CN113667693A - 一种快速实现植物遗传转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种快速实现植物遗传转化的方法，首先对二叶期种子苗子第二个关节处剪去上面部分并剪去其他侧芽，或者对2‑4cm的块茎新芽从芽生长点处剪去叶子及部分顶端分生组织，然后在剪掉的伤口处注射含目的基因的农杆菌菌液；待新芽长出后，再将含目的基因的农杆菌菌液喷射在新长出的小芽上进行二次侵染，利用该方法可快速将外源基因导入植物细胞并获得再生植株，转化率在40％以上，可以大大缩短转基因植物的获取时间，也突破了非模式植物的遗传转化障碍，适用于单子叶(如大蒜、香雪兰)及双子叶植物(如花生和土豆)，具有巨大的应用前景。

Description

一种快速实现植物遗传转化的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种快速实现植物遗传转化的方法。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是我国重要的油料作物，年产量位居世界第一，总产量在我国油料作物中居首位，由于国内大部分栽培种花生均来源于狮头企和伏花生，且花生的遗传转化体系不完善，导致花生的育种和种子资源匮乏。大蒜是一种重要的蔬菜，用途广泛，加工产品种类多样，同时具有食用和保健双重价值。大蒜品种资源丰富，优良品种众多，但不能进行有性繁殖，导致其种性不断退化。马铃薯(Solanum tuberosum L)是全球最大的非谷类粮食作物。块茎是马铃薯的主要经济和繁殖器官。香雪兰(Fressia hybrida)属多年生球根草本花卉，花色丰富，颜色跨度广，香味特别，主要供观赏及提取香精，也是研究花青素代谢通路的优质实验材料。

目前，植物遗传转化主要有农杆菌和基因枪介导以及病毒浸染三种方法。但无论是花生，马铃薯，大蒜，还是香雪兰，在遗传转化上均存在组织培养和再生时间长，转化率低等的问题。其中，农杆菌介导的遗传转化方法操作简单、成本低、转化率高，广泛应用于各种植物的遗传转化。但传统的农杆菌和基因枪转化都需要通过较长时间的组织培养和再生诱导才能获得植株，且转化效率低。病毒浸染可以不需要组织培养且不受植物基因型的限制，如利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)介导大麦的遗传转化，但是病毒的宿主对宿主有特异性要求，且需要构建的复杂的转化载体，适合于基因沉默和编辑，对基因过表达具有限制性，导致其不能被广泛应用。因此，有必要开发一种快速实现植物遗传转化的方法，以提高转化的效率，缩短转化的时间。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种快速实现植物遗传转化的方法，该方法可快速将外源基因导入植物细胞并获得再生植株，转化率在40％以上，可以大大缩短转基因植物的获取时间，具有巨大的应用前景。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种快速实现植物遗传转化的方法，具体为：当种子发芽长至二叶期时，在第二个关节处剪去上面部分并剪去其他侧芽，或者当块茎长出2-4cm新芽时，切去芽生长点处的叶子及部分顶端分生组织，然后在剪掉的伤口处注射含目的基因的农杆菌菌液，暗培养5d后光照培养至伤口处再次长出小芽，再将含目的基因的农杆菌菌液喷射在新长出的小芽上，暗培养2d进行常规光培即可。

优选地，所述种子为花生种子。当然，其他种子植物同样适用于本发明。

优选地，所述块茎包括大蒜、土豆、香雪兰。当然，其他块茎植物同样适用于本发明。

优选地，所述含目的基因的农杆菌菌液的制备方法为：将包含目的基因的农杆菌培养至对数生长期，刮取农杆菌稀释到OD值为0.3-0.6，并加3％～5％体积的Sliwet L-77活化剂即得含目的基因的农杆菌菌液。

优选地，所述目的基因包括35S:GFP，35S:GUS，pDR5:RUBY、35S:AhmTERF1,35S:AhmTERF1-RNAi。

优选地，含目的基因的农杆菌菌液的注射量为100-150uL，含目的基因的农杆菌菌液的喷射量为50～100uL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种快速实现植物遗传转化的方法，对二叶期种子的新芽从第二个关节处剪去上面部分并剪去其他侧芽，或者对2-4cm的块茎新芽从芽生长点处剪去叶子及部分顶端分生组织，然后在剪掉的伤口处注射含目的基因的农杆菌菌液，最后待新芽长出后，再将含目的基因的农杆菌菌液喷射在新长出的小芽上进行二次侵染，利用该方法可快速将外源基因导入植物细胞并获得再生植株，转化率在40％以上，可以大大缩短转基因植物的获取时间，也突破了非模式植物的遗传转化障碍，适用于单子叶(如大蒜、香雪兰)及双子叶植物(如花生和土豆)，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为花生快速转化及再生植株鉴定结果；

