RU2711936C2

RU2711936C2 - Экспрессия белка в растениях

Info

Publication number: RU2711936C2
Application number: RU2013138452A
Authority: RU
Inventors: Жюльен БЕША; Приска КАМПАНОНИ; Шунхонг ДАЙ; Клаудио ФАККИНЕТТИ; Николя ЛЮГОН-МУЛЭН; Ричард МАНДЕЛЛ; Карен ОИСИ; Густаво РАМИРЕС; Сандрин РОЭСТИ; Элен ЛАПАРРА; Роза КАБРЕРА
Original assignee: Филип Моррис Продактс С.А.
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2020-01-23
Also published as: WO2012098119A3; EP2665818A2; JP6037395B2; EP2665818B1; KR20140034139A; WO2012098119A2; BR112013018130A2; RU2013138452A; US10472644B2; CA2824152A1; DK2665818T3; CN103403170A; PT2665818T; ES2637825T3; JP2014512802A; CN103403170B; US20140296494A1; CA2824152C; SG192022A1

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения гетерологичного пептида в растении Nicotiana tabacum. Также раскрыто применение комбинации Nicotiana tabacum и Agrobacterium в транзиторной Agrobacterium трансформации растений табака. Раскрыта система продуцирования гетерологичного полипептида у целого растения Nicotiana tabacum. Изобретение позволяет эффективно получать гетерологичный пептид в растениях Nicotiana tabacum. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл., 17 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к экспрессии белка у растений. Конкретно, настоящее изобретение направлено на способы крупномасштабного продуцирования рекомбинантных полипептидов в целых табачных растениях.

Табак применяли в качестве растения-хозяина для исследования экспрессии гетерологичного белка у растений. Описана транзиторная экспрессия разнообразных гетерологичных белков с использованием Nicotiana benthamiana, но этот вид, будучи применимым в качестве тестовой модели в лаборатории, дает в виде урожая меньше биомассы, и не является пригодным для индустриализации платформы для производства крупных количеств рекомбинантного белка в пределах короткого периода времени. Транзиторная генная экспрессия у растений и растительных клеток была разработана, прежде всего, в качестве быстрого средства, чтобы продемонстрировать получение данного белка в малых количествах и для тестирования генетических конструкций. Способы введения кодирующей последовательности белка в растение или растительную клетку включают, например, доставку с помощью генной пушки, вакуумную инфильтрацию, опосредованную Agrobacterium передачу, и опосредованную полиэтиленгликолем доставку депротеинизированной ДНК в растительные протопласты.

Стабильная трансформация была продемонстрирована для многих различных растительных видов, таких как, например, Medicago truncatula, Brassica napus, Lactuca sativa, Zea mays, Oryza sativa и виды табака, включая Nicotiana tabacum. Полагают, что N. tabacum является гибридом Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosifonnis, и, возможно, Nicotiana otophora. Его обнаруживают только при культивировании, и многочисленные варианты и сорта выращивают на промышленной основе во многих различных климатических и географических областях. Среди вариантов и сортов N. tabacum хорошо распознаются морфологические вариации, агрономические свойства и химические различия. Однако, доступна только ограниченная информация по взаимосвязи между физическими характеристиками и генетическим разнообразием вариантов и сортов N. tabacum. Еще меньше известно о пригодности каждого из таких вариантов и сортов для продуцирования рекомбинантных белков. Применяемые в настоящее время для продуцирования рекомбинантных белков промышленные крупномасштабные культуры животных клеток построены лишь на нескольких линиях клеток-хозяев, каждая из которых была широко охарактеризована. Напротив, никакой такого рода информации не было получено для растительных клеток, извлекаемых из вариантов, линий скрещивания и сортов табака и для целого растения.

Несмотря на то, что стабильная трансформация N. tabacum, в целом, для продуцирования рекомбинантного белка была установлена, транзиторная экспрессия чуждого гена у растительных клеток N. tabacum была продемонстрирована только в нескольких случаях. Эти исследования транзиторной экспрессии у Nicotiana tabacum были ограничены либо инфильтрацией растительных клеток, содержащихся внутри молодых обрезных листьев или лиственных дисков N. tabacum cv. Petit Havana (Rodriguez et al., Biotechnol. Bioeng., 2004, 89: 188-194; Potula, et al., Transgenic Res., 2008, 17: 19-32) или инъекцией листьев еще присоединенных к растению посредством инъекции вручную в абаксиальное воздушное пространство целых листьев непосредственно под эпидермальную поверхность с использованием шприца объемом 1 мл. Ни один из этих экспериментов не раскрывает технически надежную и промышленно значимую систему для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, которое основано на целых растениях N. tabacum.

Сравнительный анализ недавно проведенный Conely et al. (Plant Biotehnol J, 2010 1-11) указывает на то, что уровень транзиторной экспрессии существенно изменялся среди небольших образцов различных тестируемых разновидностей Nicotiana, и то, что не существует корреляции между урожайностями транзиторной экспрессии и стабильной экспрессии для данной разновидности. В этом исследовании придается особое значение мнению, что для транзиторной экспрессии рекомбинантного белка существует огромная непредсказуемость по урожайности среди разновидностей и сортов N. tabacum. Анализ транзиторной экспрессии, о котором сообщает Conely et al., проводили на листьях, в которые непосредственно вводили инъекционно суспензии Agrobacterium на лабораторном уровне. Многие другие аспекты способа транзиторной экспрессии, которые могут воздействовать на урожайность, особенно, когда способ масштабируют, такие как методология инфильтрации, проект конструкции экспрессии, и условия объемного роста/агрономические условия, не являются понятными.

С учетом того, что систему экспрессии растений считают многообещающей альтернативой культуре животных клеток для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, существует острая необходимость в разработке промышленно жизнеспособных производственных платформ на растительной основе, где переменные, которые являются важными в промышленном масштабе, исследуют и оптимизируют.

Эта неудовлетворенная потребность адресована настоящему изобретению и решается настоящим изобретением посредством предоставления способа, определенного признаками независимых пунктов формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления являются предметом зависимых пунктов. Настоящее изобретение предоставляет способы, в которых применяются предварительно выбранные и совместимые комбинации разновидностей N. tabacum и штаммов Agrobacterium для крупномасштабного получения гетерологичных полипептидов посредством транзиторной экспрессии. Результаты, описанные в данном документе ниже, неожиданно показывают, что среди многих тестированных разновидностей Nicotiana tabacum, не было корреляции между высоким уровнем накопления гетерологичного полипептида и низкой активностью протеазы - признака, который был отмечен другими в качестве важного фактора. Соответственно, многие разновидности N. Tabacum, предоставленные в изобретении, не рассматривались в качестве хозяина для продуцирования гетерологичных белков. Изобретение также предоставляет разнообразные усовершенствования способов, которые дополнительно увеличивают общий выход гетерологичных полипептидов, такие как применение имеющего минимальный размер бинарного вектора, наличие вирусного супрессора сайленсинга генов в растении-хозяине, инфильтрация целого растения, и конкретные условия, и практические воплощения условий объемного роста. Применение предварительно выбранной комбинации разновидностей N. tabacum и штаммов Agrobacterium, необязательно включающее одно или несколько усовершенствований способов, основанных на транзиторной экспрессии изобретения, обеспечивает получение крупных количеств гетерологичного полипептида экономически оправданно и за короткий период времени (относительно того, что требуется для трансгенного растения).

Изобретение относится к способу продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у Nicotiana tabacum, включающему стадии:

(i) предоставление комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания, или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт проявляют менее чем 10% некроза, менее чем 5% некроза, менее чем 2% некроза, менее чем 1% некроза, через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀ равным 0,32;

(ii) инфильтрацию целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum суспензией выбранного штамма вида Agrobacterium при OD₆₀₀ равной 0,1-4,0, причем указанный штамм содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений;

(iii) инкубацию инфильтрованного растения в течение периода между 5 днями и 20 днями, конкретно, между 7 днями и 15 днями, но особенно между 8 днями и 10 днями, при условиях, которые обеспечивают экспрессию экспрессируемой нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление гетерологичного полипептида.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у Nicotiana tabacum, включающему стадии:

(i) предоставления комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт, проявляют менее чем 10% некроза, менее чем 5% некроза менее чем 2% некроза, менее чем 1% некроза, через 5 дней после того, как листья указанных разновидностей, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32;

(ii) инфильтрацию целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum выбранным штаммом вида Agrobacterium, содержащим экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений при OD₆₀₀, равной 0,1-4,0;

(iii) инкубацию инфильтрованного растения в течение периода между 5 днями и 20 днями, конкретно, между 7 днями и 15 днями, но особенно, между 8 днями и 10 днями, при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление гетерологичного полипептида;

при условии, что, когда экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует зеленый флуоресцентный белок, накопление зеленого флуоресцентного белка составляет, по меньшей мере, 1% от общего растворимого белка инфильтрованного растения или растительных клеток; или, что накопление полипептида находится на уровне, который составляет, по меньшей мере 25% от уровня, получаемого у N. benthamiana, когда применяют выбранный штамм Agrobacterium, содержащий такую же экспрессируемую нуклеотидную последовательность, как описано на стадии ii) и стадии iii).

Следовательно, является предпочтительным то, что выбранная комбинация разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium, когда ее применяют в способе в соответствии с изобретением и как определена здесь в любом из предшествующих вариантов осуществления, представляет собой комбинацию, которая, когда ее применяют в соответствии с изобретением, приводит к накоплению зеленого флуоресцентного белка до, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере, 2%, по меньшей мере, 3%, по меньшей мере, 4%, по меньшей мере, 5%, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 15%, или, по меньшей мере, 20% от общего растворимого белка инфильтрованного растения, когда экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует зеленый флуоресцентный белок.

Также является предпочтительным то, что выбранная комбинация разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium, в способе в соответствии с изобретением, как определено здесь в любом из предшествующих вариантов осуществления, приводит к накоплению гетерологичного белка до уровня, который составляет, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 75%, или равного, или такого, который составляет, по меньшей мере, 110%, по меньшей мере, 125%, по меньшей мере, 150%, по меньшей мере, 200%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 300%, по меньшей мере, 400%, или, по меньшей мере, 500% от получаемого у N. bentamiana, когда применяются такая же экспрессируемая нуклеотидная последовательность и такие же условия. Накопление гетерологичного белка может быть выражено в значениях единицы массы (такой как грамм) гетерологичного белка на единицу массы (такой как кг) массы сырого вещества (СМ) листьев, что представляет собой г/кг СМ.

В альтернативном варианте осуществления, изобретение относится к способу продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида, у Nicotiana tabacum, включающему стадии:

(i) предоставления комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт, проявляет менее чем 10% некроза, менее чем 5% некроза, менее чем 2% некроза, менее чем 1% некроза, через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32;

(ii) инфильтрации целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum выбранным штаммом вида Agrobacterium, содержащим экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений при OD₆₀₀ равной 0,1-4,0;

(iii) инкубации инфильтрованного растения в течение периода между 5 днями и 20 днями, конкретно, между 7 днями и 15 днями, но особенно, между 8 днями и 10 днями, при условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление рекомбинантного белка,

при условии, что инфильтрация в соответствии со стадией ii) не осуществляется по способу, как описано и заявлено в заявке на Европейский патент 10 16 9888.4, поданной 16 июля 2010 г., конкретно, по способу, включающему:

(i) контактирование целого растения, или части растения с клетками Agrobacterium в текучей среде, где клетки Agrobacterium содержат экспрессируемую конструкцию, кодирующую гетерологичный пептид или белок;

(ii) обработку целого растения или части растения и клеток Agrobacterium с использованием одного или нескольких цикла(циклов) давления, посредством чего клетки Agrobacterium инфильтруют целое растение или часть растения, и

где, по меньшей мере, один из цикла(циклов) давления включает увеличение давления относительно атмосферного давления.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где клетки Agrobacterium содержат бинарный вектор, конкретно, бинарный вектор с минимальным размером, содержащий элементы последовательности, которые являются необходимыми для поддержания и репликации плазмиды у Escherichia coll и клетках Agrobacterium, и для переноса Т-ДНК в растительную клетку табака, и дополнительную область Т-ДНК, содержащую кодирующую последовательность пептида или белка, которая находится под контролем регуляторных элементов, функциональных в растении Nicotiana tabacum, и, необязательно, селектируемый маркерный ген растения, где необходимые элементы последовательности составляют, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% от полного имеющего минимальный размер бинарного вектора.

В конкретном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где применяют минимальный бинарный вектор, содержащий, состоящий из, или состоящий по существу из следующих элементов нуклеиновой кислоты:

a) первый элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер, который является функциональным в Escherichia coli и виде Agrobacterium;

b) второй элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации, которая является функциональной в Escherichia coli;

c) третий элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-инициатор репликации;

d) четвертый элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации, которая является отличной от первой точки начала репликации, и, которая является функциональной в Agrobacterium; и

e) пятый элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность области Т-ДНК, содержащей правую пограничную последовательность Т-ДНК и левую пограничную последовательность Т-ДНК индуцирующей опухоль плазмиды Agrobacterium tumefaciens (Ti-плазмиды) или индуцирующей разрастание корней плазмиды Agrobacterium rhizogenes (Ri-плазмиды);

где вышеуказанные элементы нуклеиновой кислоты предоставлены на кольцевой полинуклеотидной молекуле и разделены гэп-нуклеотидными последовательностями, которые не имеют функции при репликации, поддержании или переносе нуклеиновой кислоты, и, где указанные гэп-нуклеотидные последовательности составляют менее чем 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% от общего размера вектора. Предпочтительно, гэп-нуклеотидные последовательности составляют менее чем 20% от общего размера вектора.

В одном варианте осуществления изобретения, векторная молекула для применения в способе изобретения имеет общий размер, равный менее чем 5900 по (пар оснований), конкретно, менее чем 5500 по, конкретно, менее чем 5200 по, конкретно, менее чем 5100 по, но особенно, 5139 по.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где указанный минимальный бинарный вектор основан на широком круге хозяев плазмиды pRK2.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где указанный минимальный бинарный вектор имеет полинуклеотидную последовательность, являющуюся на, по меньшей мере, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, но конкретно, 100% идентичной с полинуклеотидной последовательностью, как отображено в SEQ ID NO: 1, и, где элементы нуклеиновой кислоты (a)-(e) проявляют такую же функциональность, как соответствующие элементы, представленные в SEQ ID NO:1.

В конкретном варианте осуществления, бинарный вектор с минимальным размером имеет последовательность, как показано в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, клонируют в бинарном векторе с минимальным размером, содержащем элементы последовательности, которые являются необходимыми для поддержания и репликации плазмиды у клеток Escherichia coli и Agrobacterium, и для переноса Т-ДНК в растительную клетку табака, и, необязательно, селектируемый маркерный ген растения, где доля необходимых элементов последовательности составляет, по меньшей мере, 70% от нуклеотидов полного, имеющего минимальный размер бинарного вектора без экспрессируемой нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где супрессор сайленсинга генов транзиторно экспрессируется в указанных выбранных разновидности, линии скрещивания или сорте растения N. tabacum, когда экспрессируется нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичный полипептид.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где супрессор сайленсинга генов представляет собой протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где супрессор сайленсинга генов кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где супрессор сайленсинга генов, конкретно, протеаза хелперного компонента (HcPro) потивируса, конкретно, протеаза хелперного компонента (HcPro) потивируса с SEQ ID NO: 5, расположена на первом бинарном векторе, а гетерологичный полипептид расположен на втором бинарном векторе.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с настоящим изобретением, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где первый бинарный вектор предоставлен в первом штамме Agrobacterium, а второй вектор предоставлен во втором штамме Agrobacterium, и, где на стадии (ii), отношение клеток первого штамма Agrobacterium, содержащего первый бинарный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, к клеткам второго штамма Agrobacterium, содержащий второй бинарный вектор, содержащий супрессор сайленсинга генов, конкретно, протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса, конкретно, протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса с SEQ ID NO: 5, находится в интервале от 3:1 до 1,6:1. В другом варианте осуществления, изобретение относится к способу любого из предшествующих вариантов осуществления, где регуляторные последовательности, функциональные у растений, управляющие экспрессией гетерологичного полипептида, содержат промотор, конкретно, один из промоторов, раскрытых здесь ниже, но, особенно, промотор HT-CPMV как таковой, конкретно, промотор HT-CPMV или в сочетании с минимальным промотором 35S CaMV, как показано в SEQ ID NO: 2.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение относится к способу любого из предшествующих вариантов осуществления, где регуляторные последовательности, функциональные у растений, управляющие экспрессией гетерологичного полипептида, содержат промотор, конкретно, один из промоторов, раскрытых здесь ниже, но особенно, промотор FLt или его функциональный фрагмент, где промотор FLt соответствует MMV, FMV или PCISV, конкретно, промотору FLt, как представлено в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

В конкретном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу продуцирования, гетерологичного полипептида у Nicotiana tabacum, включающему стадии:

(i) предоставление комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания, или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт, проявляют менее, чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32;

(ii) инфильтрации целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum суспензией выбранного штамма вида Agrobacterium при OD₆₀₀, равной 0,1-4,0, указанный штамм содержит протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса, конкретно, протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса с SEQ ID NO: 5, и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, и, необязательно, применения одного или более цикла(циклов) давления, где, по меньшей мере, один из цикла(циклов) давления включает увеличение давления относительно атмосферного давления,

(iii) инкубацию инфильтрованного растения в течение периода 5-10 дней при условиях, которые обеспечивают экспрессию экспрессируемой нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление гетерологичного полипептида.

В еще одном другом конкретном варианте осуществления, изобретение относится к способу продуцирования гетерологичного полипептида у Nicotiana tabacum, включающему стадии:

(i) предоставления комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт, проявляют менее, чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32;

(ii) инфильтрации целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum суспензией выбранного штамма вида Agrobacterium при OD₆₀₀, равной 0,1-4,0, указанный штамм содержит протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса, конкретно, протеазу хелперного компонента (HcPro) потивируса с SEQ ID NO: 5 и экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем промотора FLt или его функционального фрагмента, где промотор FLt соответствует MMV, FMV или PCISV, конкретно, промотору FLt, представленному в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14; и, необязательно, применения одного или более цикла(циклов) давления, где, по меньшей мере, один из цикла(циклов) давления включает увеличение давления относительно атмосферного давления,

(iii) инкубации инфильтрованного растения в течение периода 5-10 дней при условиях, которые обеспечивают экспрессию экспрессируемой нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление гетерологичного полипептида.

Необязательно, регуляторные последовательности включают 5' нетранслируемую лидерную последовательность, сигнал полиаденилирования, или один или более энхансеров, или комбинацию приведенных выше. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает другие регуляторные последовательности, известные специалистам в данной области, и, раскрытые здесь ниже, включая супрессор сайленсинга генов.

Следовательно, в дополнительном варианте осуществления, изобретение относится к способу любого из предшествующих вариантов осуществления, где бинарный вектор, содержащий экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или полипептид, конкретно, гетерологичный белок или полипептид, дополнительно содержит кодирующую последовательность супрессора сайленсинга генов, функционально ассоциированную с регуляторными элементами, которые являются функциональными в растении табака.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу предшествующих вариантов осуществления, где указанные выбранная разновидность, линия скрещивания или сорт растения N. tabacum содержат супрессор сайленсинга генов, конкретно, супрессор сайленсинга генов вирусного происхождения, и конкретно, супрессор сайленсинга генов, выбранный из группы, состоящей из белка p19 вируса некроза огурца (CNV), белка p1 вируса желтой пятнистости риса (RYMV), белка p25 вируса X картофеля (PVX), белка AC2 вируса мозаики африканской маниоки (ACMV), белка 2b вируса мозаики огурца (CMV) и протеазы хелперного компонента (HcPro) потивируса.

В дополнительном варианте осуществления, изобретение относится к способу любого из предшествующих вариантов осуществления, где указанный способ включает инфильтрацию указанных выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта второй суспензией клеток Agrobacterium, содержащей бинарный вектор, содержащий кодирующую последовательность супрессора сайленсинга генов. Вторая суспензия клеток Agrobacterium может необязательно быть от того же самого штамма, что и выбранный штамм Agrobacterium. Первая суспензия и вторая суспензия клеток Agrobacterium может быть инфильтрована в любой последовательности или одновременно. Первая суспензия и вторая суспензия клеток Agrobacterium может быть смешана перед использованием для инфильтрации табачного растения. Необязательно, первую суспензию и вторую суспензию клеток Agrobacterium смешивают при определенном соотношении числа клеток из каждой суспензии.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где суспензия клеток Agrobacterium применяют на стадии (ii) для инфильтрации разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum с плотностью клеток (OD₆₀₀) в интервале от 0,1 до 1,0, конкретно, от 0,3 до 0,9, конкретно, от 0,5 до 0,8, и, особенно, от 0,15 до 0,35.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где выбранные разновидность, линия скрещивания или сорт Nicotiana tabacum, предоставленные на стадии i) представляют собой разновидность, линию скрещивания, или сорт Nicotiana tabacum, выбранные из группы, состоящей из доступных N. tabacum с обозначениями PM016, PM021, PM92, PM102, PM132, PM204, PM205, PM215, PM216 или PM217, как депонированы с NCIMB, Aberdeen, Scotland или DAC Mata Fina, PO2, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, PO2, Wisliςa, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 от линии скрещивания 97 BU21 × Hoja Parado, Samsun NN, Izmir, Xanthi NN, Karabalgar, Denizli и PO1.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где выбранные разновидность, линия скрещивания или сорт растения Nicotiana tabacum, предоставленные на стадии i) являются одной из любой линии ΡΜ016 Nicotiana tabacum, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd, (Международное депозитарное ведомство по Будапештскому договору, расположенное по адресу Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Соединенное Королевство) под инвентарным номером NCIMB 41798; PM021, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41799; PM092, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41800; PM102, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCiMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41801; PM132, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41802; PM204, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41803; PM205, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41804; PM215, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41805; PM216, депонированная под инвентарным номером NCIMB 41806; и PM217, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41807.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где выбранный штамм Agrobacterium, предоставленный на стадии i) является штаммом Agrobacterium tumefaciens, выбранным из группы, состоящей из AGL1, EHA105, GV2260, GV3101 и Chry5.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где выбранный штамм Agrobacterium, предоставленный на стадии i) является штаммом Agrobacterium AGL1 или EHA105.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где комбинация выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum и выбранного штамма Agrobacterium, предоставленного на стадии i) представляет собой комбинацию, выбранную из группы, состоящей из линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом Agrobactenum tumefaciens AGL1 и линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом EHA105 Agrobactenum tumefaciens.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где комбинация выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum и выбранного штамма Agrobactenum tumefaciens, предоставленного на стадии i) представляет собой комбинацию, выбранную из группы, состоящей из линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens и линии PM204 табака Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobactenum tumefaciens.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный штамм Agrobactenum tumefaciens дополнительно содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность протеазы хелперного компонента (HcPro) потивируса.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у растения, конкретно, растения рода Nictotiana, конкретно, растения Nicotiana tabacum, включающий стадии:

инфильтрации целого растения выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта, конкретно, растения рода Nictotiana, конкретно, растения Nicotiana tabacum с помощью экспрессируемой нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений, конкретно, суспензией выбранного штамма вида Agrobactenum при OD₆₀₀, равной 0,1-4,0, указанный штамм содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений;

(iii) инкубации инфильтрованного растения, конкретно, в течение периода между 5 днями и 20 днями, конкретно, между 7 днями и 15 днями, но особенно, между 8 днями и 10 днями, при условиях, которые обеспечивают экспрессию экспрессируемой нуклеотидной последовательности в инфильтрованном растении и накопление гетерологичного полипептида.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где, перед инфильтрацией, растения подвергают воздействию света, таким образом, что устьичная проводимость находится в интервале от между 70 мкмоль м^-2с^-1 и 600 мкмоль м^-2с^-1, конкретно, между 100 мкмоль м^-2с^-1 и 500 мкмоль м^-2с^-1, конкретно, между 200 мкмоль м^-2с^-1 и 300 мкмоль м^-2с^-1, конкретно, между 250 мкмоль м^-2с^-1 и 450 мкмоль м^-2с^-1.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инфильтрации включает подвергание основных частей растения in situ, включая листья растения, и/или цветки растения, и/или стебель растения, и/или корни растения, но конкретно, целого растения, воздействию давления, которое является более низким, чем атмосферное давление или вакуума.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инфильтрации включает подвергание основных частей растения in situ, включая листья растения, и/или цветки растения, и/или стебель растения, и/или корни растения, но конкретно, целого растения, воздействию давления, которое является более высоким, чем атмосферное давление.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где стадия iii) включает инкубацию растения в условиях естественного освещения в течение семи - девяти часов в день, предпочтительно восьми часов в день. Способ является особенно применимым для улучшения уровня транзиторной экспрессии гетерологичного белка.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где стадия iii) включает инкубацию указанного инфильтрованного растения в вертикальном положении или, в качестве альтернативы, в перевернутом положении.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указан гетерологичный полипептид представляет собой гемагглютинин вируса гриппа или его иммуногенный фрагмент.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный способ дополнительно включает инкубацию целого инфильтрованного растения в перевернутом положении, или в условиях естественного освещения в течение семи - девяти часов в день, или при обоих условиях.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, причем указанный способ дополнительно включает (a) перед инфильтрацией, выращивание целого растения, конкретно, целого растения рода Nicotiana, конкретно, табачного растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта N. tabacum при плотности, равной, по меньшей мере, 100 растениям на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 200-600 растений на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 400-550 растений на квадратный метр, или (b) после инфильтрации, инкубацию инфильтрованных целых растений при плотности, равной, по меньшей мере 100 растениям на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 200-600 растений на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 400-550 растений на квадратный метр, или (c) перед инфильтрацией, выращивание целого растения, конкретно, целого растения рода Nicotiana, конкретно, целого табачного растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта N. tabacum при плотности, равной, по меньшей мере, 100 растениям на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 200-600 растений на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 400-550 растений на квадратный метр, и после инфильтрации, инкубацию инфильтрованных целых растений при плотности, равной, по меньшей мере, 100 растениям на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 200-600 растений на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 400-550 растений на квадратный метр.

В конкретном варианте осуществления, способ в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления включает (a) перед инфильтрацией, выращивание целого растения, конкретно, целого растения рода Nicotiana, конкретно, целого табачного растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта N. tabacum при плотности, равной, по меньшей мере, 100 растениям на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 200-600 растений на квадратный метр, конкретно, при плотности, равной 400-550 растений на квадратный метр, и (b) инфильтрацию указанных растений, когда они достигают высоты, равной 30-50 см, конкретно, 35-45 см.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где инфильтрованные растения, конкретно, инфильтрованные растения рода Nicotiana, конкретно, Agrobacterium инфильтрованные табачные растения инфильтруют водным раствором фермента, содержащим один или несколько ферментов, которые разрушают или расщепляют растительную клеточную стенку, чтобы способствовать экстрации и очистке гетерологичного белка. Конкретно, раствор фермента содержит один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из целлюлаз, гемицеллюлаз, ксиланаз, пектиназ и полигалактуроназ. Целлюлазы, которые могут применяться, включают эндоглюканазы (E.C. 3.2.1.4), целлобиогидролазы (также именуемые как экзоглюканаза, E.C. 3.2.1.91), или β-глюкозидазы (также именуемые как целлобиаза, E.C. 3.2.1.21). После инфильтрации ферментами, растения могут инкубироваться в течение периода времени в интервале от, по меньшей мере, 1, 2, 5, 10, 12, 18 до 24 часов.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение предоставляет композицию, содержащую полипептид гемагглютинина 5 вируса гриппа (H5), конкретно, полипептид гемагглютинина 5 вируса гриппа (H5), как показано в SEQ ID NO: 8, продуцируемый в растении, конкретно, растении рода Nicotiana, конкретно, табачного растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта N. tabacum посредством способа в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение предоставляет систему для продуцирования гетерологичного полипептида у целого растения, конкретно, целого растения рода Nicotiana, конкретно, целого табачного растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта N. tabacum в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, экспрессируемой нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений, конкретно, суспензии содержащей клетки штаммаа вида Agrobacterium, содержащие экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, средство для инфильтрации целых растений, конкретно, клетками Agrobacterium, и, необязательно, теплицу для инкубации инфильтрованного растения, которая приспособлена для поддержки (a) инкубации инфильтрованного растения в перевернутом положении при освещении сверху в течение от семи до девяти часов в день, (b) выращивания или инкубации целого растения при плотности, равной по меньшей мере 75 растений на квадратный метр или (c) обоих процессов.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный гетерологичный полипептид представляет собой фактор роста, рецептор, лиганд, сигнальную молекулу; киназу, фермент, гормон, супрессор опухоли, белок свертывания крови, белок клеточного цикла, метаболический белок, нейрональный белок, сердечный белок, белок, недостающий при специфических болезненных состояниях, антитела, антигены, белки, которые обеспечивают устойчивость к заболеваниям, белки для заместительной терапии генетических заболеваний человека, противомикробные белки, интерфероны и цитокины. Примеры включают, но не ограничены ими, вирусные антигены, такие как гемагглютинин вируса гриппа.

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ для инкубации инфильтрованного растения, содержащего экспрессируемую нуклеотидную последовательность кодирующую полипептид, конкретно, гетерологичный полипептид, причем указанный способ включает инкубацию растения в перевернутом положении. Способ, является применимым, конкретно, для увеличения уровня транзиторной экспрессии гетерологичного белка. Предпочтительно, растение, которое инкубируют в перевернутом положении, представляет собой целое растение, которое инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, конкретно, гетерологичный полипептид. В еще одном другом варианте осуществления, растение, которое инкубируют в перевернутом положении, представляет собой трансгенное растение. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инкубации включает инкубацию инфильтрованного растения в перевернутом положении. Также предоставлена теплица, которая приспособлена для поддержки инкубации инфильтрованных растений в перевернутом положении в течение любого отрезка времени, где перевернутые инфильтрованные растения освещают свыше.

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ для инкубации инфильтрованного растения, содержащего экспрессируемую нуклеотидную последовательность кодирующую полипептид, конкретно, гетерологичный полипептид, указанный способ включает инкубацию растения в условиях естественного освещения в течение от семи до девяти часов в день, предпочтительно восьми часов в день. Способ, конкретно, является применимым для увеличения уровня транзиторной экспрессии гетерологичного белка. Предпочтительно, инфильтрованное растение представляет собой целое растение, которое инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, конкретно, гетерологичный полипептид. Предпочтительно, растение, которое инкубируют, является растением на свету в течение от семи до девяти часов в день, предпочтительно восьми часов в день. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инкубации включает инкубацию инфильтрованного растения в перевернутом положении.

