CN114958904B - 一种快速获得萝卜转基因材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT‑PCR分析鉴定阳性毛状根；切取阳性毛状根放置于愈伤组织培养基上诱导愈伤组织，获得转基因愈伤组织。本发明提高了发根农杆菌诱导萝卜毛状根的效率，缩短了发根时间，成功诱导了转基因愈伤组织，能够进行萝卜部分本体基因功能验证。
Description
技术领域
本发明属于萝卜转基因体系技术领域，涉及发根农杆菌介导的萝卜遗传转化体系的建立方法，以及以转基因毛状根为外植体获得转基因愈伤组织方法的优化。
背景技术
萝卜(Raphanus sativus L.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，营养丰富，食疗保健价值高，在我国蔬菜生产和周年供应中占有重要地位。目前，随着萝卜基因组序列的公布以及转基因工程等现代生物技术的快速发展，给萝卜种质遗传改良提供了新的思路和选择。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒诱导植物产生生理性状和遗传性稳定的毛状根，同时将外源基因共同整合到植物基因组中，从而实现目的基因的遗传转化。发根农杆菌介导的遗传转化具有周期短、操作简单和应用范围广等优点，已成为植物基因功能验证和根系生物学研究的有力工具。然而，目前尚未见对发根农杆菌介导萝卜遗传转化的影响因素进行综合分析的研究报道，没有建立高效的转化体系。通过发根农杆菌诱导萝卜产生不定根，提高了转化的效率，能够进行部分基因功能在萝卜本体中的验证。
发明内容
本发明提供了一种快速获得萝卜转基因毛状根和以毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织的体系，为萝卜基因功能的验证提供了有效方法。与其他的瞬时转化和异源转化相比，发根农杆菌介导的遗传转化体系更便捷、稳定。
本发明的具体技术方案如下：
一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括以下步骤：
(1)对萝卜种子进行消毒，将消毒后的种子播种到灭菌的MS培养基上获得无菌苗。
(2)活化携带目的基因的发根农杆菌。
(3)侵染无菌苗的前一天使用LB液体培养基摇菌。
(4)待无菌苗生长到6-7d时，切除实生根获得无根苗，使用步骤(3)中的菌液侵染无根苗。
(5)侵染后的植株在无菌滤纸上晾干，随后接种到MS培养基上共培养2d。
(6)共培养结束后，将植株转移到脱菌培养基上进行培养。
(7)培养30d后，对发出的毛状根进行表型鉴定，提取DNA和RNA进行PCR检测和qRT-PCR分析，检测目的基因是否成功转入毛状根并过量表达。
(8)以转基因毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织。
所述的发根农杆菌为MSU440菌株，属于农杆碱型发根农杆菌。
步骤(1)中，采用75％的乙醇消毒1.5min，8％的次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上晾干，完成种子灭菌过程。
步骤(2)中，携带目的基因的发根农杆菌菌液保存在-80℃冰箱中，使用LB固体培养基进行活化；
所述的LB固体培养基为：在每升的LB培养基中添加100mg/L卡那霉素(Kan)+50mg/L链霉素(Str)+15g/L琼脂。
步骤(2)中，使用灭菌枪头吸取20μL菌液，在LB固体培养基上划线后密封，倒置于28℃恒温培养箱培养2d，待菌落长出。
步骤(3)中，使用灭菌枪头刮取菌落转移到LB液体培养基中，于28℃，220rmp恒温摇床培养8-12h。
所述的LB液体培养基为：LB液体培养基+100mg/L Kan+50mg/L Str。
步骤(4)中，侵染时使用的菌液OD600值为1.0；
步骤(4)中，侵染时间为10min；
步骤(4)中，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)。
步骤(5)中，侵染后的外植体放在无菌滤纸上，使用滤纸吸干植株表面菌液，伤口处向下，竖直插入培养基中，确保伤口完全接触培养基。
步骤(6)中，脱菌培养基为：MS培养基+300mg/L头孢噻肟霉素(Cef)，脱菌培养过程中不需要更换培养基。
步骤(7)中，通过表型观察，初步鉴定转基因毛状根；
步骤(7)中，采用CTAB法提取DNA；
步骤(7)中，PCR扩增反应体系为：总体积为10μL，其中Taq酶Mix 5μL、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH2O 3μL。
PCR反应程序：
qRT-PCR反应体系为：体系为15μL，其中，2×SYBR green reaction mix 7μL，引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH2O 3μL。
qRT-PCR反应程序：
步骤(8)中，诱导愈伤组织的毛状根切成0.5cm的切断；
步骤(8)中，诱导愈伤组织的培养基为：MS+0.75mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+300mg/L Cef。
步骤(8)中，诱导愈伤组织的时长为21d。
本发明的有益成果：
本发明以萝卜品种‘NAU-LHZ’的无根苗为外植体材料，建立了发根农杆菌介导的萝卜遗传转化体系，并且以转基因毛状根为外植体成功诱导出转基因愈伤组织。不仅克服了传统转基因体系周期长、转化效率低的问题，还为萝卜本体基因功能的验证提供了有效手段。与瞬时转化相比，该转化系统更稳定、可靠性更高，为萝卜基因功能的验证以及转基因植株的培育提供了一种新方法。
