これらの結果は、遠心分離されていないイノキュラムが、より高いレベルの組換えタンパク質の産生において、遠心分離されたイノキュラムよりも有意にそして意外にも効果的であることも確かにする。
液体培養における細菌増殖は、誘導相、対数相、静止相および死滅相の４つの連続した相によって特徴づけられる。対数相の間は細菌は代謝的に活性があり、静止相に到達するまで急速に成長し、そこでは培地中の１つまたは複数の栄養物質が枯渇し、さらなる増殖を限定する。形質転換の成功のために、細菌は、早期〜中期の対数相で通常採取される。アグロバクテリウム株ＡＧＬ１の成長曲線を決定することを目標とするパイロット実験を実行する。データから、静止相に入る前に、対数相はＯＤ600＝０．３とＯＤ600＝３．８〜４．０との間で起こったことが示される。最終イノキュラムの調製において必要な培養の体積を低下させるために、後期対数相まで（すなわちより高い密度で）増殖させた培養の使用が、タバコにおける発現レベルに影響を与えることができるかどうかが、試験される。通常の２．０のＯＤ600または３．８のＯＤ600のいずれかまで増殖させ、インフィルトレーション溶液中で直接希釈した培養から調製したイノキュラムにより、ＰＭ１３２タバコ植物をインフィルトレーションする。顕著なことには、インフィルトレーションの６日後のｔＧＦＰレベルの分析から、後期対数相のアグロバクテリウム培養をイノキュラム調製のために使用することによって、一過性発現が影響を受けないことが示される。
これらのすべてのデータから、一過性組換えタンパク質発現に影響を与えずに、高細胞密度（ＯＤ600＝最大３．８）の培養の使用に加えて、イノキュラムを調整する場合の遠心分離および再懸濁物の工程の省略によって、タバコの一過性アグロバクテリウム媒介性形質転換のためのイノキュラム調製のスケールアップを非常に促進することができることが実証される。
実施例１３：転倒させた位置でのインフィルトレーションしたタバコ植物のインキュベーションによる組換えタンパク質の発現増加
この実施例は、転倒させた位置でインフィルトレーションしたタバコ植物のインキュベーションが組換えタンパク質の発現増加に引き起こすという意外な解明を記述する。インフィルトレーションしたタバコ植物は、特に温室中で高密度でインキュベーションした場合、インフィルトレーションした葉の重量を支えることができないので倒れる傾向があるという問題に対する解決を調査している間に、この解明がなされた。提供された解決は上下逆さまでインフィルトレーションした植物をインキュベーションすることによるものである。顕著なことには、転倒させたインフィルトレーションした植物のインキュベーションは、正常な直立位置でインキュベーションされたタバコ植物と比較して、組換えタンパク質産生において有意な増加をもたらした。
タバコ植物を、上記のｔＧＦＰ発現カセットを含むプラスミドｐＣ９１またはＨ５発現カセットを含むｐＣ７１のいずれかを保有するアグロバクテリウム株ＡＧＬ１の細胞により、バキュームインフィルトレーションする。すべてのタバコ植物を、上記のような発現可能なＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを含むｐＣ１２０によりさらに共インフィルトレーションする。
植物およびインフィルトレーション。ロックウールにおいて成長させ、すべておよそ２８ｃｍの高さであるＮ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２の５〜６週間齢の植物を、上記のｔＧＦＰ発現カセットを含むプラスミドｐＣ９１またはＨ５発現カセットを含むｐＣ７１のいずれかを保有するアグロバクテリウム株ＡＧＬ１の細胞により、上記のように、バキュームインフィルトレーションする。すべてのタバコ植物を、上記のような発現可能なＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを含むｐＣ１２０によりさらに共インフィルトレーションする。インフィルトレーション直後に、インフィルトレーションした植物は、温室において照射が植物より上の位置から提供されながら上下逆さまでインキュベーションされる。インフィルトレーションの４および６日後に、各々の処理群から４植物を収穫し、１植物あたり３枚の葉ディスクを使用してｔＧＦＰ発現を測定する。上記のように、葉ディスクを液体窒素下で凍結し、２ｍｌエッペンドルフチューブ中で細粉まで粉砕し、ｔＧＦＰの抽出を実行する。ｔＧＦＰ発現の定量化のために、各々の抽出物の５μＬを２００μＬに希釈し、蛍光を記述されるように測定する。３つの重複測定を作製する。
結果
植物は水ストレスの病徴を示さなかった。上下逆さまで植物を吊り下げた数日後に、植物の茎はより高い位置から上で照らされた光に向かって屈曲して、フック様構造を形成する。図７から、ｔＧＦＰ発現および蛍光は、直立位置でインキュベーションした通常処理の植物と比較して、転倒させた位置（すなわち上下逆さま）でインキュベーションした植物では平均して２倍高いことが理解できる（図７）。
実施例１４ インフィルトレーション前のタバコ植物の増殖密度の増加による、ｔＧＦＰおよびＨ５の発現促進