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ для инкубации множества инфильтрованных растений, внутри определенной области, где число инфильтрованных растений на единицу площади составляет выше среднего значения, которое применяют для выращивания трансгенных растений. Способ включает инкубацию, по меньшей мере 25-500 инфильтрованных растений на квадратный метр, или, по меньшей мере, 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере, 150, по меньшей мере, 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400 инфильтрованных растений на квадратный метр. Предпочтительно, растение представляет собой целое растение, которое инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, конкретно, гетерологичный полипептид. Способ является применимым, конкретным для снижения затрат на продуцирование гетерологичного полипептида. Также предоставлена теплица, которая приспособлена для инкубации, по меньшей мере, 25-500 инфильтрованных растений на квадратный метр, или, по меньшей мере, 100 инфильтрованных растений на квадратный метр. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инкубации включает инкубацию инфильтрованного растения с другими инфильтрованными растениями в определенной области, где плотность инфильтрованного растения в области составляет, по меньшей мере, 25-500 инфильтрованных растений на квадратный метр, или, по меньшей мере, 100 инфильтрованных растений на квадратный метр.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к композиции, содержащей комбинацию выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт, проявляют менее, чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорт были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащей комбинацию выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum выбранным штаммом вида Agrobacterium, содержащим экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений при OD₆₀₀ равной 0,1-4,0.

В одном варианте осуществления клетки Agrobacterium в указанной композиции имеют плотность клеток (OD₆₀₀), равную, по меньшей мере, 2,1, по меньшей мере, 2,4, по меньшей мере, 2,7, по меньшей мере, 3,0, по меньшей мере, 3,3, по меньшей мере, 3,6, по меньшей мере 3,8, по меньшей мере 3,9, равной, по меньшей мере, 4,0.

В одном варианте осуществления разновидность, линия скрещивания или сорт Nicotiana tabacum в указанной композиции выбирают из группы, состоящей из N. tabacum с обозначением PO2, AS44, Wisliςa, Simmaba, PM132, PM092, PM016, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, PM102, NC 297, PM021, AA37-1, B13P, F4 от скрещивания BU21 × Hoja Parado, линия 97, Samsun, PO1, PM204, PM205, PM215, PM216 и PM217.

В одном варианте осуществления разновидность, линия скрещивания или сорт Nicotiana tabacum в указанной композиции выбирают из группы, состоящей из Nicotiana tabacum линии PM016, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd, (Международное Хранилище по Будапештскому договору, расположенном по адресу Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Соединенное Королевство) под инвентарным номером NCIMB 41798; PM021, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41799; PM092, семена которой были депонированы 6 января 2011 в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41800; PM102, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41801; PM132, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41802; PM204, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41803; PM205, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41804; PM215, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41805; PM216, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41806; и PM217, семена которой были депонированы 6 января 2011 г. в NCIMB Ltd. под инвентарным номером NCIMB 41807.

В одном варианте осуществления, выбранный штамм Agrobacterium в любой из ранее описанных композиций, представляет собой штамм Agrobacterium tumefaciens, выбранный из группы, состоящей из AGL1, EHA105, GV2260, GV3101 и Chry5.

В одном варианте осуществления, выбранный штамм Agrobacterium в любой из ранее описанных композиций, представляет собой штамм Agrobacterium AGL1 или EHA105.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к композиции, содержащей комбинацию линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens или линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом EHA105 Agrobacterium tumefaciens.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к композиции, содержащей комбинацию линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens или линии PM204 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к композиции в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный штамм Agrobacterium дополнительно содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность протеазы хелперного компонента (HcPro) потивируса.

Определения

Техническим и научным терминам и выражениям, используемым в пределах объема притязаний данной заявки, в целом, придается значение, которое они обычно имеют в области техники биологии растений. В данном документе ссылаются на разнообразные методологии, известные квалифицированным специалистам в области. Публикации и другие материалы, в которых приводятся такие известные методологии, на которые делаются ссылки, включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте, как если бы они приводились в полном объеме. При практической реализации изобретения будут использоваться, если не указано другим образом, общепринятые методы химии, молекулярной биологии, микробиологии, генетической инженерии и биологии растений, которые находятся в пределах квалификации в данной области.

Любые подходящие материалы и/или способы, известные квалифицированным специалистам, могут применяться при осуществлении настоящего изобретения: однако, описаны предпочтительные материалы и/или способы. Материалы, реагенты и т.п., на которые ссылаются в следующих описаниях и примерах, могут быть получены из промышленных источников, если не отмечено иным образом.

Все из следующих определений терминов применяют к полному содержанию данной заявки. Слово "включающий" не исключает других элементов или стадий, а неопределенный артикль "a" или "an" не исключает множество. Единственная стадия может выполнять функции нескольких признаков, приведенных в формуле изобретения. Термины "по существу", "около", "приблизительно" и т.п. в связи с параметром или значением, конкретно, также определяют точно параметр или точно значение, соответственно. Термин "около" в контексте данного числового значения или интервала относится к значению или интервалу, который находится в пределах 20%, в пределах 10% или в пределах 5% от данного значения или интервала.

"Растение", как используют в пределах настоящего изобретения, относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития, и его потомкам.

"Растительная часть" или "часть растения", как используют здесь, означает обозначение любой части растения, т.е. органа растения, растительной ткани, растительной клетки, зародыша, листа и т.д. в полевых условиях или в культуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, относящихся к инокуляции растения в условиях высокого или низкого давления или их комбинации, этот термин относится к частям растения в полевых условиях.

"Табачное растение", как применяют в пределах настоящего изобретения относится к растению видов, принадлежащих к роду Nicotiana, включая но не ограничиваясь лишь им Nicotiana tabacum (или N. tabacum). Некоторые варианты осуществления изобретения описаны здесь с использованием термина "табачное растение" без уточнения Nicotiana tabacum, такие описания должны рассматриваться как конкретно включающие Nicotiana tabacum.

"Растительная клетка" или "табачная растительная клетка", как используют в пределах настоящего изобретения, относится к структурной и физиологической единице растения, конкретно, табачного растения. Растительная клетка может находиться в виде протопласта без клеточной стенки, изолированной одиночной клетки или культивируемой клетки, или как часть более высокоорганизованной единицы, такой, но не ограниченной лишь ими, растительной ткани, растительного органа или целого растения.

"Растительный материал", как используют в пределах настоящего изобретения, относится к любой твердой, жидкой или газообразной композиции, или их комбинации, получаемой из растения, включая листья, стебли, корни, цветки или части цветков, плоды, пыльцу, яйцеклетки, зиготы, семена, обрезки, выделения, экстракты, культуры клеток или тканей или любым другим частям или продуктам растения.

"Растительная ткань", как использую здесь, означает группу растительных клеток, организованную в структурную или функциональную единицу. Любая ткань растения в полевых условиях или в культуре включается. Этот термин включает, но не ограничен лишь ими, целые растения, органы растения и семена.

"Растительный орган", как используют здесь, относится к обособленной или дифференцированной части растения, такой как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.

Термин "оптическая плотность" или “OD" относится к оптическому определению поглощения оптического элемента при данной длине волны (например, 600 нм = OD₆₀₀), измеренного на спектрофотометре.

Термин "полинуклеотид" используют здесь для обозначения полимера нуклеотидов, который может представлять собой немодифицированную или модифицированную дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). Соответственно, полинуклеотид может представлять собой без ограничения, геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловую РНК. Кроме того, полинуклеотид может являться однонитевой или двухнитевой ДНК, ДНК которая является смесью однонитевой и двухнитевых областей, гибридную молекулу, содержащую ДНК и РНК, или гибридную молекулу со смесью однонитевых и двухнитевых областей. Дополнительно, полинуклеотид может быть составлен из трехнитевых областей, содержащих ДНК, РНК или обеих. Полинуклеотид может содержать одно или несколько модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может представлять собой пептиднуклеиновую кислоту (ПНА). В целом, полинуклеотиды, предоставляемые данным изобретением могут быть собраны из изолированных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или индивидуальных нуклеотидов или комбинации вышеперечисленных.

Термин "генная последовательность", как используют здесь, относится к нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которая кодирует белок или полипептид, конкретно, гетерологичный белок или полипептид или биологически активной РНК, и охватывает нуклеотидную последовательность частичной кодирующей последовательности, которая кодирует только фрагмент гетерологичного белка. Генная последовательность может также включать последовательности, имеющие регуляторную функцию на экспрессию генов, которые расположены против хода транскрипции или по ходу транскрипции относительно кодирующей последовательности, а также интронные последовательности гена.

Каждый из терминов "регулирующая транскрипцию нуклеотидная последовательность" или "регуляторные последовательности", относятся к нуклеотидным последовательностям, влияющим на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию ассоциированной (или функционально связанной) нуклеотидной последовательности, подлежащей транскрипции. Регулирующая транскрипцию нуклеотидная последовательность может иметь разнообразные локализации по отношению к нуклеотидным последовательностям, подлежащим транскрипции. Регулирующая транскрипцию нуклеотидная последовательность может быть расположена против хода транскрипции (5'-некодирующие последовательности), внутри или по ходу транскрипции (3'-некодирующие последовательности) последовательности, подлежащей транскрипции (например, кодирующей последовательности). Регулирующие транскрипцию нуклеотидные последовательности могут быть выбраны из группы, содержащей энхансеры, промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны, 5'-нетранслированные последовательности, 3'-нетранслированные последовательности и сигнальные последовательности полиаденилирования. Они включают природные и синтетические последовательности, а также последовательности, которые могут представлять собой комбинацию синтетических и природных последовательностей.

Термин "промотор" относится к нуклеотидной последовательности по 5’^-концу гена, который направляет инициацию транскрипции гена. В целом, промоторные последовательности являются необходимыми, но не всегда достаточными, чтобы управлять экспрессией гена, с которым они функционально связаны. При построении экспрессируемой генной конструкции, ген помещают в достаточной близости к и в подходящей ориентации относительно промотора, таким образом, что экспрессия гена управляется промоторной последовательностью. Промотор позиционируют предпочтительно против хода транскрипции гена и на расстоянии от сайта начала транскрипции, который сближает расстояние между промотором и геном, которым он управляет в его природном расположении. Как известно в данной области, некоторая вариация этого расстояния может переноситься без потери промоторной функции. Как используют здесь, термин "функционально связанный" означает, что промотор соединен с кодирующей областью таким образом, что транскрипция этой кодирующей области управляется и регулируется этим промотором. Средства для функционального связывания промотора с кодирующей областью являются хорошо известными в области.

Термин "супрессор сайленсинга генов", используемый в контексте данного изобретения, относится к кодируемым вирусом белкам, которые позволяют некоторым генам обойти пост-транскрипционный сайленсинг генов посредством связывания с РНК сайленсинга. Трансгены также, когда их внедряют в растительную клетку, могут запускать пост-транскрипционный сайленсинг генов, в результате которого устанавливается низкая экспрессия таких генов или ее отсутствие.

Термины "белок", "полипептид", "пептид" или "пептидные фрагменты", как используют здесь, являются взаимозаменяемыми и определяются для обозначения биомолекулы, составленной из двух или более аминокислот, связанных пептидной связью, которая может складываться во вторичную, третичную или четвертичную структуру для достижения конкретной морфологии.

Термин "гетерологичный", как используют здесь, относится к биологической последовательности, которая не встречается в природных условиях в контексте конкретных полинуклеотида или полипептида в клетке или организме. Термины "рекомбинантный белок" или "гетерологичный белок" или "гетерологичный полипептид", как используют здесь взаимозаменяемо, относятся к белку или полипептиду, который продуцируется клеткой, но не встречается в природных условиях в клетке. Например, рекомбинантный или гетерологичный белок, продуцируемый в растительной клетке или целом растении, может представлять собой белок млекопитающих или человека.

Гетерологичный белок, который может экспрессироваться в модифицированной растительной клетке, может представлять собой антиген (который может, без ограничения, применяться в вакцине), включая но не ограничиваясь лишь ими, белок патогена, вирусный белок, бактериальный белок, белок простейших, белок нематод; фермент, включая, но не ограничиваясь лишь ими, фермент (который может без ограничения, применяться при лечении заболевания человека или для промышленных применений); цитокин; фрагмент рецептора цитокиан; белок крови; гормон; фрагмент рецептора гормона, липопротеин; антитело или фрагмент антитела.

Термины "антитело" и "антитела" относятся к моноклональным антителам, мультиспецифическим антителам, человеческим антителам, гуманизированным антителам, камелизированным антителам, химерным антителам, одноцепочечным Fvs (scFv), одноцепочечным антителам, однодоменным антителам, доменным антителам (VH, VHH, VLA), фрагментам Fab, F(ab') фрагментам, дисульфид-связанным Fvs (sdFv), и эпитоп-связывающим фрагментам любого из перечисленных выше. Конкретно, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты иммуноглобулиновых молекул, т.е., молекул, которые содержат участок связывания антигена. Иммуноглобулиновые молекулы могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.

Термин "экспрессируемый" в контексте данного изобретения относится к функциональному связыванию гена с регуляторными элементами, которые направляют экспрессию белка или полипептида, кодируемых геном в растительных клетках, содержащихся внутри листа.

Термины "некроз" и "некротический ответ", как используют здесь взаимозаменяемо, относятся к гиперчувствительному ответу в ткани растения, конкретно, табачного растения, включаемого посредством, например, инокуляции ткани растения, например, штаммом Agrobacterium. Некроз наблюдают, когда подвергнутая инъекции ткань листьев разрушается, и клетки умирают (см. Klement & Goodman, Annual Review of Phytopathology 5 (1967) 17-44). Некроз является различимым для специалиста в области от пожелтения, которое является состоянием, при котором не происходит разрушения ткани листьев и обширной смерти клеток.

Как используют здесь, "граница Т-ДНК" относится к ДНК фрагменту, содержащему последовательность длиной приблизительно 25 нуклеотидов, распознаваемую продуктами гена вирулентности штамма Agrobacterium, такого как штамм A. tumefaciens или A. rtiizogenes strain, или его модифицированной или прошедшей мутацию форме, и, который является достаточным для переноса последовательности ДНК, с которой он связан, в эукариотические клетки, предпочтительно, растительные клетки. Это определение включает, но не ограничено лишь ими, все природные границы Т-ДНК из плазмид дикого типа Ti, а также любого их функционального производного, и включает химически синтезированные границы Т-ДНК. В одном аспекте, кодирующая последовательность и последовательность контроля экспрессии экспрессионной конструкции в соответствии с изобретением расположена между двумя границами Т-ДНК.

Термин "вакуумная инфильтрация", как используют в настоящем описании, относится к способу, который обеспечивает проникновение патогенных бактерий, например, Agrobacterium, в межклеточное или интерстициальное пространства. Физически, вакуум генерирует отрицательное атмосферное давление, которое вызывает уменьшение воздушных пространств между клетками в растительной ткани. Более длительное пребывание и более низкое давление, меньшее воздушное пространство создаются внутри растительной ткани. Последующее увеличение давления обеспечивает перемещение бактериальной суспензии, используемой при инфильтрации в растительную ткань, и приводит к контакту клеток Agrobacterium с растительными клетками внутри растительной ткани.

Как используют здесь, "уровень транзиторной экспрессии" относится к способности экспрессировать, по меньшей мере, приблизительно 250 микрограммов, по меньшей мере, приблизительно 500 микрограммов, по меньшей мере, приблизительно 750 микрограммов, по меньшей мере, приблизительно 1 мг, по меньшей мере, приблизительно 2 мг, по меньшей мере, приблизительно 3 мг, по меньшей мере, приблизительно 4 мг, по меньшей мере, приблизительно 5 мг, по меньшей мере, приблизительно 10 мг, по меньшей мере, приблизительно 15 мг, по меньшей мере, приблизительно 25 мг, по меньшей мере, приблизительно 50 мг, по меньшей мере, приблизительно 75 мг, по меньшей мере, приблизительно 100 мг, по меньшей мере, приблизительно 150 мг, по меньшей мере, приблизительно 200 мг, по меньшей мере, приблизительно 500 мг, по меньшей мере, приблизительно 1000 мг, по меньшей мере, приблизительно 1,5 г, по меньшей мере, приблизительно 2 г, по меньшей мере, приблизительно 2,5 г, по меньшей мере, приблизительно 5 г, по меньшей мере, приблизительно 7,5 г, по меньшей мере, приблизительно 10 г, по меньшей мере, приблизительно 15 г, или, по меньшей мере, приблизительно 20 г на кг массы растительной ткани.

Как используют здесь, "транзиторная" относится к периоду времени, который является достаточно длительным, чтобы обеспечить выделение белка из подходящей растительной ткани. Предпочтительно, экспрессия белка находится на приемлемо высоких уровнях в пределах, по меньшей мере, приблизительно 1 дня, по меньшей мере, приблизительно 2 дней, по меньшей мере, приблизительно 3 дней, по меньшей мере, приблизительно 4 дней, по меньшей мере, приблизительно 5 дней, по меньшей мере, приблизительно 6 дней, по меньшей мере, приблизительно 7 дней, по меньшей мере, приблизительно 8 дней, по меньшей мере, приблизительно 9 дней, по меньшей мере, приблизительно 10 дней, по меньшей мере, приблизительно 11 дней, по меньшей мере, приблизительно 12 дней, по меньшей мере, приблизительно 13 дней, по меньшей мере, приблизительно 14 дней, или, по меньшей мере, приблизительно 15 дней после внедрения экспрессионной конструкции в растительную ткань.

В одном аспекте, приемлемо высокие уровни получают в пределах 3-7 или 5-10 дней и более, предпочтительно в пределах 3-5 или 5-7 дней, после введения экспрессионной конструкции в растительную ткань.

Настоящее изобретение предоставляет несколько усовершенствований известных способов, основанных на транзиторной экспрессии, основанных на предварительно выбранной комбинации разновидности N. tabacum и штаммов Agrobacterium, которые обеспечивают продуцирование больших количеств гетерологичного белка экономичным образом и за короткий период времени (относительно тому, что требуется для трансгенного растения).

Конкретно, настоящее изобретение предоставляет способ продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у Nicotiana tabacum, включающий стадии:

(i) предоставления комбинации выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта растения Nicotiana tabacum и выбранного штамма вида Agrobacterium, причем разновидность, линия скрещивания или сорт проявляют менее чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорт были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀ равной 0,32;

(ii) инфильтрации целого растения из выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum суспензией выбранного штамма вида Agrobacterium при OD₆₀₀, равной 0,1-4,0, причем указанный штамм содержит экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид под контролем регуляторных последовательностей, функционирующих у растений;

Разновидности N. Tabacum

Настоящее изобретение предоставляет предварительно выбранные разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum для применения в качестве растений-хозяев в способах продуцирования гетерологичного полипептида посредством транзиторной экспрессии. Особенно желательным, является применять одну из разновидности, линий скрещивания или один из сортов Nicotiana tabacum в качестве растения-хозяина, которое подлежит инфильтрации предварительно выбранным штаммом Agrobacterium, чтобы оптимизировать выход гетерологичного полипептида. Разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum могут быть выбраны из группы, состоящей из инвентарных обозначений N tabacum PM016, PM021, PM92, PM102, PM132, PM204, PM205, PM215, PM216 или PM217, как они депонированы в NCIMB, Aberdeen, Scotland, или DAC Mata Fina, PO2, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, PO2, Wisliςa, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 от скрещивания BU21 x, Hoja Parado линии 97, Samsun NN, Izmir, Xanthi NN, Karabalgar, Denizli и PO1, или любых других разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum, которые проявляют менее, чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium, конкретно, штаммом Agrobacterium, идентифицированном в следующем параграфе, но особенно, штаммом Agrobacterium AGL1 или EHA105, при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32. В разнообразных вариантах осуществления, растения предварительно выбранной разновидности N. tabacum, которые имеют возраст от 5 до 7 недель, предпочтительно 6 недель, выращенные из семян, используют на стадии инфильтрации изобретения. Обычно, такие растения N. tabacum имеют высоту, в интервале от 40 до 60 мм, и, предпочтительно, от 43 до 55 мм.

Виды и штаммы Agrobacterium

Настоящее изобретение предоставляет предварительно выбранные штаммы Agrobacterium для применения в способах продуцирования гетерологичного полипептида посредством транзиторной экспрессии экспрессируемой последовательности. Особенно преимущественным является использовать один из предварительно выбранных штаммов Agrobacterium для инфильтрации предварительно выбранной разновидности N. Tabacum, чтобы оптимизировать выход гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, виды Agrobacterium, которые могут использоваться в способе в соответствии с изобретением, включают но не ограничены лишь ими Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi, Argobacterium vitis, но особенно, Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один штамм Agrobacterium содержит Agrobacterium tumefaciens. Используемые виды Agrobacterium могут представлять собой штамм дикого типа (например, вирулентный) или безопасный штамм. Подходящие штаммы Agrobacterium включают штаммы дикого типа (например, такие как Agrobacterium tumefaciens) или штаммы, у которых один или несколько генов подвергнуты мутации для увеличения эффективности трансформации, например, такие как штаммы Agrobacterium, где генная экспрессия vir и/или его индукция изменены вследствие присутствия мутантных или химерных генов virA или virG (например, Chen and Winans, 1991, J. Bacteriol. 173: 1139-1144; и Scheeren-Groot et al., 1994, J. Bacteriol. 176:6418-6246), Штаммы Agrobacterium, содержащие избыточные копии гена virG, такого как гена super virG, полученного из pTiBo542, предпочтительно связывались с дубликатной плазмидой, как описано, например, в патенте США № 6483013. Другие подходящие штаммы включают, но не ограничены лишь ими: A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke et al., Nature 252: 169-170 (1974)), A136 (Watson et al., J. Bacteriol 123: 255-264 (1975)); LBA401 1 (Klapwijk et al., J. Bacteriol 141: 128-136 (1980)), LBA4404 (Hoekema et al., Nature 303: 179-180 (1983)); EHA101 (Hood et al., J. Bac. 168: 1291-1301 (1986)); EHA105 (Hood et al., Trans Res. 2: 208-218 (1993)); AGL1 (Lazo et al., Bio/Technology 2: 963-967 (1991)); A281 (Hood et al., supra (1986)).

В разнообразных конкретных вариантах осуществления изобретения, штамм Agrobacterium tumefaciens AGL1 или EHA105 может применяться в способе в соответствии с настоящим изобретением.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, множество суспензий клеток Agrobacterium, каждая из которых экспрессирует различные гены, может применяться для продуцирования индивидуальных белков или гетеромультимерного белка, или для повышения уровня экспрессии гетерологичного полипептида. В таких случаях, предполагают, что клетки Agrobacterium в различных суспензиях клеток Agrobacterium могут представлять собой такой же предварительно выбранный штамм или различные предварительно выбранные штаммы. Альтернативно или дополнительно, одиночный штамм Agrobacterium может содержать множество последовательностей, содержащих различные гены, конкретно, гетерологичные гены. Различные гены могут заключаться в пределах одиночной молекулы нуклеиновой кислоты (например, одиночного вектора) или могут быть предоставлены в различных векторах. Неограничивающим примером второго гена, который может экспрессироваться в растении-хозяине является ген, который кодирует супрессор сайленсинга, вирусного происхождения.

Тест на некроз

Изобретение предоставляет тест на некроз для предварительного выбора разновидности Nicotiana tabacum в качестве растения-хозяина и штамма Agrobacterium в качестве носителя для внедрения экспрессируемой нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный полипептид в клетки растения-хозяина, где такая предварительно выбранная комбинация продуцирует эффективно значимое количество гетерологичного полипептида. Без связи с приведенным ниже, тест на некроз этого изобретения позволяет проводить идентификацию растения-хозяина, которое является восприимчивым к инфекции клетками штамма Agrobacterium, и все еще остается резистентным к разрушению его ткани клетками Agrobacterium, посредством чего выживает в течение достаточного периода времени, в интервале от пяти до десяти дней, для обеспечения экспрессии гена, кодирующего гетерологичный полипептид, и накопления гетерологичного полипептида в инфицированных растительных клетках. Ожидается, что комбинации разновидностей N. tabacum и штаммов Agrobacterium, которые приводят в результате к значительному некрозу, продуцируют меньше и накапливают меньше гетерологичного полипептида, поскольку инфицированные растительные клетки погибают рано и быстро, и любой продуцируемый гетерологичный белок будет разрушаться в мертвых клетках или потерян перед сбором.

Тест на некроз включает инфильтрацию листьев разновидности N. tabacum в возрасте шести недель посредством инъекции суспензии клеток Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32 с помощью шприца. Обычно, сразу же после инфильтрации, возможно увидеть сектор листа, стягиваемый жилками рядом с участком инъекции, который становится насыщаемым бактериальной суспензией. Периметр сектора маркируют для более позднего присвоения балльной оценки. Целое растение с инфильтрованными листьями инкубируют при условиях нормального роста, и листья инспектируют через 5 дней после инфильтрации. Некроз характеризуется разрушением растительной ткани и обширной смертью клеток в пределах инфильтрованного сектора, и может быть подвергнут балльной оценке методами, хорошо известными в области (Klement & Goodman, Annual Review of Phytopathology 5 (1967) 17-44). Если инфильтрованные листья проявляют менее чем 20%, менее чем 10% некроза, менее чем 5% некроза, менее чем 2% некроза, или менее чем 1% некроза, разновидность N. tabacum и штамм Agrobacterium являются предварительно выбранной комбинацией разновидности N. tabacum и штамма Agrobacterium изобретения. Методы количественной оценки процентного выражения некроза (% некроза) являются хорошо известными в области, и его можно определить, например, посредством измерения площадей одного или нескольких листьев, которые являются некротическими и общих площадей одного или более листьев, которые были инфильтрованы клетками Agrobacterium.

Бинарный вектор

Любой бинарный вектор может применяться в пределах объема способа настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления, имеющий минимальный размер бинарный вектор (на который также ссылаются, как на минимальный бинарный вектор) может использоваться в способах изобретения. Эти бинарные векторы с минимальным размером раскрыты в рассматриваемой одновременно с настоящей заявкой, заявке того же заявителя, EP11151187.9, поданной 17 января 2011 г, раскрытие которой включено здесь во всей полноте. Их особенным образом конструируют для управления транзиторной экспрессии кодирующей последовательности, кодирующей белок или полипептид, конкретно, гетерологичный белок или полипептид (который помещают в пределах области Т-ДНК) в инфильтрованных табачных растениях. В большинстве вариантов осуществления, бинарные векторы, которые могут использоваться в способах изобретения, не кодируют вирусные белки или вирусные функции, которые способствуют системному распространению или движению клетка-к-клетке последовательности в инфильтрованном растении. Подробности вектора описаны в разделах ниже.

Настоящая заявка, следовательно, предоставляет векторы для опосредованной Agrobacterium трансформации в способе в соответствии с изобретением, особенно преимущественные для экспрессии нуклеиновой кислоты в растительной клетке, конкретно экспрессии белка или полипептида в растительной клетке, растительной ткани или конкретном компартаменте растительной клетки, для продуцирования одного или нескольких метаболитов или других соединений в растительной клетке, или части растительной клетки, для регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты, для идентификации последовательностей с регуляторной функцией в растительной клетке, для идентификации функции гена и нуклеиновой кислоты, либо одной или нескольких экзогенных или эндогенных нуклеиновых кислот.

Имеющие минимальный размер бинарные векторы, которые предоставлены здесь, являются особенно преимущественными, поскольку они имеют минимальный размер, стабильно поддерживаются в виде высокого количества копий в бактериальной клетке, являются в высокой степени гибкими и применимыми для множества целей и могут применяться для транзиторной экспрессии, а также экспрессии гетерологичной последовательности в стабильных трансгенном растении или растительной клетке.

Имеющий минимальный размер бинарный вектор, который может применяться в пределах объема способа настоящего изобретения, может содержать, состоять из, или состоять по существу из следующих элементов нуклеиновой кислоты:

a) первого элемента нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер, который является функциональным в Escherichia coli и виде Agrobacterium;

b) второго элемента нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации, которая является функциональной в Escherichia coli;

c) третьего элемента нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-инициатор репликации;

d) четвертого элемента нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации, которая является отличной от первой точки начала репликации, и которая является функциональной в Agrobacterium, и

e) пятого элемента нуклеиновой кислоты, содержащего нуклеотидную последовательность области Т-ДНК, содержащую правую пограничную последовательность Т-ДНК и левую пограничную последовательность Т-ДНК, индуцирующей опухоль плазмиды Agrobacterium tumefaciens или индуцирующей разрастание корней плазмиды Agrobacterium rhizogenes;

где вышеуказанные элементы нуклеиновой кислоты предоставлены на кольцевой полинуклеотидной молекуле и разделены пробельными нуклеотидными последовательностями, которые не имеют функции при репликации, поддержании или переносе нуклеиновой кислоты, и, где указанные пробельные нуклеотидные последовательности составляют менее чем 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% от общего размера вектора. Предпочтительно, пробельные нуклеотидные последовательности составляют менее чем 20% от общего размера вектора.

В конкретном варианте осуществления изобретения, имеющий минимальный размер бинарный вектор может применяться в способе в соответствии с настоящим изобретением, где

(i) левая пограничная последовательность Т-ДНК и нуклеотидная последовательность, кодирующая селектируемый маркер (a), разделены первой нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 300 по;

(ii) нуклеотидная последовательность, кодирующая селектируемый маркер (a), и нуклеотидная последовательность первой точки начала репликации (b) разделены второй нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 200 по;

(iii) нуклеотидная последовательность первой точки начала репликации (b) и нуклеотидная последовательность, кодирующая белок-инициатор репликации (c), разделены третьей нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 200 по;

(iv) нуклеотидная последовательность, кодирующая белок-инициатор репликации (c), и нуклеотидная последовательность второй точки начала репликации (d) разделены четвертой нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 500 по; и

(v) нуклеотидная последовательность второй точки начала репликации (d) и правая пограничная последовательность Т-ДНК разделены пятой нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 150 по.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, имеет общий размер, равный менее чем 5900 по, менее чем 5500 по, менее чем 5200 по или менее чем 5100 по, но особенно, общий размер 5150 по.

В еще одном другом конкретном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определен в предшествующем параграфе, где элементы нуклеиновой кислоты от (a) до (e) расположены линейно относительно друг друга на векторной молекуле, чтобы находиться в порядке построения в первом варианте осуществления изобретения, т.е., (a)(b)(c)(d)(e).

Квалифицированный специалист в области будет способен легко генерировать имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, содержащий скелет с различным порядком элементов нуклеиновых кислот от a) до e), как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления.