附图说明
附图1侵染7d和30d后不同外植体毛状根的诱导情况(A：7d下胚轴；B：7d生长点；C：7d带柄子叶；D：7d无根苗；E：30d下胚轴；F：30d生长点；G：30d带柄子叶；H：30d无根苗)；
附图2不同侵染时间毛状根的诱导情况(A：侵染5min；B：侵染10min；C：侵染15min)；
附图3不同苗龄毛状根的诱导情况(A：3-4d苗龄；B：6-7d苗龄；C：9-10d苗龄)；
附图4为实施例1中诱导获得的转基因红色表型毛状根；
附图5为实施例1中转基因红色毛状根为外植体诱导产生的红色愈伤组织；
附图6为实施例1中转基因红色毛状根PCR检测图(M：2000Marker；CK：转pCAMBIA1300空载的白色毛状根；RsMYB90：红色表型转基因毛状根)；
附图7为实施例1中RsMYB90基因qRT-PCR分析(CK：转pCAMBIA1300空载的白色毛状根；Transgenic hairy root：红色表型转基因毛状根)。
附图8为实施例1中诱导RsMYB90转基因毛状根和愈伤组织示意图。
具体实施方式
实施例1 RsMYB90转基因毛状根和愈伤组织的诱导
1、萝卜无菌苗获得
(1)选取大小均匀一致的‘NAU-LHZ’萝卜种子，在超净工作台中对种子进行消毒。
(2)75％酒精消毒1.5min，8％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3次。
(3)将消毒的种子置于无菌滤纸上晾干，用灭菌的镊子将种子接种到MS固体培养基上，于25℃，光照时长为16h/d的条件下培养6-7d获得无菌苗。
2、农杆菌菌液制备
(1)取-80℃冰箱保存的携带pCAMBIA1300-RsMYB90过表达载体的MSU440发根农杆菌菌液，在超净工作台中，用移液枪吸取20μL菌液在LB+100mg/L Kan(卡那霉素)+50mg/LStr(链霉素)的固体培养基上划线，待菌液晾干后，密封平板，倒置于28℃恒温培养箱中培养2d。
(2)刮取活化的菌块转入LB+100mg/L Kan(卡那霉素)+50mg/L Str(链霉素)的液体培养基中28℃，220rmp摇床培养8-12h。
(3)菌液11200rmp离心5min去上清液，采用1/2MS重新悬浮农杆菌，调节OD600值为1.0。(4)加入300μmol/L AS，混匀，获得侵染菌液。
3、外植体制备
(1)活化农杆菌的同时，选择长势良好的无菌苗，在超净工作台中切除无菌苗实生根，获得无根苗外植体。
4、农杆菌侵染
(1)将外植体浸入菌液中，于28℃，220rmp摇床中，侵染10min。
(2)侵染结束后，在超净工作台中将外植体用无菌水冲洗3-4次，置于无菌滤纸上晾干。
5、共培养和脱菌培养
(1)将晾干的外植体接种于MS培养基上共培养2d。
(2)共培养结束后，将外植体转入MS+300mg/L Cef的培养基上脱菌培养。
6、转基因毛状根筛选和愈伤组织诱导
(1)RsMYB90基因为控制花青素合成基因，转入RsMYB90基因的毛状根呈现红色表型；通过表型鉴定、PCR检测和qRT-PCR分析筛选具有红色表型的转基因毛状根。
PCR扩增反应体系为：总体积为10μL，其中Taq酶Mix 5μL、RsMYB90 F(10μM)和pCAMBIA1300 R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH2O 3μL。扩增引物分别为：
RsMYB90-1300 F：atacaccaaatcgactctagaATGGAGGGTTCGTCCAAAGG
pCAMBIA1300 R：TTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTC
PCR反应程序：
qRT-PCR反应体系为：体系为15μL，其中，2×SYBR green reaction mix 7μL，RsMYB90-qRT F(10μM)和RsMYB90-qRT R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH2O 3μL。扩增引物分别为：
RsMYB90-qRT F：TTCTTCTTCGCCTTCATAAACTT
RsMYB90-qRT R：GGATCGAGGTCGAGGTTTG
qRT-PCR反应程序：
(2)在超净工作台中，将红色转基因毛状根切成0.5cm的小段，接种在MS+0.75mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+300mg/L Cef的培养基上诱导愈伤组织，其中愈伤组织的诱导率为81.25％。愈伤组织诱导率＝(分化愈伤组织的毛状根数/接种的总毛状根数)×100％。
本实施例以RsMYB90为目的基因，但不限于此基因，目的基因可同等替换，采用实施例1的方法获得转基因毛状根和愈伤组织。
实施例2 外植体类型对毛状根诱导的影响
表1 不同外植体对毛状根诱导的影响
选取长势相同的6-7d苗龄无菌苗的带柄子叶、下胚轴、生长点和无根苗为试验材料，以MS为基本培养基，使用添加200μmol/L AS，OD600值为0.8的菌液侵染10min后，黑暗条件共培养2d后，转接于添加500mg/L Cef的脱菌培养基培养，其他操作方法同实施例1。30d后统计毛状根诱导率和阳性率。
如表1所示，发根率和阳性率受外植体类型影响较大，4种外植体种，无根苗的诱导率和阳性率均为最高。
实施例3 侵染时间对毛状根诱导的影响
表2 不同侵染时间对毛状根诱导的影响
选择长势相同的无菌苗，按照实施例2的方法设置5min，10min，15min三种侵染处理，30d后统计毛状根诱导率和阳性率。