この実施例は、ｔＧＦＰおよび組換えＨ５の発現に対するインフィルトレーション前にタバコ植物を高密度で成長させる意外な効果を記述する。実験から、正常な直立した条件下でインキュベーションした場合の２つのタバコ品種のＰＭ１３２およびＰＭ２１７は、インフィルトレーション前に高密度で成長させた場合、より低い密度で成長させた植物と比較して、インフィルトレーションしたバイオマスの重量ベースで、およそ４０％多いｔＧＦＰおよび７０％多い組換えＨ５を顕著に産生したことが示される。
植物およびインフィルトレーション
異なる植付け密度でタバコを成長させる効果を研究するために、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍのＰＭ１３２およびＰＭ２１７植物を、１平方メートルあたり２５および１００の植物の２つの密度で成長させる。種蒔きの４６日後に、植物は、前述されたように、ＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーを含有するｐＣ１２０を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１と一緒に、ｔＧＦＰ発現カセットを含有するｐＣ９１またはＨ５発現カセットを含有するｐＣ７１のいずれかを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１各々により、バキュームインフィルトレーションする。インフィルトレーションで使用した最終ＯＤ600は０．３２である。両方の密度で成長させた植物について、平均の植物高、気孔の直径、葉緑素含有量、葉厚みおよび水分含有量を、インフィルトレーション前に測定する。表３から理解することができるように、高密度で成長させた植物は、より大きく、より少ない葉緑素およびより薄い葉を有していたが、気孔の直径は同じである。ＰＭ１３２について、水分含有量は低密度または高密度で成長させた植物で同じであるが、ＰＭ２１７について、低密度で成長させた場合水分含有量ははるかに低い。インフィルトレーション後に、植物の２分の１は直立してまたは転倒させて（上下逆さま）インキュベーションする。各々の３植物の３重複測定にわたり、１処理あたり合計９植物で、測定を実行する。
結果
上記のように、インフィルトレーション５日後に葉を収穫し、抽出物を調製し、ｔＧＦＰ発現の分析を実行する。抽出物をＧＦＰバッファー中で１：１に希釈し、５μＬを蛍光定量化のために２００μＬのＧＦＰバッファーと混合する。組換えＨ５の発現をＥＬＩＳＡによって定量化する。結果は表４中で要約される。
表４から理解することができるように、正常な直立位置でインキュベーションした場合、両方の品種についてのｍｇ／ｋｇ生重量葉バイオマスにおけるｔＧＦＰの発現は、低密度で成長させた植物と比較すると、インフィルトレーション前に高密度で成長させた植物で平均して４１％高い。類似の結果がＨ５について得られ、低密度で成長させて、インフィルトレーション後に正常な直立位置でインキュベーションした植物と比較すると、高密度で成長させた場合、発現の平均の２１〜４０％の間の増加を示した。ｔＧＦＰおよびＨ５の発現に対する転倒させたインキュベーションの効果を研究するために、インフィルトレーションした植物の２分の１をインフィルトレーション後に転倒させた位置でインキュベーションする。表４から理解することができるように、転倒させた位置でインキュベーションし、低密度で成長させた植物についてはｔＧＦＰおよびＨ５の両方の発現の有意な増加があるが、インフィルトレーション前に高密度で成長させた植物についての発現の増加ははるかに少ない。転倒させた位置で低密度で成長させたＰＭ１３２植物については、ｔＧＦＰの４０％およびＨ５の７１％の増加をもたらす。インフィルトレーション前に高密度で成長させた植物については、増加は、正常な直立位置でインキュベーションした植物と比較して、ｔＧＦＰでわずか３％およびＨ５で７％である。全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を定め、ｔＧＦＰおよびＨ５の発現をＴＳＰと比較して推測する。ｔＧＦＰおよびＨ５の発現は、高密度で成長させ、転倒させた位置でインキュベーションした植物で常により高い。直立位置において、低密度で成長させた植物にはおよそ１０．５％のｔＧＦＰ発現の増加があった。高密度で成長させた植物について、増加はおよそ１３．６％である。Ｈ５について、直立位置でインキュベーションし、インフィルトレーション前に低密度で成長させた植物の収率の増加は０．２５％であるが、高密度で成長させた植物の収率の増加は０．３７％である。ｔＧＦＰおよびＨ５の両方について、転倒させた位置でのインキュベーションは、発現の増加をもたらした（ＴＳＰのパーセンテージで測定されるように）。低密度で成長させた植物について、転倒させた位置でのインキュベーションは４０〜６０％のバイオマスの増加をもたらした。高密度で成長させた植物について、転倒させた位置でのインキュベーションは２０％の増加をもたらした。ｔＧＦＰについて、最高のタンパク質収率は１６．２％であり、植物をインフィルトレーション前に高密度で成長させ、転倒させた位置でインキュベーションした場合に得られる。これは、低密度で成長させ、正常な直立位置でインキュベーションした植物（ＴＳＰの１０．５％）と比較して、％ＴＳＰに換算してタンパク質収率において５４％の増加を示した。
