CN105132457A - 一种快速遗传转化苜蓿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速遗传转化苜蓿的方法，是一种利用农杆菌介导法直接转化苜蓿萌发种子，而不需要组织培养过程的新方法。其特点是，包括如下步骤：采用苜蓿萌发种子为转化受体，以携带外源基因的农杆菌介导实现，具体步骤包括：(1)无菌苜蓿成熟种子萌发；(2)携带外源基因的农杆菌的培养及注射式转化；(3)共培养及脱菌；(4)抗性植株的获得；(5)转基因植株的获得。本发明方法的操作相对简单、无需昂贵的仪器及工具；利用萌发种子作为受体，不受基因型的限制，取材方便，避开了严格的组织培养过程；转化方法浸染时间短、转化周期也大大缩短，与其他的农杆菌介导苜蓿转化方法相比，具有显著的优势。

Description

一种快速遗传转化苜蓿的方法

技术领域

本发明涉及一种快速遗传转化苜蓿的方法，是一种利用农杆菌介导法直接转化苜蓿萌发种子，而不需要组织培养过程的新方法。

背景技术

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)为多年生豆科牧草，在我国栽培历史悠久、分布广泛。其蛋白质含量丰富，营养价值高，干草产量居多种豆科牧草之首，素有“牧草之王”的美誉。此外，发达的根系和生物固氮的特性使其对土壤改良、防止水土流失、提高土壤养分中也起到重要作用。

逆境尤其是盐碱、干旱等是抑制植物生长和降低作物产量的重要的环境因子,紫花苜蓿等优良栽培作物因长期生长在较优裕的条件下，其抗旱耐盐等遗传潜力非常有限。长期以来，抗逆性品种的培育被认为进一步提高苜蓿抵御逆境的有效途径。随着生物技术的发展，转基因育种已成为苜蓿新品种培育的重要手段，它大大缩短了育种周期，打破了种间的界限，促进了不同物种间遗传物质的交换，弥补了常规育种技术的一些局限性。自1985年Vasil在国际草原学大会上第一次提出了利用遗传转化技术将外源的特定基因导入牧草的可行性，为基因工程改良牧草奠定了理论基础。近年来，苜蓿通过基因转化技术，在抗寒性、抗旱性、耐盐性等研究方面取得了一系列的突破性成就，加速了苜蓿育种进程。

农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated)是利用农杆菌Ti质粒或Ri质粒可侵入受体细胞并整合进染色体DNA上的特性，实现了外源基因向植物受体的转化。在众多基因转化方法中，该方法以低成本、低拷贝、可转移大片段的DNA等优点，广泛应用于植物愈伤组织、悬浮细胞、叶盘、茎段、子叶、下胚轴及薄层细胞等离体材料的转化。

在农杆菌介导苜蓿遗传转化的研究中，除少数工作外，苜蓿转基因植株的获得均依赖于器官、组织和细胞培养技术。基因型是组织培养与遗传转化能否成功的关键，而目前只有少数苜蓿品种可通过组织和细胞培养再生大量植株。此外，依赖于组织和细胞培养技术的转化周期长。以农杆菌介导的叶盘法转化苜蓿为例，叶片经农杆菌浸染、共培养后，细胞经脱分化形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织再分化出抗性芽，最后形成完整的抗性植株，这个过程的最短时间不少于90d。因此，建立不受基因型制约的简单、快速的苜蓿遗传转化方法和技术体系具有重要意义。

例如在中国发明专利CN103074363A中，周晓馥等公开了一种利用苜蓿种子进行基因转化的方法。即以苜蓿种子作为转化受体，在萌发过程中与含目标基因的根癌农杆菌菌液共培养，靠渗透作用使得质粒DNA进入植物细胞中。该苜蓿转化方法避开了经组织培养获得再生植株的过程，缩短了转化周期。在农杆菌介导植物转化的过程中，植物伤口产生的糖类和酚类等化学物质使得农杆菌产生趋向性，使其附着在伤口诱发肿瘤，从而实现浸染伤口并将T-DNA插入到植物基因组中。因此，该专利中受体材料仅靠渗透作用实现外源DNA的转化，存在转化效率较低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种直接以苜蓿萌发种子为转化受体，无需进行组织培养及植株再生过程的农杆菌介导苜蓿的快速遗传转化苜蓿的方法。

