CN109825524A - 一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法 - Google Patents
一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，由以下步骤组成：烟草外植体预培养；利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体；共培养；分化培养，其中分化培养基中Basta的浓度为3‑5mg/mL；生根诱导和阳性植株检测；本发明通过选择适宜浓度的特美汀对共培养前的叶盘进行清洗，有效减少农杆菌污染；筛选出针对抗性苗生长的最佳抗生素浓度，进而提高了除草剂筛选抗性阳性率。
Description
【技术领域】
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种农杆菌介导的除草剂 Basta抗性导入烟草的转化方法。
【背景技术】
农杆菌(Agrobacteriμm)是一类生活在植物根的表面，依靠根组织渗透出来的营养物质生存的，普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌具有天然感染植物细胞的能力，可以诱发植物冠瘿瘤。农杆菌中存在一种巨大质粒，称为Ti质粒。Ti质粒可以作为外源基因的载体，介导外源基因的转化。目前农杆菌介导的遗传转化已经广泛应用于双子叶植物和单子叶植物中，应用的农杆菌主要为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。
对于烟草的农杆菌转化，常规选用的质粒的植物筛选抗性大部分为卡那和潮霉素抗性。除草剂抗性质粒的筛选体系的建立，会大大便捷特殊基因研究的流程，也方便了其他作物类基因功能的验证。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，以解决现有技术中存在的除草剂筛选抗性阳性率低和易污染的问题。
本发明采用以下技术方案：一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，由以下步骤组成：
烟草外植体预培养；
利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体；
共培养；
分化培养，其中分化培养基中Basta的浓度为3-5mg/mL；
生根诱导和阳性植株检测。
进一步地，所述分化培养中采用的分化培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖 +6-BA1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar+500mg/L Cef+Basta，pH5.8，所述Basta 的浓度为4mg/mL。
进一步地，转化方法为：将预培养的烟草外植体置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD600为0.5-0.6，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养 20min。
进一步地，所述共培养的培养条件为：28度下暗培养2-3天。
进一步地，所述共培养前采用特美汀清洗叶盘。
进一步地，所述特美汀的浓度为320-640mg/L。
进一步地，所述特美汀的浓度为640mg/L。
进一步地，所述特美汀的清洗次数为3次，清洗时间为：第一次30分钟，后两次10分钟。
进一步地，所述共培养的培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L +NAA0.1mg/L+7.8g/L Agar+200μL/L AS，pH5.8。
进一步地，所述生根诱导和阳性植株检测中，生根诱导的培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/L Agar+500mg/L Cef，pH5.8；阳性植株检测为利用基因组DNA进行PCR检测。
本发明的有益效果是：通过选择适宜浓度的特美汀对共培养前的叶盘进行清洗，有效减少农杆菌污染；筛选出针对抗性苗生长的最佳抗生素浓度，进而提高了除草剂筛选抗性阳性率。
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，由以下步骤组成：
步骤1：烟草外植体预培养；
步骤2：利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体；
步骤3：共培养；
步骤4：分化培养，其中分化培养基中Basta的浓度为3-5mg/mL；
步骤5：生根诱导和阳性植株检测。
其中，步骤3中，共培养的培养条件为：28度下暗培养2-3天；共培养的培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar+200μL/L AS，pH5.8。
共培养前采用特美汀清洗叶盘，特美汀的浓度为320-640mg/L，特美汀的清洗次数为3次，清洗时间为：第一次30分钟，后两次10分钟。
表1特美汀筛选浓度的确定
| 同批次外植体编号 | 特美汀浓度 | 农杆菌污染率 |
| 1 | 0 | 95％ |
| 2 | 320mg/L | 58％ |
| 3 | 480mg/L | 36％ |
| 4 | 640mg/L | 6％ |
农杆菌污染率(％)＝污染农杆菌的外植体/接种外植体总数×100
当不加特美汀时，接种的外植体在3-5天后，其周围基本都出现了大面积的农杆菌生长和污染，甚至将外植体包裹起来。分别用320mg/L，480mg/L，640mg/L 浓度的特美汀清洗后，污染率有明显的下降。从表1可以看出，采用640mg/L的特美汀清洗，对于农杆菌的抑制效果较好。
其中，本发明的步骤4中，分化培养中采用的分化培养基为4.43g/L MS +30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar+500mg/L Cef+Basta， pH5.8，Basta的浓度为4-5mg/mL。
其中，本发明的步骤5中，生根诱导和阳性植株检测中，生根诱导的培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/L Agar+500mg/L Cef，pH5.8；阳性植株检测为利用基因组DNA进行PCR检测。
实施例1
以烟草品种为“Nicotiana tabacum NN”叶片为外植体，利用含有除草剂Basta 抗性的农杆菌EHA105进行转化，阳性植株利用基因组PCR进行检测。
步骤1：烟草外植体预培养
配制预培养培养基：
MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌。
烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有 5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。
将烟草叶切成1cm2的叶盘，叶面向下放置在预培养基上，暗培养2天，每批 100个叶盘。
步骤2：利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体
转化方法为：将预培养的烟草外植体置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD600为0.5，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养20min。
侵染液培养基为4.43g/LMS+30g/L蔗糖，pH5.8；121℃，20min灭菌；现用现加100μL/L AS。
步骤3：共培养
配制共培养培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+200μL/L AS。
取出步骤2中得到的烟草外植体，用滤纸吸干叶盘表面液体后，采用特美汀清洗叶盘，特美汀的浓度为640mg/L，清洗次数为3次，清洗时间为：第一次 30分钟，后两次10分钟。
叶面向下接种于共配培养基，28度下暗培养2天。
步骤4：分化培养
配制分化培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+500mg/L Cef+4mg/L Basta。
用滤纸吸干烟草外植体表面水分，叶面向下平铺在分化培养基上，每培养皿 8-10片子叶，每两周转接一次。
统计已分化的外植体数，通过公式(1)计算分化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为4mg/L分化率为80％-90％，具体结果见表2。
分化率(％)＝(已分化的外植体数/接种外植体总数)×100 (1)
步骤5：生根诱导
配制生根培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8；121℃，20min 灭菌后+500mg/L Cef
将可以明显区分开的芽切去基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上进行培养。
步骤6：阳性植株检测
取一元硬币大小的叶片于管中，加入2粒钢珠后用珠磨仪打碎，加入800微升CTAB，65度10min。加入600微升三氯甲烷，混匀，4度离心10min，取上清液于新1.5mL离心管，加入500微升三氯甲烷，混匀后，4度下离心10min。取上清液于新离心管并加入等量异丙醇，摇匀后在-20度环境下沉淀3小时。
PCR鉴定：PCR反应体系(20微升)
反应体系：8.5微升PCR MIX；8.5微升H2O；2微升基因组DNA；0.5微升 F；0.5微升R。
反应程序：95℃，5min；95℃，30S；60℃，30S；72℃，2min；30个循环； 72℃，5min。
电泳鉴定：
制胶：1.25g琼脂糖中加入100mL TAE，加热至彻底溶解，充分混匀后倒入模具，室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样。
跑胶：电泳槽中加入TAE，漫过凝胶即可。样品中加入1.5微升染料，混合后点样15微升，接通电源，电压220V，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。
电泳结束后，凝胶成像观察，对比marker确定片段大小。
统计已转化的外植体数，通过公式(2)计算转化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为4mg/L转化率为12.7％-27.9％。
转化率(％)＝(已转化的外植体数/接种外植体总数)×100 (2)
当除草剂Basta抗性浓度为4mg/L时，结果见表2，外植体从第一次继代开始出苗，第二次继代开始大量出苗。质粒编号为2018002的外植体经转化后，获得86棵苗，经PCR鉴定获得24颗阳性苗，证明该基因已导入烟草中，转化率为27.9％，而质粒编号为2018003的外植体转化后，获得55棵苗，经PCR鉴定获得7颗阳性苗，转化率为12.7％。
表2除草剂Basta抗性(4mg/mL)的结果
| Basta抗性的质粒编号 | 筛选压 | 分化率 | 转化率 |
| 2018002 | 4mg/mL | 90％ | 27.9％ |
| 2018003 | 4mg/mL | 80％ | 12.7％ |
实施例2
以烟草品种为“Nicotiana tabacum NN”叶片为外植体，利用含有除草剂Basta 抗性的农杆菌EHA105进行转化，阳性植株利用基因组PCR进行检测。
步骤1：烟草外植体预培养
配制预培养培养基：
MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌。
烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有 5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。
将烟草叶切成1cm2的叶盘，叶面向下放置在预培养基上，暗培养2天，每批 100个叶盘。
步骤2：利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体
转化方法为：将预培养的烟草外植体置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD600为0.6，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养20min。
侵染液培养基为4.43g/LMS+30g/L蔗糖，pH5.8；121℃，20min灭菌；现用现加100μL/L AS。
步骤3：共培养
配制共培养培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+200μL/L AS。
取出步骤2中得到的烟草外植体，用滤纸吸干叶盘表面液体后，采用特美汀清洗叶盘，特美汀的浓度为640mg/L，清洗次数为3次，清洗时间为：第一次 30分钟，后两次10分钟。
叶面向下接种于共配培养基，28度下暗培养3天。
步骤4：分化培养
配制分化培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+500mg/L Cef+5mg/L Basta。
用滤纸吸干烟草外植体表面水分，叶面向下平铺在分化培养基上，每培养皿 8-10片子叶，每两周转接一次。