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер, функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), расположен проксимально к левой пограничной последовательности Т-ДНК. В конкретном варианте осуществления, элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер, функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), и левую пограничную последовательность Т-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 300 по.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер, функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), расположен проксимально к правой пограничной последовательности Т-ДНК. В конкретном варианте осуществления, элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), и правую пограничную последовательность Т-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 150 по.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и второй точки начала репликации (d), расположены проксимально к левой пограничной последовательности Т-ДНК и правой пограничной последовательности Т-ДНК, соответственно.

В конкретном варианте осуществления изобретения, предоставлена векторная молекула в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где первая точка начала репликации (b) и вторая точка начала репликации (d) не являются непосредственно примыкающими друг к другу, и, по меньшей мере, один другой функциональный элемент вектора разделяет первую точку начала репликации (b) и вторую точку начала репликации (d).

В конкретном варианте осуществления изобретения, первую точку начала репликации (b) и вторую точку начала репликации (d) выбирают из группы, состоящей из Col E1 ori и RK2 oriV, соответственно.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b), расположен проксимально к левой пограничной последовательности Т-ДНК, а элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d), расположен проксимально к правой пограничной последовательности Т-ДНК.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b), расположен проксимально к правой пограничной последовательности Т-ДНК, а элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d), расположен проксимально к левой пограничной последовательности Т-ДНК.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлена векторная молекула в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где первая точка начала репликации (b) и вторая точка начала репликации (d) не являются непосредственно примыкающими друг к другу, и, по меньшей мере, один другой функциональный элемент вектора разделяет первую точку начала репликации (b) и вторую точку начала репликации (d).

В еще одном другом варианте осуществления, элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) или второй точки начала репликации (d) и левую пограничную последовательность Т-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 300 по. В еще одном другом варианте осуществления, элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) или второй точки начала репликации (d) и правую пограничную последовательность T-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 150 по.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности первой точки начала репликации (b) и второй точки начала репликации (d), являются примыкающими друг к другу и расположены проксимально к левой пограничной последовательности Т-ДНК. В конкретном варианте осуществления, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) или нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d) и левую пограничную последовательность Т-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 300 по, и элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и второй точки начала репликации (d) разделены нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 200 по.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности первой точки начала репликации (b) и второй точки начала репликации (d), являются примыкающими друг к другу и расположены проксимально к правой пограничной последовательности Т-ДНК. В конкретном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) или нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d) и правую пограничную последовательность Т-ДНК, разделен нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 150 по, и элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и второй точки начала репликации (d), разделены нуклеотидной последовательностью, заполняющей пробел из не более чем 500 по.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-инициатор репликации (c), фланкирован элементами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d).

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), фланкирован элементами нуклеиновой кислоты, содержащими нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d). В конкретном варианте осуществления, фланкирующие элементы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации (b) и нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации (d), отделены от элементов нуклеиновой кислоты, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-инициатор репликации (c), или элементов нуклеиновой кислоты, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium (a), посредством нуклеотидной последовательности, заполняющей пробел из не более чем 200 по и 500 по, соответственно.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (a) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер функциональный в клетке Escherichia coli и Agrobacterium. Селектируемый маркер может являться резистентным к антибиотикам, конкретно, резистентным к антибиотику, выбранному из группы, состоящей из ампициллина, хлорамфеникола, канамицина, тетрациклина, гентамицина, спектиномицина, блеомицина, флеомицина, рифампицина, стрептомицина и бластицидина S.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (b) содержит нуклеотидную последовательность первой точки начала репликации, функциональную в Escherichia coli, выбранную из группы, состоящей из ColE1 точки начала репликации, точки начала репликации, принадлежащей к группе несовместимости ColE1; pMB1 точки начала репликации, и точки начала репликации, принадлежащей к любой из групп несовместимости FI, FII, FIII, FIV, I, J, N, O, P, Q, T или W.

В конкретном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (b) содержит нуклеиновую кислоту ColE1 точки начала репликации. ColE1 точка начала репликации может быть получена, например, из вектора pBluescript (Agilent Technotogies, Santa Clara, CA, USA).

В еще одном другом конкретном варианте осуществления изобретения, изобретение предоставляет имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (b) содержит нуклеиновую кислоту из pMB1 точки начала репликации. pMB1 точки начала репликации кодирует две РНК, PHKI и РНКII и один белок, известный как Rom или Rop. Например, pMB1 точки начала репликации может представлять собой pGEM вектора (Promega Corporation, Madison, Wl, USA) или pUC вектора, такого как, но не ограничиваясь лишь ими, pUC8 (GenBank: L08959.1) и приводящий в результате к высокому количеству копий.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (c) содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-инициатор репликации который представляет собой RK2 TrfA белок-инициатор репликации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (d) содержит нуклеотидную последовательность второй точки начала репликации, которая является отличной от первой точки начала репликации и является функциональным в Agrobacterium, и содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из минимально oriV точки начала репликации, RK2 oriV, и точки начала репликации, принадлежащей к любой из группы несовместимости FI, FII, FIII, FIV, I J, N, O, P, Q, T или W.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлена векторная молекула в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где второй элемент нуклеиновой кислоты b) или четвертый элемент нуклеиновой кислоты d) является точкой начала репликации (oriV), а третий элемент нуклеиновой кислоты c) представляет собой TrfA белок-инициатор репликации из широкого интервала плазмиды хозяина RK2, функциональный как в Escherichia coli, так и Agrobacterium spp. (Schmidhauser и Helinski (1985). J. Bacteriol. 164: 446-455).

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлена векторная молекула в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где пятый элемент нуклеиновой кислоты e) содержит две пограничные последовательности Т-ДНК, а именно левую пограничную последовательность T-ДНК и правую пограничную последовательность Т-ДНК.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, элемент нуклеиновой кислоты e) содержит пограничную последовательность Т-ДНК из Agrobacterium spp. штамма из семейства нопалинов, который обладает способностью катализировать нопалин, нопалиновую кислоту, лейцинопин, глутаминопин или сукцинамопин.

В альтернативных вариантах осуществления изобретения, элемент нуклеиновой кислоты e) содержит пограничную последовательность T-ДНК из штамма Agrobacterium из семейства октопинов, который обладает способностью катализировать октопин, октопиновую кислоту, лизопин или гистопин. В некоторых других вариантах осуществления изобретения, элемент нуклеиновой кислоты e) содержит пограничную последовательность Т-ДНК штамма Agrobacterium из семейства маннитилов, катализирующего маннопин, маннопиновую кислоту, агропин или агропиновую кислоту.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлен имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где элемент нуклеиновой кислоты (e) содержащий нуклеотидную последовательность области Т-ДНК, содержащей правую пограничную последовательность Т-ДНК и левую пограничную последовательность Т-ДНК опухолеиндуцирующей плазмиды Agrobacterium tumefaciens или индуцирующей разрастание корней плазмиды Agrobacterium rhizogenes, содержит, по меньшей мере, один уникальный сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, конкретно, по меньшей мере, два, три, четыре или пять уникальных сайтов расщепления эндонуклеазой рестрикции.

Сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции может представлять собой сайт, выбранный из группы, состоящей из AatII, Acc65l, AcII, AfIII, AfIIII, AhdI, AloI, ApaBI, ApaI, AseI, AsiSI, AvrII, BaeI, BamHI, BanII, Bbr71, BbsI, BbvCI, BfrBI, BlpI, BmtI, BplI, Bpmi, Bpu10I, BsaAI, Bsai, BsaXI, BsiWI, BspEI, BsrGI, BstAPI, BstBI, BstZ17l, Bsu36I, DraIII, EcolCRI, EcoNI, EcoRI, FalI, FseI, FspAI, HindIII, HpaI, KpnI, M.AcII, M.AfIIII, M.AIoI, M.ApaI, V.BaeI, M.BanII, M.BbvCIA, M.BbvCIB, M.BnI, M.BsaAI, M.BstI, M.BstVI, M.DraIII, M.EcoAI, M.EcoKI, M.EcoR124I, M.HindIII, M.HpaI, M.KpnBI, M.KpnI, M.MunI, M.PaeR7I, M.PhiBssHII, M.PshAI, M.Rrh4273I, M.SacI, M.SaII, M.Sau3239l, M.SnaBI, M.Tth111I, M.VspI, M.XbaI, M.XhoI, MfeI, MluI, NheI, NruI, NsiI, PciI, PmlI, Ppu10I, PshAI, PspOMI, PsrI, RsrII, SacI, SaiI, SanDI, SapI, SciI, SnaBI, SrfI, SwaI, Tth111I, XbaI, XhoI, XmnI и ZraI. Такие сайты расщепления могут принимать внедрение любой ДНК (такой как экспрессионной кассеты), которая содержит совместимый 5'-конец, совместимый 3'-конец, или один или два “тупых” концов.

В одном варианте осуществления, указанная кассета экспрессии содержит регуляторный элемент, который является функциональным у растения, конкретно, растения рода Nicotiana, и нуклеотидную последовательность, представляющую интерес.

Квалифицированный специалист в области может легко удалить сайт распознавания эндонуклеазы, который вырезают один или несколько раз, посредством мутации или изменения одного или нескольких пар оснований нуклеиновой кислоты, содержащей указанный сайт распознавания без изменения свойств вектора. Следует учитывать, что любой такой сайт распознавания эндонуклеазы рестрикции, который находится снаружи кодирующей последовательности, регуляторной последовательности или другой последовательности с функцией, существенной для вектора, может быть изменен без оказания воздействия на свойства и функции вектора. Аналогично, следует учитывать, что можно подвергать мутации последовательность, содержащуюся в пределах фрагмента, кодирующего белок, без изменения функции указанного белка посредством введения молчащей мутации. Следует учитывать, что квалифицированный специалист в области может не иметь необходимости в уникальном сайте рестрикции или любом сайте рестрикции или комбинации сайтов для целей клонирования, поскольку последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии в растительной клетке, или любая другая последовательность нуклеиновой кислоты, может также быть непосредственно введена в область Т-ДНК вектора или куда-то в другое место посредством конструирования, и химически синтезирована вместе с элементами нуклеиновой кислоты от a) до e) векторной молекулы в соответствии с изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, без необходимости использовать эндонуклеазы рестрикции.

Изобретение также предоставляет имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с изобретением, где пятый элемент нуклеиновой кислоты (e) дополнительно содержит, между правой пограничной последовательностью Т-ДНК и левой пограничной последовательностью Т-ДНК, регуляторный элемент, который является функциональным в трансформированных растении или растительной клетке, и который будет функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей продукт, представляющий интерес, когда такую нуклеотидную последовательность внедряют в векторную молекулу. Такие векторные молекулы могут легко применяться для введения нуклеотидной последовательности, представляющей интерес. Один или несколько уникальных сайтов расщепления рестрикцией могут присутствовать между регуляторным элементом и одной из пограничных последовательностей Т-ДНК, чтобы способствовать введению нуклеотидной последовательности, представляющей интерес. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение дополнительно предоставляет имеющий минимальный размер бинарный вектор для применения в способе в соответствии с изобретением, где пятый элемент нуклеиновой кислоты (e) дополнительно содержит, между правой и левой пограничными последовательностями Т-ДНК, регуляторный элемент, который является функциональным в растительной клетке, и, который является функционально связанным с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, представляющий интерес.

В разнообразных вариантах осуществления изобретения, регуляторный элемент, который присутствует в области T-ДНК, представляет собой промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, модифицированного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, двойного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, минимального промотора 35S, промотора нопалинсинтазы, промотора вируса мозаики вигны китайской, промотора HT-CPMV, промотора CPS2p копалилсинтазы табака, промотора дигидринина, промотора пластоцианина, 35S/Промотора HT-CPMV, и многих других промоторов, которые извлекают из колимовирусов, таких как, но не ограничиваясь лишь ими, вирус (MMV), вируса мозаики норичника (FMV), вирус хлоротичных прожилок арахиса (PCLSV), двойного 35S промотора CaMV (35S×2), двойного промотора MMV (MMV×2) и двойного промотора FMV (FMV×2).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеотидная последовательность под контролем регуляторного элемента растения кодирует селектируемый маркер, который является функциональным в растительной клетке, конкретно, селектируемый маркер, выбранный из группы, состоящей из резистентных к антибиотикам, ризистентных к гербицидам и репортерного белка или полипептида, который продуцирует визуально идентифицируемые характеристики.

Растительный селектируемый маркер, присутствующий в бинарном векторе, подлежащем применению в пределах способа настоящего изобретения, конкретно, имеющем минимальный размер бинарном векторе, как описано здесь прежде, может представлять собой маркер, предоставляющий резистентность к аминоглюкозидному антибиотику, такому как канамицин или неомицин, гербициду, такому как фосфинотрицин или глюфозинат. В альтернативе, селектируемый маркер может являться скринируемым маркером, таким как флуоресцентный белок, включая но, не ограничиваясь лишь им, зеленый флуоресцентный белок (GFP).

Однако, для целей транзиторной экспрессии, применимость селектируемого маркера для применения в растении может быть минимальной, и может быть исключена из вектора. Это обеспечивает дополнительное существенное снижение размера вектора. Например, как показано в разделе примеров 1.3, pPMP1 был сконструирован посредством делеции pBIN61-производного гена фосфотрансферазы неомицина (nptII), который кодирует резистентность к канамицину из pC100. Таким образом, pPMP1 является примером вектора изобретения, в котором нет растительного селектируемого маркера.

Соответственно, в одном варианте осуществления изобретения, предоставлена векторная молекула в соответствии с настоящим изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, где селектируемый маркерный ген растения отсутствует, или был исключен.

Как продемонстрировано в примере 2, настоящее изобретение дополнительно предоставляет минимальный бинарный вектор из менее чем 5150 пар оснований, содержащий минимальный скелет и область Т-ДНК, который без оказания воздействия на репликацию и стабильное поддержание в бактериальной клетке, мог бы поддерживаться как плазмида с высоким числом копий в Escherichia coli и Agrobacterium spp., которые могут применяться в пределах объема способа в соответствии с изобретением. Последовательность минимального бинарного вектора pPMP1 представлена в SEQ ID NO: 1.

Соответственно, в одном варианте осуществления, настоящее изобретение предусматривает применение векторной молекулы, имеющей полинуклеотидную последовательность, являющуюся, по меньшей мере, на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной с полинуклеотидной последовательностью, как отображено в SEQ ID NO: 1, и, где элементы нуклеиновой кислоты от (a) до (e) проявляют такую же функциональность противоположные элементы, представленные в SEQ ID NO:1, в способе в соответствии с настоящим изобретением.

Векторы настоящего изобретения и элементы нуклеиновой кислоты от a) до e), как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, и содержащиеся внутри таких векторов, могут либо являться природными последовательностями нуклеиновой кислоты, ковалентно связанными на кольцевой ДНК-плазмиде, или химически синтезированными последовательностями нуклеиновой кислоты или их смесью. Когда они синтезированы химически, элементы нуклеиновой кислоты от a) до e) могут быть основаны на природных нуклеиновой кислоте и последовательностях белка или полипептида бактерий или других организмов, представляющих интерес, и проявляют такую же функциональность, как природные последовательности.

В конкретном варианте осуществления, векторная молекула имеет полинуклеотидную последовательность, как отображено в SEQ ID NO: 1.

Применение pPMP1 и его производных приводило к хорошим стабильной, а также транзиторной экспрессии нуклеиновых кислот, белков или пептидов в трансформированных растительных клетках Nicotiana tabacum и Nicotiana benthamiana, как продемонстрировано в примере 10. Кроме того, трансформация с помощью pPMP1 и его производных, таких как минимальный раститетльный выбираемый бинарный вектор pC100, приводила в результате предпочтительно к однократной или иной интеграциям с низким числом копий в ядерном геноме растения и небольшой или отсутствию интеграции скелетных последовательностей вектора.

Промотор/энхансеры/терминаторы

Растительные экспрессионные векторы, которые являются функциональными в растительной клетке и могут применяться в пределах объема способа настоящего изобретения, чтобы управлять и/или осуществлять контроль над экспрессией гена, представляющего интерес в табачном растении, могут также содержать, если желательно, регуляторную область промотора (например, область, придающую индуцируемую или конститутивную, регулируемую окружающей средой или факторами развития, или клеточно- или ткане-специфичную экспрессию), сайт начала инициации транскрипции, сайт связывания с рибосомами, сигнал процессинга РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования. Регуляторные элементы, подлежащие использованию в пределах объема способа изобретения, могут являться частью кассеты экспрессии и присутствовать в векторной молекуле, конкретно, бинарном векторе, но особенно, бинарном векторе с минимальным размером в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, как описано здесь, функционально связанном с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, представляющий интерес.

В разнообразных вариантах осуществления изобретения, регуляторный элемент присутствует в области Т-ДНК бинарного вектора, конкретно, бинарного вектора с минимальным размером в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, как описано здесь. Предпочтительные промоторы для использования в пределах объема способа в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления представляют собой промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, модифицированный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, двойной промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, минимальный промотор 35S, промотор нопалинсинтазы, промотор вируса мозаики вигны китайской, промотор HT-CPMV, промотор CPS2p копалилсинтазы табака, промотор дигидринина, промотор пластоцианина, 35S/промотора HT-CPMV, и многие другие промоторы, которые извлекают из ДНК-вирусов, принадлежащих к семейству Caulimoviridae, либо промоторы непроцессированного транскрипта (FLt) или промоторы субгеномного. Примеры таких ДНК-вирусов включают, не ограничиваясь лишь ими, вирус мозаики цветной капусты (CaMV), вирус мозаики мирабилиса (MMV), вирус мозаики норичника (FMV), вирус хлоротичных прожилок арахиса (PCLSV).

Особенно предпочтительными для применения в способе в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления являются промоторы непроцессированного транскрипта (FLt) из ДНК-вирусов, принадлежащих к семейству Caulimoviridae, включая, но не ограничиваясь лишь ими, FMV промоторы, такие как описаны в WO1998000534 и US5994521, MMV промоторы, такие как описаны в US6420547 и US6930182 и PCISV промоторы, такие как описаны в WO1998005198, US5850019 и EP929211.

Многие такие промоторы могут быть модифицированы посредством связывания множества копий, например двух копий, их энхансерной последовательности в тандем, для усиления активности промотора, таких как, но не ограничиваясь лишь ими, двойного CaMV промотора 35S (35S×2), двойного MMV промотора (MMV×2), двойного FMV промотора (FMV×2). Функциональные фрагменты этих промоторов, известные или описанные в цитируемых ссылках могут применяться в векторе изобретения. Были созданы конкретные примеры таких промоторов и сайты расщепления фермента рестрикции EcoRI и HindIII были включены по концам, чтобы способствовать клонированию в минимальные векторы изобретения. Нуклеотидные последовательности, которые являются на, по меньшей мере, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными этим последовательностям, и, которые являются функциональными при обеспечении экспрессии у растений функционально связанной нуклеотидной последовательности, также могут применяться в векторах изобретения.

В конкретном варианте осуществления изобретения, одна или несколько из следующих промоторных последовательностей могут применяться внутри вектора в соответствии с изобретением и, как описано здесь в одном из предшествующих вариантов осуществления:

>pMMV однократно энхансированная между сайтами EcoRI и Hind3

>pMMV дважды энхансированная между сайтами EcoRI и Hind3

>pFMV однократно энхансированная между сайтами EcoR1 и Hind3

>pFMV дважды энхансированная между сайтами EcoR1 и Hind3

> pPCISV однократно энхансированная между сайтами EcoR1 и Hind3

> pPCISV дважды энхансированная между сайтами EcoR1 и Hind3

Два ряда производных от pC100 векторов были созданы посредством введения промотора FLt из одного из этих ДНК-вирусов семейства Caulimoviridae в области Т-ДНК. Фиг.7 показывает область Т-ДНК ряда из девяти векторов, именно, pC141, pC190, pC19l, pC192, pC193, pC241, pC242, pC243 и pC265. Сайт множественного клонирования, присутствующий по направлению транскрипции промотора FLt в этих векторах обеспечивает введение нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, для экспрессии в растительных клетках, конкретно, растительных клетках растений рода Nicotiana, конкретно, Nicotina tabacum. Второй ряд более мелких векторов был создан посредством удаления кассеты экспрессии, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую растительный селектируемый маркер (nptII) посредством обработки каждого из векторов первого ряда с помощью SpeI и Avrll, и рециркуляризации плазмиды. Эти векторы, а именно, pC277, pC278, pC279, pC280, pC281 и pC282, являются особенно пригодными для транзиторной экспрессии полипептида, представляющего интерес в растительных клетках или растениях, конкретно, растениях рода Nicotiana, конкретно, Nicotiana tabacum. Соответственно, бинарный вектор изобретения, как описано здесь в одном из предшествующих вариантов осуществления, может содержать в его области Т-ДНК, одну или две, или более копий промотора FLt ДНК-вируса из MMV, FMV или PCISV, (например, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) и необязательно, кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую растительный селектируемый маркер.

В одном варианте осуществления изобретения, вектор для экспрессии генной последовательности гетерологичного полипептида, конкретно, бинарный вектор, но особенно, имеющий минимальный размер бинарный вектор, как описано здесь в одном из предшествующих вариантов осуществления, может содержать одну или несколько регуляторных последовательностей, в данном случае, нетранслированные области, полученные из вируса мозаики вигны китайской (HT-CPMV; WO 07/135480, которая включена здесь посредством ссылки во всей полноте). Предпочтительно, бинарный вектор также содержит минимальный промотор 35S CaMV. Система HT-CPMV основана на минимальном промоторе, модифицированном 5'-UTR, содержащем гипертранслируемые (HT) элементы, и 3’-UTR из CPMV РНК-2, который обеспечивает усиленную трансляцию и высокое накопление рекомбинантных белков у растений.

Минимальный 35S-CaMV промотор (SEQ ID NO: 2)

Последовательность промотора может состоять из проксимальных и более дистальных элементов против направления транскрипции, причем последние элементы часто называют энхансерами. Соответственно, "энхансер" представляет собой последовательность ДНК, которая может стимулировать промоторную активность, и может являться присущим элементом промотора или гетерологичным элементом, введенным для повышения уровня или тканевой специфичности промотора. Он способен действовать в обоих направлениях (нормальном или перевернутом), и способен функционировать даже тогда, когда движение происходит либо против направления трансляции или по ходу транскрипции от промотора. Как энхансеры, так и другие промоторные элементы против хода транскрипции связывают последовательность-специфичные ДНК-связывающие белки, которые опосредуют их эффекты. Промоторы могут быть извлечены в их полноте из нативного гена, или быть составлены из различных элементов, извлеченных из различных промоторов, обнаруженных в природе, или даже быть составлены из сегментов синтетических ДНК. Промотор может также содержать последовательности ДНК, которые вовлечены в связывание белковых факторов, которые управляют эффективностью инициации транскрипции в ответ на физиологические условия или условия развития.

Примеры энхансеров включают элементы из CaMV промотора 35S, генов октопинсинтазы (Ellis el al., 1987), ген актина риса I, ген алкогольдегидрогеназы кукурузы (Callis 1987), ген морщинистости кукурузы I (Vasil 1989), энхансеры омега трансляции вируса гравировки табака (TEV) и вируса табачной мозаики (TMV) (Gallie 1989) и промоторы из нерастительных эукариотов (например, дрожжей; Ma 1988). Векторы для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть построены, чтобы включать такой энхансерный элемент. Применение энхансерного элемента, и особенно, множества копий элемента, может способствовать увеличению уровня транскрипции из примыкающих промоторов, когда их применяют в контексте трансформации растения.

Область терминации может быть выбрана из группы, состоящей из области терминации нопалинсинтазы (nos), белка вегетативного хранения (vsp), или ингибитора-2 протеазы (pin2).

Сигнальные пептиды

Векторы экспрессии растения, конкретно, бинарные векторы, и, особенно, бинарные векторы с минимальным размером в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, как описано здесь, которые являются функциональными в растительной клетке и могут применяться в пределах объема способа настоящего изобретения, могут дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, который нацеливает вновь экспрессируемый белок на субклеточное местоположение. Сигнальные пептиды, которые могут применяться в таких векторных молекулах, представляют собой, например, пептиды, выбранные из группы, состоящей из вакуолярной нацеливающей последовательности, хлоропластной нацеливающей последовательности, митохондриальной нацеливающей последовательности, последовательности, которая индуцирует образование белковых тел в растительной клетке, или последовательности, которая индуцирует образование масляных тел в растительной клетке.

В одном варианте осуществления изобретения, нацеливающая последовательность представляет собой сигнальный пептид для импорта белка в эндоплазматическую сеть. Сигнальные пептиды представляют собой транзитные пептиды, которые расположены по крайнему N-концу белка и расщепляются ко-трансляционно во время перемещения через мембрану эндоплазматической сети. Сигнальный пептид, который может применяться в векторной молекуле в соответствии с изобретением, без его ограничений, представляет собой природный пептид по N-концу последовательности легкой или тяжелой цепи IgG, или сигнальный пептид пататина, как описано в EP2002807566 и WO2007EP1606, конкретно, сигнальный пептид пататина из pC148, как описано в примере 9. Может применяться любая нуклеотидная последовательность, которая может кодировать последовательность сигнального пептида пататина.

В одном варианте осуществления, нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид пататина, состоящий из: MATTKSFLILFFMILATTSSTCA (SEQ ID NO: 15), может применяться в векторе в соответствии с изобретением, и, как описано здесь в одном из предшествующих вариантов осуществления.

Дополнительные сигнальные пептиды могут, например, быть предсказаны программой инструментов предсказания SignalP (Emanuelsson et al., 2007, Nature Protocols 2: 953-971).

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, нацеливающая последовательность может представлять собой пептид удерживания эндоплазматической сети. Нацеливающие последовательности удерживания эндоплазматической сети находятся на крайнем C-конце белка, и могут представлять собой последовательность из четырех аминокислот, такую как KDEL, HDEL или DDEL, где K является лизином, D является аспарагиновой кислотой, E является глутаминовой кислотой, L является лейцином и H является гистидином.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, нацеливающая последовательность может представлять собой последовательность, которая при гибридизации с белком приводит в результате к образованию несекреторных органелл хранения в эндоплазматической сети, таких как, но не ограничиваясь лишь ими, органеллы, описанные в WO07/096192, WO06/056483 и WO06/056484, которые включены здесь посредством ссылки в их полноте. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нацеливающая последовательность может представлять собой вакуолярную нацеливающую последовательность, хлоропластную нацеливающую последовательность, митохондриальную нацеливающую последовательность или любую другую последовательность, добавление которой приводит к специфичному нацеливанию белка, гибридизированного на конкретной органелле в растении или растительной клетке.

В одном варианте осуществления, векторная молекула в соответствии с изобретением и, как определено в любом из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержит в области Т-ДНК сайт сайт-специфичной рекомбинации для сайт-специфичной рекомбинации. В одном варианте осуществления, сайт сайт-специфичной рекомбинации расположен по ходу транскрипции регуляторного элемента растения. В еще одном другом варианте осуществления, сайт сайт-специфичной рекомбинации расположен против хода транскрипции регуляторного элемента растения. В конкретном варианте осуществления изобретения, сайт рекомбинации является сайтом LoxP и частью сайт-специфичной системы рекомбинации Cre-Lox. В сайт-специфичной системе рекомбинации Cre-Lox используют циклическую рекомбиназу (Cre), которая катализирует рекомбинациию между специфичными сайтами (LoxP), которые содержат сайты специфичного связывания для Cre.

В еще одном другом конкретном варианте осуществления, сайт рекомбинации представляет собой сайт назначения Gateway. Например, нуклеиновые кислоты, представляющие интерес, сначала клонируются в доступный для приобретения "вектор входа" и в последующем рекомбинируются в "вектор назначения". Вектор назначения может применяться для анализа активности промотора данной последовательности нуклеиновой кислоты или числа последовательностей, для анализа функции, для локализации белка, для белок-белкового взаимодействия, для сайленсинга данного гена или для экспериментов по аффинной очистке. Технология клонирования Gateway можно приобрести у Invitrogen Inc., USA.

Супрессор сайленсинга генов

В разнообразных вариантах осуществления, выбранная разновидность табака для применения в способах в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, может содержать супрессор сайленсинга генов, конкретно, супрессор сайленсинга генов вирусного происхождения, и конкретно, супрессор сайленсинга генов потивируса или вируса, выбранного из группы, состоящей из вируса некроза огурцов (CNV), вируса реки Хафель (HaRV), латентного грушевого вируса (PeLV), вируса некроза Lisianthus, латентного вируса алжирского винограда, вируса некротических пятен Pelargonium (PeNSV), вируса кольцевой пятнистости Cymbidium (CymRSV), вируса крапчатой курчавости артишока (AMCV), вируса кольцевой пятнистости итальянской гвоздики (CIRV), вируса некротической карликовости салата, вируса желтой пятнистости риса (RYMV), вируса X карьофеля (PVX), вируса Y картофеля (PVY), вируса мозаики африканской маниоки (ACMV), вируса огуречной мозаики (CMV), вируса гравировки табака (TEV) или вируса карликовости кустов томатов (TBSV).

В еще одном другом варианте осуществления указанный супрессор сайленсинга генов выбирают из группы, состоящей из p19 белка вируса некроза огурца (CNV), p1 белка вируса желтой пятнистости риса (RYMV), p25 белка вируса X картофеля (PVX), AC2 белка вируса мозаики африканской маниоки (ACMV), 2b белка вируса мозаики огурца (CMV) и протеазы хелперного компонента (HcPro) вируса гравировки табака (TEV).

Подробные описания супрессора сайленсинга генов, включая HcPro, предоставлены в WO98/44097, WO01/38512 и WO01/34822, которые включены здесь посредством ссылки во всей полноте. Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей HcPro, предоставлен здесь, как приведен в SEQ ID NO: 5. и на который также ссылаются, как на P1-HcPro-P3. Эта последовательность может быть введена в бинарный вектор, известный в области, или имеющий минимальный размер бинарный вектор изобретения. Соответственно, в неограничивающем примере, экспрессируемая генная последовательность HcPro содержит следующую последовательность или ее фрагмент, которые являются функциональными при повышении урожайности гетерологичного белка в табачном растении.