高密度で成長され、転倒させた位置でインキュベーションした植物の葉の上部表面に到達する光の減少が、発現増加を引き起こしたかどうかを評価するために、ｔＧＦＰ発現ベクターによりインフィルトレーションした植物を全暗下でインキュベーションする。顕著なことには、データは、全暗おけるインキュベーションがｔＧＦＰ発現について有害であることを示す。図１８から理解することができるように、暗所中でインキュベーションした植物は、光中で成長された植物と比較して、平均して４５％の少ないｔＧＦＰを産生した。追加の実験を実行して、ＰＭ１３２におけるバイオマス産生に対する３つのより高度増殖密度（１ｍ2あたり１２２、５２９のおよび９６１植物）の効果を調べた。実験は５つの重複測定による完全乱塊法デザインにおいて実行した。成長用の基材は３０ｃｍ×３０ｃｍ×７ｃｍのロックウールブロックであり、木製の穴掘り具は植物密度に従って製作された。穴掘り具をブロックの中へ圧迫して、深さおよそ５ｍｍの小さなくぼみを生成する。苗木を手によってブロックの中へ移植した。植物を含有するブロックの３０ｃｍ×３０ｃｍの全域を一定間隔で配置して所望される密度を達成するが、インフィルトレーションの時に中央の１５ｃｍ×１５ｃｍのエリア中に位置する植物のみをインフィルトレーションした。この実践は、中央領域の周囲の境界の形成による任意の周辺効果の除去を可能にした。インフィルトレーション前に、境界の植物を切り取り廃棄した。インフィルトレーションを２つの発生段階（２５ｃｍおよび３５ｃｍの植物高）の植物で実行した。インフィルトレーションした植物を正常または転倒させた位置で５日間温室中でインキュベーションした。
イノキュラムは、ＴｕｒｂｏＧＦＰ発現カセットを保有するＡＧＬ１培養：ＨｃＰｒｏを保有するＡＧＬ１培養の比率が３：１であり、最終ＯＤ600が０．８である以外は上記のように調製した。植物を５０ｍｂａｒの圧力（１分間４５秒以内に到達する）下でインフィルトレーションし、１．５秒で迅速に放出した。インフィルトレーションの５日後に、全バイオマス、葉および茎の生重量、葉厚みならびに他のバイオマス測定を行なった。茎を含む植物全体材料をドライアイス中で迅速に凍結し、−８０℃で保存した。
１ｍ2あたり１２２、５２９および９６１植物で植えたタバコ植物のバイオマスの特徴から、植物密度のこれらの範囲では、平均植物高、％葉バイオマスおよび葉厚み中に有意な差異が観察されないことが示された。しかしながら、％葉バイオマスは比較的一定のままでありながら、密度の増加につれて個別の植物の重量の低下がある。増殖領域の単位あたりバイオマスの増加は、５２９植物／ｍ2の密度で両方の時間点で観察された。高さが３５〜４５ｃｍになった時に植物をインフィルトレーションし、１ｍ2あたり５２９植物で植えた場合、およそ１ｍ2あたり５ｋｇの葉生重量または１ｍ2あたり１０ｋｇの全バイオマスの最大収率が得られた。単位領域あたりＴｕｒｂｏＧＦＰの収率は、バイオマス中のＴｕｒｂｏＧＦＰ濃度に１平方メートルあたりのバイオマスの計算された収率を掛けることによって得られた。単位領域あたりＴｕｒｂｏＧＦＰの最も高い収率が１ｍ2あたり５２９植物の密度で得られた。１ｍ2あたり９６１植物までの植付け密度のさらなる増加は、組換えタンパク質の収率に対して負の影響があった。
実施例１５ インフィルトレーション後の短い昼条件下のインキュベーションによる促進された組換えタンパク質発現
この実施例は、インフィルトレーション後の短い（１日あたり８時間の光）日および長い（１日あたり２０時間の光）昼条件下で、タバコ植物をインキュベーションした実験の結果を記述する。実験から、植物がインフィルトレーション後の短い昼条件下で保たれる場合、正常な直立位置に加えて上下逆さまでインキュベーションした植物について、ｔＧＦＰの発現が非常に促進されることが示される。
植物およびインフィルトレーション
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＰＭ１３２植物を１平方メートルあたり７５植物の密度で成長させる。４２日齢の植物を、１：１比率および最終ＯＤ600＝０．３２で、ｐＣ９１（ｔＧＦＰのバイナリー発現ベクター）およびｐＣ１２０（ＨｃＰｒｏ遺伝子サイレンシングサプレッサーバイナリー発現ベクター）を含有する２つのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１株の混合物によりインフィルトレーションする。植物は平均して高さ４３．４ｃｍであり、５５９．６μｍｏｌ ｍ−２ ｓ−１の平均の気孔コンダクタンスを有し、イノキュラム取り込みのために適切な気孔開口が指摘される（表５）。インフィルトレーション後に、植物を、１日あたり８時間の光または１日あたり２０時間の光の２つの異なる光サイクル下でインキュベーショする。各々の光処理下の植物の２分の１を正常な直立位置で、および他の２分の１を転倒させた位置で配置する。合計で、４つの処理を実行する。植物は、インフィルトレーションの０、３、５、７および９日後に収穫する。各々の測定について、１処理あたり４植物を収穫し、１植物あたり３枚の葉ディスクをｔＧＦＰ発現解析のために採取する。ｔＧＦＰ定量化のために、葉ディスクを１ｍｌのＧＦＰバッファー中で粉砕し、５μＬの抽出物を前述されるように蛍光測定のために２００μＬのＧＦＰバッファーと混合する。
結果
２つの光レジーム下のｔＧＦＰ発現の定量化（ｍｇ ｔＧＦＰ／ｋｇ生重量バイオマス）から、インフィルトレーション後の組換えタンパク質産生に対する有意な光の効果が明らかになった（図８）。植物の位置（直立または転倒させた）にかかわらず、短い昼条件下でインキュベーションした植物は、図８から理解することができるように有意により高い量のｔＧＦＰを産生した。インフィルトレーションの７日後に、８時間の光でインキュベーションした植物において、ｔＧＦＰの発現は、インフィルトレーション後に２０時間の光の下でインキュベーションした植物と比較して、２倍の量である。
