CN106755082B - 高效获得大戟转基因植株的方法及其农杆菌介导转化体系 - Google Patents
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Abstract
一种高效获得大戟转基因植株的方法及其农杆菌介导转化体系，属于农杆菌介导转化体系。包括以下步骤：通过高效再生体系获得胚性愈伤受体材料；供体农杆菌菌株的培养；抑菌素头孢噻肟钠浓度的确定；农杆菌转化条件的优化；抗性愈伤的筛选培养和植株再生及转基因植株的分子检测。通过优化农杆菌转化时的菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养条件等影响因素，建立了大戟农杆菌介导转化体系。克服了现有农杆菌介导技术难以应用于大戟植物遗传转化的缺陷，建立了以胚性愈伤为受体材料的高效大戟农杆菌转化体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导转化体系，特别是一种高效获得大戟转基因植株的方法及其农杆菌介导转化体系。
背景技术
京大戟又称大戟、龙虎草等，是大戟科大戟属植物大戟(EuphorbiapekinensisRupr)的干燥根，京大戟性味苦、寒、有毒，作为药材最初见于《神农本草经》，在中医中常用于峻下逐水药，功效泄水逐饮，消肿散结。临床上常用于胸膜炎积水,晚期血吸虫病腹水,肝硬化腹水及精神分裂症等。
目前对大戟的化学成分和药理作用已经具有一定的研究基础，从大戟中分离到了多种结构复杂的化合物，药理研究发现大戟中分离的化合物具有抗肿瘤、抗白血病、镇痛、消炎等作用。临床研究发现京大戟具有治疗精神分裂症、肝硬化腹水、便秘、耕牛前胃弛缓等疗效。但京大戟具有毒性，限制了大戟的应用。京大戟的活性成分大部分为萜类化合物。大戟萜类成分在大戟属植物中广泛存在,其结构独特、新颖,为主要生物活性成分,不同碳骨架类型的萜成分生理活性具有明显差异性。
大戟中的活性物质种类繁多，然而作为次生代谢产物，其绝对含量又是很低的，这也成为次生代谢产物研究开发的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高次生代谢产物或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将次生代谢产物生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入相应的宿主中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高次生代谢产物含量的最佳途径。国内外不少实验室正在进行这方面的研究。
诱导培养大戟的愈伤组织，以根癌农杆菌为介导，获得大戟转基因植株的方法，将是开展大戟代谢工程研究提高大戟活性成分含量并实现大戟活性成分工厂化生产的有效方法。目前尚未发现获得大戟转基因植株的相关报道。
发明内容
本发明的目的是要提供一种高效获得大戟转基因植株的方法及其农杆菌介导转化体系，诱导培养大戟的愈伤组织，以根癌农杆菌为介导，获得大戟转基因植株；开展大戟代谢工程研究提高大戟活性成分含量并实现大戟活性成分工厂化生产。
本发明的目的是这样实现的：本发明包括获得大戟转基因植株的方法、农杆菌介导转化体系。
获得大戟转基因植株的方法，包括愈伤组织的诱导和增殖培养、根癌农杆菌介导的转化，抗性愈伤组织的筛选和增殖培养，分化培养及抗性植株的检测，实现大戟转基因植株用于代谢工程。
农杆菌介导转化体系：采用大戟的花作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有潮霉素抗性的pCAMBIA1301质粒导入大戟愈伤组织，经抗性愈伤组织筛选及分化培养获得大戟的无菌苗，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，获得大戟转基因植株。
具体步骤为：
(1)大戟愈伤组织的诱导：选择即将开放的或刚开放的花为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在花的切口处逐渐产生白色的愈伤组织，并且花骨朵不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素6-BA和NAA而组成；
(2)大戟胚性愈伤组织的诱导培养：将大戟花骨朵诱导出的白色愈伤组织转接至胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加不同配比的6-BA和NAA而组成；
(3)遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含潮霉素基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以大戟胚性愈伤组织为受体进行转化；
(4)抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；
(5)抗性愈伤组织的分化培养：将抗性愈伤组织转入到分化培养基上培养，待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长壮后生根；
(6)PCR法检测转基因植株：提取每个植株的总DNA,PCR检测是否含有潮霉素磷酸转移酶基因；如果电泳能检测出目的条带，表明外源基因整合到受体细胞的染色体中并表达。
本发明所述的根癌农杆菌，市场上有公开出售的生物材料，可以从多家公司购得。与现有技术相比，本发明采用基因工程方法，利用农杆菌介导将pCAMBIA1301质粒导入大戟愈伤组织中，获得了转基因大戟植株。这对后期开展大戟活性成分合成途径的代谢工程，最终解决大戟资源短缺，满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。该方法在大戟生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、大戟基因工程、细胞工程、代谢工程以及大戟遗传转化体系的建立等方面具有广泛的应用价值。