Гетерологичный белок

В разнообразных вариантах осуществления, инфильтрация выбранных разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum в пределах объема способа в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления может осуществляться выбранным штаммом вида Agrobacterium, содержащим экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок или полипептид, выбранный из группы, состоящей из факторов роста, рецепторов, лигандов, сигнальных молекул; киназ, ферментов, гормонов, супрессоров опухолей, белков свертывания крови, белков клеточного цикла, метаболических белков, нейрональных белков, сердечных белков, белков, отсутствующих при специфических болезненных состояниях, антител или их фрагментов, иммуноглобулинов, антигенов, белков, которые обеспечивают устойчивость к заболеваниям, противомикробных белков, интерферонов и цитокинов. В разнообразных вариантах осуществления, гетерологичный белок или полипептид представляет собой человеческий белок или полипептид, модифицированный человеческий белок или полипептид, химерный белок или полипептид. В разнообразных вариантах осуществления, гетерологичный белок или полипептид не является белком или полипептидом патогена растения, или более конкретно, не является белком или полипептидом грибкового растительного патогена, вирусного растительного патогена, бактериального растительного патогена, патогеном видов Solanaceae, патогеном Nicotiana или патогеном табака.

Экспрессируемая нуклеотидная последовательность может содержать последовательность, которая была оптимизирована для экспрессии в растительных клетках, конкретно, в растительных клетках растений рода Nicotiana, конкретно, Nicotina tabacum. Несмотря на то, что экспрессируемая нуклеотидная последовательность может отличаться от нативной человеческой кодирующей последовательности, аминокислота транслируемого продукта является идентичной. Один или несколько кодонов в экспрессируемой нуклеотидной последовательности были заменены на предпочтительные кодоны в соответствии с известной применимостью кодонов растения, конкретно, растения рода Nicotiana, конкретно, Nicotina tabacum, что приводит к схеме предпочтительных кодонов, кодирующих такие же аминокислоты в экспрессируемой нуклеотидной последовательности, что обеспечивает увеличенную экспрессию в растении или табачном растении (относительно применения нативной кодирующей последовательности). Методы модификации нуклеотидной последовательности для таких целей являются хорошо известными, см., например, US 5786464 и US 6114148.

В одном аспекте, последовательности, кодирующие антиген, применяют в пределах объема способа изобретения, как описано здесь в одном из предшествующих вариантов осуществления, включая последовательности для индуцирования защитных иммунных ответов (например, как в готовой форме вакцины). Такие пригодные антигены включают, но не ограничены лишь ими, микробиальные антигены (включая вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены, паразитарные антигены и т.п.); антигены из многоклеточных организмов (таких как многоклеточные паразиты); аллергены; и антигены, ассоциированные с патологиями человека или животных (например, таких как рак, аутоиммунные заболевания, и т.п.). В одном предпочтительном аспекте, вирусные антигены включают, но не ограничены лишь ими: антигены ВИЧ; антигены для придания защитных иммунных ответов на грипп; ротавирусные антигены; антигены сибирской язвы; антигены бешенства; и т.п. Антигены вакцин могут кодироваться как мультивалентные пептиды или полипептиды, например, содержащие различные или одни и те же антигенные кодирующие последовательности, повторяемые в экспрессионных конструкциях, и необязательно разделенные одной или несколькими линкерными последовательностями.

В одном варианте осуществления, экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела, или как легкую цепь, так и тяжелую цепь антитела. В конкретном варианте осуществления, тяжелая цепь или легкая цепь являются цепями антитела, которое связывает человеческие CD20. В еще одном другом конкретном варианте осуществления, тяжелая цепь или легкая цепь являются цепями антитела, которое связывает человеческие CD20 с помощью участка связывания антитела ритуксимаба.

В разнообразных вариантах осуществления, экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует гетерологичный белок или полипептид, выбранный из группы, состоящей из антигена вируса гриппа, конкретно, гемагглютинина (HA). Вирусы гриппа представляют собой оболочечные вирусы, которые исходят из плазматической мембраны инфицированных клеток млекопитающих. Их классифицируют на типы A, B или C, на основании присутствующих нуклеопротеинов и антигенов матриксного белка. Вирусы гриппа типа А могут дополнительно подразделяться на подтиды в соответствии с комбинацией присутствующих поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). HA управляет способностью вируса связываться с клетками-хозяевами и проникать в них.

В настоящее время признают 16 подтипов HA (H1-H16). Каждый тип вируса гриппа А представляет один тип HA и один тип NA гликопротеина. HA белок, который может продуцироваться посредством способов изобретения, включает H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16 или его фрагмент или часть. Примеры подтипов, содержащих такие HA белки, включают A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/lndonesia/512006 (H5N1), A/chicken/New York/1995, A/herring gull/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/mallard/MN/33/00, A/duck/Shanghai/1/2000, A/northem pintail/TXI828189/02, A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4)_I A/shoveier/lran/G54/03, A/chicken/Germany/N/1949(H10N7), A/duck/Engiand/56(H11N6), A/duck/Alberta/-60176(H12N5), A/Gull/Maryland/704/77(H13N6), A/Mallard/Gurjev/263/82, A/duck/-Australia/341/83 (H15N8), A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburg/66, PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapore/1/57 (H2N2), A/Anhui/112005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1), A/Equine/Prague/56 (H7N7), A/HongKong/1073/99 (H9N2). Считают, что некоторые из вирусов гриппа, имеющих один из указанных выше H подтипов, могут вызывать инфекцию у человека, и вследствие своего происхождения, могут вести к пандемии. Многие из антигенов этих подтипов (H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16) могут, таким образом, применяться в вакцине от пандемического гриппа. Подтипы H1, H2, H3 являются основными подтипами, которые вовлечены в инфекцию человеческого гриппа, и антигены таких подтипов предусмотрены для использования в сезонной вакцине против гриппа.

Считают, что любая нуклеотидная последовательность, которая кодирует гемагглютинин вируса гриппа или его иммуногенный фрагмент, может применяться в способах изобретения, таким образом, что гемагглютининовый полипептид или его фрагмент продуцируются в хозяйской разновидности N. tabacum. Например, любая из биологических последовательностей гемагглютинина вируса гриппа, представленная в общедоступных базах данных, таких как Genbank (Nucleic Acids Research 2004 Jan 1;32(1):23-6), или Influenza Research Database (IRD; see www.fludb.orq или Squires et al. BioHealthBase: informatics support in the elucidation of influenza virus host pathogen interactions и virulence. Nucleic Acids Research (2008) vol. 36 (Database issue) pp. D497) может применяться в соответствии с настоящим изобретением.

Пример нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный белок, представляющий интерес, предоставлен ниже и приведен в SEQ ID NO: 8. Эта нуклеотидная последовательность кодирует зрелый гемагглютинин 5 вируса гриппа (H5), и кодоны были оптимизированы для экспрессии последовательности у растений. Соответственно, изобретение предусматривает векторы в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, как описано выше, содержащие, в области Т-ДНК и функционально связанные с растительным регуляторным элементом, нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелый гемагглютинин 5 вируса гриппа, проявляющий, по меньшей мере, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 99,5% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 8.

Зрелый оптимизированный HEI (H5)

Получение инокулята и клеточная плотность

В одном варианте осуществления изобретения, различные штаммы Agrobacterium, такие как Agrobacterium tumefaciens или бактерии Agrobacterium rhizogenes могут применяться для получения инокулята, как продемонстрировано в примере 1. Штаммы Agrobacterium могут содержать бинарный вектор, содержащий Т-ДНК с геном, представляющим интерес, под контролем растительных регуляторных элементов, выращенные до OD₆₀₀>1,6. Штаммы Agrobacterium могут быть собраны цетрифугированием и ресуспендированы в растворе для инфильтрации при плотности клеток (OD₆₀₀), равной, по меньшей мере, 2,1, по меньшей мере, 2,4, по меньшей мере, 2,7, по меньшей мере, 3,0, по меньшей мере, 3,3, по меньшей мере, 3,6, по меньшей мере 3,8, по меньшей мере 3,9, по меньшей мере 4,0. В конкретном варианте осуществления, OD₆₀₀ раствора для инфильтрации составляет >2.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, штаммы Agrobacterium могут быть дополнительно разбавлены в растворе для инфильтрации и, в качестве необязательной меры, может быть добавлен ацетосирингон для индуцирования вирулентности.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения, две или более суспензий Agrobacterium могут быть получены в соответствии с настоящим изобретением и, как описано здесь. Указанные две или более суспензий могут затем либо использоваться раздельно для инфильтрации совместимых разновидности, линий скрещивания или сортов Nicotiana tabacum или, при альтернативном подходе, могут сначала смешиваться перед инфильтрацией. Конкретно, первая суспензия Agrobacterium, содержащая первый бинарный вектор с первым экспрессируемым геном, например, кодирующей последовательностью, которая кодирует белок или полипептид, конкретно, гетерологичный белок или полипептид, такие как приведенные в предыдущем разделе, может быть получена, как описано здесь и смешана со второй суспензией Agrobacterium, содержащей второй бинарный вектор со вторым экспрессируемым геном, например, кодирующей последовательностью, которая кодирует супрессор сайленсинга генов.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, инокулят, полученный, как описано здесь, может храниться до недели при 4-6°C перед применением.

Как продемонстрировано в примерах 11, 12 и 14, соответственно, изобретение также предоставляет дополнительные усовершенствования к описанному выше способу получения инокулята, который дополнительно усиливает общий выход гетерологичных полипептидов.

В одном варианте осуществления изобретения, Agrobacteria выращивают и затем собирают центрифугированием и ресуспендируют в растворе, предпочтительно в растворе для инфильтрации, предпочтительно до OD₆₀₀>2,0, для генерации концентрированного инокулята. Альтернативно, Agrobacteria выдерживают в культуральной среде без центрифугирования и без ресуспендирования. В конкретном варианте осуществления, клетки Agrobacterium, которые культивируют для инфильтрации, выращивают до желательной оптической плотности без селекции антибиотиком. Инокулят может применяться немедленно или храниться для более позднего применения. В день инфильтрации, различные концентрированные инокуляты, содержащие различные штаммы Agrobacterium, как описано здесь, или идентичные штаммы Agrobacterium, содержащие бинарные векторы с различными последовательностями, кодирующими белок, могут быть смешаны вместе при различных соотношениях или комбинациях соотношений, например при соотношении, равном 3:1, 1,67:1, 1:3, 1:1, и затем разбавлены в растворе для инфильтрации до конечной OD₆₀₀, подлежащей определению. Например, в одном варианте осуществления, бактериальный раствор может иметь конечную OD₆₀₀, равную 0,32 или 0,85. Инокуляты могут быть уравновешены до комнатной температуры в течение определяемого периода, например, 30 минут. Инокуляты могут быть последовательно разбавлены до OD₆₀₀ в растворе для инфильтрации для получения более низких бактериальных плотностей.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, штамм Agrobacterium, такой как AGL1, может содержать ген или генную конструкцию, например репортерный ген, например, tGFP или супрессор сайленсинга, например, HcPro.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, штамм Agrobacterium представляет собой AGL1, конечная OD инокулята равна 0,7, соотношение клеток AGL1, содержащих экспрессируемый ген, представляющий интерес, по сравнению с клетками AGL1, содержащими экспрессируемую последовательность HcPro в инокуляте равен от 2,5 до 1, и разновидностью Nicotiana tabacum является PM132.

Инфильтрация растений

Как только совместимая комбинация разновидности, линии скрещивания или сорта Nicotiana tabacum и штамма Agrobacterium идентифицированы, как описано выше, любой известный способ инфильтрации растений может применяться в пределах объема способа в соответствии с изобретением, такой как, но не ограничиваясь лишь ими, доставка с помощью генной пушки молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей ген, кодирующий желательный белок экспрессируемым образом, опосредованная Agrobacterium доставка бинарного вектора, содержащего экспрессируемый ген, электропорация протопластов и опосредованная полиэтиленгликолем доставка депротеинизированной ДНК в растительные протопласты. Бомбардировка частицами обычно достигает только нескольких клеток, а ДНК должна достичь клеточного ядра для завершения транскрипции, и, таким образом, она не является очень эффективной для транзиторной экспрессии.

Применение Agrobacterium, доставляемого посредством инфильтрации (агро-инфильтрация), может доставлять чужеродные гены к значительно более высокому числу клеток. Оригинальная система инфильтрации Agrobacterium для транзиторной экспрессии была описана Kapila et al., Plant Sci. 122: 101-108 (1997) и была разработана для быстрого тестирования функциональности белка, полагаемого применимым для резистентности заболеваниям ткани растения.

В разнообразных вариантах осуществления изобретения, предоставлены системы для обработки интактных целых растений, конкретно, целых и интактных растений или частей растений таких как, органы растений или растительные ткани, чтобы они контактировали с клетками Agrobacterium, посредством подвергания воздействию низкого атмосферного давления или вакуума. Системы, применяемые в способе в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать камеру для приема целого растения, конкретно, целого и интактного растения или части растения, такого как орган растения или растительная ткань, или множества таких целых растений или частей растений, и средство для создания окружения в виде низкого давления текучей среды и необязательно доставки отрицательного или положительного давления текучей среды, или комбинации как отрицательного, так и положительного давления текучей среды.

В одном варианте осуществления изобретения, предоставлены системы для обработки интактных целых растений, конкретно, целых и интактных растений или частей растений, таких как органы растений или растительные ткани, которые контактировали с клетками Agrobacterium при воздействии низкого атмосферного давления или вакуума. Применение систем в способе в соответствии с настоящим изобретением может включать камеру для приема целого растения, конкретно, целого и интактного растения или части растения, такой как орган растения или растительная ткань, или множества таких целых растений или частей растений, и средство для создания окружения низкого давления текучей среды и необязательно доставки положительного давления текучей среды.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение предусматривает использование улучшенного способа для введения клеток Agrobacterium в целое растение, конкретно, целое и интактное растение или часть растения, такую как орган растения или растительная ткань, как раскрыто в рассматриваемой одновременно с настоящей заявкой заявке EP 10 16 9888.4, поданной 16 июля 2010 г., раскрытие которой включено здесь во всей своей полноте. Способ предоставляет положительное давление текучей среды, или комбинацию положительного и отрицательного давления текучей среды, чтобы способствовать инфильтрации целого растения клетками Agrobacterium, конкретно, целого и интактного растения или части растения, такой как орган растения или растительная ткань, в отличие от способов, известных в области, в которых используют вакуум или отрицательное давление. Изобретение также предоставляет системы и средства для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением для доставки положительного давления текучей среды к целым растениям, конкретно, целым и интактным растениям или частям растения, таким как органы растения или растительные ткани, которые контактируют или контактировали с клетками Agrobacterium.

Положительное давление текучей среды доставляют, когда целое растение, конкретно, целое и интактное растение или части растения, и бактерии подвергают обработке одним или более цикла(циклов) давления в закрытых условиях. Давление текучей среды представляет собой давление в некоторых точках внутри текучей среды, такой как вода или воздух. Например, в закрытых условиях, объем, в котором содержится текучая среда, является постоянным, в разнообразных вариантах осуществления изобретения, давление текучей среды представляет собой давление воздуха в камере с фиксированным объемом.

Значения положительного давления, применимые в изобретении, могут, таким образом, быть выражены в единицах процентных значений от давления окружающего воздуха, например, и без ограничения, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 350%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1000%, 1050%, 1110%, 1150%, 1200%, или любого промежуточного значения, или любого значения, большего, чем предыдущее. Подобная договоренность может применяться при описании отрицательного давления, которое является значением давления, более низкого, чем давление окружающего воздуха.

Положительное давление может альтернативно выражаться в единицах абсолютного давления, например, и без ограничения, 1,1 атм, 1,5 атм, 2 атм, 2,5 атм, 3 атм, 3,5 атм, 4 атм, 4,5 атм, 5 атм, 5,5 атм, 6 атм, 6,5 атм, 7 атм, 7,5 атм, 8 атм, 8,5 атм, 9 атм, 9,5 атм, 10 атм, 10,5 атм, 11 атм, 11,5 атм, 12 атм, и т.д.; или 1,1 бар, 1,5 бар, 2 бар, 2,5 бар, 3 бар, 3,5 бар, 4 бар, 4,5 бар, 5 бар, 5,5 бар, 6 бар, 6,5 бар, 7 бар, 7,5 бар, 8 бар, 8,5 бар, 9 бар, 9,5 бар, 10 бар, 10,5 бар, 11 бар, 11,5 бар, 12 бар, или любого промежуточного значения или любого значения, большего, чем предыдущее. Там где давление окружающего воздуха не предоставлено для сравнения в описании здесь, подразумевают, что давление окружающего воздуха является стандартным атмосферным давлением на земле на уровне моря.

Термин "цикл давления", используемый здесь, относится к ряду изменений давления в течение периода времени. В одном варианте осуществления, цикл давления включает целевое давление, которое, по своей сути, представляет собой давление, которое должно быть достигнуто в пределах данного периода времени. Например, во время цикла давления, желательное давление в камере начинается с нахождения в равновесии с давлением окружающего воздуха, изменяется до целевого давления, и возвращается к давлению окружающего воздуха. Соответственно, камера, используемая в изобретении, может начинать цикл давления посредством увеличения давления свыше давления атмосферного воздуха и заканчивать цикл давления посредством установления равновесия с атмосферным воздухом.

В способах изобретения, может применяться множество различных циклов давления, и каждый может применяться один или несколько раз, таким образом, но, не ограничиваясь перечисленными, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять раз. Соответственно, в способе изобретения или даже при цикле давления, вариация давления с течением времени может выражаться графиком или волнообразной формой, такой как синусоида, прямоугольная волна, треугольная волна, или пилообразная волна, или любой волнообразной формой, которая аппроксимирует одну из приведенных выше.

Конкретно, цикл давления может включать целевое давление, которое является положительным давлением. В некоторых вариантах осуществления, способ изобретения не включает применение целевого давления, которое является отрицательным давлением. В других вариантах осуществления, предусмотрено применение первого целевого давления, которое является положительным давлением, а также второго целевого давления, которое является отрицательным давлением. В других вариантах осуществления, первое целевое давление является отрицательным давлением, и второе целевое давление представляет собой положительное давление. Период отдыха может быть включен между циклами давления.

В некоторых вариантах осуществления, клетки Agrobacterium, содержащие экспрессионные конструкции, инфильтруют в целое растение, конкретно, целое и интактное растение или часть целого и интактного растения, такую как орган растения или растительная ткань. В одном варианте осуществления, инфильтрацию осуществляют в присутствии поверхностно-активного вещества, включая анионное, катионное, неионное и цвиттерионное поверхностно-активные вещества. Неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ, которые могут применяться, представляют собой Triton X-100 или Silwet L-77, сильное поверхностно-активное вещество, которое проявляет относительно низкую токсичность по отношению к растениям.

В одном варианте осуществления, целое и интактное растение располагают верхней стороной вниз внутри камеры, и его листья являются полностью погруженными в жидкость, содержащую клетки Agrobacterium. Камера соединена с источником низкого давления воздуха через входной клапан. Например, для создания низкого атмосферного давления (приблизительно 50 мбар).

Дополнительно к вышеуказанному оборудованию, системы для использования в способе в соответствии с изобретением могут необязательно дополнительно содержать средство для транспортировки множества целых растений или частей растений, таких как органы растений или растительные ткани от их положения в камеру, средство для облегчения контакта множества целых растений или растительных тканей с клетками Agrobacterium, средство для приема множества целых растений или растительных тканей в камере, средство для позиционирования и репозиционирования множества целых растений или частей растений, таких как органы растений или растительные ткани в камере, средство для возврата множества целых растений или частей растений в камеру. Предпочтительно, одно или несколько из приведенных выше средств представляют собой автоматизированные электро-механические системы, и включают, но не ограничены лишь ими, системы автотранспорта, фабричные автоматизированные системы, системы безопасности, системы управления процессом, системы передачи данных, системы хранения данных и вычислительные системы.

В разнообразных вариантах осуществления, клетки Agrobacterium, несущие экспрессионные конструкции с геном или генами, конкретно, гетерологичными геном или генами, применяют для доставки гена(генов) к целому и интактному растению или части растения, такой как орган растения или растительная ткань, для транзиторной экспрессии в клетках и/или внеклеточных пространствах растения или частей растения. В целом, подходящая экспрессионная конструкция содержит: по меньшей мере, одну пограничную последовательность Т-ДНК, регуляторную последовательность экспрессии (например, промотор, который может быть индуцируемым или конститутивным, промотор, чья активность является тканеспецифической или стремящейся к ткани), и ген, функционально связанный с экспрессионной регуляторной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления, экспрессионная конструкция является частью вектора, содержащего одну или несколько точек начала репликации, по меньшей мере, одну точку начала репликации, пригодную для репликации вектора, содержащую экспрессионную конструкцию в виде Agrobacterium.

Способ инфильтрации с положительным давлением может применяться для получения транзиторной экспрессии многих видов растений, включающих, но не ограничиваясь лишь ими: табак (вид Nicotiana), салат, люцерну, фасоль золотистую, шпинат, одуванчик, красный салатный цикорий, рукколу, салатный цикорий, эскариоль, цикорий, артишок, кукурузу, картофель, рис, сою, хлопок, мелкозерные злаковые культуры, пшеницу, ячмень, сорго, сахарную свеклу, канолу, Крестоцветные (например,, Brassica, Arabidopsis), ряску и томат.

Подходящие растительные орган или ткань, в целом, могут представлять собой любую часть растения. В одном предпочтительном аспекте, растительная ткань представляет собой листовую ткань. В одном аспекте, растительная ткань представляет собой листовую ткань от растения, содержащую листья, имеющие, по меньшей мере, приблизительно 7-8 см для, по меньшей мере, одного размера.

Практические реализации в теплице

Инкубация в перевернутом положении

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ для инкубации растения после инфильтрации бактериальной суспензией, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида, указанный способ включает инкубацию растения в перевернутом положении. Предпочтительно, растение, которое инкубируют в перевернутом положении, представляет собой целое растение, которое инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида.

В еще одном другом варианте осуществления, растение, которое инкубируют в перевернутом положении, представляет собой трансгенное растение.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инкубации включает инкубацию инфильтрованного растения в перевернутом положении. Также предоставлена теплица, которая приспособлена для поддержания инкубации инфильтрованных растений в перевернутом положении в течение любого отрезка времени, конкретно, в течение периода между 5 днями и 10 днями, где обращенные инфильтрованные растения освещают свыше. В одном аспекте изобретения, растения освещают в течение от 7 до 9 часов на 24 часа, конкретно, в течение 8 часов на 24 часа.

Этот способ приводит к увеличенной экспрессии рекомбинантного белка, как показано в примере 13.

В одном варианте осуществления изобретения, способ, включающий инкубацию растения в перевернутом положении, может применяться в пределах объема способа в соответствии с любым из предшествующих аспектов или вариантов осуществления, конкретно, в пределах стадии инкубации (iii), как описано здесь.

В одном варианте осуществления изобретения, модификация инкубации растения в перевернутом положении, может применяться к способу в соответствии с изобретением, принимая во внимание любой из предшествующих аспектов или вариантов осуществления, конкретно, в контексте стадии инкубации (iii), как описано здесь.

Освещение

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ для инкубации растения после инфильтрации бактериальной суспензией, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида, указанный способ включает инкубацию растения в условиях естественного освещения в течение от 5 часов до 15 часов в день (24 часа), от 5 часов до 10 часов, от 7 до 9 часов, предпочтительно, в течение восьми часов в день (24 часа). Способ является особенно применимым для увеличения уровня транзиторной экспрессии гетерологичного белка, как продемонстрировано в примере 15.

В одном варианте осуществления, инфильтрованное растение представляет собой целое растение, которое инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида и инкубируют в условиях естественного освещения в течение от семи до девяти часов в день, предпочтительно восьми часов в день. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанная стадия инкубации включает инкубацию инфильтрованного растения в перевернутом положении.

В одном варианте осуществления изобретения, модификация инкубации растения в условиях естественного освещения в течение от семи до девяти часов в день, предпочтительно восьми часов в день, может применяться к способу в соответствии с изобретением, принимая во внимание любой из предшествующих аспектов или вариантов осуществления, конкретно, в контексте стадии инкубации (iii), как описано здесь.

Густота посадки

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ, включающий выращивание множества растений при высокой густоте в пределах определенной области перед инфильтрацией указанных растений бактериальной суспензией, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида. Также предусматривают, что после инфильтрации, инфильтрованное растение инкубируют при высокой густоте внутри определенной области. Также охваченным является способ, где множество растений высаживают при высокой плотности как перед, так и после инфильтрации.

Конкретно, способ включает выращивание множества растений при плотности, равной, по меньшей мере, от 25 до 500 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 50 до 400 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 100 до 300 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 150 до 250 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 100 до 900 растений на квадратный метр. В одном варианте осуществления, растения высаживают при плотности, равной, по меньшей мере, 100 растениям на квадратный метр. В еще одном другом варианте осуществления, растения выращивают при плотности, равной, по меньшей мере, 500 растениям на квадратный метр. Множество растений, после выращивания при указанных выше условиях в течение периода между 30 днями и 50 днями после посева, конкретно, между 40 днями и 50 днями после посева, но конкретно, в течение 46 дней после посева, инфильтруют суспензией клеток Agrobacterium, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида при OD₆₀₀, идентифицированной в предыдущих параграфах.

В одном варианте осуществления, после инфильтрации, растения инкубируют в вертикальном положении.

В еще одном варианте осуществления, после инфильтрации, растения инкубируют в перевернутом положении. Конкретно, инфильтрованные растения инкубируют в перевернутом положении в течение любого отрезка времени, конкретно, в течение периода между 5 днями и 10 днями, где перевернутые инфильтрованные растения освещают свыше. В одном аспекте изобретения, растения освещают в течение от 7 до 9 часов на 24 часа, конкретно, в течение 8 часов на 24 часа.

Данный способ приводит к увеличенной экспрессии рекомбинантного белка, как показано в примере 14.

Способ является особенно применимым для снижения затрат на продуцирование гетерологичного белка. Также предоставлена теплица, которая является приспособленной для выращивания растений при плотности, равной, по меньшей мере, от 25 до 500 растений на квадратный метр, или, по меньшей мере, 100 инфильтрованных растений на квадратный метр.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, где указанный способ модифицирован для включения стадии выращивания множества растений Nicotiana tabacum при высокой плотности в пределах определенной области перед инфильтрацией указанных растений бактериальной суспензией, содержащей экспрессируемую нуклеотидную последовательность белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида. Конкретно, множество растений Nicotiana tabacum выращивают при плотности, равной, по меньшей мере, от 25 до 500 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 50 до 400 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 100 до 300 растений на квадратный метр, по меньшей мере, от 150 до 250 растений на квадратный метр, но особенно, по меньшей мере, 100 растений на квадратный метр.

В одном варианте осуществления изобретения, способ для инкубации множества инфильтрованных растений в пределах определенной области может применяться в пределах объема способа в соответствии с любым из предшествующих аспектов или вариантов осуществления, конкретно, в пределах стадии инкубации (iii), как описано здесь.

В одном варианте осуществления изобретения, модификация выращивания множества растений перед инфильтрацией при высокой густоте в пределах определенной области может применяться к способу в соответствии с изобретением, принимая во внимание любой из предшествующих аспектов или вариантов осуществления.

Ферментативное разрушение клеточной стенки инфильтрованных растений

В еще одном другом аспекте изобретения, предоставлен общий способ, включающий обработку целого, интактного инфильтрованного Agrobacterium растения одним или несколькими ферментами, которые разрушают или расщепляют стенку растительной клетки, чтобы способствовать экстракции гетерологичного белка. В одном варианте осуществления, способ включает инфильтрацию инфильтрованного Agrobacterium растения одним или несколькими ферментами посредством методов, известных в области, включающих но не ограничиваясь лишь ими, шприцевую инфильтрацию, вакуумную инфильтрацию и инфильтрацию при положительном давлении текучей среды. Метод инфильтрации позволяет осуществить, перед механическим разрушением инфильтрованного Agrobacterium растения, доставку расщепляющих ферментов в апопластное пространство, что приводит в результате к деградации клеточной стенки без высвобождения большей части содержимого клетки. Данная стадия инфильтрации может осуществляться с использованием аналогичного оборудования, которое обеспечивает инфильтрацию целого интактного растения суспензией клеток Agrobacterium. Данный способ может применяться в качестве необязательной стадии в разнообразных способах продуцирования гетерологичного белка, представляющего интерес, как описано в одном из предшествующих вариантов осуществления. Пример 17 описывает эксперимент, который демонстрирует применимость данного аспекта изобретения с инфильтрованными Agrobacterium табачными растениями, которые продуцируют гемагглютинин 5 гриппа (H5).

Для разрушения клеточной стенки растений могут применяться многие ферменты, используемые в промышленном процессе, включая но, не ограничиваясь лишь ими, целлюлазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, пектиназы и полигалактуроназы. Целлюлазы, которые могут применяться, включают эндоглюканазы (E.C. 3.2.1.4), целлобиогидролазы (также именуемые экзоглюканазой, E.C. 3.2.1.91), или β-глюкозидазы (также именуемые целлобиазой, E.C. 3.2,1.21). Эндоглюканазы гидролизуют β-гликозидные связи внутри и разупорядоченно вдоль целлюлозных цепей, в то время как целлобиогидролазы удаляют молекулы целлобиозы из восстанавливающих и невосстанавливающих концов цепей, β-Глюкозидазы гидролизуют целлобиозу до двух молекул глюкозы, и, следовательно, устраняют ингибирование целлобиозы на целлобиогидролазы и эндоглюканазы. Ферменты, имеющие активность полигалактуроназы гидролизуют гликозидные связи в цепи полигалактуроновой кислоты, которые обычно обнаруживают в стенках растительной клетки как цепи 1,4-связанной α-D-галактуроновой кислоты и метоксилированных производных. Ксиланазы (EC3.2.1.8) расщепляют β,1-4 связи между D-ксилозой, которая образует полимер ксилан, основной компонент растительной гемицеллюлозы. Многие из этих ферментов получают из грибков (видов Trichoderma, видов Rhizopus и вида Aspergillus), и микроорганизмов, и могут быть приобретены на рынке в виде смеси, например, Macerozyme™ (целлюлаза 0,1 Ед/мг, гемицеллюлаза, 0,25 Ед/мг, пектиназа 0,5 Ед/мг, bioWORLD, Dublin, Ohio, USA); и Driselase™ (ламинариназа, ксиланаза и целлюлаза, Sigma-Aldrich, USA).

После инфильтрации ферментами, растения могут инкубироваться в течение периода времени в интервале, по меньшей мере, от 1, 2, 5, 10, 12, 18 до 24 часов.

