CN104561089B - 一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明所提供的方法为将甜瓜种子去壳、灭菌、浸泡后进行培育，得到转化受体，将含有目的基因的重组农杆菌活化、重悬，在子叶未展开前，去除转化受体的顶芽及侧芽，在子叶节分生组织处注射含有目的基因的重组农杆菌，诱导甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗，将其移栽至土壤中进行培养，最后利用卡那霉素筛选转基因植株。本发明的方法不需要培养基的无菌操作，产生的不定芽多，转化率高达16‑20％，受甜瓜基因型限制小，转化周期短，从植株侵染到收获当代种子仅需3‑4个月，20‑30d后可进行PCR检测，节省了大量时间、人员、财力、物力。

Description

一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用

技术领域

本发明涉及一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

遗传转化是指将外源基因通过直接、间接的方法将其导入到植物体中，外源基因随机整合到植物体基因组中，并且能够稳定遗传。将目的基因转入某一植物中，通过观察植物形态和生理行为的变化来认识基因的功能，是目前应用最多、技术最成熟的基因功能研究方法。由于基因表达受转化效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响，因此需慎重选择转化系统。虽然近几年来，农杆菌介导法转化甜瓜的技术已不断完善，但多数方法需经过外植体的脱分化和再分化的过程，且存在转化效率低、遗传稳定性差、转化周期长等问题。这些问题严重阻碍了功能基因的验证及转基因育种的进程。

甜瓜转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等。甜瓜属于双子叶植物，是公认难转化的植物，转基因的困难主要是组培再生能力很差、转化率低、重复性差、基因型局限等问题，所以利用农杆菌介导的基因工程手段进行甜瓜的遗传改良存在着很大的局限性。目前主要是靠大量的转化受体来获得转基因植株，普遍采用的农杆菌介导的甜瓜转基因体系包括子叶节法、下胚轴法、胚尖法等转化方法存在周期长，一般至收获种子需6-8个月，生根、移栽过程成功率低，并且转化率低于10％。因此，进一步研究建立新的、高效稳定的甜瓜转基因体系是十分必要的。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种转基因甜瓜组培苗的培育方法，该方法是将甜瓜种子去壳、灭菌、浸泡后进行培育，得到转化受体，将含有目的基因的重组农杆菌活化、重悬，在子叶未展开前，去除转化受体的顶芽及侧芽，在子叶节分生组织处注射含有目的基因的重组农杆菌，诱导甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗，将其移栽至土壤中进行培养，最后利用卡那霉素筛选转基因植株。

所述方法步骤如下：

1)甜瓜转化受体的培育：将甜瓜种子去壳灭菌，浸泡后播种到营养钵中培养，获得转化受体；

2)侵染液的准备：将含有目的基因农杆菌进行活化和重悬处理，获得含有目的基因的重 组农杆菌侵染液；

3)转化：对步骤1)所得转化受体进行剪切，在子叶未展开前，去除顶芽及侧芽，在子叶节分生组织处注射步骤2)所得含有目的基因的重组农杆菌侵染液；

4)芽诱导：诱导步骤3)中甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗；

5)成苗培养及筛选：将侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中进行培养，用卡那霉素涂抹新长出的叶片，保留叶片无变化的植株为转基因植株。

步骤1)所述转化受体的培育是将甜瓜种子去壳后，用70％酒精灭菌30s，再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次，每次泡1分钟，选取100粒饱满的种子，在55-60℃水中浸泡，用玻璃棒不断搅拌，至水温为室温后浸泡12h，然后将种子播到营养钵中，在光照强度2000Lx、日间温度25℃及夜间温度20℃的条件下，每日光照培养16h、每日黑暗培养8h。

步骤2)所述含有目的基因的农杆菌，目的基因为CmACS-7，农杆菌为根癌农杆菌EHA105，筛选标记基因为，具有卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因NPT II。

所述CmACS-7的引物序列如下：

CmACS-7，5′-F TTCAACAAATCTTCAGTTCAATTTCTCTC 3′

CmACS-7，5′-R AGAAAACAAGGATTTCTTTTTCTTTTTCCTCAG 3′

npt II-F GACTGGGCACAACAGACAATC

npt II-R ATACCGTAAAGCACGAGGAAG。

步骤2)所述侵染液的活化和重悬是将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液于28℃培养至OD₆₀₀＝0.8～1.2，然后在4000rpm下离心10min，用200μmol/L的乙酰丁香酮液体培养基重悬至OD600为0.6。