附图说明：
图1是本发明的大戟胚型愈伤组织结构图。
图2是本发明的大戟转化后抗性愈伤组织图。
图3是本发明的大戟分化培养基上再生的抗性苗图。
具体实施方式
本发明包括获得大戟转基因植株的方法、农杆菌介导转化体系。
获得大戟转基因植株的方法，包括愈伤组织的诱导和增殖培养、根癌农杆菌介导的转化，抗性愈伤组织的筛选和增殖培养，分化培养及抗性植株的检测，实现大戟转基因植株用于代谢工程。
农杆菌介导转化体系：采用大戟的花作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有潮霉素抗性的pCAMBIA1301质粒导入大戟愈伤组织，经抗性愈伤组织筛选及分化培养获得大戟的无菌苗，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，获得大戟转基因植株。
具体步骤为：
(1)大戟愈伤组织的诱导：选择即将开放的或刚开放的花为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在花的切口处逐渐产生白色的愈伤组织，并且花骨朵不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素6-BA和NAA而组成；
(2)大戟胚性愈伤组织的诱导培养：将大戟花骨朵诱导出的白色愈伤组织转接至胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加不同配比的6-BA和NAA而组成；
(3)遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含潮霉素基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以大戟胚性愈伤组织为受体进行转化；
(4)抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；
(5)抗性愈伤组织的分化培养：将抗性愈伤组织转入到分化培养基上培养，待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长壮后生根；
(6)PCR法检测转基因植株：提取每个植株的总DNA,PCR检测是否含有潮霉素磷酸转移酶基因；如果电泳能检测出目的条带，表明外源基因整合到受体细胞的染色体中并表达。
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1：大戟胚性愈伤组织的诱导；
取大戟的即将开放或刚开放的花骨朵，进行消毒，程序如下：先用自来水冲洗2h，无菌水冲洗2次，75％乙醇消毒45s，无菌水冲洗3次，0.1％升汞消毒6min，之后在其上划伤痕，接种于愈伤组织诱导培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+植物凝胶0.4g/L)中，先26±1℃黑暗培养7d，再进行光照培养，接种的花骨朵7d后伤口边缘开始膨大，14d后诱导出愈伤组织。将愈伤组织继代接种于胚性愈伤诱导培养基上，该胚性愈伤诱导培养基组成为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+0.4g/L植物凝胶。筛选到长势好而快，没有褐化且呈现黄绿色的质地致密的胚性愈伤组织待侵染。
实施例2：含潮霉素基因的植物表达载体pCAMBIA1301根癌农杆菌工程菌的获得；
将植物表达载体pCAMBIA1301转入根癌农杆菌(如EHA105,为市场有公开出售的生物材料)，并进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌(Agl-1)：培养根癌农杆菌至菌液OD600＝0.5，将菌液冰浴30min后，转移菌液至1.5mL离心管中，4℃,5000rpm离心5min，去上清；用抽滤灭菌的预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体后于冰上放置30min,然后5000rpm离心5min，去上清，用100μL预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体后于4℃保存备用，此为制备好的农杆菌感受态。取制备好的一管感受态，加入1μL质粒pCAMBIA1301，轻轻混匀后置冰上5min，然后液氮中放8min，37℃水浴热击5min，然后加入800μL YEB液体培养基，轻轻混匀；28℃,200rpm振荡培养4h后，室温4000rpm，4℃离心10min，去上清，余下200μL菌液重悬菌体混匀，涂布在含100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB固体培养基上，于28℃倒置培养2d，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后进行潮霉素磷酸转移酶基因的PCR检测。结果表明，植物表达载体pCAMBIA1301已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
实施例3：
1.根癌农杆菌介导的转化
1.1根癌农杆菌的培养；
挑取含所述植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于含有100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床培养过夜，当菌液浓度OD600达到0.6-0.8时，4000rpm离心10min，去上清，用含有100μM乙酰丁香酮的MS重悬沉淀在底部的农杆菌，28℃，180rpm摇床培养活化2h后用于转化大戟胚性愈伤。
1.2根癌农杆菌与外植体的共培养；