インフィルトレーションの７日後に、８時間で直立した植物におけるｔＧＦＰ発現は、２０時間の光レジーム下でインキュベーションした同じような植物におけるｔＧＦＰ発現よりも１０４％高い。上下逆さまでインキュベーションした植物について、傾向は類似しており、８時間の光の植物は、２０時間の光レジーム下でインキュベーションした植物よりも５０％多いｔＧＦＰを産生する。転倒させた位置でのインキュベーションは、２つの光レジーム（８時間の光および２０時間の光）下で成長させた植物におけるｔＧＦＰ発現も促進した。８時間の光処理と比較して、２０時間の光での発現促進はより明白であり、正常な直立位置で２０時間の光で成長させた植物の３７１．２ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ生重量バイオマスから、８時間の光で上下逆さまの位置でインキュベーションした植物の８５７．５ｍｇのｔＧＦＰ／ｋｇ生重量バイオマスに増加しており、それは組換えタンパク質収率において１３０％の増加を示す。
実施例１６ アグロバクテリウムによる植物の至適化されたインフィルトレーション
この実施例は、インフィルトレーション前のタバコ植物の気孔開口部を調べる実験の結果を記述する。結果から、気孔コンダクタンスが明るい条件下で成長させたタバコ植物の特徴の範囲にあるように、インフィルトレーション前にタバコ植物を光に曝露するべきであることが示される。タバコ植物は光または空間についての任意の競合を回避するために、約９植物／ｍ2の密度に成長させた。実験単位を毎日モニタリングして、一様で安定的成長させる環境を保証する。灌水溶液は、適切な栄養物質供給を保証するために、２．４の電気伝導率値（Ｅ．Ｃ）および２０６ｍｇ／Ｌと等しい含有窒素量を有していた。散水レジームは、過剰散水または低散水によって引き起こされる任意のストレスを回避するために植物の必要性に従って調整した。
３９日齢のＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の２つの品種（ＰＭ１３２およびＰＭ１５）は、上記のように、ＴｕｒｂｏＧＦＰ（ｐＣ９１）をコードする発現カセットを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｌ１）により、ＨｃＰｒｏを発現するアグロバクテリウム（Ａｇｌ１）と組み合わせて形質転換した。ＧＦＰの発現は最小のＣａＭＶ３５Ｓ＋プロモーターおよびササゲモザイクウイルス（ＨＴ−ＣＰＭＶ）の５’ＵＴＲによって駆動され、一方ＨＣ−Ｐｒｏの発現は二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動された。インフィルトレーション混合物中の細菌濃度は、単一のコンストラクト処理（ＧＦＰまたはサイレンシングサプレッサー（ＳｏＳ））については０．１６および２つのコンストラクト処理（ＧＦＰ＋ＳｏＳ）については０．３２に維持した。植物は、標準的なインフィルトレーションプロトコルに従って、１分間５０ｍｂａｒでインフィルトレーションした。
インフィルトレーションの前に、植物の２分の１を暗コンパートメント中に配置し、一方他の２分の１を人工光を補足した自然光を持つコンパートメントの内部に配置した。この時間の間に、気孔コンダクタンスを、定常状態ポロメーターＳＣ−１（Ｄｅｃａｇｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して記録した。測定は、位置４、５、および６（１は茎に垂直な茎頂の最初の葉である）で３枚の完全に伸びた連続葉で行なわれた。成長用の基材（ロックウール）の水分含有量をＷＥＴ２センサー（Ｄｅｌｔａ−Ｔ ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）により測定した。
気孔コンダクタンス差異は、両方のタバコ品種についての明処理および暗処理の間で極めて有意であった。光中で維持された植物は、暗所中で維持された植物よりも４〜８倍高いコンダクタンス値を示した。光中のＰＭ１３２植物は２６０．６μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の平均値を示し、一方暗所中のものは７０．４μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1であった。同様に、光中のＰＭ１５植物は４４０．１μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の平均値を示し、一方暗所中のものは５３．６μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1であった。これらの結果は、植物に与えられた光量によってタバコにおける気孔開口部を調節できることを示す。植物を明るい条件下に保つことは気孔開口を促進するが、光の量を低下させることは有意に気孔開口部を減少させる（より低い気孔コンダクタンス）。タバコ品種間の気孔コンダクタンスにおける差異も観察されることを指摘する価値もあり、ＰＭ１５は光中でＰＭ１３２よりも１．