图2为转基因花生的功能和遗传表型；

图3为块芭植物快速转化及再生植株鉴定结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

目前，常用报告系统来检测转基因的效率，如常用的β-glucuronidase(GUS)报告基因可通过组织特异染色来表征转基因的情况；绿色荧光蛋白(Green FluoresecentProtein，GFP)及其衍生物可通过荧光显微镜活体来观察转基因的情况；RUBY是由南京农业大学和玉乒课题组研发的，通过转化甜菜素报告系统，阳性转化植物在可见光下裸眼可视，即呈现黄紫色。

花生线粒体转录终止因子(Arachis hypogasa mitochondrial terminal facter1,AhmTERF1)是研究花生的一个功能基因，参与线粒体的合成，过表达促进植物生长和提高花生的生物量，进行RNAi干扰则抑制花生生长，通过快速转化获得的AhmTERF1过表达及RNAi植株同样具有明显的遗传表型。

实施例1一种快速实现花生转基因的方法

该方法包括如下步骤：

(1)提前将花生种子埋于拟南芥土和珍珠岩混合土(购买于广州市东联园艺有限公司)中，置于室外自然光下进行培养，直至发芽并长至二叶期；

(2)外源基因与载体构建

1)35S:GFP(中国科学院华南植物园刘旭老师赠予)报告系统的构建：具体构建方法参照文献“Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidaseas a sensitive andversatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.1987；6:3901–3907.”；

2)pDR5:RUBY(南京农业大学和玉乒老师赠予)报告系统的构建具体参照文献“Yubing He,Tao Zhang,Hui Sun et al.A reporter for noninvasively monitoringgene expression and plant transformation.Hortic Res.2020Sep 19；7:152.”；

3)35S:AhmTERF1-RNAi由擎科生物公司构建；35S:AhmTERF1(也称35S：AhmTERF1-ox)的构建方法为：

提取花生总RNA后进行反转录，利用诺维赞公司的

III RT SuperMix(+gDNAwiper)参照说明书操作合成第一链cDNA，利用花生数据库(https://www.peanutbase.org/)中AhmTERF基因(登录号：Arahy.SB3XQV)的CDS序列，用PrimerPremier 5.0设计带有酶切位点的克隆引物(AhmTERF1-GFP-F：CTGTACAAGCGGTACCCCGGGATGAAAACTTCATCTTCTCTTCATC；AhmTERF1-GFP-R：GTCCTAGGCTACGTAGGATCCTCAACTCGAATTCTTTTTCAG)，采用该克隆引物以反转录得到的cDNA为模板进行PCR(PCR反应体系：KOD buffer(购自东洋纺(上海)生物科技有限公司)5.0μL，dNTP 2.0μL，Forwardprime 0.3μL，Reverseprimer 0.3μL，KOD 0.2μL，cDNA 1.0μL，ddH₂O 1.2μL。PCR反应程序为：94℃，5min，一个循环；98℃，10s，55℃，30s，68℃，1min30s，40个循环，68℃，5min，一个循环)。用双酶切对35S:eGFP(中国科学院华南植物园刘旭老师赠予)质粒载体进行线性化反应(酶切反应程序：37℃，4h，反应体系为：质粒1-2μg，Restriction enzyme 11μL(购自南京诺维赞生物科技股分有限公司)，Restriction enzyme 2(购自南京诺维赞生物科技股分有限公司)1μL，10×buffer 5μL，ddH₂O up to 50μL)。然后用1％琼脂糖凝胶将PCR产物与酶切产物进行电泳，参照DNA Marker条带大小，将目的条带切割下来，按照Magen的凝胶DNA回收试剂盒的操作说明进行回收，并用超微量核酸分析仪(Nano-200，杭州奥盛仪器有限公司)检测回收产物的浓度与纯度。将PCR产物和酶切产物利用诺维赞的ClonExpress II One Step CloningKit按说明书操作进行同源重组。