如表2所示，不同侵染时间毛状根诱导率差异不显著，10min和15min都可100％诱导毛状根产生，不同侵染时间表现出不同的阳性率，其中侵染时间为10min阳性率最高。
实施例4 苗龄对毛状根诱导的影响
表3 不同苗龄对毛状根诱导的影响
选择同一批种植3-4d，6-7d，9-10d苗龄的无菌苗，按照实施例2的方法进行侵染，30d后统计毛状根诱导率和阳性率。
如表3所示，不同苗龄的无菌苗表现出不同的诱导能力和阳性率，其中6-7d苗龄的无菌苗在较高诱导能力较高的基础上表现出最高的阳性率。
实施例5 乙酰丁香酮(AS)浓度对毛状根诱导的影响
表4 不同AS浓度对毛状根诱导的影响
选择长势相同的无菌苗，设置0，100，200，300，400，500μmol/L的AS，按照实施例1的方法进行侵染，30d后统计毛状根诱导率和阳性率。
如表4所示，AS浓度对诱导率影响不大，不同浓度的AS都可以100％诱导毛状根，但对阳性率存在较大影响，其中300μmol/L的AS阳性率最高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对萝卜种子进行消毒，接种到MS培养基上，获得无菌苗，所述萝卜品种为NAU-LHZ；
(2)携带目的基因的发根农杆菌菌液活化与侵染液制备，所述目的基因为RsMYB90基因；
(3)外植体制备与侵染：待无菌苗生长到6-7d时，切除实生根获得无根苗，使用步骤(2)得到的浸染液浸染无根苗；
(4)共培养、脱菌培养及毛状根诱导；
(5)根据表型或载体荧光标记筛选转基因毛状根；
(6)DNA、RNA提取和反转录，PCR检测和qRT-PCR分析；
(7)将转基因毛状根切成0.5cm的小段接种至愈伤组织培养基上诱导转基因愈伤组织；
其中，步骤(6)提取DNA的方法为CTAB法；DNA检测的PCR反应体系如下：总体积为10μL，其中Taq酶Mix 5μL、10μM引物F和10μM引物R各0.5μL、20ng/μL模板DNA 1μL、ddH2O 3μL；扩增引物分别为：
RsMYB90-1300 F：atacaccaaatcgactctagaATGGAGGGTTCGTCCAAAGG；
pCAMBIA1300 R：TTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTC；
PCR反应程序：
qRT-PCR反应体系如下：体系为15μL，其中，2×SYBR greenreaction mix 7μL，10μM引物F和10μM引物R各0.5μL，20ng/μL cDNA 4μL，ddH2O 3μL；扩增引物分别为：
RsMYB90-qRT F：TTCTTCTTCGCCTTCATAAACTT；
RsMYB90-qRT R：GGATCGAGGTCGAGGTTTG；
qRT-PCR反应程序：
2.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(1)中，消毒方式为：采用75％的酒精消毒1.5min，8％的次氯酸钠消毒10min，随后用无菌水冲洗3次；所述的MS培养基为含琼脂和蔗糖的MS培养基；无菌苗于25℃，光照时长为16h/d的条件下培养。
3.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(2)中含有目的基因的发根农杆菌菌液保存在-80℃冰箱中，活化农杆菌的培养基为：LB+100mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素；摇菌时培养基为：LB+100mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素；侵染液制备时，采用1/2MS液体培养基，将菌液OD600值调节至1.0，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮，侵染过程在28℃，220rmp摇床中进行；1/2MS液体培养基的成分为1/2MS+30g/L蔗糖。
4.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(3)中取6-7d苗龄无菌苗，从生长点向下1cm处快速切断获得无根苗外植体；将无根苗浸入OD600＝1.0的菌液中侵染10min，用无菌水冲洗3次，随后在无菌滤纸上完全晾干。
5.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(4)中共培养培养基为MS培养基，共培养在黑暗条件下进行，时间为2d；脱菌培养基为MS+300mg/L头孢噻肟霉素，脱菌培养30d。
6.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(7)中愈伤诱导培养基成分为：MS+0.75mg/L噻二唑苯基脲+0.5mg/L萘乙酸+300mg/L头孢噻肟霉素。
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Non-Patent Citations (1)
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| Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation of radish (Raphanus sativus L. cv. Valentine) for accumulation of anthocyanin;Hanhong Bae等;Plant Omics;第5卷(第4期);第383页左栏第3段至第384页右栏第3段 * |
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