步骤3)所述注射重组农杆菌侵染液是通过管状针头向步骤1)所得的转化受体的子叶节分生组织处注射40μL重组农杆菌的悬浮液，置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下进行暗培养两天，然后见光培养，第3天重复滴加1次。

步骤4)所述芽诱导是将pH5.7且含有1/2MS、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05％表面活性剂SILWET-77的诱导液滴加到步骤3)的注射处，促进茎尖不定芽的分化，直到甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽。

步骤5)所述成苗的培养与筛选是将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中，在正常水肥条件下培养10天，长出新叶后，用100mg/L卡那霉素涂抹新叶，3天后，观察叶片是否变黄，野生型未转基因甜瓜的阴性植株的叶片变黄，转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色，去除叶 片变黄的植株，保留叶片无变化的植株。

所述方法具体步骤为：

1)转化受体的培育：将甜瓜种子去壳后，用70％酒精灭菌30s，再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次，每次泡1分钟，选取100粒饱满的种子，在55-60℃水中浸泡，用玻璃棒不断搅拌，至水温为室温后浸泡12h，然后将种子播到营养钵中，在光照强度2000Lx、日间温度25℃及夜间温度20℃的条件下，每日光照培养16h、每日黑暗培养8h，获得转化受体；

2)侵染夜的准备：将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液于28℃培养至OD₆₀₀＝0.8～1.2，然后在4000rpm下离心10min，用含200μmol/L的乙酰丁香酮液体培养基重悬至OD600为0.6，获得含有目的基因的重组农杆菌侵染液；

3)转化：对步骤1)所得甜瓜幼苗进行剪切，在子叶未展开前，去除顶芽及侧芽，通过管状针头向步骤1)所得的转化受体的子叶节分生组织处注射40μL重组农杆菌的悬浮液，置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下进行暗培养两天，然后见光培养，第3天重复滴加1次；

4)芽诱导：将含有1/2MS、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05％表面活性剂SILWET-77且pH5.7的诱导液滴加到步骤3)中的注射处，促进茎尖不定芽的分化，直到甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗；

5)成苗培养及筛选：将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中，在正常水肥条件下培养10天，长出新叶后，用100mg/L卡那霉素涂抹新叶，3天后，观察叶片是否变黄，野生型未转基因甜瓜的阴性植株的叶片变黄，转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色，去除叶片变黄的植株，保留叶片无变化的植株。

本发明所述方法，适用于培育转基因甜瓜组培苗。

本发明有益效果：

本发明针对现有技术的不足和缺陷，提供了一种甜瓜茎尖转基因方法来快速培养获得转基因甜瓜组培苗，本发明方法考虑到了农杆菌介导侵染进行转化时，湿度和光照对转化细胞组织分化的影响，并且对处理后的植株进行遮光保湿，保证了适宜湿度条件。本发明采用的茎尖不定芽转基因方法与其他方法相比，最大限度的保持了甜瓜植株的完整性，依赖其自身植株的正常生长，在诱导时考虑了根对激素等敏感性问题，注意了激素的配比情况，从而达到获得转化植株的目的，整个转化过程脱离了植物组织培养条件下各种因素的限制。

目前普遍采用的农杆菌介导的甜瓜转基因方法，周期长，一般收获种子需3-4个月，生根、移栽过程成功率低，并且转化率低于10％。而本发明提供的转化方法不需要培养基的无菌操作，产生的不定芽多，转化率高，转化效率可达16-20％，同时受甜瓜基因型限制小，转化周期短，从植株侵染到收获当代种子仅需3-4个月，20-30d后可进行PCR检测，培养液用量少，节省了大量时间、人员、财力、物力。