同源重组连接反应程序：37℃，30min；4℃，Forever。

将重组后的连接产物加入到大肠杆菌感受态菌液DH5α中(购自广州康体生物科技有限公司)，轻轻吹打混匀，冰上放置30min，然后42℃，热激90s，冰上放置5min。加入1mL LB液体培养基，37℃，150rpm，振荡培养30min。12000rpm，离心30s后去掉800μL上清液，将剩余菌液吹打混匀，均匀涂布于含有50mg/L Kana抗生素的LB平板培养基中，吹干后置于37℃培养箱，倒置培养至长出单克隆菌落，随机挑选单克隆菌落，加入含有Kana抗生素的LB液体培养基中，37℃、150rpm振荡培养2h，以菌液为模板进行PCR，PCR反应体系：Mix(购自广州擎科生物技术有限公司)5.0μL，Forwardprime(AhmTERF1-GFP-F)0.2μL，Reverse primer(AhmTERF1-GFP-R)0.2μL，Bacteria solution 1.0μL，ddH₂O 3.6μL。PCR反应程序为：95℃，5min，一个循环；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min30s，40个循环，72℃，5min，一个循环。鉴定成功的阳性单克隆菌液送至生工生物工程公司测序，测序无误即构建成功。用相同方法构建35S:GFP，pDR5:RUBY以及35S:AhmTERF1-RNAi载体。

4)将测序无误的单克隆菌液35S:GFP，pDR5:RUBY以及35S:AhmTERF1,35S:AhmTERF1-RNAi扩大培养后使用Magen质粒小提试剂盒提取质粒，具体操作方法参照试剂盒说明书。将质粒加入到EHA105感受态或AGL感受态菌液中，轻轻吹打充分混匀，冰上放置30min。在液氮中重冻1min后37℃解冻1-2min，加入1mL含Kana抗生素的YEP液体培养基，28℃，100rpm，振荡培养2h。12000rpm，离心30s后去掉800μL上清液，将剩余菌液吹打混匀，均匀涂布于含有50μg/mL Kana和50μg/mL利福平YEP平板培养基中，吹干后置于28℃培养箱，倒置培养至长出单克隆菌落。随机挑选单克隆菌落，以菌液为模板进行PCR【PCR反应体系：Mix 5.0μL，Forwardprime(AhmTERF1-GFP-F)0.2μL，Reverse primer(AhmTERF1-GFP-R)0.2μL，Bacteria solution 1.0μL，ddH₂O 3.6μL。PCR反应程序为：95℃，5min，一个循环；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min30s，40个循环，72℃，5min，一个循环】，鉴定结果为阳性即为含有目的基因的农杆菌。

(5)在固体YEP培养基上将含外源标记基因35S:GFP，pDR5:RUBY以及35S:AhmTERF1,35S:AhmTERF1-RNAi的农杆菌培养至对数生长期，小心刮取农杆菌并将其稀释到OD值为0.3-0.6之间，并加3％～5％体积的活化剂(Sliwet L-77,GE HealthcareBiosciences)，得到含目的基因的农杆菌菌液；

(6)在二叶期花生的第二个关节处剪去上面部分并剪去其他侧芽(见图1A)，然后用显微注射器在剪掉的伤口处注射(100-150uL)含目的基因的农杆菌菌液，并记录标记，暗培养5d(对于不同的植物，注射的部位需要进行探索，但对于种子萌发或是块茎诱导生芽的物种均可参考以上两种方法)。

(7)5天后将转化植株花生进行室外自然光照培养，直至伤口处再次长出小芽，进行二次浸染，即利用微量移液枪吸取少量(50～100uL)含目的基因的菌液喷射在新长出的小芽上，暗培养2d；

(8)2天后将转化植株进行常规光培，取新长出的小芽，采用CTAB法提取花生总基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR及琼脂糖凝胶电泳检测和验证，以及western blot实验检测基因表达及产物，显微镜观察转化基因表达情况。