Выход

В одном варианте осуществления, изобретение относится к способу продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у Nicotiana tabacum в соответствии с предыдущими аспектами или вариантами осуществления при условии, что, когда экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует белок, такой как Turbo зеленый флуоресцентный белок (tGFP) или гемагглютинин H5, накопление белка составляет, по меньшей мере, 1%, по меньшей мере, 2%, по меньшей мере, 5%, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 15% или, по меньшей мере, 20% от общего растворимого белка инфильтрованного растения; или накопление полипептида или белка находится на уровне, который составляет, по меньшей мере, 25%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 110%, по меньшей мере, 125%, по меньшей мере, 200%, по меньшей мере, 250%, по меньшей мере, 300%, по меньшей мере, 400%, или, по меньшей мере, 500% от уровня, получаемого у N. benthamiana, когда выбранный штамм Agrobacterium, содержащий такую же экспрессируемую нуклеотидную последовательность, применяют, как описано на стадии ii) и стадии iii), как продемонстрировано в примерах 14 и 15, соответственно. Способы, известные в области, могут применяться для измерения и сравнения выхода способа и контролей.

Система для промышленного продуцирования белка у растений

В одном варианте осуществления, изобретение относится к системе для продуцирования белка или полипептида, конкретно, гетерологичного белка или полипептида у растений Nicotiana tabacum, причем система включает следующие элементы: (a) целые растения выбранных разновидности, линий скрещивания или сортов Nicotiana tabacum в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, (b) бактериальную суспензию в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащую клетки штамма Agrobacterium, которая является совместимой с выбранными растениями разновидностей, линий скрещивания или сортов Nicotiana tabacum элемента (a), таким образом, что указанные растения проявляют менее чем 20% некроза, менее чем 10% некроза, менее чем 5% некроза, менее чем 2% некроза, менее чем 1% некроза, через 5 дней после того, как листья указанных разновидности, линии скрещивания или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции выбранным штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32, (c) средство для инфильтрации целых растений клетками Agrobacterium в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, и (d) необязательно теплицу для выращивания растений при высокой густоте и инкубации инфильтрованного растения, которая является приспособленной для поддержки (i) выращивания множества растений при плотности, равной, по меньшей мере, от 25 до 500 растений на квадратный метр, или, по меньшей мере, 100 растений на квадратный метр в соответствии с любым из предшествующих аспектов и, как продемонстрировано в примере 14; (ii) инкубации инфильтрованных растений в перевернутом положении в соответствии с любым из предшествующих аспектов и, как продемонстрировано в примере 13, при освещении сверху в течение от семи до девяти часов в день в соответствии с любым из предшествующих аспектов и, как продемонстрировано в примере 15.

Фармацевтические композиции

После инкубации растения или растительной ткани в подходящих условиях, которые обеспечивают экспрессионной конструкции экспрессию пептида или белка у множества растительных клеток, белок может быть обнаружен и количественно определен в растении или части растения, такой как орган растения или растительная ткань, или в их клетках. После сбора урожая, выделение пептида или белка может осуществляться с использованием рутинных способов в данной области. Например, по меньшей мере, часть биомассы может быть гомогенизирована, и рекомбинантный пептид или белок могут быть экстрагированы и дополнительно очищены. Экстракция может включать замачивание или погружение гомогената в подходящем растворителе. Способы очистки включают, но не ограничены лишь ими, методики иммуноаффинной очистки и очистки, основанные на специфическом размере пептида, белка или белкового комплекса, электрофоретической подвижности, биологической активности и/или суммарного заряда пептида или белка, подлежащего очистке, или основанные на молекуле-метке в белке. Характеризацию выделенного пептида или белка можно проводить посредством иммуноанализа или других способов, известных в области. Например, пептиды или белки можно анализировать на гелях для SDS-PAGE посредством Вестерн-блоттинга или посредством окрашивания Кумасси голубым, когда пептид или белок являются очищенными по существу.

Рекомбинантные белки, продуцируемые посредством способов изобретения, могут применяться в качестве фармацевтических средств, и могут экспрессироваться для их применимости в качестве нутрицевтиков и космецевтиков, поскольку эти продукты применяют для непосредственного приема внутрь, инъекции или нанесения (например, местного введения) людям. Может также экспрессироваться рекомбинантный белок, который является применимым в производстве аналогично регулируемых продуктов для ветеринарии.

Способы изобретения могут также применяться для экспрессии одного или более генов для воспроизводства ферментативных путей для химического синтеза или для промышленных процессов.

Фармацевтические композиции изобретения предпочтительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательное средство для готовой формы любого типа. Термин "парентеральный", как используют здесь, относится к режимам введения, которые включают внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрастернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Носитель может представлять собой парентеральный носитель, более конкретно, раствор, который является изотоническим с кровью реципиента. Примеры таких сред-носителей включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Неводные среды, такие как нелетучие масла и этилолеат также являются применимыми здесь, как и липосомы. Носитель подходящим образом содержит минорные количества добавок, таких как вещества, которые усиливают изотоничность и химическую стабильность. Такие материалы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты или их соли; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные (менее чем приблизительно из десяти остатков) (поли)пептиды, например, полиаргинин или трипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или аргинин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая целлюлозу или ее производные, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; спиртосахара, такие как маннит или сорбит; противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты, полоксамеры или ПЭГ.

Краткое описание фигур, таблиц и последовательностей

Настоящее изобретение далее описано посредством ссылки на следующие неограничивающие фигуры, таблицы и примеры.

Фиг.1 показывает схематические изображения (A) минимального растительного селектируемого бинарного вектора pC100 и (B) минимального бинарного вектора pPMP1.

Фиг.2 показывает результаты тестирования разнообразных разновидностей N.tabacum, PM67, PM81, PM92, PM128, PM132, PM133 и PM204, для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с использованием разнообразных супрессоров сайленсинга генов. Растения инфильтруют бактериальной суспензией A91 (штамм AGL1, содержащий генную конструкцию pC91, содержащую растительную экспрессируюмую кассету tGFP) и AGL1, содержащую супрессоры сайленсинга генов p1 (A18), p25 (A19), AC1 (A20), 2b (A21), p19 из CNV (A32) и HcPro (A120). Экспрессия через 6 дней после инфильтрации отображена в мг на кг замороженной свежей массы листьев.

Фиг.3 показывает разновидности табака Simmaba, PM132, Burley 21, PM16, PM21, K 149, PO1 и PO2 (A) и PM92, Yaka JB 125/3 и PM204 (B) инфильтрованные разнообразными штаммами Agrobacterium, несущими кассету экспрессии tGFP в бинарном векторе pBINPLUS. Их всех тестируют в комбинации с AGL1 (pC120), содержащим супрессор сайленсинга генов HcPro. Растения подвергают вакуум-инфильтрации штаммами Agrobacterium AGL1 (A91), EHA105 (E91), GV2260 (G91), LBA4404 (L91), GV3101 (V91) и Cry-5 (Y91) и AGL1 (pC120). Концентрацию турбоGFP определяют через 6 дней после инфильтрации и отображают в мг на кг замороженной массы листьев.

Фиг.4 показывает результаты анализа H5 методом Вестерн-блоттинга в неочищенных экстрактах N. tabacum PM132 и N. benthamiana, транзиторно экспрессирующих H5. Полосу ожидаемого размера (75 кДа) обнаруживают у N. tabacum PM132 и N. benthamiana, транзиторно экспресирующих H5, и не обнаруживают у имитатора или контрольного штамма дикого типа). Общие растворимые белки экстрагируют из замороженного порошкообразного листового материала в PBS Дульбекко 1× при соотношении, равном 1 г замороженной массы к 2 мл экстракционного буфера. Равные объемы экстрактов (соответствующие 45-55 мкг общего белка на лунку) и контрольный белок H5 денатурируют в SDS-содержащем загрузочном буфере + восстанавливающий агент и загружают на гель 4-12% Bis-Tris NuPAGE. Белки переносят на мембрану PVDF с использованием устройства iBlot (Invitrogen). Обнаружение H5: 1) инкубация с первичными антителами [кроличьи против-H5, Immunetech #IT-003-005V, 1 мг/0,5 мл], при 1/1000 O/N при 4°C; 2) инкубация с вторичными антителами [HRP-конъюгированными козьими против кроличьих, Jackson Cat. #11-035-046, 0,4 мг/мл] при разведении 1/10000 в течение 1 ч при комнатной температуре; инкубация с HRP-субстратом ECL-Plus (GE #RPN2132) в течение 5 мин при комнатной температуре, 4) обнаружение хемилюминесценции с помощью Chemismart (Экспозиция 2 мин, Апертура 8).

Фиг.5 показывает 2D контурные графики предсказанные эффекты плотности Agrobacterium (OD инокулята) и отношения A91 к A120 (COI:SoS) в инокуляте на уровни экспрессии ТурбоGFP при 6 DPI (в мг на кг замороженной массы; значения, представленные в белых прямоугольниках) для трех разновидностей табака: А Burley 21, B PM132 и C PM204.

Фиг.6 показывает эффекты удаления стадии центрифугирования при получении инокулята на транзиторную экспрессию табака. Растения разновидностей табака Burley 21, PM132 и P204 подвергают совместной инфильтрации A91 и A120, полученными из культур, которые либо центрифугируют и ресуспендируют в растворе для инфильтрации или непосредственно разбавляют в растворе для инфильтрации. Флуорометрические измерения экспрессии tGFP осуществляют при 6 DPI. Панели показывают стандартную ошибку среднего.

Фиг.7 показывает экспрессию tGFP через 4 и 6 дней после инфильтрации в мг/кг свежей массы листовой биомассы в табачных растениях PM132, которые содержат вертикально в качестве нормы или в перевернутом положении.

Фиг.8 показывает динамику изменений во времени экспрессии tGFP в мг tGFP/кг свежей листовой массы в табачных растениях, инкубируемых в условиях низкого 8 ч освещения по сравнению с длительным 20 ч освещением, после инфильтрации.

В Таблице 1 перечислены все тестированные разновидности Nicotiana tabacum.

В Таблице 2 перечислены все двадцать шесть (26) разновидностей Nicotiana tabacum с экспрессией моноклональных антител C5-1 свыше 25% от контрольной N.benthamiana, как определяют посредством иммунологического доттинг-блоттинга. ++: сигнал между 25 и 50% от контрольной N.benthamiana и +++: сигнал, равный или свыше 50% от контрольной N.benthamiana. Фенотип инфильтрованного растения дается и сравнивается с неинфильтрованным растением той же разновидности.

В Таблице 3 перечислены характеристики растения N.tabacum PM132 и PM217, выращенных при 25 или 100 растениях на кв.м. Высота приведена в см, устьичная проводимость в мкмоль/м²с, показатель содержания хлорофилла (CCI) как считываемое значение с датчика измерителя хлорофилла CCM-200 (Opti-Science, USA), толщина листьев в мм и содержание воды в %.

Таблица 4 показывает экспрессию tGFP и H5 в листьях растений N.tabacum PM132 и PM217, выращенных при 25 или 100 растениях на кв.м перед инфильтрацией и после инфильтрации, инкубированных в течение 5 дней в вертикальном или перевернутом положении.

Таблица 5 показывает характеристики растений N.tabacum PM132, выращенных при 75 растениях на кв.м, используемых для определения эффекта инкубации в течение короткого и длинного светового дня после инфильтрации. Высота приведена в см, устьичная проводимость в мкмоль/м²с, показатель содержания хлорофилла (CCI) как считываемое значение с датчика измерителя хлорофилла CCM-200 (Opti-Science, USA), толщина листьев в мм и содержание воды в %.

В описании и примерах, сделана ссылка на следующие последовательности, которые представлены в списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1 отображает нуклеотидную последовательность вектора pPMP1

SEQ ID NO: 2 отображает нуклеотидную последовательность минимального промотора 35S-CaMV

SEQ ID NO: 3 отображает нуклеотидную последовательность 5'UTR HT-CPMV

SEQ ID NO: 4 отображает нуклеотидную последовательность 3'UTR HT-CPMV

SEQ ID NO: 5 отображает нуклеотидную последовательность P1-HcPro-P3

SEQ ID NO: 6 отображает нуклеотидную последовательность прямого праймера PC201F

SEQ ID NO: 7 отображает нуклеотидную последовательность обратного праймера PC202R

SEQ ID NO: 8 отображает нуклеотидную последовательность оптимизированного гемагглютинина 5 гриппа

SEQ ID NO: 9: отображает нуклеотидную последовательность однократно энхансированного фрагмента промотора pMMV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 10: отображает нуклеотидную последовательность дважды энхансированного фрагмента промотора pMMV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 11: отображает нуклеотидную последовательность однократно энхансированного фрагмента промотора pFMV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 12: отображает нуклеотидную последовательность дважды энхансированного фрагмента промотора pFMV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 13: отображает нуклеотидную последовательность однократно энхансированного фрагмента промотора pPCISV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 14: отображает нуклеотидную последовательность pPCISV дважды энхансированного фрагмента промотора pPCISV между сайтами EcoR1 и Hind3

SEQ ID NO: 15: отображает аминокислотную последовательность сигнального пептида пататина

SEQ ID NO: 16: отображает неоптимизированную последовательность (слегка модифицированную) пататина табака, как в C148 (впереди тяжелой цепи)

SEQ ID NO: 17: отображает оптимизированную последовательность пататина табака как в C148 (впереди легкой цепи)

SEQ ID NO: 18: отображает нуклеотидную последовательность последовательности зрелой тяжелой цепи ритуксимаба (оптимизированный табак), как в C148

SEQ ID NO: 19: отображает аминокислотную последовательность зрелой тяжелой цепи ритуксимаба

SEQ ID NO: 20: отображает нуклеотидную последовательность зрелой легкой цепи ритуксимаба (оптимизированный табак), как в C148

SEQ ID NO: 21: отображает аминокислотную последовательность зрелой легкой цепи ритуксимаба

Примеры

Следующие примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Если не указано другим образом, в настоящем изобретении используются общепринятые методы и способы молекулярной биологии, клеточной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, биологии растений, скрещивания растений и продуцирования белка.

Пример 1: Агроинфильтрация табачных растений

Данный пример описывает разнообразные способы инфильтрации выбранных разновидностей, линий скрещивания или сортов Nicotiana tabacum клетками Agrobacterium. Целое растение или растительная ткань могут быть инфильтрованы Agrobacterium с помощью вакуума, посредством высокого давления или посредством шприца без иглы. Перед инфильтрацией, табачные растения выращивают в теплице в блоках из минеральной ваты при 20 часовом световом периоде и 4 часовом темновом периоде, 26°C/20°C день/ночь и 70%/50% относительной влажности (день/ночь). Растениям дают удобрение посредством внутрипочвенного орошения.

Получение инокулята. Бактерии Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes, содержащие бинарный вектор, содержащий Т-ДНК с геном, представляющим интерес, под контролем растительных регуляторных элементов выращивают до OD₆₀₀>1,6 в YEB-среде, содержащей 2 г/л Говяжьего экстракта, 0,4 г/л Дрожжевого экстракта, 2 г/л Бакто-Пептона, 2 г/л Сахарозы, 0,1 г/л MgSO₄ и подходящие антибиотики для селекции соответствующего штамма Agrobacterium и бинарного вектора, в колбе Эрленмейера при 28°C и 250 об/мин на ротационном шейкере. Культуру затем разбавляют 1:100 в свежей LB бульонной среде Миллера, содержащей 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и подходящие антибиотики, и дополнительно выращивают при 28°C и 250 об/мин на ротационном шейкере до OD₆₀₀>2. Бактерии собирают центрифугированием в течение 15 минут при 8000g и 4°C. Пеллетированные бактерии ресуспендируют в растворе для инфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl₂ и 5 мМ MES (именуемом здесь как инфильтрационный раствор) при конечном рН, равном 5,6, и OD₆₀₀>2. Необязательно, бактерии могут быть дополнительно разбавлены в растворе для инфильтрации, и может быть добавлен ацетосирингон, чтобы индуцировать вирулентность. Необязательно, первую бактериальную суспензию Agrobacterium, полученную, как описано выше, смешивают со второй суспензией Agrobacterium, несущей второй бинарный вектор со вторым экспрессируемым геном. Неограничивающим примером такого второго гена является кодирующая последовательность, которая кодирует супрессор сайленсинга генов. Необязательно, инокулят может храниться в течение до недели при 4-6°C перед применением.

Шприцевая инфильтрация. Шприц, имеющий размеры стандартного 2-мл шприца, заполняют раствором для бактериальной инфильтрации и, без иглы, вдавливают в абаксиальную сторону листа. Поршень вдавливают для принуждения ввода бактериальной суспензии в ткань листа. Данное действие повторяют, пока большая часть листового пространства не будет инфильтрована. После инфильтрации, растения выдерживают при низком освещении минимально в течение 8 часов и в течение первого дня защищают от полного солнечного освещения. На следующий день, растения помещают в условия нормального освещения до сбора урожая.

Вакуумная инфильтрация. Растения инфильтруют посредством погружения надземных частей в химический стакан объемом 10 л, заполненный бактериальным инокулятом и подвергания всего инфицированного растения или инфицированных частей растений воздействию сильно пониженного атмосферного давления (в целом, именуемого здесь как вакуум). Вакуумную инфильтрацию осуществляют в стеклянном вакуумном колпаке (Schott-Duran Mobilex 300 мм) с использованием насоса V-710 Buchi, соединенного с регулятором V-855, и давление снижают от атмосферного давления (1 бар) до 50 мбар в течение 3-4 минут. По достижении, вакуум в вакуумном колпаке выдерживают в течение 1 минуты с последующим возвратом к атмосферному давлению в течение приблизительно 2 секунд. Искусственное освещение (80-100 мкмоль фотон/см²) выдерживают во время полного процесса инфильтрации, чтобы гарантировать соответствующие световые условия. После инфильтрации, растения помещают наряду с неинфильтрованными контрольными растениями в теплице до сбора урожая. Условия роста, такие как удабривание, фотопериод и температура являются такими же, как используют перед инфильтрацией. Воду и удобрение вводят в растения, используя систему капельного орошения.

Сбор урожая и отбор образцов материала. Отбор образцов можно начинать через 16 часов, но обычно инфильтрованные листья или инфильтрованные области листа собирают через 6 дней инкубации в теплице. Листовой материал помещают в термосварной мешок, герметизируют и помещают между слоями сухого льда в течение, по меньшей мере, 10 минут. После сбора, все образцы листьев хранят при -80°C до дополнительной обработки. Собранные листья гомогенизируют до состояния тонкодисперсного порошка с использованием кофемолки на сухом льде, экстрагируют посредством (i) двух стадий интенсивного встряхивания в течение 20 секунд каждая в 3 об/масс экстракцонного буфера, содержащего 50 мМ Tris-основания, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,2% Triton X-100, конечный pH 7,5, и (ii) центрифугирования при 20000g в течение 15 минут. Растворимые экстракты выдерживают на льду до анализа.

Пример 2: Бинарные векторы для транзиторной экспрессии

Данный пример описывает проект и разработку вектора pPMP1 и минимального бинарного вектора pC100, содержащих ген резистентности к канамицину для выбора трансформированных растительных клеток и применяемых в данной заявке.

Конструкция области Т-ДНК и скелетного фрагмента Нуклеотидная последовательность многокопийного бинарного вектора pBIN61 (Bendahmane et al., 2000. Plant Journal 21: 73-81) из приблизительно 13500 пар оснований по длине анализируют на нуклеиновые кислоты, имеющие функцию при репликации, поддержании, выборе трансгенных клеток и переносе Т-ДНК. Разрабатывают новую нуклеотидную последовательность, содержащую только нуклеиновые кислоты, имеющие функцию, как описано выше. Полученную в результате нуклеотидную последовательность химически синтезируют в двух частях. Первый фрагмент, содержащий область Т-ДНК, ограниченную правой Т-ДНК (RB) и левой Т-ДНК (LB) пограничными последовательностями, растительный селектируемый ген резистентности к канамицину (nptII) из pBIN61 под контролем промотора нопалинсинтазы (pNOS) и терминатор и уникальные сайты рестрикции StuI, AscI и EcoRI, химически синтезируют с помощью фланкирующих сайтов рестрикции Pvull и клонируют в сайте PvuII из pUC-производного вектора pMK (Geneart, Regensburg, Germany), который дополнительно содержит точку начала репликации ColE1 (Col E1 ori) и бактериальный ген резистентности к канамицину (KmR), что приводит в результате к pGA13. Второй фрагмент, содержащий скелетную область с ColE1 ori и минимальный RK2 oriV точки начала репликации и ген, кодирующий производнный от RK2 TrfA белок-инициатор репликации pBIN61, химически синтезируют с помощью уникальных сайтов рестрикции AscI, Stui и PvuII и клонируют в pUC-производном pMA векторе (Geneart, Regensburg, Germany), который дополнительно содержал ген резистентности к ампициллину (ApR), что приводит к pGA14.

Проект конструкции и разработка pC100. Минимальный бинарный растительный селектируемый вектор pC100 (фиг.1A) создают посредством объединения двух фрагментов, первого фрагмента и второго фрагмента, которые синтезируют de novo. Первый фрагмент содержит 1, ген резистентности к лекарству канамицину, функциональный в E.coli и Agrobacterium, и содержащий ген фосфотрансферазы неомицина III; 2, точку начала репликации ColE1; 3, минимальную точку начала репликации oriV (Kowalczyk L. et al., Molecular Microbiology, 2005, 57(5): 1439-1449); 4, ген trfA1 плазмиды IncP, которая активирует oriV (Kongsuwan K. et al., J. Bacteriology, 2006, 188(15): 5501-5509), и 5, уникальные AscI и StuI сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции на крайних концах фрагмента для объединения указанного фрагмента 1 и фрагмента 2 для генерации минимального бинарного вектора pC100. Второй фрагмент содержит область Т-ДНК, которая содержала 6, левую пограничную последовательность Т-ДНК Agrobacterium; 7, правую пограничную последовательность Т-ДНК Agrobacterium; 8, необязательно, селектируемый маркерный ген для селекции трансгенной растительной клетки и содержащий ген фосфотрансферазы неомицина II под контролем промотора нопалинсинтазы, и терминаторную последовательность нопалинсинтазы нопалиновой плазмиды Agrobacterium tumefaciens; 9, уникальный сайт распознавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI для клонирования чуждого гена и расположенный между 7, правой границей Т-ДНК и 8, геном селектируемого маркер, и 10, уникальные сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции AscI и StuI по крайним концам фрагмента для объединения указанного фрагмента 2 и фрагмента 1 для генерации минимального бинарного вектора pC100.

Конструкция минимального бинарного вектора pPMP1. pPMP1 (5139 по; фиг.1B) конструируют посредством делеции растительного селектируемого гена nptII из pC100, генерирующего минимальный бинарный вектор pPMP1 с SEQ ID NO: 1. pPMP1 содержит уникальный сайт рестрикции EcoRI в положении +1; LB в положении от +69 до +94; первую гэп-последовательность из 250 по, где гэп-последовательность не имеет функции при репликации pPMP1, поддержания в бактериальной клетке или переноса области Т-ДНК в растительную клетку; первую последовательность из приблизительно 1100 по, содержащую ген KmR, кодирующий последовательность от +653 до +1454 и приблизительно 300 по регуляторных последовательностей против хода и по ходу транскрипции от кодирующей последовательности; вторую гэп-последовательность из приблизительно 150 по; вторую последовательность, содержащую ColE1 ori от +1602 до +2269; третью гэп-последовательность из приблизительно 150 по; третью последовательность из приблизительно 1500 по, содержащую кодирующую последовательность aTrfA от +3662 до +2517 и приблизительно 350 по регуляторных последовательностей против хода и по ходу транскрипции кодирующей последовательности; четвертую гэп-последовательность из приблизительно 450 по; четвертую последовательность, содержащую RK2 oriV от +4932 до 4303; пятую гэп-последовательность из 109 по; RB в положении от 5041 до 5066 и уникальный сайт рестрикции EcoRI в положении +5139.

Пример 3: Репортерные аналитические тесты для визуализации транзиторной экспрессии у табака

Данный пример описывает разнообразные репортерные аналитические тесты для использования в растительных клетках для определения эффективности трансформации и экспрессии гетерологичного гена в указанных растительных клетках.

Анализ бета-глюкуронидазы. Бета-глюкуронидазу применяют в качестве репортера и анализируют в соответствии со способом, описанном у Jefferson et al., EMBO J, 1987, 6:3901-3907.

Аналитический тест на зеленый флуоресцентный белок. Табачные растения со-инфильтруют клетками штамма AGL1 Agrobacterium tumefaciens, содержащими (i) супрессор сайленсинга генов p 19, и отдельно (ii) улучшенным вариантом зеленого флуоресцентного белка из веслоногого рачка Pontellina plumata, доступного для приобретения как TurboGFP (Evrogen, USA, номер по каталогу FP552). Экспрессией p19 управляет промотор 35S двойного вируса мозаики цветной капусты. Экспрессией TurboGFP управляет минимальный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты и 5'-UTR вируса мозаики вигны китайской (HT-CPMV). Бактериальные концентрации в инфильтрационной смеси доводят до OD₆₀₀=0,16 для каждой из двух бактериальных суспензий, одной, содержащей кодирующую последовательность TurboGFP и другой, содержащей супрессор p19 сайленсинга генов. Растения для инфильтрации выращивают в теплице в блоках из минеральной ваты с 20 часовым световым периодом и 4 часовым темновым периодом, при 26°C/20°C дневной/ночной температуре и 70%/50% относительной влажности (день/ночь). Растениям вносят удобрение посредством подпочвенного орошения. Растения инфильтруют при 50 мбар в течение 1 минуты, следуя стандартным протоколам инфильтрации или посредством шприцевой инфильтрации, как описано в примере 1.

Сразу же после вакуумной инфильтрации растения подвешивают в перевернутом состоянии на пару минут на держатель, чтобы уменьшить избыток инфильтрационного раствора, оставшийся в листьях, и затем помещают на тепличные стеллажи для проведения оставшейся части эксперимента. Составы для удобрения после инфильтрации выдерживаются такими же, как и перед инфильтрацией и орошение одобрением подается через систему капельного орошения два раза в день в течение 45 секунд. Экспрессию GFP у растений анализируют качественно и количественно. Качественные оценки GFP осуществляют под синим светом (Лампа с ручкой HL32T, Clare Chemical Research, USA), которая испускает свет в интервале возбуждения TurboGFP (Длина волны возбуждения = 482 нм и длина волны эмиссии = 502 нм). Количественный анализ GFP в листьях проводят посредством измерения флуоресценции на считывающем устройстве Modulus для микропланшетов (Turner Biosystems) в режиме флуоресценции с синим оптическим набором ((длина волны возбуждения = 490 нм и длина волны эмиссии = 510-570 нм). При любой данной точке сбора урожая, листовые диски по приблизительно 80 мг собирают с помощью перфоратора листовых дисков от пяти листьев на растении (полностью распустившиеся листья из положений 1-5, 0 представляет верхушечную мерисистему черенка и 1, первый лист) от трех растений на обработку. Образцы мгновенно замораживают в жидком азоте и хранят при -80°C и затем измельчают в TissueLyser (Qiagen) в течение приблизительно 2,5 минут в присутствии 1 мл экстракционного буфера, содержащего 50 мМ Трис, 2мМ DTT, 150 мМ NaCI, 1% Triton X-100 и 4M мочевину, pH 7,4. После измельчения, образцы центрифугируют при полной скорости в течение 10 мин в микроцентрифуге и 500 мкл супернатанта собирают и хранят при -20°C до анализа. Образцы из пяти листьев одиночного растения объединяют в пул посредством сбора 200 мкл супернатанта из каждого экстракта в единственную микроцентрифужную пробирку. Объединенные экстракты повторно центрифугируют в течение 10 мин при 4°C и 700 мкл супернатанта переносят в чистую пробирку. Для количественной оценки флуоресценции, 5 мкл супернатанта разбавляют в 195 мкл экстракционного буфера и измеряют в считывающем устройстве для микропланшетов. Концентрацию GFP вычисляют с использованием стандартной кривой, построенной при использовании промышленного рекомбинантного белка TurboGFP. Стандартную кривую получают посредством добавления различных количеств рекомбинантного белка TurboGFP к экстракту контрольного табачного растения и разбавления 1:40 в экстракционном буфере.

Пример 4: Сравнение разновидностей Nicotiana tabacum посредством транзиторной экспрессии

Данный пример описывает сравнения (i) экспрессии моноклональных антител C5-1 у более, чем 90 разновидностей Nicotiana tabacum после агроинфильтрации и (ii) фенотипических характеристик растений перед инфильтрацией и после нее.

Разновидности Nicotiana tabacum. Свыше девяноста (>90) разновидностей Nicotiana tabacum, как приведены в таблице 1, тестируют с целью идентификации линий табака, которые являются подходящими для транзиторной экспрессии рекомбинантного белка. Tobacco линий выбираются таким образом, чтобы они включали максимально возможное разнообразие типов табака, выращенного в мире, включая табак дымовой сушки, Берли, восточного типа, полувосточного типа и линии покровного сигарного табака. Тестируют следующие разновидности табака: N. tabacum AA 37-1, N.tabacum B 13P, N.tabacum Xanthi (Mitchell-Mor), N.tabacum KTRD#3 Гибрид 107, N.tabacum Bel-W3, N.tabacum 79-615, N.tabacum Samsun Holmes NN, F4 от скрещивания N.tabacum BU21 × N.tabacum Hoja Parado, line 97, N.tabacum KTRDC#2 Гибрид 49, N.tabacum KTRDC#4 Гибрид 110, N.tabacum Берли 21, N.tabacum PM016, N.tabacum KTRDC#5 KY 160 SI, N.tabacum KTRDC#7 FCA, N.tabacum KTRDC#6 TN 86 SI, N.tabacum PM021, N.tabacum K 149, N.tabacum K 326, N.tabacum K 346, N.tabacum K 358, N.tabacum K 394, N.tabacum K 399, N.tabacum K 730, N.tabacum KY 10, N.tabacum KY 14, N.tabacum KY 160, N.tabacum KY 17, N.tabacum KY 8959, N.tabacum KY 9, N.tabacum KY 907, N.tabacum MD 609, N.tabacum McNair 373, N.tabacum NC 2000, N.tabacum PG 01, N.tabacum PG 04, N.tabacum PO1, N.tabacum PO2, N.tabacum PO3, N.tabacum RG 11, N.tabacum RG 17, N.tabacum RG 8, N.tabacum Speight G-28, N.tabacum TN 86, N.tabacum TN 90, N.tabacum VA 509, N.tabacum AS44, N.tabacum Banket A1, N.tabacum Basma Drama B84/31, N.tabacum Basma I Zichna ZP4/B, N.tabacum Basma Xanthi BX 2A, N.tabacum Batek, N.tabacum Besuki Jember, N.tabacum C104, N.tabacum Coker 319, N.tabacum Coker 347, N.tabacum Criollo isionero, N.tabacum PM092, N.tabacum Delcrest, N.tabacum Djebel 81, N.tabacum DVH 405, N.tabacum Galpao Comum, N.tabacum HB04P, N.tabacum Hicks Broadleaf, N.tabacum Kabakulak Elassona, N.tabacum PM102, N.tabacum Kutsage E1, N.tabacum KY 14×L8, N.tabacum KY 171, N.tabacum LA BU 21, N.tabacum McNair 944, N.tabacum NC 2326, N.tabacum NC 71, N.tabacum NC 297, N.tabacum NC 3, N.tabacum PVH 03, N.tabacum PVH 09, N.tabacum PVH 19, N.tabacum PVH 2110, N.tabacum Red Russian, N.tabacum Samsun, N.tabacum Saplak, N.tabacum Simmaba, N.tabacum Talgar 28, N.tabacum PM132, N.tabacum Wisliςa, N.tabacum Yayaldag, N.tabacum NC 4, N.tabacum TR Madole, N.tabacum Prilep HC-72, N.tabacum Prilep P23, N.tabacum Prilep PB 156/1, N.tabacum Prilep P12-2/1, N.tabacum Yaka JK-48, N.tabacum Yaka JB 125/3, N.tabacum TI-1068, N.tabacum KDH-960, N.tabacum TI-1070, N.tabacum TW136, N.tabacum PM204, N.tabacum PM205, N.tabacum Basma, N.tabacum TKF 4028, N.tabacum L8, N.tabacum TKF 2002, N.tabacum TN90, N.tabacum GR141, N.tabacum Basma xanthi, N.tabacum GR149, N.tabacum PM216, N.tabacum PM217, N.tabacum GR153, N.tabacum Petit Havana, N.tabacum PM215.