附图说明

图1转CmACS-7基因植株的PCR检测

(M，2kb Marker；11，质粒DNA；9，未转化植株；1-8，10转基因植株)。

图2转化植株的Southern blot检测

(1，3转化植株；2，质粒阳性对照；4，非转基因植物)。

图3甜瓜转化植株花器官形态观察

(A，C转化转基因植株M-23蔓上着生雌花；B，D非转化植株蔓上着生完全花和雄花)。

图4pBI121的质粒图谱。

图5注射重组农杆菌悬浮液示意图。

图6转化苗的筛选；

(A，抗性苗；B，非抗性苗)。

图7甜瓜转基因植株的PCR检测；

(M，2kb Marker；1，质粒；9，未转化植株；2-8转基因植株)。

图8甜瓜转基因植株的PCR检测；

(M，2kb Marker；1，质粒；3-9，转基因植株；2，未转化植株)。

图9转化植株的Southern blot检测；

(1，阳性对照；2，转基因植株；3-6，转化植株)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：甜瓜子叶节遗传转化法

1.甜瓜子叶节遗传转化法

无菌苗的获得：取上述试验品系大小均一、籽粒饱满的甜瓜，温汤浸种4-5h，流水冲洗，在超净工作台上先用75％酒精浸泡1min，然后用0.1％HgCl₂溶液浸泡15min，轻轻摇动几次，用无菌水冲洗4次，然后将种子分别平放于培养基1/8MS，水加琼脂中(其中每升含蔗糖30g、琼脂7.5g，pH值5.8)。28℃暗培养1-2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为25℃，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx。

(1)无菌苗获得培养基：1/8MS+1％蔗糖；

(2)预培养培养基:MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L；

(3)共培养及不定芽培养基:MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.1mg/L；

(4)伸长培养基：MS+6-BA 1.0mg/L，附加50mg/L浓度的卡那霉素(Km)和头孢霉素500mg/L(Cef)；

(5)生根培养基:1/2MS，附加50mg/L浓度的卡那霉素(Km)和头孢霉素500mg/L(Cef)。

2.转化植株的PCR检测

对获得的抗性植株移栽到田间，提取抗性植株株系和对照植株M-23的基因组DNA，用特异性引物进行扩增，共接种400个外植体，得到的再生苗共有11株扩增出2000bp左右的特异条带，初步统计PCR阳性率为2.25％。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。

3.Southern blot检测

为明确外源CmACS-7基因在甜瓜基因组中的整合拷贝数，提取部分经PCR鉴定比较明显的阳性植株基因组DNA，酶切后进行电泳转膜，以标记的基因探针与其进行Southernblot杂交。结果表明，有2株各有1条杂交带，外源基因以单拷贝形式整合到甜瓜基因组的DNA中(图2)。

4转化率的统计

采用农杆菌介导的组培转化方法，共获得PCR阳性植株9株，见表1。

表1 转化率的统计

由表1可知，按照传统方法的甜瓜子叶节遗传转化法得到的转化率仅为2.25％，转化率较低。

实施例2：

1)转化受体的培育

将甜瓜种子去壳后，用70％酒精灭菌30s，再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次，每次泡1分钟。选取品系M-22的100粒饱满的种子，在55-60℃水中浸泡，用玻璃棒不断搅拌，至水温为室温后浸泡12h，然后将种子播到营养钵中，在光照强度2000Lx、日间温度25℃及夜间温度20℃的条件下，每日光照培养16h、每日黑暗培养8h，获得转化受体。

2)侵染液的准备

植物表达载体pBI121(图4)，目的基因为CmACS-7，农杆菌为根癌农杆菌EHA105，筛选标记基因为，具有卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因NPT II(即新霉素磷酸转移酶基因，图4)，得到含有目的基因的重组根癌农杆菌EHA105/CmACS-7。用于下一步实验。

CmACS-7的引物序列如下：

CmACS-7，5′-F TTCAACAAATCTTCAGTTCAATTTCTCTC 3′

CmACS-7，5′-R AGAAAACAAGGATTTCTTTTTCTTTTTCCTCAG 3′

npt II-F GACTGGGCACAACAGACAATC

npt II-R ATACCGTAAAGCACGAGGAAG。

将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP培养液(溶剂为水，溶质及其浓度分别为：氯化钠5g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L)，于28℃培养至OD600＝0.8～1.2，然后在4000rpm下离心10min，用含200μmol/L的乙酰丁香酮液体培养基重悬至OD600为0.6，获得含有目的基因的重组农杆菌侵染夜。