图1中，(A)为快速转化操作的示意图，即将二叶期花生的第一茎节剪去(上)，并用显微注射器对伤口处进行农杆菌注射后进行光培长出的新芽示意图(下)。(B)为对花生进行RUBY报告系统转化，其中左为对照组花生植株，右为pDR5：RUBY转基因植株，从图(B)可见转化上RUBY的花生肉眼可见到明显的黄紫色(RUBY)，而对照的花生没有明显的变化(Mock)。(C)为对转化RUBY的花生叶片进行显微观察，可见明显的甜菜素累积。(D)为对转化绿色荧光GFP蛋白的花生叶片进行荧光观察，可见明显的绿色荧光，表明该方法可获得阳性转化植株。(E)利用RUBY特异引物(RUBY-F：TGGGCAGGCCTCGATAAG；RUBY-R：CGGAAGCGGCTTTGGTCCTG)对转化RUBY的植株进行PCR鉴定。(F)为利用GFP特异引物(eGFP-F：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT；eGFP-R:TTACTTGTACAGCTCGT)进行PCR鉴定，并用其特异抗体对GFP蛋白进行WB实验鉴定。(E)和(F)的鉴定结果表明，通过本发明的快速转化方法可以获得RUBY及GFP报告系统转化的花生植株。

花生AhmTERF1基因参与线粒体的合成，过表达AhmTERF1促进花生毛状根的生长，而RNAi降低其表达后抑制花生毛状根和生长。本发明将35S：AhmTERF1-ox及35S：AhmTERF1-RNAi分别导入花生中，并进行相关的PCR鉴定及表型观察。

图2中，(A)为利用35S：AhmTERF1-ox的特异检测引物(35S-F：GCTCCTACAAATGCCATCA，35S-R：ACTCGAATTCTTTTTCAGTTTC)对通过快速转化方法获得的花生AhmTERF1过表达植株进行PCR鉴定；(B)为利用AhmTERF1-RNAi的特异检测引物(KAN-F:ATGGGGATTGAACAAGATGGATTG；KAN-R:TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG)对通过快速转化的方法获得的花生AhmTERF1-RNAi转基因植株进行PCR鉴定；(C)为对AhmTERF1过表达(AhmTERF1-ox)或RNAi转基因的花生植株进行表型观察。发现阳性转化的35S：AhmTERF1-ox植株生长旺盛，而转化35S：AhmTERF1-RNAi的植株生长明显受抑制，表明本发明的快速转化方法可用于基因功能及遗传表型分析。

根据特异引物的PCR鉴定结果对35S:GFP，pDR5:RUBY以及35S:AhmTERF1,35S:AhmTERF1-RNAi的转化率进行统计发现，通过该快速转化方法培育转基因花生可以获得较高的转化率，转化率在40％以上(见表1)。

表1各植物快速遗传的转化率

注：EHA105和AGL农杆菌均为中国科学院华南植物园刘旭都是赠予；AhmTERF1-ox表示AhmTERF1基因地过表达；DR5-RUBY表示RUBY由DR5启动子驱动。

实施例2一种快速实现块芭植物(大蒜、土豆、香雪兰)转基因的方法

该方法包括如下步骤：

(1)提前将大蒜蒜瓣，土豆块茎埋于土壤中，置于室外自然光下进行培养，直至发芽；香雪兰花球用自来水浸泡6h后，于培养箱16-18℃下诱导发芽，直至长出2-4cm长的新芽；

(2)35S:GUS(中国科学院华南植物园刘旭老师赠予)报告系统的构建：具体构建方法参照文献“Chalfie M,Tu Y,Euskirchen G,Ward WW,Prasher DC.Green fluorescentprotein as a marker for gene expression.Science.1994；263:802–805.doi:10.1126/science.8303295.”；

(3)在固体YEP培养基上将含外源标记基因35S:GUS的农杆菌培养至对数生长期，小心刮取农杆菌并将其稀释到OD值为0.3-0.6之间，并加3％～5％体积的活化剂(SliwetL-77,GE Healthcare Biosciences)，得到含目的基因的农杆菌菌液；

(4)当块茎(如大蒜，土豆，香雪兰)长出2-4cm新芽时，切去芽生长点处的叶子及部分顶端分生组织(见图2)，然后用显微注射器在剪掉的伤口处注射(100-150uL)含目的基因的农杆菌菌液，并记录标记，暗培养5d；