Разновидности табака могут быть получены из коллекции Nicotiana Университета Штата Северная Каролина, Отделение растениеводства (Оксфорд, Северная Каролина, США). Для всех линий измеряют агрономические (биомасса, плодовитость, однородность) и аналитические параметры (общий растворимый белок, общие протеазы, общие алкалоиды). С этой целью, табачные растения выращивают индивидуально в горшочках размером 12 см в условиях общепринятой системы с плавающим слоем в теплице. Агрономические и аналитические параметры измеряют при сборе урожая. Исследования транзиторной экспрессии осуществляют посредством шприцевой co-инфильтрации первой и второй суспензии Agrobactenum tumefaciens. Первая суспензия A. tumefaciens представляет собой бактерии A. tumefaciens AGL1, несущие бинарный вектор, содержащий кодирующую последовательность моноклональных антител под контролем растительных регуляторных элементов. Вторая суспензия A. tumefaciens представляет собой бактерии AGL1, несущие кодирующую последовательность супрессора сайленсинга генов p19 вируса огуречного некроза под контролем растительных регуляторных элементов. Все эксперименты по инфильтрации осуществляют в трех параллельных опытах в трех растениях каждый. Одно дополнительное растение содержится в качестве контроля для каждой линии табака.

Генные конструкции. Генная конструкция C7 представляет собой pCambia-производный бинарный вектор, содержащий две кассеты экспрессии, содержащие тяжелую и легкую цепь моноклонального антитела C5-1 под контролем пластоцианинового промотора pPC и терминаторной последовательности. Генная конструкция C32 представляет собой производный от pKYLX7 бинарный вектор, содержащий кассету экспрессии, содержащую супрессор p19 сайленсинга генов вируса огуречного некроза (CNV) под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и терминатора. Все бинарные векторы находятся в штамме AGL1 Agrobactenum tumefaciens.

Транзиторная экспрессия моноклональных антител C5-1. Табачные растения выращивают индивидуально в горшочке размером 12 см в теплице. Три растения каждой разновидности табака инфильтруют бактериальной суспензией с использованием шприца, как описано в примере 1. Через 6 дней после инфильтрации, все инфильтрованные листья от одного растени собирают в термосвариваемый мешок, замораживают до -80°C и затем измельчают до тонкодисперсного порошка и полностью гомогенизируют. Из каждого растения, общие растворимые белки экстрагируют из приблизительно 1 г замороженной массы измельченного порошка листьев в 3 мл экстракционного буфера. Экстракционный буфер представляет собой 50 мМ Tris (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 4M мочевину и 2 мМ DTT. В качестве контрольного образца, идентичный экстракт получают из растений Nicotiana benthamiana, инфильтрованных в то же самое время такими же суспензиями Agrobacterium. Для анализа экспрессии C5-1, растительные экстракты разбавляют 200-кратно, и серийные разведения наносят в виде пятен на нитроцеллюлозную мембрану, используя систему дот-иммуноблоттинга Easy-titer ELIFA (Pierce). Нитроцеллюлозные мембраны инкубируют с HRP-мечеными антителами от Jackson ImmunoResearch (кат. № #115-0,5-205) при разведении 1:5000. Сигналы на мембранах анализируют визуально, и каждому растению присваивается балльная оценка на основании визуальной интерпретации интенсивности сигнала в сравнении с интенсивностью сигнала серийных разведений контрольного экстракта N. benthamiana. Оценка в баллах присваивается следующим образом:

+ - пятно обнаруживаемо ниже 25% от сигнала контрольного образца,

++ = между 25 и 50% от сигнала контрольного образца,

+++ = между 50 и 100% от сигнала контрольного образца.

Результаты. Никакого сигнала не обнаружено у контрольных растений и из тестированных 90 разновидностей, 26 разновидностей показывают значимую экспрессию и имеют балльную оценку ++. 64 разновидности не показывают никакой или имели только небольшую экспрессию. Перечень 26 разновидностей, показывающих экспрессию моноклональных антител C5-1, представлен в таблице 2.

Пример 5: Эффект супрессоров сайленсинга генов на транзиторную экспрессию зеленого флуоресцентного белка у N. tabacum.

В данном примере описано сравнение эффекта разнообразных супрессоров сайленсинга генов на экспрессию репортерной генной конструкции у ряда разновидностей табак с использованием агроинфильтрации. Также описан эффект (i) промотора, управляющего экспрессией супрессора сайленсинга генов и (ii) отношение целевого белка к супрессору сайленсинга генов.

Конструкции репортера и супрессора сайленсинга генов. Ген зеленого флуоресцентного белка представляет собой ген TurboGFP (tGFP) от Evrogen (см. пример 3). Ген TurboGFP клонируют под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и последовательности HT-CPMV и терминаторной последовательности NOS в pBINPLUS, что приводит в результате к генной конструкции pC91. Тестируют следующие супрессоры сайленсинга генов: белок p19 вируса огуречного некроза (CNV), белок p1 вируса желтой пятнистости риса (RYMV), белок p25 вируса картофеля X (PVX), белок AC2 вируса мозаики африканской маниоки (ACMV), белок 2b вируса мозаики огурца (CMV) и протеазу хелперного компонента (HcPro) вируса гравировки табака (TEV). Супрессоры сайленсинга генов p1 из RYMV, p25 из PVX, AC2 из ACMV, 2b из CMV, HcPro из PVY и p19 из CNV клонируют по тупым концам в сайте SmaI pBIN61 (Bendahmane et al., Plant J, 2000, 21:73-81) в смысловой ориентации под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и терминаторной последовательности для генерации генных конструкций pC18, pC19, pC20, pC21, pC120 и pC32, соответственно. Все последовательности являются общедоступными.

Промоторные генные конструкции. Для тестирования эффекта разнообразных промоторов, управляющих экспрессией супрессора сайленсинга генов, p19 из CNV, присутствующий в генной конструкции pC32 под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и терминатора, также помещают в условия (i) контроля промотора pNOS нопалинсинтазы (генная конструкция pC224) и (ii) промотора pPC пластоцианина Medicago sativa сорт WL357HQ (GenBank EF628506,1) что приводит в результате к pBIN61-родственной генной конструкции pC226.

Растительный материал. Растения N. benthamiana и N. tabacum PM67, PM81, PM92, PM128, PM132, PM133 и PM204 выращивают в теплице, как описано в примере 4.

Инфильтрация и анализ экспрессии. Растения шести- и семинедельного возраста инфильтруют посредством вакуумной инфильтрации, как описано в примере 1. Все генные конструкции представлены в штамме AGL1 A. tumefaciens. A18 представляет собой AGL1(pC18), A19 представляет собой AGL1 (pC19), A20 представляет собой AGL1 (pC20), A21 представляет собой AGL1 (pC21), A32 представляет собой AGL1(pC32), A120 представляет собой AGL1(pC120), A224 представляет собой AGL1 (pC224), A226 представляет собой AGL1 (pC226) и A91 представляет собой AGL1 (pC91). Анализ экспрессии зеленого флуоресцентного белка проводят, как описано в примере 3.

Результаты тестирования разнообразных разновидностей N. tabacum и супрессоров сайленсинга генов. Эффективность разнообразных супрессоров сайленсинга генов для усиления экспрессии tGFP у табака сравнивают с аналогичной эффективностью у растений N. benthamiana. Две разновидности, PM92 и N. tabacum Wisliςa проявляли более выраженный некроз и хлороз. Ни один из супрессоров сайленсинга генов не вызывал видимых симптомов стресса у N. benthamiana. Экспрессию tGFP у N. benthamiana проверяют под синим светом при 6 DPI и лучшие результаты получают с растениями, со-трансфсцированными с генной конструкцией, что продуцировало очень сильный сигнал флуоресценции GFP. Флуоресценция tGFP в листьях N. tabacum является наивысшей, когда табачные растения всех тестируемых семи разновидностей со-трансфицируют с супрессором HcPro сайленсинга генов, как в pC120 (фиг.2). Значимую экспрессию также обнаруживают, когда N. tabacum PM204 co-инфильтруют с супрессором p1 сайленсинга генов из RYMV (pC18 в A18; фиг.2) и супрессором AC2 сайленсинга генов из ACMV (pC20 в A20; фиг.2). Наилучшие результаты получают для N. tabacum PM204 для трех тестированных супрессоров сайленсинга генов и наивысшую экспрессию обнаруживают, когда co-инфильтруют с HcPro (pC120), с последующим AC2 (pC20) и p1 (pC18).

Результаты тестирования N.tabacum PM132 и 204 и супрессоров сайленсинга генов. Эффекты HcPro из TEV, AC2 из ACMV и p19 из CNV супрессоров сайленсинга генов на экспрессию tGFP в PM132 и PM204 тестируют у растений 6-недельного возраста. Дополнительно, тестируют эффекты трех различных экспрессируемых промоторов, управляющих супрессором p19 сайленсинга генов из CNV. Тестируют следующие промоторы: промотор 35S вируса мозаики цветной капусты и терминатор в pC32, промотор нопалинсинтазы и терминатор в pC224 и пластоцианиновый промотор pPC и терминатор в pC226. Количественная оценка уровней экспрессии tGFP через 6 дней после инфильтрации показала, что высокую экспрессию получают только тогда, когда супрессор сайленсинга HcPro применяют в комбинации с A91, несущей генную конструкцию tGFP. Уровни экспрессии в PM132 и PM204 более чем в 3 раза выше, чем уровни, полученные для других супрессоров сайленсинга генов. Примечательно, что до 10-кратного увеличения уровней экспрессии tGFP в PM132 и PM204 наблюдают, когда инфильтруют 6-недельные табачные растения, в сравнении с 7-недельным растением.

Пример 6: Сравнение продуктивности биомассы, алкалоидов, общего растворимого белка и общей протеазной активности разновидностей табака

Этот пример предоставляет сравнение продуктивности биомассы, содержания общего растворимого белка, содержания протеаз и содержания алкалоидов у ряда разновидностей N. tabacum.

Растительный материал. Все разновидности табака, перечисленные в таблице 1 и описанные в примере 5 выращивают в 288-ячеечных поддонах Styrofoam (0,25 м²/поддон) с использованием традиционной системы с плавающим слоем. Разновидности табака выращивают в двух параллельных опытах с использованием рандомизированного блочного дизайна в теплице. Листья собирают на разнообразных стадиях для определения содержания общего растворимого белка, общей протеазы и содержания алкалоидов в листьях. Листья табачных растений, выращенных в теплице, собирают в теплице, быстро замораживают в жидком азоте и измельчают до тонкодисперсного порошка, который переносят в пробирки объемом 50 мл и хранят при -80°C до осуществления анализов.

Экстракция листового материала для ферментного анализа. Измельченный порошок табачного листа смешивают с четырьмя объемами экстракционного буфера, содержащего 50 мМ фосфата калия, забуференного NaOH до pH 7,5, 1% нерастворимого PVP и 0,1% β-меркаптоэтанол. Гомогенаты центрифугируют в течение 10 минут при 1200g и супернатант применяют, чтобы определить активность протеазного фермента и для определения от содержания общего растворимого белка.

Ферментный анализ. Азоколл-расщепляющую активность (азоколлазу) определяют посредством измерения высвобождения красного красителя из Азоколла (Calbiochem), как описано Ragster и Chrispeels, Plant Physiology, 1979, 64: 857-862. Двадцать мг субстрата Азоколла смешивают с 50-100 мкл ферментного экстракта в 25 мМ Tris-HCl, pH 9,0 буфере в общем объеме, равном 2 мл, и инкубируют в водяной бане при 37°C в течение 15 минут. Реакцию останавливают посредством охлаждения пробирок до 2°C в течение 15 мин и затем центрифугируют при 2000g в течение 10 минут. Супернатант помещают в спектрофотометр и экстинкцию измеряют при 520 нм.

Определение алкалоидов. 0,1 г порошка измельченного табачного листа переносят в стеклянный пузырек и добавляют 0,5 мл раствор гидроксида натрия (2н NaOH). Через 15 минут добавляют 5 мл раствора метил-трет-бутилового эфира, содержащего 0,4 мг/мл хинолина, и образец встряхивают в течение 2,5 часов. Верхний слой жидкой среды переносят в чистый стеклянный сцинтилляционный флакон и загружают в автосамплер газового хроматографа Perkin Elmer Autosystem XL для измерения. Количество алкалоида измеряют, как описано Chen et al., Beitrage zur Tabakforschung International, 2005, 21 : 369-379.

Общий растворимый белок. Содержание общего растворимого белка (ОРБ) в листовых экстрактах определяют с использованием аналитического реагента Кумасси-Плюс (Pierce) посредством измерения поглощения в устройстве для считывания микропланшетов при 595 нм, как описано у Bradford, Analitical Biochemistry, 1976, 72: 248-254. Экстракты разбавляют 1:10 в ультрачистой воде и 10 мкл загружают в трех параллельных опытах на плоскодонный микропланшет.

Результаты. Протеазная активность экстракта Coker 347, PM132, PM092, PM204, PM102 и Saplak составляла 145,6, 118,4, 116,6, 109,8, 39,7 и 15,1, соответственно. Продуктивность листовой биомассы в г/кв.м F4 (BU21 x Hoja Parado)/97, PM102, PM132, PM204, PM092 составляла 400938, 318306, 190506, 187442 и 187422, соответственно. Содержание алкалоидов PM016, PM021, PM092, PM102, PM132 и PM204 в мг/г листовой ткани составляет 3,57, 1,79, 0,41, 3,2, 0,79 и 0,66 соответственно. Содержание белка в экстрактах PM016, PM021, PM092, PM102, PM132 и PM204 в пг/мл экстракта составляет 525, 374, 317, 288, 261 и 311, соответственно.

Пример 7: Эффект штаммов Agrobacterium на транзиторную экспрессию

В данном примере описан эффект использования шести различных штаммов Agrobacterium tumefaciens для агроинфильтрации разновидностей табака, на экспрессию целевого белка.

Штаммы Agrobacterium и бинарные векторы. Чтобы тестировать эффект штаммов Agrobacterium на транзиторную экспрессию, табачные растения подвергают вакуум-инфильтрации, как описано в примере 1, штаммами A. tumefaciens AGL1, EHA105, GV2260, GV3101, Cry5 и LBA4404, причем каждый из них несет генную конструкцию pC91. pC91 содержала ген tGFP под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и лидерной последовательности HT-CPMV и последовательности нопалинсинтазного терминатора в бинарном векторе pBINPLUS. Все их co-инфильтруют с AGL1, несущим pC120, которая содержит экспрессируемую последовательность из HcPro. A91 представляет собой AGL1(pC91), E91 представляет собой EHA105(pC91), G91 представляет собой GV2260(pC91), L91 представляет собой LBA4404(pC91), V91 представляет собой GV3101 (pC91), Y91 представляет собой Chry5(pC91), и A120 представляет собой AGL1 (pC120).

Получение инокулята. Культуры Agrobacterium выращивают в LB Miller MES pH 5,6, дополненной соответствующими антибиотиками, до конечной оптической плотности (OD₆₀₀), равной >2,0. Бактерии собирают центрифугированием и ресуспендируют в растворе для инфильтрации (10 мМ MgCl₂, 5 мМ MES, pH 5,6). В каждом эксперименте, суспензию Agrobacterium, несущую конструкцию pC91 смешивают в равных объемах с суспензией Agrobacterium, несущей ген супрессора сайленсинга для генерации 6× концентрированного инокулята. В день инфильтрации, концентрированный инокулят разбавляют до 1× конечной концентрации (соответствующей OD₆₀₀, приблизительно равной 0,3) в растворе для инфильтрации и уравновешенной до комнатной температуры.

Растительный материал. Растения N. tabacum Burly 21, PM16, PM21, K149, PO1, PO2, PM92, Simmaba, PM132, Wisliςa, Yaka JB 125/3 и PM204 выращивают в теплице в горшочках размером 12 см в условиях режима фотопериода, состоящего из 20 часового освещения и 4 часовой темноты, при температуре 26°C/20°C день/ночь и относительной влажности 70%/50% день/ночь.

Инфильтрация растений. Растения инфильтруют в условиях вакуума, как описано в примере 1. Искусственное освещение (80-100 мкмоль фотон/см²) поддерживается во время всего процесса инфильтрации, чтобы гарантировать соответствующие световые условия. После инфильтрации, растения помещают обратно в теплицу до сбора урожая. Появление симптомов стресса, таких как хлороз (пожелтение листьев) и некротические повреждения ("мертвые" пятна) регистрируют визуально посредством сравнения инфильтрованных растений с неинфильтроваными контролями. Условия роста, такие как внесение удобрений, фотопериод и температура являются такими же, как используют перед инфильтрацией, но в этом случае воду и удобрение вносят к растениям, используя систему капельного орошения. В периоде от четырех до шести дней после инфильтрации, растения помещают под синий свет и все инфильтрованные листья, показывающие флуоресценцию, собирают, помещают в мешок с застежкой молнией и хранят при -80°C до обработки для анализа.

Визуализация и количественное определение Turbo GFP. Накопление tGFP в собранных листьях регистрируют под синим светом в темной камере. Собранные листья гомогенизируют до тонкодисперсного порошка под сухим льдом и образцы по 1,00+/-0,05 г замороженной массы порошка экстрагируют в 3 мл экстракционного буфера (50 мМ основание Tris; 100 мМ NaCl; EDTA 1 мМ; 0,2% Triton X-100; pH 7,5) посредством двух стадий энергичного встряхивания в течение 20 секунд, с последующим центрифугированием при 20000 г в течение 15 мин. Растворимые экстракты сохраняют на льду для анализа. Экстракты N. tabacum разбавляют 1:50 в экстракционном буфере и 200 мкл загружают в трех параллельных опытах на черный 96-луночный планшет (Corning). Концентрацию TurboGFP в экстрактах определяют посредством измерения флуоресценции на считывающем устройстве для микропланшетов Modulus (Turner Biosystems) с помощью Синего оптического набора (длина волны возбуждения: 490 нм/длина волны эмиссии: 510-570 нм). Флуоресценцию образцов корректируют посредством вычитания аутофлуоресценции экстрактов неинфильтрованных контрольных растений. Стандартную кривую получают посредством добавления контрольного белка TurboGFP (rTurbo GFP, Evrogen #FP552) в интервале концентраций от 4000 до 125 нг/мл к неинфильтрованному экстракту, разбавленному окончательно 1:50 в экстракционном буфере.

Результаты. Растения инфильтруют в двух загрузках. Сначала, N. tabacum Берли 21, PM016, PM21, K149, PO1, PO2, Simmaba и PM132 инфильтруют и анализируют на экспрессию tGFP. Через шесть дней после инфильтрации можно было наблюдать, что штаммы Agrobacterium Cry 5 и GV2260 вызывали ответный тяжелый стресс, включая хлороз и некротические повреждения на листьях большинства тестированных разновидностей табака. Дополнительно, разновидности табака PM016, PM21 и K149, по-видимому, являются высокочувствительными к агроинфильтрации, и сильный некроз наблюдают со многими тестированными штаммами. Наивысшая экспрессия для всех тестированных штаммов, соответственно, была в случае PM132 (фиг.3A). Неожиданно, что более, чем в два раза высокую экспрессию получают для штаммов Agrobacterium AGL1 и EHA105, несущих генную конструкцию pC91, достигающую приблизительно 700 мг tGFP/кг замороженной листовой массы по сравнению с 400 мг tGFP/кг замороженной листовой массы для GV2260, 200 мг tGFP/кг замороженной листовой массы для GV3101 и менее чем 100 мг tGFP/кг замороженной листовой массы для Cry-5 и LBA4404. Разновидности табака Берли 21, PM016, PM21, K149, PO1, PO2 и Simmaba продуцировали значительно меньше tGFP, в интервале от нуля до приблизительно 200 мг tGFP кг замороженной листовой массы максимально, в зависимости от применяемого штамма Agrobacterium. Разновидности табака PM92 и PM204 продуцировали до 400 мг tGFP/кг замороженной листовой массы при использовании AGL1 для доставки обеих генных конструкций. Примечательно, что PM204 также продуцирует до 400 мг tGFP кг замороженной листовой массы, когда используют EHA105, но другие разновидности табака PM92 и PM181 продуцируют только половину этого количества с использованием такой же бактерии для доставки (фиг.3B).

Вывод. Комбинация, состоящая из A. tumefaciens AGL1 или EHA105, несущих конструкцию, представляющую интерес, (представленную репортерным геном tGFP ген в кассете экспрессии на базе HT-CPMV), и AGL1, несущего супрессор сайленсинга (HcPro) приводила к наиболее высокому накоплению tGFP в данном эксперименте. Две разновидности табака PM132 и PM204 представляют собой разновидности, которые накапливали наиболее высокие уровни tGFP и PM132, тестируют дополнительно на рекомбинантное продуцирование полипептида гемагглютинина H5 вируса гриппа (см. пример 8).

Пример 8: Транзиторная экспрессия гемагглютинина H5 у N. tabacum

В данном примере, описана транзиторная экспрессия гемагглютинина H5 у разновидности N.tabacum, с использованием агроинфильтрации.

Штаммы Agrobacterium, генные конструкции и растения. Генная конструкция pC71 представляет собой производный от pBIN61 бинарный вектор, содержащий кодирующую последовательность гемагглютинина 5 (H5) гена штамма H5N1 гриппа, помещаемый под контроль минимального промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и 5'-UTR из HT-CPMV, и по 3'-концу терминатор нопалинсинтазы и 3'-UTR из HT-CPMV. pC120 подвергают co-инфильтрации, как описано выше, для предоставления супрессора сайленсинга генов He-Pro. Как pC71, так и pC120 присутствуют в том же штамме AGL1. Четырнадцать растений PM132 выращивают и инфильтруют с помощью AGL1(pC71) и AGL1(pC120), как описано прежде в примере 7.

Экстракция и Вестерн-анализ. Все листья собирают, замораживают до -80°C, измельчают до порошка и гомогенизируют, как описано прежде. Обнаружение рекомбинантно продуцируемого белка H5 производят посредством вестерн-блоттинга с использованием неочищенных экстрактов инфильтрованных PM132 N. tabacum и контрольных растений N. benthamiana, инфильтрованных теми же агробактериями и транзиторно экспрессирующих белок H5. Фиг.4 показывает результаты Вестерн-анализа неочищенных экстрактов и полосу ожидаемой молекулярной массы для H5 (75 кДа). Из фиг.4 также очевидно, что интенсивность H5 является сравнимой для экстрактов N. tabacum PM132 и N. benthamiana. Никакой полосы при 75 кДа не обнаруживают у неинфильтрованных контролей дикого типа.

Гемагглютининовая активность экстрактов. Гемагглютинин обладает способностью связываться с моносахаридом сиаловой кислотой, которая присутствует на поверхности эритроцитов у красных кровяных клеток. Гемагглютинирование может применяться для определения относительной активности гемагглютининового белка и его применяют для определения биологической активности рекомбинантного H5, присутствующего в неочищенных экстрактах N. tabacum PM132 и N. benthamiana, транзиторно экспрессирующих H5, как описано прежде. 1,5-кратные серийные разведения растительных экстрактов получают и смешивают в 96-луночном микропланшете с красными кровяными клетками. Красные кровяные клетки, которые не связываются с гемагглютинином, будут седиментировать и осаждаться с образованием плотного сгустка. Красные кровяные клетки, которые связываются с гемагглютинином, образуют решетку, которая покрывает лунку. Только корректно собранный гомотримерный гемагглютинин будет связывать эритроциты. Анализ гемагглютинации, осуществляемый на экстрактах вышеуказанных табачных растений, транзиторно экспрессирующих белок H5, показал, что экстракты PM132 имели гемагглютиновую активность, указывая на то, что корректно складчатый тримерный H5 продуцируется у вакуум-инфильтрованного N. tabacum PM132.

Пример 9: Транзиторная экспрессия моноклонального антитела ритуксимаба

Конструкция экспрессионных векторов моноклонального антитела ритуксимаба. Ритуксимаб представляет собой мышиное/человеческое химерное моноклональное антитело IgG1, которое связывается с человеческим CD20. Ритуксимаб применяют при лечении многих лимфом, лейкемий, отторжении трансплантатов и некоторых аутоиммунных расстройствах. Кассета экспрессии, содержащая полные кодирующие последовательности легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела ритуксимаба как у регистрационного номера CAS 174722-31-7 или в WO02/060955 получают посредством химического синтеза с кодонами, оптимизированными для экспрессии в растительной клетке табака.

>последовательность зрелой тяжелой цепи ритуксимаба (оптимизированного для табака), как у C148

Последовательность зрелой тяжелой цепи синтезируют с сигнальным пептидом пататина и помещают под контроль промотора HT-CPMV и HT-CPMV нетранслированных 5' и 3' UTR-последовательностей, как в патенте WO09/087391 и у терминаторной последовательности 35S вируса мозаики цветной капусты.

SEQ ID NO:16:

atggccactactaaatcttttttaattttattttttatgatattagcaactactagttcaacatgtgct является примером нуклеотидной последовательности, которая кодирует пататиновый сигнальный пептид, который вводят по 5'-концу последовательности, кодирующей тяжелую цепь иммуноглобулина у pC148.

Легкую цепь с пататиновым сигнальным пептидом помещают под контроль пластоцианинового промотора и терминаторной последовательности, как в патенте WO01/25455.

>последовательность зрелой легкой цепи ритуксимаба (оптимизированного для табака), как у C148

5'-конец последовательности, кодирующей легкую цепь иммуноглобулина у pC148, связан с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17, которая кодирует пататиновый сигнальный пептид, где применимость кодона была оптимизирована для экспрессии у табака.

atggccactactaagtccttccttatcctcttcttcatgatccttgctactacttcttctacatgtgct (SEQ ID NO: 17)

Обе кассеты экспрессии клонируют в части Т-ДНК pC100, как описано в примере 2, для генерации pC148. pCambia-2300 (GenBank: AF234315,1; Hajdukiewicz et al., 1994. Plant. Mol. Biol. 25: 989-994) амплифицируют посредством ПЦР, с использованием праймеров PC201F (5'-AGAAGGCCTTCCGGGACGGCGTCAG-3'; SEQ ID NO: 6) и PC202R (5'-ATGGCGCGCCCCCCTCGGGATCA-3'; SEQ ID NO: 7), что приводит в результате к уникальным сайтам расщепления StuI и AscI эндонуклеазы рестрикции. Фрагмент pCambia-2300 лигируют с фрагментом StuI/AscI из pC148, содержащим кассету экспрессии ритуксимаба для генерации pCambia-Ритуксимаб.

Изобретение предусматривает векторы в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления и, как описано выше, содержащие, в области Т-ДНК и функционально связанную с растительным регуляторным элементом, нуклеотидную последовательность, кодирующую зрелую тяжелую цепь иммуноглобулина, который связывается с человеческими CD20, проявляющую, по меньшей мере, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 99,5% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 18.

Изобретение также предусматривает векторы в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления и, как описано выше, содержащие, в области Т-ДНК и функционально связанную с растительным регуляторным элементом, нуклеотидную последовательность, кодирующую эрелую легкую цепь иммуноглобулина, который связывается с человеческими CD20, проявляющую, по меньшей мере, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% или 99,5% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 20.

Инфильтрация растений Nicotiana benthamiana. Все бинарные векторы, используемые в данном исследовании вводят в Agrobacterium tumefaciens AGL1. Бактерии выращивают в YEB-среде, содержащей 2 г/л говяжьего экстракта, 0,4 г/л дрожжевого экстракта, 2 г/л Бакто-Пептона, 2 г/л сахарозы, 0,1 г/л MgSO₄ и необходимые антибиотики для селекции соответствующего штамм Agrobacterium и бинарного вектора, в колбе Эрленмейера при 28°C и 250 об/мин на ротационном шейкере до OD₆₀₀>1,6. Культуру затем разбавляют 1:100 в свежей среде LB Broth Miller, содержащей 10 мМ MES и подходящие антибиотики, и дополнительно растят при 28°C и 250 об/мин на ротационном шейкере до OD₆₀₀>2. После выращивания, бактерии собирают центрифугированием при 8000g и 4°C в течение 15 мин. Сгустки бактерий ресуспендируют в растворе для инфильтрации до OD₆₀₀>2. Растения Nicotiana benthamiana co-инфильтруют клетками штамма AGL1 Agrobacterium tumefaciens, одними, содержащими (i) экспрессируемый супрессор сайленсинга генов p19 вируса кустистой карликовости томата (TBSV) (Swiss-Prot P50625); и другими (ii) pC148 или pCambia-Ритуксимаб, при соотношении 1:1 и конечной OD₆₀₀=0,3. Кодирующая последовательность для TBSV супрессора сайленсинга генов p19 находится под контролем двойного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты и терминаторной последовательности в pBin19 (Bevan MW (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721). Вакуумную инфильтрацию, сбор и отбор образцов материала осуществляют, как описано в примере 1, за исключением того, что экстракционный буфер содержит 50 мМ Tris (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 4M мочевины и 2 мМ DTT. Экспрессию моноклональных антител ритуксимаб количественно оценивают в растворимых экстрактах посредством ELISA. Микротитровальные планшеты (Immulon 2HB, Thermofisher) покрывают в течение ночи при 4°C антителами захвата (специфичная тяжелая цепь козьих против-мышиных IgG1 Sigma, #M8770) при концентрации 2,5 мкг/мл. Стандартную кривую (4-80 нг/мл) получают, используя мышиный IgG1 контрольный белок (Bethyl, #MI10-102) в экстракте-имитаторе (полученном из листового материала, инфильтрованного только бактериальной суспензией с супрессором сайленсинга генов p19). Растворимые экстракты разбавляют 1:1000 в буфере для разведения (50 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100), и стандарты и образцы загружают в трех параллельных опытах и инкубируют в течение 1 часа при 37°C. Антитела для обнаружения представляют собой конъюгированные с пероксидазой козьи Fc-специфичные против-мышиного IgG от Jackson ImmunoResearch (#115-035-205), которые применяют при разведении 1:40000 и инкубируют в течение 1 часа при 37°C. Общий растворимый белок в экстрактах определяют с использованием аналитического реагента Кумасси-Плюс от Pierce (#24236). Результаты шести экспериментов для каждой из комбинаций, pC148 с супрессором сайленсинга генов p19 и pCambia-Ритуксимаб с супрессором сайленсинга генов p19, показывают, что средняя экспрессия ритуксимаба в листьях Nicotiana benthamiana составляет 136,30 мг/кг свежей массы (СМ) листьев для pC148 по сравнению с 122,60 мг/кг СМ для pCambia-Ритуксимаб.