一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特别之处在于，包括如下步骤：采用苜蓿萌发种子为转化受体，以携带外源基因的农杆菌介导实现，具体步骤包括：(1)无菌苜蓿成熟种子萌发；(2)携带外源基因的农杆菌的培养及注射式转化；(3)共培养及脱菌；(4)抗性植株的获得；(5)转基因植株的获得。

进一步的，包括如下步骤：

(1)无菌苜蓿成熟种子萌发：

取苜蓿饱满、成熟种子，经消毒灭菌后置于MS固体培养基中光照培养，光照时间为光16h/暗8h，培养温度为24±2℃，培养时间为72-96h；待苜蓿种子萌发后，即可作为转化受体材料待用；

(2)携带外源基因的农杆菌培养及注射式转化：

挑取含有质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg·L^-1Kan和20mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，置入摇床，28℃，220rpm振荡暗培养至菌液浓度达到OD600为0.8-1.0，3000rpm离心10min，收集菌体；加入50mlMS液体培养基重悬浮，用于转化；将步骤(1)获得的转化受体材料转至铺设无菌滤纸的无菌玻璃培养皿中，利用无菌微型注射器吸取携带外源基因的农杆菌菌液向子叶基部刺入并推进菌液即完成浸染；

(3)共培养及脱菌：

取步骤(2)得到的注射携带外源基因农杆菌的苜蓿萌发种子，置于铺设无菌滤纸的MS培养基中，暗培养2d，温度为24±2℃；共培养结束后，将转化后的萌发种子转至无菌三角瓶中，用无菌水清洗后，再用无菌滤纸吸干子叶及胚轴、胚根上的水分；

(4)抗性植株的获得：

将得到的苜蓿萌发种子置于筛选培养基中培养20-30d，获得抗性植株；其中筛选培养基为含有0.05mg·L^-1NAA、30mg·L^-1Kan、500mg·L^-1Cef的1/2MS固体培养基；光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24±2℃；

(5)转基因植株的获得：

当步骤(4)得到的抗性植株叶片长至7-8片，根长为5-8cm时，剪切枝条扦插至步骤(4)中的筛选培养基中，待植株生根，剪切叶片经PCR和RT-PCR检测，携带选择标记基因及外源基因的整合和表达为转基因植株。

步骤(1)中苜蓿种子萌发程度为：种子萌发至胚已突破种皮，出现肉眼可见的胚根与子叶，子叶颜色为黄色至黄绿色，子叶基部至胚根顶端长度为0.6-1.0cm。

步骤(2)中农杆菌为含有选择标记基因NPTII以及目的基因的根癌农杆菌菌株。

步骤(2)中农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀0.8-1.0，注射部位为沿子叶基部至胚根方向约1-2mm处；所使用的无菌微型注射器规格为1ml，针头规格为4.5号。

步骤(3)中用无菌水清洗具体是指使用含500mg·L^-1Cef的无菌水对转化受体清洗2-3次。

本发明方法的操作相对简单、无需昂贵的仪器及工具；利用萌发种子作为受体，不受基因型的限制，取材方便，避开了严格的组织培养过程；此外本发明的转化方法浸染时间短、转化周期也大大缩短，与其他的农杆菌介导苜蓿转化方法相比，具有显著的优势，可在苜蓿基因工程育种中推广与应用。

附图说明

附图1为质粒pCambia2300-HaBADH的物理图谱；

附图2为转化受体的苜蓿种子萌发中后期形态图；

附图3为转化受体浸染后共培养图；

附图4为筛选培养图(筛选培养5d，图中绿色植株为经选择压力筛选后的抗性植株)；

附图5为筛选培养图(筛选培养后10d，图中绿色植株为经选择压力筛选后的抗性植株)；

附图6为苜蓿转基因植株标记基因NPTII的PCR检测图，其中，M为2000bpDNAladderMaker；1-20为部分转基因植株；P为阳性质粒pCambia2300-HaBADH；N为未转化植株；

附图7为苜蓿转基因植株目的基因HaBADH的PCR检测图，其中，M为2000bpDNAladderMaker；P为阳性质粒pCambia2300-HaBADH；N为未转化植株；1-15为部分阳性株系；

附图8为苜蓿转基因植株内参基因Actin的RT-PCR检测图，其中，M为2000bpDNAladderMaker；1-4为部分阳性植株；N为阴性对照；

附图9为转基因植株目的基因HaBADH的RT-PCR检测图，其中，M为2000bpDNAladderMaker；P为阳性质粒pCambia2300-HaBADH(显示为1500bp条带)；N为未转化植株；1-12为阳性株系。