将大戟胚性愈伤团块接种于根癌农杆菌菌液中，28℃，120rpm摇床培养30min，取出愈伤团块，用无菌滤纸吸干多余的菌液，然后转入铺有一层无菌滤纸的含有100μM AS的共培养基上，26±1℃黑暗共培养3天，用含300mg/L cef的无菌水洗涤愈伤3次，过滤后再用若干无菌滤纸吸干水分，然后将愈伤置于共培养基(MS+蔗糖30g/L+4g/L植物凝胶+100μMAS)上，于26±1℃暗培养3天，使农杆菌充分浸染大戟愈伤组织。
1.3抗性愈伤组织的筛选与继代培养；
共培养后，把愈伤组织转接到恢复培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝胶+300mg/L cef)上，进行脱菌培养，于26±1℃暗培养2个星期后转接到筛选培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝胶+300mg/L cef+100mg/L潮霉素)上进行抗性愈伤组织的筛选培养，每4个星期继代培养一次。
1.4抗性愈伤组织的分化；
将抗性愈伤组织转入到分化培养基(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝胶+cef 250mg/L+潮霉素100mg/L)上培养，分化条件为16h光照，8h黑暗，光照度50μmol/m2/s，温度为(26±1)℃。待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长壮后生根。
2.转化植株的PCR检测
首先用CTAB方法提取抗性植株叶片的总DNA，然后用PCR方法检测其是否含有潮霉素磷酸转移酶基因。PCR反应条件为：95℃变性3min；然后是30个循环的95℃，30sec，59℃，40sec,72℃，1min；最后再72℃延生5min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增各抗性植株的总DNA，部分植株能扩增出与预期结果一致的特异目的片段(共检测50株植株，其中阳性植株为19株，转化效率为38％)，而以非转化大戟植株总DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明潮霉素磷酸转移酶基因已经整合到部分大戟植株的基因组中。
本实施例利用所构建的含植物表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌菌株转化大戟愈伤组织，获得经PCR检测的转基因植株。为后期开展大戟代谢工程和大规模工厂化生产大戟活性成分并最终解决药物资源匮乏提供了一种有效的解决方法。
Claims (1)
1.一种高效获得大戟转基因植株的方法，其特征是：获得大戟转基因植株的方法，具体步骤为：
(1)大戟愈伤组织的诱导：选择即将开放的或刚开放的花为愈伤组织诱导用外植体，进行消毒，程序如下：先用自来水冲洗2h，无菌水冲洗2次，75％乙醇消毒45s，无菌水冲洗3次，0.1％升汞消毒6min；在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在花的切口处逐渐产生白色的愈伤组织，并且花骨朵不断膨大；
所述愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+植物 凝胶0.4g/L；
(2)大戟胚性愈伤组织的诱导培养：将大戟花骨朵诱导出的白色愈伤组织转接至胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；
所述胚性愈伤诱导培养基为：MS+6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.1mg/L+蔗糖 30g/L+0.4g/L植物凝胶；
(3)遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含潮霉素基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以大戟胚性愈伤组织为受体进行转化；
(4)抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：愈伤组织转接到恢复培养基上，进行脱菌培养，恢复培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖 30g/L+4g/L植物凝胶+300mg/L cef，于26±1℃暗培养2个星期后转 接到筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选培养，每4个星期继代培养一次，筛选培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝胶+300mg/L cef +100mg/L潮霉素；
(5)抗性愈伤组织的分化培养：将抗性愈伤组织转入到分化培养基上培养，待分化出芽后，将长出的小芽转入到不含潮霉素的分化培养基中，待小苗长壮后生根；所述的分化培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+ NAA 0.05mg/L+蔗糖 30g/L+4g/L植物凝胶+cef 250mg/L+潮霉素100mg/L；
(6)PCR(聚合酶链反应)法检测转基因植株：提取每个植株的总DNA,PCR检测是否含有潮霉素磷酸转移酶基因；如果电泳能检测出目的条带，表明外源基因整合到受体细胞的染色体中并表达。
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| 优良年宵花一品红组培快繁技术;王伯诚等;《上海农业科技》;20071231(第1期);70-71 * |
| 六种矮型一品红的离体组织培养研究;蒋小满等;《北方园艺》;20021231(第3期);62-63 * |
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