3)转化

种子在营养钵中培养两天后，在子叶未展开前，去除顶芽及侧芽，通过内径为0.1mm、外径为0.24mm的管状针头(图5)向转化受体的子叶节分生组织处注射40μL重组农杆菌的悬浮液，置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下进行暗培养两天，然后见光培养，第3天重复滴加1次。

4)芽诱导

将含有1/2MS、1.0mg/L6-BA(6苄基腺嘌呤)、0.05％表面活性剂SILWET-77且pH5.7的诱导液滴加到步骤3)中的注射处，促进茎尖不定芽的分化，直到甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗；

5)成苗培养及筛选

将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中，在正常水肥条件下培养10天，长出新叶后，用100mg/L卡那霉素涂抹新叶，3天后，观察叶片是否变黄，部分结果如图6所示，野生型未转基因甜瓜M-22的阴性植株涂抹卡那霉素的叶片变黄(图6中的B图)，转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色(图6中的A图)。去除叶片变黄的植株，保留叶片无变化的植株。

6)PCR鉴定

取经步骤5)经卡那霉素筛选无明显变化的植株，提取基因组DNA，以该DNA为模板进行抗性基因NPT II和CmACS-7引物PCR扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，扩增产物中含有440bp的NPT II CmACS-7基因片段的植株为阳性转基因植株，不含有该片段的植株为阴性转基因植株，阳性率统计：经过用上述两种引物对阳性枝进行PCR检测(图7，图8)。

表2 转化过程中的数目统计结果

转化比率＝(PCR鉴定阳性植株数/注射幼苗数)×100。

由表2数据计算平均转化效率为18.7％。在进行PPT筛选时，去除阴性植株，选取阳性植株，获得的PPT阳性植株70％为第3、4个枝。若进行无筛选标记的转基因时，可去除首先长出的不定芽，保留第4个以后的不定芽。Southern杂交鉴定T1代转基因植株，通过X光片显影结果显示，基因以单拷贝形式插入到基因组中，杂交结果见图9。

实施例3:4个不同甜瓜基因型转基因效率分析

转基因受体：选取4个不同基因型的甜瓜品系M-23、WQ、M-76、M-19，每个品系选取50粒饱满种子，置于12cm培养皿中，上下各铺双层纱布，加蒸馏水(约100ml)刚好没过种子，于25℃培养箱暗下催芽萌发，25℃光照培养，2天后(子叶展开前)用刀片小心去除顶芽及侧芽，子叶节分生组织处注射含有目的DNA的重组农杆菌。

侵染液准备：将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP培养液(溶剂为水，溶质及其浓度分别为：氯化钠5g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L)于28℃培养至OD 600为0.8-1.2；4000rpm，离心10min，用如下液体培养基重悬至OD600为0.6得到重组农杆菌的悬浮液：乙酰丁香酮200μmol/L，将制备的重组农杆菌的悬浮液，通过内径为0.1mm、外径为0.24mm的管状针头注射(图5)到去除顶芽和侧芽的所述幼芽的子叶节分生组织处，每个所述幼苗注射40μL，将所述幼苗置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下培养。进行暗培养两天后，然后见光培养。

芽诱导阶段：每天在伤口处滴加芽诱导培养液，诱导新芽的分化生长，分化的生长点处膨大，并不断分化出不定芽。随着不定芽的继续生长，长势旺盛的芽开始伸长生长，获得侵染甜瓜幼苗。

成苗培养及筛选：将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中于正常水肥条件下培养10天，直到长出新叶后，用100mg/L的卡那霉素涂抹新长出的叶片，3天后，观察叶片是否变黄，野生型未转基因甜瓜的阴性植株涂抹卡那霉素的叶片变黄，转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色。去除叶片变黄的植株，保留叶片无变化的植株。

PCR鉴定：取经经卡那霉素筛选无明显变化的植株，提取基因组DNA，以该DNA为模板进行抗性基因引物PCR扩增，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，扩增产物中含有440bp的NPT II CmACS-7基因片段的植株为阳性转基因植株，不含有该片段的植株为阴性转基因植株，阳性率统计：经过用上述两种引物对阳性枝进行PCR采用筛选标记基因NPT II和目的基因CmACS-7GmFB双重引物(与实施实例2中的引物相同)。