(5)5天后将转化植株大蒜及土豆进行室外自然光照培养，香雪球则在培养箱中进行光照培养(16-18℃)，直至伤口处再次长出小芽，进行二次浸染，即利用微量移液枪吸取少量(50-100uL)含目的基因的菌液喷射在新长出的小芽上，暗培养2d；

(6)2天后将转化植株进行常规光培，取新长出的小芽进行GUS染色验证转化基因表达情况。

图3中，(A)为将冒芽的大蒜剪去芽点，显微注射携带35S：GUS农杆菌，待长出蒜苗后对叶片进行GUS染色。结果表明，该快速转化方法可以向大蒜植株快速导入GUS基因。(B)为将冒芽的香雪球剪去芽点，显微注射携带35S：GUS农杆菌，待长出新芽后取芽点进行GUS染色。结果表明，该快速转化方法可以向香雪球幼芽快速导入GUS基因。(C)为将冒芽的土豆剪去芽点叶子，显微注射携带35S：GUS农杆菌，待长出新芽后取芽点进行GUS染色。结果表明，该快速转化方法可以向土豆幼芽快速导入GUS基因。

根据GUS染色结果对35S:GUS的转化率进行统计发现，通过该快速转化方法培育转基因大蒜、土豆以及香雪兰，其中大蒜和土豆可以获得较高的转化率，转化率在40％以上，但香雪兰中的转化效率只有14％(见表1)。主要原因是大部分转化的香雪兰花球容易腐烂，不能长出新芽，可能需要进一步摸索注射菌的浓度。

通过上述实施例可见，采用本发明的快速转化方法在花生以及块芭植物(大蒜、土豆)中均有较高的转化率(40％以上)。该方法可适用于单子叶(如大蒜、香雪兰)及双子叶植物(如花生和土豆)，利用该方法可快速将外源基因导入植物细胞并获得再生植株，大大缩短了转基因植物的获取时间，也突破了非模式植物的遗传转化障碍，具有巨大的应用前景。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南师大（清远）科技创新研究院有限公司

<120> 一种快速实现植物遗传转化的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> AhmTERF1-GFP-F(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtacaagc ggtaccccgg gatgaaaact tcatcttctc ttcatc 46

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> AhmTERF1-GFP-R(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcctaggct acgtaggatc ctcaactcga attctttttc ag 42

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> RUBY-F(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggcaggcc tcgataag 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> RUBY-R(Artificial Sequence)

<400> 4

cggaagcggc tttggtcctg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> eGFP-F(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgt 25

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> eGFP-R(Artificial Sequence)

<400> 6

ttacttgtac agctcgt 17

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 35S-F(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcctacaa atgccatca 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 35S-R(Artificial Sequence)

<400> 8

actcgaattc tttttcagtt tc 22

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> KAN-F(Artificial Sequence)

<400> 9

atggggattg aacaagatgg attg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> KAN-R(Artificial Sequence)

<400> 10

tcagaagaac tcgtcaagaa ggcg 24

Claims (6)

1.一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，当种子发芽长至二叶期时，在第二个关节处剪去上面部分并剪去其他侧芽，或者当块茎长出2-4cm新芽时，切去芽生长点处的叶子及部分顶端分生组织，然后在剪掉的伤口处注射含目的基因的农杆菌菌液，暗培养5d后光照培养至伤口处再次长出小芽，再将含目的基因的农杆菌菌液喷射在新长出的小芽上，暗培养2d进行常规光培即可。

2.根据权利要求1所述的一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，所述种子为花生种子。

3.根据权利要求1所述的一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，所述块茎包括大蒜、土豆、香雪兰。

4.根据权利要求1所述的一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，所述含目的基因的农杆菌菌液的制备方法为：将包含目的基因的农杆菌培养至对数生长期，刮取农杆菌稀释到OD值为0.3-0.6，并加3％～5％体积的Sliwet L-77活化剂即得含目的基因的农杆菌菌液。

5.根据权利要求1所述的一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，所述目的基因包括35S:GFP，35S:GUS，pDR5:RUBY、35S:AhmTERF1,35S:AhmTERF1-RNAi。

6.根据权利要求1所述的一种快速实现植物遗传转化的方法，其特征在于，含目的基因的农杆菌菌液的注射量为100-150uL，含目的基因的农杆菌菌液的喷射量为50～100uL。

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