７倍高いコンダクタンスを示す。したがって、インフィルトレーション前に、ＰＭ１３２の気孔コンダクタンスが約７０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える、１００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える、１５０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える、２００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える、２５０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える、または３００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1を超える範囲中にあることが好ましい。
インフィルトレーションした葉はドライアイス中で粉末に凍結し粉砕した。ＧＦＰを抽出し、蛍光を測定した。両方のタバコ品種について、ＧＦＰ含有量は、暗所中でインキュベーションした植物よりも光中でインキュベーションした植物で有意により高かった。ＰＭ１３２において、光中でインキュベーションした植物は暗所中でインキュベーションした植物よりも４０％の多くの蛍光を示した。ＰＭ１５について、光中でインキュベーションした植物は暗所中でインキュベーションした植物よりも２００％の多くの蛍光を示した。データは、タバコにおいて気孔が光条件の変化に対して急速に反応することを示した。少ない光下に配置した植物は、明るい植物よりも４〜８倍少ない気孔コンダクタンスを示した。少ない光によって引き起こされる気孔閉鎖は、バキュームインフィルトレーション効率に負に影響を与え、したがってタバコにおけるＧＦＰ発現を減少させる。暗所中でインキュベーションした植物は、インフィルトレーションされなかった葉組織の大きな領域、および正常な光条件下で成長させた植物と比較して５０％を超えるＧＦＰ発現の低下を示した。
実施例１７ 酵素によるタバコ植物のインフィルトレーション
この実施例は、アグロバクテリウムにより前にインフィルトレーションしたタバコ植物を、植物細胞壁を分解または消化する酵素により処理して異種タンパク質の抽出および単離を支援する実験の結果を記述する。タバコ植物は上記のようにＨ５についてのコード配列を含む遺伝子コンストラクトｐＣ７１によってインフィルトレーションされており、Ｈ５の一過性発現および産生を可能にする温室条件下でインキュベーションする。以下の酵素の水性混合物を調製した。０．０５％ Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ、０．４％のセルロース、０．０６６％ Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ、０．６Ｍマンニトール、ｐＨ５．６の０．７ｇ／ｌ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）。酵素混合物の１つのサンプルにおいて、グリシンを１５ｇ／ｌの濃度に添加する。酵素混合物を１グラムの葉あたり０．３ｍｌの体積でシリンジによってタバコ葉の下側の中へ注入した。比較のために、葉の薄い切断されたストリップを同じ混合物中に沈めてインキュベーションした。収穫およびＨ５の抽出の前に、葉を１２時間インキュベーションした。抗Ｈ５の抗体によるウエスタンブロットは、同じような量のＨ５がグリシンの有無にかかわらず酵素混合物により得られることを示した。シリンジインフィルトレーションによる抽出および切断した葉を沈めることによる抽出の効率も類似していた。結果から、細胞壁消化酵素によるタバコ葉のインフィルトレーションを使用して、タバコ植物からの異種タンパク質の抽出を支援できることが示される。
本発明は前述の記述中で詳細に記述されるが、かかる記述は説明または例示であり、制限ではないと判断すべきである。以下の請求項の範囲および趣旨内で、当業者によって変化および修飾を行なえることが理解されるだろう。様々な出版物および特許が本明細書を通して引用される。これらの出版物および特許の各々の開示はその全体を参照として援用される。
（表）



寄託
以下の種子サンプルは、Ｐｈｉｌｉｐ Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓ．Ａの名のもとにブダペスト条約の条項下のＮＣＩＭＢ（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ、英国）に２０１１年１月６日に寄託された。
特許の付与まで、または出願が拒絶されるかもしくは取り下げられるならば出願日から２０年間、サンプルは、依頼人によって指名された独立の専門家にのみ交付されるだろう（規則１３ｂｉｓ．６ ＰＣＴ）。

Claims (25)

  1. 大量の異種ポリペプチドをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおいて産生する方法であって、