具体实施方式

本发明方法如下：

(1)无菌苜蓿成熟种子萌发：种子萌发过程可分为，吸水膨胀、种皮胀裂、长出胚根、长出胚芽四个阶段。本发明取苜蓿饱满、成熟种子，经消毒灭菌后置于MS固体培养基中光照培养，光照时间为光16h/暗8h，培养温度为24±2℃，培养时间为72-96h。待苜蓿种子萌发至胚已突破种皮，出现肉眼可见的胚根与子叶，子叶颜色为黄色至黄绿色，子叶基部至胚根顶端长度为0.6-1.0cm时，作为转化受体材料。

(2)携带外源基因的农杆菌培养及注射式转化：挑取经鉴定含有质粒pCambia2300-HaBADH的农杆菌单菌落(含有选择标记基因NPTII以及目的基因BADH的根癌农杆菌菌株GV3101，此基因构建由宁夏农林科学院实验室提供，农杆菌菌株由该实验室保存)接种于含50mg·L^-1Kan和20mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，置入摇床，28℃，220rpm振荡暗培养至菌液浓度达到OD600为0.8-1.0，3000rpm离心10min，收集菌体。加入50mlMS液体培养基重悬浮，用于转化。将步骤(1)获得的转化受体材料转至铺设无菌滤纸的无菌玻璃培养皿中，利用无菌微型注射器吸取携带外源基因的农杆菌菌液向子叶基部刺入并推进菌液。

(3)共培养及脱菌：取出步骤(2)中注射携带外源基因农杆菌的苜蓿萌发种子，置于铺设2层无菌滤纸的MS培养基中，暗培养2d，温度为24±2℃。共培养结束后，将转化后的萌发种子转至无菌三角瓶中，使用含500mg·L^-1Cef的无菌水对其清洗2-3次后，无菌滤纸吸干子叶及胚轴、胚根上多余的水分。

(4)抗性植株的获得：将经步骤(3)共培养及清洗后的苜蓿萌发种子置于筛选培养基中培养20-30d，获得抗性植株。筛选培养基为含有0.05mg·L^-1NAA、30mg·L^-1Kan、500mg·L^-1Cef的1/2MS固体培养基。光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24±2℃。

(5)转基因植株的获得：当步骤(4)中获得抗性植株叶片长至7-8片，根长为5-8cm时，剪切枝条扦插至步骤(3)中的筛选培养基中，待植株生根，剪切叶片进行分子检测，如PCR扩增和RT-PCR扩增，可验证选择标记基因及外源基因的整合和表达。

步骤(2)中农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀0.8-1.0，注射部位为沿子叶基部至胚根方向约1-2mm处，针头扎入深度以不穿破为宜。所使用的无菌微型注射器规格为1ml，针头规格为4.5。

本发明方法采用苜蓿萌发中后期(即胚根突破种皮、胚芽尚未形成阶段)的种子为转化受体，利用注射法向子叶基部(细胞分裂活跃的分生组织)刺破并推入农杆菌菌液，达到外源基因转化的目的。该方法克服了种子靠渗透作用进行外源基因转化存在的不足，实现了农杆菌对伤口处的转化，还施加了由外向内的压力，更有利于农杆菌的浸染。实验证明，采用本方法可成功实现目的基因向受体植株的转化，转化率达到15.11％。

实施例1：

基本转化方法：

(1)以携带有质粒pCambia2300-HaBADH的农杆菌GV3101(此基因构建由宁夏农林科学院实验室提供，农杆菌菌株由该实验室-70℃保存)为基因供体。质粒pCambia2300-HaBADH携带梭梭甜菜碱合成关键酶基因BADH和新霉素磷酸转移酶基因NPTII。NPTII基因赋予植物对卡那霉素(Kan)产生抗性。基因载体由宁夏农林科学院实验室构建，质粒pCambia2300-HaBADH物理图谱见图1。

(2)苜蓿无菌成熟种子的萌发：挑选苜蓿饱满、成熟种子，去离子水冲洗10min后，置于超净工作台经75wt％乙醇漂洗30s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1wt％氯化汞溶液振荡灭菌15min，用无菌水冲洗4-5次，每次2-3min。灭菌后的种子置于无菌滤纸上吸干水分后接种于MS培养基上。培养温度为25±2℃，光照时间为光16h/暗8h。待苜蓿种子萌发至胚已突破种皮，出现肉眼可见的胚根与子叶，子叶颜色为黄色至黄绿色，子叶基部至胚根顶端长度为0.6-1.0cm时，作为转化受体材料。MS培养基参照Murashige&Skoog(1962)的方法配制。