Пример 10: Транзиторная экспрессия частиц, подобных вирусу гриппа H5 у табака

Генные конструкции. Ген, кодирующий супрессор сайленсинга генов HcPro вируса гравировки табака (TEV) изолята TEV7DA (GenBank: DQ986288.1), клонируют в уникальном EcoRI сайте pC100 для генерации pC120. Кодирующая последовательность находится под контролем двойного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, 5'-нетранслируемой области TEV7DA и нопалинсинтазной терминаторной последовательности, сегмента 4 гемагглютинина вируса H5N1 (GenBank: EF541394.1), содержащего кодирующую последовательность для зрелого гемагглютинина H5, клонируют под контролем минимального промотора 35 вируса мозаики цветной капусты, 5'- и 3'-нетранслированных областей HT-CPMV и нопалинсинтазной терминаторной последовательности в уникальном EcoRI сайте pPMP1 (см. пример 2), что приводит к pC229.

Инфильтрация растений Nicotiana tabacum и подготовка образцов. Все генные конструкции вводят в Agrobacterium tumefaciens AGL1. Растения Nicotiana tabacum выращивают в теплице в блоках из минеральной ваты при 20-часовом световом периоде, 4-часовом ночном периоде, дневной/ночной температуре 26°C/20°C и 70%/50% дневной/ночной относительной влажности. Бактерии выращивают, как описано в примере 9, до конечной OD₆₀₀, равной 3,5. Культуры Agrobacterium, содержащие генную конструкцию pC229 и конструкцию супрессора сайленсинга генов pC120 смешивают при соотношении 3:1 и разбавляют до OD₆₀₀=0,8 в растворе для инфильтрации. Растения инфильтруют посредством уменьшения давления воздуха до 900 мбар ниже атмосфернго давления в пределах 15 с, с временем выдерживания 60 с, с последующим возвратом к атмосферному давлению за приблизительно 2 с. Листья инфильтрованных растений собирают от 10 растений через 5 дней после инфильтрации и гомогенизируют, используя шнековый пресс (Green Star Corrupad, GS 1000, Korea Co.). Метабисульфит натрия добавляют до конечной концентрации 10 мМ, чтобы снизить окисление образца. pH экстракта регулируют до pH 5,3 и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 20-30 мин без перемешивания. Celpure P300 (Sigma-Aldrich) (10%) затем добавляют к экстракту, и смешивают в течение 1 минуты. Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу Whatman, предварительно покрытую Celpure P300 (10% взвеси Celpure P300 в 10 мМ метабисульфита натрия). Для ультрацентрифугирования, три порции сахарозы готовят в ультрацентрифужных пробирках следующим образом: 1) 3 мл 80% сахарозы; 2) по 1,5 мл каждого раствора из 60 и 45% сахарозы; и 3) 1 мл каждого раствора из 60, 45 и 35% сахарозы. Осветленные и отфильтрованные образцы экстракта (до 13 мл) осторожно помещают на верхнюю часть градиентов сахарозы и подвергают ультрацентрифугированию в роторе типа качающегося ковша (Sorvall Surespin 630; Kendro) при 24000 об/мин в течение 1 часа при 4°C (135000 RCFmax). Образцы концентрированной сахарозы подвергают префильтрации, используя фильтр 0,45 мкм и подвергают гель-проникающей хроматографии (ГПХ) в изократических условиях на автоматизированной хроматографической системе AKTA. Проходящим буфером является TBS, с pH 7,5 и размер образца равен 4 мл при скорости потока 1 мл/мин на колонке HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, 17-1069-01). Фракции, содержащие очищенный H5, объединяют и концентрируют до приблизительно 0,3 мг/мл с использованием мембранного устройства для ультрафильтрации с пределом 30кДа (Millipore) и дополнительно анализируют.

Гель-электрофорез и вестерн-блоттинг. Образцы объединенных фракций подвергают SDS-PAGE, вестерн-блоттингу и Blue Native-PAGE с использованием стандартных методов. SDS-PAGE представляет собой гель на 4-12% SDS-PAGE. В качестве контроля (Ctrl+) применяют доступный для приобретения рекомбинантный H5 (Immune Technology Corp., New York, cat. #IT-003-0052p). После разделения, белки окрашивают красителем для белка Imperial M (Pierce #24615). Для Вестерн-блоттинга, первичным антителом является кроличье антитело против-HA (H5N1 VN 1203/04 #IT 003-005V, Immune Technology Corp., New York). Для обнаружения, применяют FC-фрагмент HRP-меченных affiniPure козьих-против-кроличьих IgG (Jackson Laboratories, # 111-035-046). Обнаружение проводят посредством хемилюминесценции, с использованием хемилюминесцентного набора Immuno-star HRP (BIO-RAD Laboratory, 170-5040). Результаты получают, используя Chimio-Capt 3000, и они показывают присутствие H5 в экстрактах растений, инфильтрованных генной конструкцией pC229. Молекулярная масса является аналогичной массе промышленно выпускаемого рекомбинантного H5. Нативный-PAGE осуществляют на 4-16% Bis-Tris предформованных полиакриламидных гелях (Novex, Invitrogen, USA). Для загрузки, образцы обрабатывают дигитонином в нативном буфере для образцов для электрофореза на полиакриламидном геле (PAGE) и инкубируют в течение 1 ч при 4°C. В последующем, образец добавки Native-PAGE G-250 (Novex, Invitrogen, USA) добавляют до конечной концентрации, равной 0,5% и образцы загружают и прогоняют на 4-16% Bis-Tris PAGE геле. Гели прогоняют при 4°C при постоянном напряжении 150В в течение первых 60 мин. Далее, напряжение увеличивают до 250В в течение еще 30 мин и гели окрашивают красителем для белков Imperial M. Результаты нативного-PAGE и Вестерн-блоттинга показывают успешную экспрессию H5 после транзиторной экспрессии у табака.

Гемагглютинирование. Природный тримерный гемагглютинин (HA), такой как белок H5, обладает способностью связываться с моносахаридной сиаловой кислотой, которая присутствует на поверхности эритроцитов (красных кровяных клеток). Это свойство, известное как гемагглютинация является базисом быстрого аналитического теста, и применяется здесь для определения биологической активности рекомбинантного белка. Гемагглютинирующую активность продуцируемого табаком H5 измеряют посредством инкубации 1,5-кратных серийных разведений растительного экстракта, а также экстракта, очищенного посредством гель-фильтрации (эксклюзионной по размерам хроматографии) в 96-луночном планшете с конкретным количеством красных кровяных клеток. Красные кровяные клетки, не связанные с H5, оседают на дно лунки и образуют преципитат. Важно отметить, что только H5, правильно собранный в виде гомо-тримера будет связывать эритроциты. Гемагглютинирующую активность наблюдают в экстрактах табачных растений, инфильтрованных генной конструкцией pC229, а также фракциями pC229, обогащенными посредством гель-фильтрации.

Пример 11: Оптимизация плотности инокулята для трансфекции в табак

Следующие эксперименты описывают оптимизацию способов изобретения. Анализируют три фактора: (i) конечную концентрацию бактерий в инокуляте (в интервале от 0,05 до 0,85), (ii) соотношение конструкции, представляющей интерес (COI), и супрессора сайленсинга SoS, то есть COI:SoS (в интервале от 3,00 до 0,33); (iii) и разновидности табака, используемые при экспрессии (N. tabacum Берли 21, PM132 и PM204). Уровень экспрессии TurboGFP в инфильтрованных листьях измеряют через 6 дней после инфильтрации (DPI). В эксперименте используют дизайн контурированного центрального композита с 4 центральными точками (OD₆₀₀=0,45, отношение COI:SoS=1,67:1) и 3 повторами для всего 48 прохождений. В качестве контролей, три неинфильтрованных растения каждой разновидности выращивают при таком же расположении и условиях, как и инфильтрованные растения.

Получение инокулята. Две культуры Agrobacterium AGL1, несущие кассеты экспрессии для репортерного гена tGFP (A91) в качестве COI, и супрессор сайленсинга HcPro (A120) в качестве SoS выращивают в "не содержащей животных" LB Miller (10 г/л NaCl + 10 г/л растительного триптона + 5 г/л дрожжевого экстракта), дополненной карбенициллином и канамицином, до конечной оптической плотности (OD₆₀₀), равной 2,0. Бактерии собирают центрифугированием и ресуспендируют в растворе для инфильтрации, как описано выше. В день инфильтрации, концентрированные инокуляты A91 и A120 смешивают вместе при трех различных соотношениях, 3:1, 1,67:1 и 1:3 и разбавляют в растворе для инфильтрации до конечной OD₆₀₀, равной 0,85 в каждом случае. Три инокулята уравновешивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Три инокулята при OD₆₀₀=0,85 дополнительно последовательно разбавляют до OD₆₀₀=0,45 и 0,05 в растворе для инфильтрации для оценки эффектов использования более низких бактериальных плотностей.

Опосредованная Agrobacterium инфильтрация и сбор биомассы. Табачные растения инфильтруют, инкубируют и собирают, как описано в примере 1. Экстракцию и количественную оценку tGFP осуществляют, как описано в примере 3. Стандартную кривую получают посредством добавления контрольного белка TurboGFP (Evrogen) в интервале концентраций от 4000 до 125 нг/мл к неинфильтрованному экстракту, разбавленному до конечного значения 1:50 в экстракционном буфере.

Результаты. Чтобы определить влияют ли OD₆₀₀ и COI:SoS у Agrobacterium на уровни экспрессии tGFP у разновидностей N. tabacum, осуществляют ограниченный ряд экспериментов, в которых оба фактора изменяются одновременно. Табачные растения разновидностей Берли 21, PM132 и PM204 инфильтруют A91 и A120 при OD₆₀₀, равной 0,85, 0,45 и 0,05 и при отношениях COI:SoS, равных 3,00, 1,67 и 0,33. Как ожидалось из предыдущих экспериментов, стрессовый ответ на агроинфильтрацию, такой как пожелтение листьев, наблюдают при 6 DPI у трех тестируемых разновидностей табака. Симпиомы усиливались вместе с бактериальной плотностью в инокуляте. Разновидность Берли 21 проявляла более выраженное пожелтение листьев даже при самой низкой плотности. Небольшие некротические повреждения являются видимыми на листьях PM132 и PM204, инфильтрованных инокулятом при OD₆₀₀=0,85, но являются наиболее ограниченными к базальной части листьев. Стрессовые симптомы обусловлены, в основном, плотностью инокулята никакого явного эффекта отношения COI:SoS не наблюдают.

Далее, применяют регрессионную модель, которая является надежной для всех трех разновидностей табака, для интерполяции экспрессии tGFP экспрессии внутри экспериментального пространства. Показано, что результаты являются статистически достоверными. Несмотря на наблюдаемые симптомы, флуориметрическая количественная оценка TurboGFP не показывает отрицательной корреляции между стрессовым ответом растения на возрастающую оптическую плотность и уровни экспрессии в пределах тестируемого интервала. Листья, которые проявляют сильное пожелтение или даже некротические повреждения при высоких OD, все еще экспрессируют более высокие уровни tGFP, чем при низкой OD. Предсказанный ответ на плотность инокулята и отношение COI:SoS является сходным для всех трех разновидностей табака и для всех трех максимальная экспрессия может быть достигнута при высоких оптических плотностях Agrobacterium в инокуляте и высоком отношении COI:SoS (фиг.5), подтверждая, что оба фактора влияют на транзиторную рекомбинантную экспрессию белка. Наивысшие уровни экспрессии наблюдали для PM132 и PM204 (фиг.5B и C).

Оптимальные параметры, которые идентифицируют для каждой из трех разновидностей, составляют: OD₆₀₀=0,69; COI:SoS=2,40 для Берли 21, OD₆₀₀=0,7428; COI:SoS=2,8058 для PM132 и OD₆₀₀=0,6729; COI:SoS=2,0805 для PM204. При этих параметрах продуцировалось 215, 698 и 603 мг tGFP на кг замороженной массы, соответственно. Однако, предсказанные оптимальные значения для PM132 находятся почти за границей условий, выбранных для данного эксперимента (фиг.5B). Следовательно, второй эксперимент осуществляют, используя конечную OD₆₀₀ инокулята в интервале от 0,6 до 1,2 и отношение COI:SoS в интервале от 2,0 до 4,5. В этом случае воспроизводимость модели является низкой, означая, что существует большая чистая ошибка с высоким шумом, указывая тем не менее на существование плато вокруг оптимума, предсказанного в первом эксперименте.

С использованием ANOVA с методикой общей линейной модели для сравнения всех возможных пар значений уровня, наилучшей модели включавшей взаимодействия, тест указывает на то, что уровень экспрессии tGFP у PM132 является значительно более высоким, чем уровни у Берли 21 и PM204.

Перед оптимизацией, используемые стандартные условия составляют OD₆₀₀=0,32 и отношение COI:SoS=1,00. В 2,0-2,5 раза более высокая рекомбинантная экспрессия белка достигается посредством увеличения как концентрации клеток Agrobacterium в инокуляте, так и отношения конструкции, представляющей интерес к супрессору сайленсинга.

Пример 12: Улучшенное масштабирование получения инокулята для опосредованной Agrobacterium транзиторной экспрессии.

Растительный материал. Регулярные загрузки растений N. tabacum Берли 21, PM132 и PM204 выращивают при 35 растений/м² в отделении А теплицы в блоках из минеральной ваты при 20-часовом световом периоде, 26°C/20°C дневной/ночной температуре и 70%/50% дневной/ночной относительной влажности. Растения подвергают удобрительныму орошению посредством подповерхностного орошения.

Получение инокулята Agrobacterium. Культуры Agrobacterium штамма AGL1, несущие кассеты экспрессии для либо репортерного гена tGFP (A91) или супрессора сайленсинга HcPro (A120), выращивают в "не содержащей животных" LB Miller (10 г/л NaCl + 10 г/л растительного триптона + 5 г/л дрожжевого экстракта), дополненной карбенициллином и канамицином, до конечной OD₆₀₀>2,0 (если не установлено иначе). В зависимости от условий тестирования, как описано ниже, бактерии либо собирают центрифугированием и ресуспендируют в растворе для инфильтрации до OD₆₀₀>2,0 или бактерии содержат в культуральной среде для генерации концентрированных инокулятов. В день инфильтрации, концентрированные инокуляты A91 и A120 смешивают при соотношении 1:1, разбавляют в растворе для инфильтрации до конечной OD₆₀₀, равной 0,32, и уравновешивают в течение 30 минут до комнатной температуры.

Определение содержания общего растворимого белка. Содержание общего растворимого белка (TSP) в экстрактах определяют с использованием аналитического реагента Кумасси-Плюс (Pierce) посредством измерения поглощения на считывающем устройстве для микропланшетов при 595 нм. Экстракты разбавляют 1:20 в сверхчистой воде и 10 мкл загружают в трех параллельных опытах на плоскодонный микропланшет.

Результаты. Во-первых, исследуют возможность получения конечного инокулята посредством непосредственного разбавления культур Agrobacterium в растворе для инфильтрации. Как показано на фиг.6, транзиторная экспрессия tGFP у инфильтрованного табака Берли 21, PM132 и PM204 не находится под воздействием исключения стадии центрифугирования/ресуспендирования. Кроме того, растения PM132 и PM204, инфильтрованные инокулятом, полученным непосредственно из жидких культур, приводили даже к значительно более высокой экспрессии tGFP. Примечательно, что уровни экспрессии у PM132 и PM204 являются сходными при обоих условиях, и, таким образом, дальнейшие эксперименты осуществляют, используя только PM132.

После центрифугирования и ресуспендирования в непитательном инфильтрационном растворе, инокуляты обычно хранят до шести дней при 4°C без какого-либо существенного изменения в эффективности трансфекции и уровней транзиторной экспрессии. Кроме того, исключение стадий центрифугирования и ресуспендирования поднимает вопросы условий хранения и временного периода хранения. Считается общепринятым, что клетки Agrobacterium, сохраняемые в среде LB, по существу остаются в богатом питательном окружении, которое может продолжать способствовать бактериальному росту и, в результате, приводить к деградации культуры. На следующей стадии тестируют стабильность при хранении нецентрифугированного инокулята. Концентрированные культуры A91 (tGFP) и A120 (SoS) при OD₆₀₀>2,0 хранят в течение от 5 до 0 дней при 4°C и разбавляют незадолго перед инфильтрацией. Инокулят, полученный из центрифугированных культур, применяют в качестве положительного контроля. Количественная оценка уровней tGFP через 6 дней после инфильтрации указывает на то, что нецентрифугированный инокулят является стабильным в течение 5 дней при 4°C без какого-либо изменения эффективности экспрессии по сравнению с инокулятом, хранимым в течение 1 дня. Неожиданно, применение инокулята, полученного из свежих культур, приводил к более низкой экспрессии tGFP, когда ее сравнивают с культурами, которые хранили, предполагая, что короткое время хранения при 4°C является необходимым для индукции вирулентности Agrobacterium и оптимальной трансфекции. Эти результаты также подтверждают, что нецентрифугированный инокулят является значительно и неожиданно более эффективным, чем центрифугированный инокулят при продуцировании более высоких уровней рекомбинантного белка.

Бактериальный рост в жидкой культуре характеризуется четырьмя последовательными фазами: лаг-, лог-, стационарной фазами и фазой смерти. Во время лог-фазы, бактерии являются метаболически активными и растут быстро до того, как они достигают стационарной фазы, где один или более питательный компонент в среде исчерпывается и ограничивает дальнейший рост. Для успешной трансформации, бактерии обычно собирают в период от ранней- до мид-лог-фазы. Осуществляют пилотные эксперименты, целью которых является определение кривой роста штамма AGL1 Agrobacterium. Данные показывают, что лог-фаза происходит между OD₆₀₀=0,3 и OD₆₀₀=3,8-4,0, перед вступлением в стационарную фазу. Чтобы снизить объем культуры, необходимый при получении конечного инокулята, тестируют, может ли применение культур, выращенных до поздней лог-фазы, т.е. при более высоких плотностях, оказывать воздействие на уровни экспрессии у табака. Табачные растения PM132 инфильтруют инокулятом, полученным из культур, выращенных до либо обычной OD₆₀₀, равной 2,0, или до OD₆₀₀, равной 3,8, и непосредственно разбавленных в растворе для инфильтрации. Примечательно, что анализ уровней tGFP через 6 дней после инфильтрации указывает на то, что на транзиторную экспрессию не оказывает воздействия использование культур на поздней лог-фазе для получения инокулята.

Совместно, эти данные демонстрируют, что масштабирование с увеличением получения инокулята для транзиторной опосредованной Agrobacterium трансформации табака может быть значительно облегчено, без оказания воздействия на транзиторную экспрессию рекомбинантного белка, посредством применения культур при высоких плотностях клеток (до OD₆₀₀=3,8), а также посредством исключения стадий центрифугирования и ресуспендирования, при получении инокулята.

Пример 13: Увеличенная экспрессия рекомбинантных белков посредством инкубации инфильтрованных табачных растений в перевернутом положении.

Данный пример описывает неожиданное открытие того, что инкубация инфильтрованного табачного растения в перевернутом положении приводит к увеличенной экспрессии рекомбинантного белка. Открытие было сделано во время поиска решения проблемы, состоящей в том, что инфильтрованные табачные растения, особенно, когда их инкубируют при высокой густоте в теплице, имеют склонность полегать, поскольку не могут выдерживать массу инфильтрованных листьев. Предоставленное решение состоит в инкубации инфильтрованных растений в перевернутом положении. Примечательно, что инкубация перевернутых инфильтрованных растений приводила к значительному увеличению продуцирования рекомбинантного белка в сравнении с табачными растениями, инкубированными в нормальном вертикальном положении.

Табачные растения подвергают вакуум-инфильтрации клетками штамма AGL1 Agrobacterium, несущими либо плазмиды pC91, которые содержат кассету экспрессии tGFP или pC71, которая содержит кассету экспрессии H5, как описано выше. Все табачные растения также co-инфильтруют pC120, которая содержит экспрессируемый супрессор сайленсинга генов HcPro, как описано выше.

Растения и инфильтрация. Растения N. tabacum PM132 в возрасте от пяти до шести недель, выращенные в минеральной вате и все имеющие приблизительно 28 см по высоте, подвергают вакуум-инфильтрации, как описано прежде, клетками штамма AGL1 Agrobacterium, несущими либо плазмиды pC91, которые содержат кассету экспрессии tGFP или pC71, которая содержит кассету экспрессии H5, как описано выше. Все табачные растения также co-инфильтруют pC120, которая содержит экспрессируемый супрессор сайленсинга генов HcPro, как описано выше. Сразу же после инфильтрации, инфильтрованные растения инкубируют в перевернутом положении, в то время как освещение предоставляется из положения выше растений в теплице. Через 4 и 6 дней после инфильтрации, 4 растения из каждой группы обработки собирают, и три листовых диска на растение применяют для измерения экспрессии tGFP. Листовые диски замораживают жидким азотом и измельчают до тонкодисперсного порошка в пробирке Эппендорфа объемом 2 мл, а экстракцию tGFP осуществляют, как описано выше. Для количественной оценки экспрессии tGFP, 5 мкл каждого из экстрактов разбавляют до 200 мкл, и флуоресценцию измеряют, как описано. Проводят три параллельных эксперимента.

Результаты. Растения не проявляют симптомов водного стресса. Через несколько дней после подвешивания растений в перевернутом положении, стебли растений изгибаются по направлению к свету, который подается из положения выше сверху, образуя крюкообразную структуру. Из фиг.7 можно видеть, что экспрессия и флуоресценция tGFP в среднем являются в два раза выше, для растений, инкубируемых в перевернутом положении (то есть, верхом вниз), по сравнению с обычно обработанными растениями, которые инкубируют в вертикальном положении (фиг.7).

Пример 14. Усиленная экспрессия tGFP и H5 посредством увеличения густоты роста табачных растений перед инфильтрацией

Данный пример описывает неожиданный эффект выращивания табачных растений перед инфильтрацией при высокой густоте на экспрессию tGFP и рекомбинантного H5. Эксперимент показывает, что две разновидности табака PM132 и PM217, когда их выращивают при высокой густоте перед инфильтрацией, выраженно продуцируют приблизительно на 40% больше tGFP и на 70% больше рекомбинантного H5, в расчете от массы инфильтрованной биомассы, относительно растений, выращенных при более низкой густоте, когда их инкубируют при нормальных вертикальных условиях.

Растения и инфильтрации. Для исследования эффектов выращивания табака при различной густоте посадки, растения Nicotiana tabacum PM132 и PM217 выращивают при двух значениях густоты: 25 и 100 растений на квадратный метр. На день 46 после посева, растения подвергают вакуум-инфильтрации с помощью штамма AGL1 A. tumefaciens, содержащего либо pC91, содержащую кассету экспрессии tGFP, или pC71, содержащую кассету экспрессии H5, и каждого из них вместе с штаммом AGL1 A. tumefaciens, содержащим pC120, содержащую супрессор сайленсинга генов HcPro, как описано прежде. Конечная OD₆₀₀, используемая при инфильтрации, равна 0,32. Для растений, выращенных при обоих значениях густоты, среднюю высоту растения, диаметр устьица, содержание хлорофилла, толщину листа и содержание воды измеряют перед инфильтрацией. Как можно видеть из таблицы 3, растения, выращенные при высоких значениях гусоты, являются крупнее, имеют меньше хлорофилла и более тонкме листья, но диаметр устьица является таким же. Для PM132, содержание воды является таким же для растений, выращенных при низкой или высокой густоте, но для PM217, содержание воды является намного более низким, при выращивании при низкой густоте. После инфильтрации, половину растений инкубируют в вертикальном положении или перевернутыми (верхней частью вниз). Измерения осуществляют на всего 9 (девяти) растениях на обработку, распространенных на три параллельных повтора для каждого из 3 растений.

Результаты. Листья собирают через 5 дней после инфильтрации, получают экстракт, и анализ экспрессии tGFP осуществляют, как описано выше. Экстракт разбавляют 1:1 в буфере GFP и 5 мкл смешивают с 200 мкл буфера GFP для количественной оценки флуоресценции. Экспрессию рекомбинантного H5 количественно оценивают посредством ELISA. Результаты представлены в обобщенном виде в таблице 4.

Как можно видеть из таблицы 4, экспрессия tGFP в мг/кг свежей массы листовой биомассы для обеих разновидностей, когда инкубацию проводят в нормальном вертикальном положении, составляет в среднем на 41% выше для растений, выращенных при высокой густоте перед инфильтрацией, при сравнении с растениями, выращенными при низкой густоте. Аналогичные результаты получают для H5, для которого показано среднее увеличение экспрессии на 21-40% при выращивании при высокой густоте, при сравнении с растениями, выращенными при низкой густоте и инкубированными в нормальном вертикальном положении после инфильтрации. Для исследования эффектов перевернутой инкубации на экспрессию tGFP и H5, половину инфильтрованных растений инкубируют в перевернутом положении после инфильтрации. Как можно видеть из таблицы 4, происходит значительное увеличение экспрессии как tGFP, так и H5 для растений, инкубированных в перевернутом положении и выращенных при низкой густоте, но значительно меньшее увеличение экспрессии для растений, выращенных при высокой густоте перед инфильтрацией. Для растений PM132, выращенных при низкой густоте в перевернутом положении, это приводит к увеличению на 40% для tGFP и 71% для H5. Для растений, выращенных при высокой густоте перед инфильтрацией, увеличение составляет только 3% для tGFP и 7% для H5, по сравнению с растениями, инкубированными в нормальном вертикальном положении. Устанавливают общий растворимый белок (TSP), и экспрессию tGFP и H5 оценивают относительно TSP. Экспрессия tGFP и H5 всегда является более высокой для растений, выращенных при высокой густоте и инкубированных в перевернутом положении. В вертикальном положении, растения, выращенные при низкой густоте, имели увеличение экспрессии tGFP, равное приблизительно 1,5%. Для растений, выращенных при высокой густоте, увеличение составляет приблизительно 13,6%. Для H5 увеличение выхода для растений, инкубированных в вертикальном положении и выращенных при низкой густоте перед инфильтрацией, равно 0,25%, в то время как увеличение выхода для растений, выращенных при высокой густоте, составляет 0,37%. Как для tGFP, так и H5, инкубация в перевернутом положении приводила в результате к увеличению экспрессии (измеренной, как процентное содержание TSP). Для растений, выращенных при низкой густоте, инкубация в перевернутом положении приводила к увеличению биомассы на 40-60%. Для растений, выращенных при высокой густоте, инкубация в перевернутом положении приводила к увеличению на 20%. Для tGFP наивысший выход белка составляет 16,2%, и его получают, когда растения выращивают при высокой густоте перед инфильтрацией и инкубируют в перевернутом положении. Данный факт представлял увеличение на 54% выхода белка, с точки зрения % TSP, по сравнению с растениями, выращенными при низкой густоте и инкубированными в нормальном вертикальном положении (10,5% от TSP).

Чтобы оценить, могло ли сниженное попадание света на верхнюю поверхность листьев растений, выращенных при высокой густоте и инкубированных в перевернутом положении, вызвать увеличенную экспрессию, растения, инфильтрованные с использованием экспрессионного вектора tGFP, инкубируют в условиях полной темноты. Примечательно, что данные указывают на то, что инкубация в полной темноте оказывает вредное влияние на экспрессию tGFP. Как можно видеть из фиг.18, растения, инкубированные в темноте, продуцировали, в среднем, на 45% меньше tGFP по сравнению с растениями, выращенными на свету.

Дополнительные эксперименты проводили, чтобы исследовать эффект трех более высоких значений густоты выращивания, 122, 529 и 961 растений на м²на продуцирование биомассы у PM132. Эксперименты осуществляли при полностью рандомизированном блок-дизайне с пятью повторами. Субстрат для роста представлял собой блоки из минеральной ваты, с размерами 30 см × 30см × 7см, и деревянный колышек был изготовлен в соответствии с густотой растений. Колышки были вдавлены в блоки для создания небольших торфяных ямок, приблизительно 5 мм глубиной. Рассаду переносили в блоки вручную. Полная площадь, равная 30 см × 30 см блока содержала растения, пространственно разделенные для достижения желательной густоты, но во время инфильтрации, только растения расположенные в средней области 15 см ×15 см были инфильтрованы. Это практическое воплощение обеспечивало образование границ вокруг средней области для исключения каких-либо пограничных эффектов. Перед инфильтрацией, пограничные растения выдергивали и отбрасывали. Инфильтрации осуществляли на растениях при двух стадиях развития, при высотах растения, равных 25 см и 35 см. Инфильтрованные растения инкубировали в теплице в течение 5 дней в нормальном или перевернутом положении.

Инокулят получали, как описано выше, за исключением того, что отношение культуры AGL1, несущей кассету экспрессии TurboGFP, к культуре AGL1, несущей HcPro, составляло 3:1, и конечное OD₆₀₀ было равно 0,8. Растения инфильтровали под давлением 50 мбар, которого достигали в пределах 1 минут 45 секунд и сбрасывали быстро в течение 1,5 секунд.