    （ｉ）Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物の選択された品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の選択された株を前選択するための壊死試験を適用する工程であって、前記品種、育種系統または栽培品種が、０．３２のＯＤ600の細胞密度の選択されたアグロバクテリウム株を前記品種または育種系統または栽培品種の葉にシリンジによって注入した５日後に、１０％未満の壊死を示し、壊死した１つまたは複数の葉の面積と、アグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションされた１つまたは複数の葉の全面積を測定することにより壊死を決定する、上記工程と；
    （ｉｉ）０．１〜４．０のＯＤ600の(i)で選択されたアグロバクテリウム種の株の懸濁物により、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの(i)で選択された品種、育種系統または栽培品種の植物全体をインフィルトレーションする工程であって、前記株がポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む工程と；
    （ｉｉｉ）インフィルトレーションした植物において発現可能なヌクレオチド配列の発現および異種ポリペプチドの蓄積を可能にする条件下で、５日〜１０日の間の期間でインフィルトレーションした植物をインキュベーションする工程と
    を含み、前記異種ポリペプチドを、植物組織質量１ｋｇあたり少なくとも２００ｍｇの量において発現する、上記方法。
  2. ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列が、大腸菌およびアグロバクテリウム細胞におけるプラスミドの維持および複製ならびにタバコ植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移行に必須の配列因子、ならびに任意で植物で選択可能なマーカー遺伝子を含む最小サイズにしたバイナリーベクター中でクローン化され、必須の配列因子の割合が、ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列のない最小サイズにしたバイナリーベクター全体のヌクレオチドの少なくとも７０％を占める、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のインフィルトレーションのために工程（ｉｉ）において使用されるアグロバクテリウム細胞の懸濁物が、０．３〜０．９の範囲の細胞密度（ＯＤ600）を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される場合、遺伝子サイレンシングサプレッサーが、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の前記選択された品種、育種系統または栽培品種において一過性発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 遺伝子サイレンシングサプレッサーをコードするヌクレオチド配列が第１のバイナリーベクター上に位置し、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が第２のバイナリーベクター上に位置する、請求項４に記載の方法。
  6. 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現される場合、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）が、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の前記選択された品種、育種系統または栽培品種において一過性発現される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のバイナリーベクターとは別の第２のバイナリーベクターを使用して、ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）が、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物の前記選択された品種、育種系統または栽培品種において一過性発現される、請求項５または６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ポチウイルスのヘルパーコンポーネントプロテイナーゼ（ＨｃＰｒｏ）が、配列番号：５において記載されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項６または７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 第１のバイナリーベクターが第１のアグロバクテリウム株において提供され、第２のベクターが第２のアグロバクテリウム株において提供され、工程（ｉｉ）において、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第１のバイナリーベクターを含む第１のアグロバクテリウム株の細胞：第２のバイナリーベクターを含む第２のアグロバクテリウム株の細胞の比率が、３：１〜１．６：１の範囲である、請求項４〜８のいずれか一項に記載のいずれかの方法。