统计已分化的外植体数，通过公式(1)计算分化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为5mg/L分化率为69％-73％，具体结果见表3。
分化率(％)＝(已分化的外植体数/接种外植体总数)×100 (1)
步骤5：生根诱导
配制生根培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8；121℃，20min 灭菌后+500mg/L Cef
将可以明显区分开的芽切去基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上进行培养。
步骤6：阳性植株检测
取一元硬币大小的叶片于管中，加入2粒钢珠后用珠磨仪打碎，加入800微升CTAB,65度10min。加入600微升三氯甲烷，混匀，4度离心10min，取上清液于新1.5mL离心管，加入500微升三氯甲烷，混匀后,4度下离心10min。取上清液于新离心管并加入等量异丙醇，摇匀后在-20度环境下沉淀4小时。
PCR鉴定：PCR反应体系(20微升)
反应体系：8.5微升PCR MIX；8.5微升H2O；2微升基因组DNA；0.5微升 F；0.5微升R。
反应程序：95℃，5min；95℃，30S；60℃，30S；72℃，2min；30个循环； 72℃，5min。
电泳鉴定：
制胶：1.25g琼脂糖中加入100mL TAE，加热至彻底溶解，充分混匀后倒入模具，室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样。
跑胶：电泳槽中加入TAE，漫过凝胶即可。样品中加入1.5微升染料，混合后点样15微升，接通电源，电压220V，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。
电泳结束后，凝胶成像观察，对比marker确定片段大小。
统计已转化的外植体数，通过公式(2)计算转化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为5mg/L转化率为5.5％-10.1％。
转化率(％)＝(已转化的外植体数/接种外植体总数)×100 (2)
当除草剂Basta抗性浓度为5mg/L时，结果见表3，外植体从第一次继代开始出苗，第二次继代开始大量出苗。质粒编号为2018002的外植体经转化后，获得73棵苗，经PCR鉴定获得4颗阳性苗，证明该基因已导入烟草中，转化率为 5.5％，而质粒编号为2018003的外植体经转化后，获得69棵苗，经PCR鉴定获得7颗阳性苗，转化率为10.1％。
表3除草剂Basta抗性(5mg/mL)的结果
| Basta抗性的质粒编号 | 筛选压 | 分化率 | 转化率 |
| 2018002 | 5mg/mL | 73％ | 5.5％ |
| 2018003 | 5mg/mL | 69％ | 10.1％ |
实施例3
以烟草品种为“Nicotiana tabacum NN”叶片为外植体，利用含有除草剂Basta 抗性的农杆菌EHA105进行转化，阳性植株利用基因组PCR进行检测。
步骤1：烟草外植体预培养
配制预培养培养基：
MS 4.43g/L+蔗糖30g/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌。
烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有 5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。
将烟草叶切成1cm2的叶盘，叶面向下放置在预培养基上，暗培养2天，每批100个叶盘。
步骤2：利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体
转化方法为：将预培养的烟草外植体置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD600为0.55，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养20min。
侵染液培养基为4.43g/LMS+30g/L蔗糖，pH5.8；121℃，20min灭菌；现用现加100μL/L AS。
步骤3：共培养
配制共培养培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+200μL/L AS。
取出步骤2中得到的烟草外植体，用滤纸吸干叶盘表面液体后，采用特美汀清洗叶盘，特美汀的浓度为640mg/L，清洗次数为3次，清洗时间为：第一次 30分钟，后两次10分钟。
叶面向下接种于共配培养基，28度下暗培养2天。
步骤4：分化培养
配制分化培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8； 121℃，20min灭菌后+500mg/L Cef+3mg/L Basta。
用滤纸吸干烟草外植体表面水分，叶面向下平铺在分化培养基上，每培养皿 8-10片子叶，每两周转接一次。
统计已分化的外植体数，通过公式(1)计算分化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为3mg/L分化率为70％-74％，具体结果见表4。
分化率(％)＝(已分化的外植体数/接种外植体总数)×100 (1)
步骤5：生根诱导
配制生根培养基：
4.43g/L MS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/L Agar，pH5.8；121℃，20min 灭菌后+500mg/L Cef
将可以明显区分开的芽切去基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上进行培养。
步骤6：阳性植株检测
取一元硬币大小的叶片于管中，加入2粒钢珠后用珠磨仪打碎，加入800微升CTAB,65度10min。加入600微升三氯甲烷，混匀，4度离心10min，取上清液于新1.5mL离心管，加入500微升三氯甲烷，混匀后，4度下离心10min。取上清液于新离心管并加入等量异丙醇，摇匀后在-20度环境下沉淀3.5小时。
PCR鉴定：PCR反应体系(20微升)
反应体系：8.5微升PCR MIX；8.5微升H2O；2微升基因组DNA；0.5微升 F；0.5微升R。
反应程序：95℃，5min；95℃，30S；60℃，30S；72℃，2min；30个循环； 72℃，5min。
电泳鉴定：
制胶：1.25g琼脂糖中加入100mL TAE，加热至彻底溶解，充分混匀后倒入模具，室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样。
跑胶：电泳槽中加入TAE，漫过凝胶即可。样品中加入1.5微升染料，混合后点样15微升，接通电源，电压220V，根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳。