(3)农杆菌菌种的纯化与悬浮培养：

从-80℃冰箱中取出经鉴定含有质粒的农杆菌GV3101，用接种针挑菌在含50mg·L^-1卡那霉素(Kan)和20mg·L^-1利福平(Rif)的Luria-Bertani(LB)固体培养基上划线。28℃，倒置暗培养2d，至培养基上有单菌落出现。

挑取单菌落接种于50ml含50mg·L^-1Kan和20mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，置入摇床，28℃，220rpm振荡暗培养至菌液浓度达到OD600为0.8-1.0，3000rpm离心10min，收集菌体。加入50mlMS液体培养基重悬浮，用于转化。

(4)注射式转化：将转化受体材料转至铺设无菌滤纸的无菌玻璃培养皿中，利用无菌微型注射器吸取携带外源基因的农杆菌菌液，向子叶基部至胚轴1-2mm处扎入针头推进菌液，针头扎入深度以不穿破胚轴为宜，至菌液向外溢出即完成转化。所使用的无菌微型注射器规格为1ml，针头规格为4.5号。

(5)共培养及脱菌：取出转化后的萌发苜蓿种子，置于铺设2层无菌滤纸的MS固体培养基中，培养温度为24±2℃，暗培养2d。共培养结束后，将转化后的萌发种子转至含500mg·L^-1Cef的无菌水的三角瓶中，置入摇床振荡清洗2min，180rpm，清洗2-3次后，无菌滤纸吸干子叶及胚轴、胚根上多余的水分。

(6)抗性植株的获得，经共培养及脱菌后的受体置于筛选培养基中培养20-30d，获得抗性植株。筛选培养基为含有0.05mg·L^-1NAA、30mg·L^-1Kan、500mg·L^-1Cef的1/2MS固体培养基(MS培养基中大量元素与蔗糖含量均减半)。光照条件为光16h/暗8h，培养温度为24±2℃。

(7)转基因植株的获得：当步骤(4)中获得抗性植株叶片长至7-8片，根长为5-8cm时，剪切枝条扦插至步骤(3)中的筛选培养基中，待植株生根，剪切叶片经PCR和RT-PCR检测，携带选择标记基因及外源基因的整合和表达为转基因植株。

转基因的分子检测

(1)转基因植株的PCR鉴定：抗性植株在筛选培养基中继代1-2次后，去除生根培养基中的Cef，取其叶片转入MS培养基中以确定植株中是否带有农杆菌。对于已确定的无菌抗性植株利用CTAB法提取基因组DNA为模板，以质粒pCambia2300-HaBADH为阳性对照，未转化的苜蓿总DNA为阴性对照。根据NPTII和BADH基因序列，分别设计上下游引物对上述DNA样品进行PCR扩增。引物序列及扩增片段大小如下：

NPTII基因：

N1：5’-CGGCTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3’；

N2：5’-AGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’；

扩增片段大小约为795bp。

HaBADH基因：

B1：5’-GGAGAGTGGAGAGAACCC-3’；

B2：5’-CTTCAAGGAGACTTGTACCA-3’；

扩增片段大小约为1500bp。

PCR反应体系的总体积为25μl，10×buffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，上游引物(10μM)1μl下游引物(10μM)1μl，TaqDNApolymerase(2.5U·μl^-1)1μl，补足ddH₂O至25μl。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1min，循环34次；72℃保温10min，4℃保存。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(2)转基因植株的RT-PCR鉴定：采用TransZOLup法(购自Trans公司)随机提取经PCR检测出的转基因植株及未转化植株的RNA，参照Promage公司反转录试剂盒(GoScriptReverseTranscriptionSystem)合成第一链cDNA，设计苜蓿肌动蛋白基因(Actin)序列，A1：5’-GCAGGAATCCACGAGACT-ACATACAA-3’；A2：5’-GCCAAGATAGAGCCTCCAATCCAGAC-3’。分别利用Actin基因和HaBADH基因的上下游引物对合成的cDNA进行RT-PCR扩增反应。扩增条件同上，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

苜蓿遗传转化：

为了探讨多种因素对转化率的影响，设计了包括转化受体萌发状态以及浸染方式2个因素的试验。其中，转化受体萌发状态选用不同萌发时间(48h和72h)的种子作为转化受体；浸染方式选用注射式和浸泡式两种处理。每个处理设置5次重复，每次重复用萌发种子200粒。所有处理共筛选出Kan抗性植株940株。根据实例1的方法对经Kan筛选出的抗性植株叶片提取总DNA进行分子检测，筛选与分子检测结果见表1。

表1苜蓿萌发种子基因转化处理后抗性植株筛选和PCR检测结果：

注:转化率＝(转化阳性植株数/经Kan筛选后的抗性苗数)×100％。

实验数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，方差分析采用onewayANOVA，同列数值后不同大写字母表示P＝0.01水平差异显著，小写字母表示在P＝0.05水平差异显著。

根据PCR扩增和RT-PCR扩增结果证明，利用本发明方法对苜蓿进行遗传转化，可将外源基因导入受体植物。在各处理中以处理4，即以子叶突破种皮，子叶下部胚根2cm的萌发种子为外植体，利用注射法向子叶基部刺破并推入农杆菌菌液的处理转化率最高，达到15.11％±1.57Aa。

Claims (6)

1.一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用苜蓿萌发种子为转化受体，以携带外源基因的农杆菌介导实现，具体步骤包括：(1)无菌苜蓿成熟种子萌发；(2)携带外源基因的农杆菌的培养及注射式转化；(3)共培养及脱菌；(4)抗性植株的获得；(5)转基因植株的获得。

2.如权利要求1所述的一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于：

(1)无菌苜蓿成熟种子萌发：

取苜蓿饱满、成熟种子，经消毒灭菌后置于MS固体培养基中光照培养，光照时间为光16h/暗8h，培养温度为24±2℃，培养时间为72-96h；待苜蓿种子萌发后，即可作为转化受体材料待用；

(2)携带外源基因的农杆菌培养及注射式转化：

挑取含有质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg·L^-1Kan和20mg·L^-1Rif的LB液体培养基中，置入摇床，28℃，220rpm振荡暗培养至菌液浓度达到OD600为0.8-1.0，3000rpm离心10min，收集菌体；加入50mlMS液体培养基重悬浮，用于转化；将步骤(1)获得的转化受体材料转至铺设无菌滤纸的无菌玻璃培养皿中，利用无菌微型注射器吸取携带外源基因的农杆菌菌液向子叶基部刺入并推进菌液即完成浸染；

(3)共培养及脱菌：

取步骤(2)得到的注射携带外源基因农杆菌的苜蓿萌发种子，置于铺设无菌滤纸的MS培养基中，暗培养2d，温度为24±2℃；共培养结束后，将转化后的萌发种子转至无菌三角瓶中，用无菌水清洗后，再用无菌滤纸吸干子叶及胚轴、胚根上的水分；

(4)抗性植株的获得：

将得到的苜蓿萌发种子置于筛选培养基中培养20-30d，获得抗性植株；其中筛选培养基为含有0.05mg·L^-1NAA、30mg·L^-1Kan、500mg·L^-1Cef的1/2MS固体培养基；光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24±2℃；

(5)转基因植株的获得：

当步骤(4)得到的抗性植株叶片长至7-8片，根长为5-8cm时，剪切枝条扦插至步骤(4)中的筛选培养基中，待植株生根，剪切叶片经PCR和RT-PCR检测，携带选择标记基因及外源基因的整合和表达为转基因植株。

3.如权利要求2所述的一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(1)中苜蓿种子萌发程度为：种子萌发至胚已突破种皮，出现肉眼可见的胚根与子叶，子叶颜色为黄色至黄绿色，子叶基部至胚根顶端长度为0.6-1.0cm。

4.如权利要求2所述的一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(2)中农杆菌为含有选择标记基因NPTII以及目的基因的根癌农杆菌菌株。

5.如权利要求2所述的一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(2)中农杆菌菌液浓度为OD₆₀₀0.8-1.0，注射部位为沿子叶基部至胚根方向约1-2mm处；所使用的无菌微型注射器规格为1ml，针头规格为4.5号。

6.如权利要求2所述的一种快速遗传转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(3)中用无菌水清洗具体是指使用含500mg·L^-1Cef的无菌水对转化受体清洗2-3次。