  10. 工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統、または栽培品種が、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍアクセッションＤＡＣ Ｍａｔａ Ｆｉｎａ、ＰＯ２、ＢＹ−６４、ＡＳ４４、ＲＧ１７、ＲＧ８、ＨＢ０４Ｐ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｈｉｃｋｓ、ＭｃＮａｉｒ ９４４（ＭＮ ９４４）、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、Ｋ１４９、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、Ｋａｓｔｕｒｉ Ｍａｗａｒ、ＮＣ２９７、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、ＰＯ２、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔｕｒｋｉｓｈ Ｓａｍｓｕｎ、ＡＡ３７−１、Ｂ１３Ｐ、ＢＵ２１×Ｈｏｊａ Ｐａｒａｄｏ系統９７の交配からのＦ４、Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ、Ｉｚｍｉｒ、Ｘａｎｔｈｉ ＮＮ、Ｋａｒａｂａｌｇａｒ、Ｄｅｎｉｚｌｉ、ＰＯ１、ＰＭ０１６（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９８下で寄託された）；ＰＭ０２１（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１７９９下で寄託された）；ＰＭ０９２（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８００下で寄託された）；ＰＭ１０２（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０１下で寄託された）；ＰＭ１３２（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０２下で寄託された）；ＰＭ２０４（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０３下で寄託された）；ＰＭ２０５（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０４下で寄託された）；ＰＭ２１５（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０５下で寄託された）；ＰＭ２１６（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０６下で寄託された）；およびＰＭ２１７（その種子はアクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１８０７下で寄託された）、（上記種子寄託当局はＡｂｅｒｄｅｅｎ、ＳｃｏｔｌａｎｄのＮＣＩＭＢである）からなる群から選択されるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程ｉ）において提供される選択されたアグロバクテリウム株が、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ２２６０、ＧＶ３１０１およびＣｈｒｙ５からなる群から選択される株である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 工程ｉ）において提供される選択されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種および選択されたアグロバクテリウム株の組み合わせが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＥＨＡ１０５とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ１３２、およびアグロバクテリウム株ＡＧＬ１とＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ系統ＰＭ２０４からなる群から選択される組み合わせである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記異種ポリペプチドが、増殖因子、受容体、リガンド、シグナリング分子；キナーゼ、酵素、ホルモン、腫瘍抑制因子、血液凝固タンパク質、細胞周期タンパク質、代謝タンパク質、神経タンパク質、心臓タンパク質、特異的な疾患状態において欠乏したタンパク質、抗体、免疫グロブリン、抗原、疾患に対する耐性を提供するタンパク質、ヒト遺伝性疾患の置換療法のためのタンパク質、抗微生物タンパク質、インターフェロン、およびサイトカインである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記異種ポリペプチドがインフルエンザ赤血球凝集素またはその免疫原性断片である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 気孔コンダクタンスが７０μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1〜６００μｍｏｌ ｍ-2ｓ-1の間の範囲であるように、インフィルトレーション前に、植物が光に曝露される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 工程ｉｉｉ）が、植物を１日あたり７〜９時間日光条件下でインキュベーションすることを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 工程ｉｉｉ）が、転倒させた位置で前記インフィルトレーションした植物をインキュベーションすることを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. （ａ）インフィルトレーション前に、選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物全体を１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で成長させる工程、または（ｂ）インフィルトレーション後に、１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度でインフィルトレーションした植物全体をインキュベーションする工程、または（ｃ）インフィルトレーション前に、選択されたＮ．ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種のタバコ植物全体を１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度で成長させ、インフィルトレーション後に、インフィルトレーションした植物全体を１平方メートルあたり少なくとも１００の植物の密度でインキュベーションする工程をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. １平方メートルあたり２００〜６００の間の植物の密度で植物を成長させる、請求項１８に記載の方法。
  20. 工程（ｉｉｉ）後に、アグロバクテリウムによりインフィルトレーションした植物全体を、植物細胞壁を分解する１つまたは複数の酵素によりインフィルトレーションする工程（ｉｖ）をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種、育種系統または栽培品種およびアグロバクテリウム種の株の選択された組み合わせが、（ａ）同じ発現可能なヌクレオチド配列ならびに同じインフィルトレーション工程およびインキュベーション工程が使用される場合、Ｎ．ｂｅｎｔａｍｉａｎａにおいて得ることができるものの少なくとも２５％のレベルまでの異種タンパク質の蓄積、または（ｂ）発現可能なヌクレオチド配列が緑色蛍光タンパク質をコードし、同じインフィルトレーション工程およびインキュベーション工程が使用される場合、インフィルトレーションした植物の全可溶性タンパク質の少なくとも１％までの緑色蛍光タンパク質の蓄積をもたらす組み合わせである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程（ｉｉ）が、１つまたは複数の圧力サイクルによって、植物全体をインフィルトレーションすることを含み、前記圧力サイクルの少なくとも１つが大気圧と比較して圧力の増加を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. ポリペプチドをコードする発現可能なヌクレオチド配列が、ＦＬｔプロモーターまたはその機能的断片の１つまたは２つ以上のコピーを含むＴ−ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクター中にクローン化され、ＦＬｔプロモーターがＭＭＶ、ＦＭＶまたはＰＣＩＳＶのものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ＦＬｔプロモーターが、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３または配列番号：１４において提供されたものである、請求項２３に記載の方法。
  25. 請求項１〜２４のいずれかに記載のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの品種の植物全体と、請求項１〜２４のいずれかに記載のアグロバクテリウム種の株の細胞を含む懸濁物と、植物全体をアグロバクテリウム細胞によりインフィルトレーションするための手段と、任意で（ａ）インフィルトレーションした植物を転倒させた位置で１日あたり７〜９時間上からの照射と共にインキュベーションする工程、（ｂ）植物全体を１平方メートルあたり少なくとも７５の植物の密度で成長またはインキュベーションする工程、または（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）の両方の支援に適合する、インフィルトレーションした植物のインキュベーションのための温室とを含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物全体において植物組織質量１ｋｇあたり少なくとも２００ｍｇの大量の異種ポリペプチドを産生する方法において使用するためのシステム。
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