电泳结束后，凝胶成像观察，对比marker确定片段大小。
统计已转化的外植体数，通过公式(2)计算转化率，经计算除草剂Basta 抗性浓度为3mg/L，转化率为7.1％-8.1％。
转化率(％)＝(已转化的外植体数/接种外植体总数)×100 (2)
当除草剂Basta抗性浓度为3mg/L时，结果见表4，外植体从第一次继代开始出苗，第二次继代开始大量出苗。质粒编号为2018002经转化后，获得70棵苗，经PCR鉴定获得5颗阳性苗，证明该基因已导入烟草中，转化率为7.1％；而质粒编号为2018003经转化后，获得74棵苗，经PCR鉴定获得6颗阳性苗，转化率为8.1％。
表4除草剂Basta抗性(3mg/mL)的结果
| Basta抗性的质粒编号 | 筛选压 | 分化率 | 转化率 |
| 2018002 | 3mg/mL | 70％ | 7.1％ |
| 2018003 | 3mg/mL | 74％ | 8.1％ |
Claims (10)
1.一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，由以下步骤组成：
烟草外植体预培养；
利用已转入basta抗性质粒的农杆菌浸染烟草外植体；
共培养；
分化培养，其中分化培养基中Basta的浓度为3-5mg/mL；
生根诱导和阳性植株检测。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述分化培养中采用的分化培养基为4.43g/L MS+30g/L蔗糖+6-BA 1mg/L+NAA0.1mg/L+7.8g/LAgar+500mg/L Cef+Basta，pH5.8，所述Basta的浓度为4mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，转化方法为：将预培养的烟草外植体置于用转化液重悬的农杆菌菌液中，菌液调整OD600为0.5-0.6，然后黑暗条件下30℃，200r/min震荡培养20min。
4.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述共培养的培养条件为：28度下暗培养2-3天。
5.根据权利要求4所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述共培养前采用特美汀清洗叶盘。
6.根据权利要求5所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述特美汀的浓度为320-640mg/L。
7.根据权利要求6所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述特美汀的浓度为640mg/L。
8.根据权利要求7所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述特美汀的清洗次数为3次，清洗时间为：第一次30分钟，后两次10分钟。
9.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述共培养的培养基为4.43g/LMS+30g/L蔗糖+6-BA1mg/L+NAA 0.1mg/L+7.8g/LAgar+200μL/LAS，pH5.8。
10.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法，其特征在于，所述生根诱导和阳性植株检测中，生根诱导的培养基为4.43g/LMS+30g/L蔗糖+IAA 0.3mg/L+7.8g/LAgar+500mg/L Cef，pH5.8；阳性植株检测为利用基因组DNA进行PCR检测。
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| CN201910142094.9A Pending CN109825524A (zh) | 2019-02-26 | 2019-02-26 | 一种农杆菌介导的除草剂Basta抗性导入烟草的转化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109825524A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005098006A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-10-20 | Syngenta Participations Ag | Inducible promoters |
| CN101117639A (zh) * | 2007-06-28 | 2008-02-06 | 贵州省生物技术研究所 | 农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法 |
| WO2012098119A2 (en) * | 2011-01-17 | 2012-07-26 | Philip Morris Products S.A. | Protein expression in plants |
| CN104232683A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-24 | 江苏农林职业技术学院 | 一种农杆菌介导的烟草转基因方法 |
| CN106244625A (zh) * | 2016-10-09 | 2016-12-21 | 贵州大学 | 一种快速高效的农杆菌介导的烟草种子遗传转化方法 |
| CN109234309A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-01-18 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种发根农杆菌介导的烟草红花大金元转化方法 |
| CN109234311A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-01-18 | 云南中烟工业有限责任公司 | 一种烟草叶片接种携目的基因农杆菌的方法及接种装置 |
-
2019
- 2019-02-26 CN CN201910142094.9A patent/CN109825524A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| 韩凤英等: "BcA9-Barnase转基因雄性不育烟草的获得", 《西南大学学报（自然科学版）》 * |
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Application publication date: 20190531 |