Через пять дней после инфильтрации, были проведены измерения общей биомассы, свежей массы листьев и стеблей, толщины листьев и другие измерения биомассы. Цельные растительные материалы, включающие стебли, быстро замораживали в сухом льду и хранили при -80°C.

Характеристики биомассы табачных растений, высаженных при 122, 529 и 961 растений на м², указывают на то, что в этих интервалах густоты растений не наблюдают никаких значительных различий по средней массе растений, % листовой биомассы и толщине листьев. Однако, происходит снижение массы индивидуальных растений при увеличении густоты, даже если % листовой биомассы остается относительно постоянным. Возрастание биомассы на единицу площади выращивания наблюдали при двух временных отметках при густоте, равной 529 растений/м². Максимальный выход, равный приблизительно 5 кг свежей листовой массы на м² или 10 кг общей биомассы на м², получали, когда растения подвергали инфильтрации при их высоте, равной от 35 до 45 см, и их высаживали при 529 растениях/на м². Выход TurboGFP на единицу площади получали посредством умножения концентрации TurboGFP в биомассе на рассчитанные значения выходов биомассы на квадратный метр. Самый высокий выход TurboGFP на единицу площади был получен при густоте, равной 529 растениям/на м². Дальнейшее увеличение густоты посадки до 961 растений на м² имело отрицательное воздействие на выход рекомбинантного белка.

Пример 15. Усиленная рекомбинантная экспрессия белка посредством инкубации в условиях короткого дня после инфильтрации

Данный пример описывает результат эксперимента, в котором табачные растения инкубируют в условиях короткого дня (8 ч света в день) и длинного дня (20 ч света в день) после инфильтрации. Эксперимент показывает, что для растений, инкубированных в нормальном вертикальном положении, а также в перевернутом положении, экспрессия tGFP значительно усиливается, когда растения содержат в условиях короткого дня после инфильтрации.

Растения и инфильтрации. Растения N.tabacum PM132 выращивают при плотности, равной 75 растениям на кв.м, 42-дневные растения инфильтруют со смесью двух штаммов AGL1 A.tumefaciens, содержащих pC91 (бинарный экспрессионный вектор tGFP) и pC120 (бинарный экспрессионный вектор супрессора сайленсинга генов HcPro) при соотношении 1:1 и конечной OD₆₀₀=0,32. Растения в среднем имели высоту 43,4 см и имели среднюю устьичную проводимость, равную 559,6 мкмоль м^-2с^-1, указывающую на адекватное устьичное раскрытие для поглощения инокулята (таблица 5). После инфильтрации, растения инкубируют в условиях двух различных световых циклов: 8 ч света в день или 20 ч света в день. Половину растений в условиях каждой световой обработки помещают в нормальное вертикальное положение, а другую половину помещают в перевернутое положение. Всего осуществляют 4 обработки. Растения собирают через 0, 3, 5, 7 и 9 дней после инфильтрации. Для каждого измерения, собирают 4 растения на обработку, и 3 листовых диска на растение отбирают для анализа экспрессии tGFP. Для количественной оценки tGFP листовые диски измельчают в 1 мл буфера GFP и 5 мкл экстракта смешивают с 20 мкл буфера GFP для измерения флуоресценции, как описано прежде.

Результаты. Количественная оценка экспрессии tGFP (мг tGFP/кг свежей массы биомассы) в условиях двух световых режимов после инфильтрации продемонстрировала значительные световые эффекты на продуцирование рекомбинантного белка (фиг.8). Независимо от положения растения (вертикального или перевернутого), растения, инкубированные в условиях короткого дня, продуцировали значительно более высокие количества tGFP, как можно видеть из фиг.8. На день 7 после инфильтрации, у растений, инкубированных при 8 ч света, экспрессия tGFP дает двойное количество по сравнению с растениями, инкубированными в условиях 20 ч света после инфильтрации.

На день 7 после инфильтрации, экспрессия tGFP у вертикальных растений в условиях 8 ч составляет 104%, что выше, чем экспрессия tGFP у аналогичных растений, инкубированных в условиях 20 ч светового режима. Для растений, инкубированных в перевернутом положении, тенденция является сходной с растениями в условиях 8 ч света, продуцирующими на 50% больше tGFP, чем растения, инкубированные в условиях 20 ч светового режима. Инкубация в перевернутом положении также усиливала экспрессию tGFP у растений, выращенных в условиях двух световых режимов (8 часов света и 20 часов света). Усиленная экспрессия является более выраженной при 20 часовом свете по сравнению с 8 часовой световой обработкой, и могла быть увеличена от 371,2 мг tGFP/кг свежей массы биомассы для растений, выращенных в нормальной вертикальном положении, и 20 ч света, до 857,5 мг tGFP/кг свежей массы биомассы для растений, инкубированных в перевернутом положении при 8 ч свете, которые представляют 130% увеличение выхода рекомбинантного белка.

Пример 16. Оптимизированная инфильтрация растений посредством Agrobacterium

Данный пример описывает результат эксперимента, в котором исследуют устьичную апертуру табачных растений перед инфильтрацией. Результат указывают на то, что перед инфильтрацией, табачные растения должны быть подвергнуты воздействию света таким образом, что устьичная проводимость находится в интервале, который является характеристикой табачного растения, выращенного в условиях хорошего освещения. Табачные растения выращивали при плотности, равной приблизительно 9 растениям/м², чтобы избежать любой конкуренции за свет или пространство. Экспериментальные блоки подвергали мониторингу ежедневно, чтобы обеспечивать однородное и устойчивое окружение выращивания. Орошающий раствор имел значение электропроводности (E.C), равное 2,4 и содержание азота, равное 206 мг/л, чтобы обеспечивать соответствующую подачу питательных компонентов. Режим орошения регулировали в соответствии с нуждами растений, чтобы избежать любого стресса, вызванного избыточным или недостаточным орошением.

Две разновидности, PM132 и PM15, растений N.tabacum с возрастом 39 дней трансформировали с использованием Agrobacterium (AgI1), содержащим кассету экспрессии, кодирующую TurboGFP (pC91) в комбинации с Agrobacterium (AgI1), экспрессирующим Hc-Pro, как описано выше. Экспрессией GFP управляли посредством минимального промотора CaMV35S плюс и 5'UTR вируса мозаики вигны китайской (HT-CPMV), в то время как экспрессией HC-Pro управляли посредством двойного промотора CaMV35S. Бактериальные концентрации в инфильтрационной смеси поддерживали при 0,16 для обработки одной конструкцией (GFP или Супрессор Сайленсинга (SoS)) и 0,32 для обработок двумя конструкциями (GFP+SoS). Растения подвергали инфильтрации при 50 мбар в течение 1 мин, следуя стандартным протоколам инфильтрации.

Перед инфильтрацией половину растений помещают в темное отделение, в то время как другую половину помещали внутри отделения с естественным светом, дополненным искусственным светом. В это время, устьичную проводимость регистрировали, используя порометр SC-1 (Decagon Devices, USA) в устойчивом состоянии. Измерения проводили у трех полностью вытянутых последовательных листьев в положениях 4, 5 и 6 (где 1 является первым листом при апикальном побеге, который является перпендикулярным по отношению к стеблю). Содержание воды в субстрате для выращивания (Rockwool) измеряли с помощью датчика WET-2 (Delta-T devices, USA).

Различия по устьичной проводимости были очень значительными между световой и темновой обработками для обеих разновидностей табака. Растения, содержащиеся на свету, показывали значения проводимости в 4-8 раз более высокие, чем растения, содержащиеся в темноте: растения PM132 на свету показывали среднее значение, равное 260,6 мкмоль м^-2с^-1, в то время как в темноте, равное 70,4 мкмоль м^-2с^-1. Аналогично, растения PM15 на свету показывали среднее значение, равное 440,1 мкмоль м^-2с^-1, в то время как в темноте, равное 53,6 мкмоль м^-2с^-1. Эти результаты указывают на то, что устьичная апертура у табака может регулироваться количеством света, даваемого растениям: в то время как содержание растений в условиях хорошего освещения стимулирует устьичное отверстие, снижение количества света значительно снижает устьичную апертуру (более низкая устьичная проводимость). Также заслуживает упоминания то, что различия в устьичной проводимости между разновидности табака также наблюдаются с PM15, проявляющим в 1,7 раза более высокую проводимость на свету, чем PM132. Соответственно, предпочтительно, чтобы перед инфильтрацией, устьичная проводимость PM132 находилась в интервале, который больше чем приблизительно 70 мкмоль м^-2с^-1, больше чем 100 мкмоль м^-2с^-1, больше чем 150 мкмоль м^-2с^-1, больше чем 200 мкмоль м^-2с^-1, больше чем 250 мкмоль м^-2с^-1 или больше чем 300 мкмоль м^-2с^-1.

Инфильтрованные листья замораживали и измельчали до порошка в сухом льде. GFP экстрагировали, и измеряли флуоресценцию. Для обеих разновидностей табака, содержание GFP было существенно выше для растений, инкубированных на свету, чем для растений, инкубированных в темноте. У PM132 инкубированные на свету растения показали на 40% большую флуоресценцию, чем растения, инкубированные в темноте. Для PM15 инкубированные на свету растения показали на 200% большую флуоресценцию, чем растения, инкубированные в темноте.

Данные показали, что устьице у табака быстро реагирует на изменения световых условий. Растения, помещенные в условия низкого света, показали в 4-8 раз меньшую устьичную проводимость, чем хорошо освещенные растения. Закрытость устьиц, вызываемая низким светом, отрицательно воздействует на эффективность вакуумной инфильтрации и, следовательно, снижает экспрессию GFP у табака. Растения, инкубированные в темноте, проявляли большие области неинфильтрованной листовой ткани и снижение экспрессии GFP на более, чем 50%, по сравнению с растениями, выращенными в условиях нормального освещения.

Пример 17. Инфильтрация табачных растений ферментами

Данный пример описывает результат эксперимента, в котором табачные растения, ранее инфильтрованные Agrobacterium, обрабатывают ферментами, которые разрушают или расщепляют стенку растительной клетки, чтобы способствовать экстракции и выделению гетерологичного белка. Табачные растения были инфильтрованы генной конструкцией pC71, содержащей кодирующую последовательность для H5, как описано выше, и инкубированы в условиях теплицы, которые обеспечивают транзиторную экспрессию и продуцирование H5. Получали водную смесь ферментов: 0,05% мацерозима, 0,4% целлюлозы, 0,066% дризелазы, 0,6M маннитола, 0,7 г/л 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) при pH 5,6. В одном образце ферментной смеси, добавляют глицин до концентрации, равной 15 г/л.

Ферментную смесь инъекционно вводили в нижнюю часть табачных листьев посредством шприца при объеме 0,3 мл на грамм листа. Для сравнения, тонкие отрезанные полоски листьев погружали в ту же смесь и инкубировали в ней. Листья инкубировали в течение 12 часов перед сбором и экстракцией H5. Вестерн-блоттинг с антителом против-H5 показал, что сходные количества H5 были получены с использованием ферментных смесей с глицином или без него. Эффективность экстракции посредством инфильтрации шприцем и посредством погружения отрезанных листьев была также аналогичной. Результаты показывают, что инфильтрация табачных листьев ферментами, расщепляющими клеточную стенку, может применяться, чтобы способствовать экстракции гетерологичного белка из табачных растений.

В то время как изобретение было детально описано в предшествующем описании, такое описание следует рассматривать как иллюстративное или примерное, а не ограничивающее. Следует понимать, что рядовым специалистом в области могут быть сделаны изменения и модификации в пределах объема и сущности следующей формулы изобретения. Разнообразные публикации и патенты цитируют на протяжении всего описания. Раскрытия каждого из этих публикаций и патентов включены посредством ссылки во всей полноте.

Таблицы

Таблица 1
Вид	Разновидность
N. tabacum	AA37-1
N. tabacum	B13P
N. tabacum	Xanthi (Mitchell-Mor)
N. tabacum	Bel-W3
N. tabacum	Samsun Holmes NN
N. tabacum	F4 от скрещивания BU21 x Hoja Parado, линия 97
N. tabacum	Burley 21
N. tabacum	PM016
N. tabacum	PM021
N. tabacum	K 149
N. tabacum	K 326
N. tabacum	K 346
N. tabacum	K 358
N. tabacum	K 394
N. tabacum	K 399
N. tabacum	K 730
N. tabacum	KY 10
N. tabacum	KY 14
N. tabacum	KY 160
N. tabacum	KY 17
N. tabacum	KY 8959
N. tabacum	KY 9
N. tabacum	KY 907
N. tabacum	MD 609
N. tabacum	McNair 373 (MN 373)
N. tabacum	NC 2000
N. tabacum	PG 01
N. tabacum	PG 04
N. tabacum	PO 1
N. tabacum	PO 2
N. tabacum	PO 3
N. tabacum	RG 11
N. tabacum	RG 17
N. tabacum	RG 8
N. tabacum	Speight G-28
N. tabacum	TN 86
N. tabacum	TN 90
N. tabacum	VA 509
N. tabacum	AS 44
N. tabacum	Banket A1
N. tabacum	Basma Drama B84/31
N. tabacum	Basma I Zichna ZP4/B
N. tabacum	Basma Xanthi BX 2A
N. tabacum	Batek
N. tabacum	Besuki Jember
N, tabacum	C104
N. tabacum	Coker 319
N. tabacum	Coker 347
N. tabacum	Criollo Misionero
N. tabacum	PM092
N. tabacum	Delcrest
N. tabacum	Djebel 81
N. tabacum	DVH 405
N. tabacum	GalpSo Comum
N. tabacum	HB04P
N. tabacum	HICKS
N. tabacum	Kabakulak Elassona
N. tabacum	PM102
N. tabacum	Kutsaga 51E
N. tabacum	Kutsaga E1
N, tabacum	KY 14×L8
N. tabacum	KY 171
N. tabacum	LA BU 21
N. tabacum	McNair 944 (MN 944)
N. tabacum	NC 2326
N. tabacum	NC 71
N. tabacum	NC 297
N. tabacum	NC 3
N. tabacum	PVH 03
N. tabacum	PVH 09
N. tabacum	PVH 19
N. tabacum	PVH 2110
N. tabacum	Red Russian
N. tabacum	Samsun
N. tabacum	Saplak
N. tabacum	Simmaba
N. tabacum	Talgar 28
N. tabacum	PM132
N. tabacum	Wisliςa
N. tabacum	Yayaldag
N. tabacum	NC 4
N. tabacum	TR Madole
N. tabacum	Priiep HC-72
N. tabacum	Priiep P23
N. tabacum	Priiep PB 156/1
N. tabacum	Priiep P12-2/1
N. tabacum	Yaka JK-48
N. tabacum	Yaka JB 125/3
N. tabacum	TI-1068
N. tabacum	KDH-960
N. tabacum	TI-1070
N. tabacum	TW136
N. tabacum	PM204
N. tabacum	PM205
N. tabacum	Basma
N. tabacum	TKF 4028
N. tabacum	L8
N. tabacum	TKF 2002
N. tabacum	TN90 (GR141)
N. tabacum	Basma xanthi
N. tabacum	GR149
N. tabacum	GR153
N. tabacum	Petite Havana
N. tabacum	PM215
N. tabacum	PM216
N. tabacum	PM217
N. tabacum	Denizli
N. tabacum	Izmir
N tabacum	Coker 371 Gold
N. tabacum	Dae Mata Fina
N. tabacum	BY-64
N. tabacum	Kasturi Mawar
N. tabacum	Karabalgar
N. tabacum	Xanthi NN
N. tabacum	Samsun NN
N. tabacum	Turkish Samsun

Таблица 2
Обозначение	Экспрессия у 3-х растений	Фенотип инфильтрованных листьев	Фенотип контрольного растения
PM092	+++, +++, +++	от зеленого до светло-зеленого	зеленый
PO2	+++, +++, +++	зеленый	зеленый
PM016	+++, +++, +++	желтоватый	светло-зеленый
AS44	+++, +++, +++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
RG17	+++, +++, +++	желтоватый	зеленый
RG8	+++, +++, +++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
BY-64	+++, +++, +++	желтоватый	светло-зеленый
Coker 371 Gold	++/+++, ++, ++/+++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
HB04P	+++, +++, +++	желтоватый	зеленый
Basma Xanthi BX 2A	+++, +++, +++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
Coker 319	+++, +++, +++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
Hicks	+++, +++, +++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
Dae Mata Fina	+++, +++, +++	от зеленого до светло-зеленого	зеленый
McNair 944 (MN 944)	+++, +++, +++	светло-зеленый	зеленый
Burley 21	+++, ++, +++	желтоватый	светло-зеленый
K149	+++, ++, +++	светло-зеленый - желтоватый	светло-зеленый
Yaka JB 125/3	+++, ++, +++	зеленый	зеленый
PM102	+++, ++, +++	от зеленого до желтоватого	зеленый
NC297	++/+++, ++/+++, ++/+++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
PM021	++/+++, ++, ++/+++	светло-зеленый - желтоватый	зеленый
PO2	++/+++, ++, ++/+++	зеленый	зеленый
Kasturi Mawar	+++, ++, +++	от зеленого до желтоватого	зеленый
Wisliςa	++/+++, ++/+++, ++	светло-зеленый	зеленый
Simmaba	++, ++, ++/+++	светло-зеленый	зеленый
PM132	++, ++, ++	светло-зеленый	зеленый
AA37-1	++, ++, ++	желтоватый	зеленый, нижние листья желтые
Turkish Samsun	++, ++, ++	светло-зеленый	зеленый
B13P	++, ++, ++	желтоватый	зеленый
F4 от скрещивания BU21 × Hoja Parado, линия 97	++, ++, ++	желтоватый	светло-зеленый
PM204	++, ++, ++	от зеленого до светло-зеленого	зеленый
PO1	++, ++, ++	светло-зеленый	зеленый
Samsun NN	++, ++, ++	от зеленого до светло-зеленого	зеленый

Таблица 3
Характеристики биомассы
	Высота растения (см)		Устьичная проводимость (мкмоль м-2 с-1)		Содержание хлорофилла L4		Толщина листа (мм)		Содержание воды (%)
Плотность	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE
PM132
25	32,9	0,6	956,6	78,1	28,63	1,4	0,290	0,005	62,3	1,4
100	51,5	0,9	985,1	204,3	18,32	1,8	0,230	0,005	61,69	0,7
PM217
25	40,1	1,0	817,7	123,1	41,53	1,8	0,249	0,006	36,07	1,3
100	50,7	1,3	824,7	159,0	28,19	1,3	0,211	0,005	60,69	0,6

Таблица 4
Концентрация GFP и H5 мг/кг свежей массы листьев
	Вертикальное		Перевернутое			Вертикальное		Перевернутое
GFP	Среднее	SE	Среднее	SE	H5	Среднее	SE	Среднее	SE
PM132					PM132
25	343,4	15,5	482,4	19,0	25	19,5	5,4	33,4	2,4
100	483,0	63,9	499,8	60,1	100	27,1	2,8	29,0	3,8
PM217					PM217
25	314,8	29,3	441,8	10,7	25	20,5	3,4	28,9	1,2
100	449,4	36,5	439,7	25,7	100	24,8	1,0	29,9	1,2

Таблица 5
Характеристики растения
	Высота (см)		Устьичная проводимость (мкмоль м-2 с-1)		Содержание хлорофилла L4		Толщина листа (мм)		Содержание воды (%)
	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE	Среднее	SE
8 и 20 ч	43,4	1,52	559,6	92,87	27,37	1,71	0,253	0,005	60,3	1,16
8,14 и 20 ч	41,5	1,6	250,1	53,0	16,7	0,9	0,243	0,010	67,0	0,5

Депонирование:

Следующие образцы семян были депонированы в NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Scotland, UK января 6, 2011 г. Согласно условиями Будапештского договора на имя Philip Morris Products S.A:

До выдачи патента или в течение 20 лет от даты подачи заявки, если, заявка отклонена или отозвана, образец должен выдаваться только независимому эксперту, номинированному реквестром (Правило 13бис.6 PCT).

Обозначении семенной линии PM	Дата депонирования	Инвентарный №
PM016	6 января 2011	NCIMB 41798
PM021	6 января 2011	NCIMB 41799
PM092	6 января 2011	NCIMB 41800
PM102	6 января 2011	NCIMB 41801
PM132	6 января 2011	NCIMB 41802
PM204	6 января 2011	NCIMB 41803
PM205	6 января 2011	NCIMB 41804
PM215	6 января 2011	NCIMB 41805
PM216	6 января 2011	NCIMB 41806
PM217	6 января 2011	NCIMB 41807

Claims

1. Способ получения гетерологичного пептида в растении Nicotiana tabacum, включающий стадии

a. обеспечения совместимой комбинации разновидности или сорта растения Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium для применения в транзиторной Agrobacterium трансформации растений табака, полученной:

(i) применением теста на некроз к разновидности или сорту растения Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium, и

(ii) выбором разновидности или сорта, которые проявляют менее чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных вида или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции тестируемым штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32;

b. вакуумной инфильтрации совместимой комбинации разновидности или сорта растения Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium, содержащего экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид, и

c. инкубации подвергнутого вакуумной инфильтрации растения в перевернутом положении при освещении сверху в течение от семи до девяти часов в день,

d. выращивания или инкубации целого растения при плотности, равной по меньшей мере 75 растениям на квадратный метр, или

e. обоих процессов; и

f. получения гетерологичного пептида в растении Nicotiana tabacum.

2. Способ по п. 1, где выбранные разновидность или сорт Nicotiana tabacum, предоставленные на стадии (i), представляют собой разновидность или сорт Nicotiana tabacum, выбранные из группы, состоящей из N. tabacum с инвентарными обозначениями DAC Mata Fina, PО2, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, МcNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Мawar, NC 297, Coker 371 Gold, PО2, Wisliςa, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 от скрещивания BU21 x Hoja Parado 97, Samsun NN, Izmir, Xanthi NN, Karabalgar, Denizli, PО1, PM016, семена которых были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41798; PM021, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41799; PM092, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41800; PM102, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41801; PM132, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41802; PM204, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41803; PM205, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41804; PM215, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41805; PM216, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41806; и PM217, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41807, и где депозитарием семян является NCIMB в Абердине, Шотландия.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, где выбранный штамм Agrobacterium, предоставленный на стадии (i), представляет собой штамм, выбранный из группы, состоящей из AGL1, EHA105, GV2260, GV3101 и Chry5.

4. Способ по п. 1 или 2, где комбинация разновидности или сорта Nicotiana tabacum и штамма Agrobacterium, выбранная на стадии (ii), представляет собой комбинацию, выбранную из группы, состоящей из линии PM132 Nicotiana tabacum с Agrobacterium tumefaciens AGL1 и линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом EHA105 Agrobacterium tumefaciens, линии PM204 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens и линии PM204 Nicotiana tabacum со штаммом EHA105 Agrobacterium.

5. Применение совместимой комбинации разновидности или сорта Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium в транзиторной Agrobacterium трансформации растений табака, полученной:

(ii) выбором разновидности или сорта, которые проявляют менее чем 10% некроза через 5 дней после того, как листья указанных вида или сорта были подвергнуты шприцевой инъекции тестируемым штаммом Agrobacterium при плотности клеток с OD₆₀₀, равной 0,32,

для получения полипептида гемагглютинина 5 гриппа (H5) в Nicotiana tabacum, содержащего стадии:

a. вакуумной инфильтрации совместимой комбинации разновидности или сорта растения Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium, содержащего экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид, и

b. инкубации подвергнутого вакуумной инфильтрации растения в перевернутом положении при освещении сверху в течение от семи до девяти часов в день,

c. выращивания или инкубации целого растения при плотности, равной по меньшей мере 75 растениям на квадратный метр, или

e. обоих процессов; и

6. Применение по п. 5 для получения полипептида гемагглютинина 5 вируса гриппа (H5) в количестве между 100 и 700 мг на кг массы растительной ткани, где разновидность или сорт Nicotiana tabacum подвергают вакуумной инфильтрации с штаммом Agrobacterium, содержащим экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина 5 гриппа при OD₆₀₀ 0,32 и при давлении на 50 мбар и времени выдерживания 60 сек.

7. Применение по п. 5 или 6, где экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина 5 гриппа, клонируют в имеющем минимальный размер бинарном векторе c SEQ ID NO: 1.

8. Применение по п. 5 или 6, где супрессор сайленсинга генов транзиторно экспрессируется в указанных выбранных разновидности или сорте растения N. tabacum, когда экспрессируется нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид гемагглютинина 5 гриппа.

9. Применение по п. 8, где нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга генов, расположена на первом бинарном векторе, а нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид гемагглютинина 5 гриппа, расположена на втором бинарном векторе.

10. Применение по п. 5 или 6, где протеаза хелперного компонента (HcPro) потивируса транзиторно экспрессируется в указанных выбранных разновидности или сорте растения N. tabacum, когда экспрессируется нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид гемагглютинина 5 гриппа.

11. Применение по п. 10, где протеаза хелперного компонента (HcPro) потивируса кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 5.

12. Применение по п. 10 или 11, где протеаза хелперного компонента (HcPro) потивируса транзиторно экспрессируется в указанных выбранных разновидности или сорте растения N. tabacum с использованием второго бинарного вектора, который отделен от первого бинарного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина 5 гриппа.

13. Применение по любому из пп. 9-11, где первый бинарный вектор предоставлен в первом штамме Agrobacterium, а второй вектор предоставлен во втором штамме Agrobacterium, и где отношение клеток первого штамма Agrobacterium, содержащего первый бинарный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный белок, к клеткам второго штамма Agrobacterium, содержащего второй бинарный вектор, находится в интервале от 3:1 до 1,6:1.

14. Применение по любому из пп. 5-11, где выбранные разновидность или сорт Nicotiana tabacum, выбранные на стадии (ii) п. 1, представляют собой разновидность или сорт Nicotiana tabacum, выбранные из группы, состоящей из N. tabacum с инвентарными обозначениями DAC Mata Fina, PО2, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, МcNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Мawar, NC 297, Coker 371 Gold, PО2, Wisliςa, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 от скрещивания BU21 x Hoja Parado 97, Samsun NN, Izmir, Xanthi NN, Karabalgar, Denizli, PО1, PM016, семена которых были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41798; PM021, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41799; PM092, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41800; PM102, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41801; PM132, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41802; PM204, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41803; PM205, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41804; PM215, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41805; PM216, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41806; и PM217, семена которой были депонированы под инвентарным номером NCIMB 41807, и где депозитарием семян является NCIMB в Абердине, Шотландия.

15. Применение по любому из пп. 5-11, где выбранный штамм Agrobacterium, выбранный на стадии (ii) п. 1, представляет собой штамм, выбранный из группы, состоящей из AGL1, EHA105, GV2260, GV3101 и Chry5.

16. Применение по любому из пп. 5-11, где комбинация выбранных разновидности или сорта Nicotiana tabacum и выбранного штамма Agrobacterium, выбранная на стадии (ii) п. 1, представляет собой комбинацию, выбранную из группы, состоящей из линии PM132 Nicotiana tabacum с Agrobacterium tumefaciens AGL1 и линии PM132 Nicotiana tabacum со штаммом EHA105 Agrobacterium tumefaciens, линии PM204 Nicotiana tabacum со штаммом AGL1 Agrobacterium tumefaciens и линии PM204 Nicotiana tabacum со штаммом ЕНА105 Agrobacterium.

17. Применение по любому из пп. 5-11, где растения подвергают воздействию света перед вакуумной инфильтрацией таким образом, что устьичная проводимость находится в интервале между 70 мкмоль м^-2с^-1 и 600 мкмоль м^-2с^-1.

18. Применение по любому из пп. 5-11, где подвергнутые вакуумной инфильтрации растения инкубируются в течение периода между 5 и 10 днями в условиях естественного освещения в течение от семи до девяти часов в день.

19. Применение по любому из пп. 5-11, где подвергнутые вакуумной инфильтрации растения инкубируются в течение периода между 5 и 10 днями в перевернутом положении.

20. Применение по любому из пп. 5-11, дополнительно включающее (a) перед вакуумной инфильтрацией выращивание целого табачного растения из выбранных разновидности или сорта N. tabacum при плотности, равной по меньшей мере 100 растениям на квадратный метр, или (b) после вакуумной инфильтрации инкубацию подвергнутых вакуумной инфильтрации целых растений при плотности, равной по меньшей мере 100 растениям на квадратный метр, или (c) перед вакуумной инфильтрацией выращивание целого табачного растения из выбранных разновидности или сорта N. tabacum при плотности, равной по меньшей мере 100 растениям на квадратный метр, и после вакуумной инфильтрации инкубацию подвергнутых вакуумной инфильтрации целых растений при плотности, равной по меньшей мере 100 растениям на квадратный метр.

21. Применение по п. 20, где растения выращивают при плотности, равной 200-600 растениям на квадратный метр.

22. Применение по любому из пп. 5-11, дополнительно включающее инфильтрацию целого Agrobacterium-инфильтрованного растения одним или несколькими ферментами, которые разрушают стенку растительной клетки.

23. Применение по любому из пп. 5-11, где выбранная комбинация разновидности или сорта Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium представляет собой комбинацию, которая приводит в результате к (a) накоплению гетерологичного белка до уровня, который составляет по меньшей мере 25% от уровня, получаемого у N. bentamiana, когда применяют такую же экспрессируемую нуклеотидную последовательность и такие же стадии инфильтрации и инкубации, или (b) накоплению зеленого флуоресцентного белка до по меньшей мере 1% от общего растворимого белка подвергнутого вакуумной инфильтрации растения, когда экспрессируемая нуклеотидная последовательность кодирует зеленый флуоресцентный белок, и применяют такие же стадии инфильтрации и инкубации.

24. Применение по любому из пп. 5-11, где экспрессируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид гемагглютинина 5 гриппа, клонируют в бинарном векторе, содержащем область T-ДНК, которая содержит одну или две или более копий промотора FLt или его функционального фрагмента, где промотор FLt представляет собой промоторы из MMV, FMV или PCISV.

25. Применение по п. 24, где указанный промотор FLt является промотором, представленным в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.

26. Система продуцирования гетерологичного полипептида у целого растения Nicotiana tabacum, содержащая:

а) средство для вакуумной инфильтрации целых растений клетками Agrobacterium, полученными в результате скрининга на совместимую комбинацию разновидности или сорта растения Nicotiana tabacum и штамма вида Agrobacterium для применения в транзиторной Agrobacterium трансформации растений табака, и

b) теплицу, оборудованную для

(i) инкубации подвергнутого вакуумной инфильтрации растения в перевернутом положении при освещении сверху в течение от семи до девяти часов в день,

(ii) выращивания целого растения при плотности, равной по меньшей мере 75 растениям на квадратный метр, или

(iii) обоих процессов.