阳性率统计：经过用两种引物对阳性植株进行PCR检测，4个品种平均阳性率为17％，具体见表3。

表3 不同甜瓜基因型转化率结果

品种	转化效率(％)
		M-23	16
WQ	16
		M-76	20
M-19	16

将实施例1-3培养方法取得的效果进行对比，结果如表3所示：

表3 实施例1和实施例2、3培养方法效果的对比

	转化周期d	转化效率％
			实施例1	90-100	2.25
实施例2	40-50	18.7
			实施例3(M-23)	40-50	16
实施例3(WQ)	40-50	16
			实施例3(M-76)	40-50	20
实施例3(M-19)	40-50	16

从表3可以看出，本发明所提供的方法(实施例2和实施例3)，在转化率方面明显优于现有方法(实施例1)，转化率得到了显著提高，同时就转化周期来说，大大缩短了获得转基因苗的时间，同时避免了组织培养过程中对无菌的要求，也最大限制地了克服了组培中基因型的限制。

本发明方法考虑到了湿度和光照对转化细胞组织分化的影响，本申请对处理后的植株进行遮光保湿，保证适宜湿度条件。本发明的茎尖不定芽转基因方法、最大限度的保持了甜瓜植株的完整性，依赖其自身植株的正常生长，从而达到获得转化植株的目的，整个转化过程脱离了植物组织培养条件下各种因素的限制。本发明提供的转化方法不需要培养基的无菌操作，产生的不定芽多，转化率高，同时受甜瓜基因型限制小，转化周期短，从植株侵染到收 获当代种子仅需3-4个月，20-30d后可进行PCR检测，培养液用量少，节省了大量时间、人员、财力、物力。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种转基因甜瓜组培苗的培育方法，其特征在于，步骤如下：

1)甜瓜转化受体的培育：将甜瓜种子去壳后，用70％酒精灭菌30s，再用0.05％升汞消毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次，每次泡1分钟，选取100粒饱满的种子，在55-60℃水中浸泡，用玻璃棒不断搅拌，至水温为室温后浸泡12h，将种子播到营养钵中，在光照强度2000Lx、日间温度25℃及夜间温度20℃的条件下，每日光照培养16h、每日黑暗培养8h，获得转化受体；

2)侵染液的准备：将含有CmACS-7的重组根癌农杆菌EHA105的单菌落用含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养液于28℃培养至OD₆₀₀＝0.8～1.2，然后在4000rpm下离心10min，用200μmol/L的乙酰丁香酮液体培养基重悬至OD600为0.6,获得含有目的基因的重组农杆菌侵染液；

3)转化：对步骤1)所得转化受体进行剪切，在子叶未展开前，去除顶芽及侧芽，在子叶节分生组织处注射步骤2)所得含有目的基因的重组农杆菌侵染液；所述注射重组农杆菌侵染液是通过管状针头向步骤1)所得的转化受体的子叶节分生组织处注射40μL重组农杆菌的悬浮液，置于25℃、黑暗、湿度为90％的条件下进行暗培养两天，然后见光培养，第3天重复滴加1次；

4)芽诱导：诱导步骤3)中甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽，芽伸长生长获得侵染甜瓜幼苗；所述芽诱导是将pH5.7且含有1/2MS、1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05％表面活性剂SILWET-77的诱导液滴加到步骤3)的注射处，促进茎尖不定芽的分化，直到甜瓜茎尖生长点分化处膨大出不定芽；

5)成苗培养及筛选：将培养的侵染甜瓜幼苗移栽至土壤中，在正常水肥条件下培养10天，长出新叶后，用100mg/L卡那霉素涂抹新叶，3天后，观察叶片是否变黄，野生型未转基因甜瓜的阴性植株的叶片变黄，转基因植株涂抹卡那霉素的叶片仍为绿色，去除叶片变黄的植株，保留叶片无变化的植株。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述含有目的基因的农杆菌，目的基因为CmACS-7，农杆菌为根癌农杆菌EHA105，筛选标记基因为，具有卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶基因NPT II；所述CmACS-7的引物序列如下：

CmACS-7，5′-F TTCAACAAATCTTCAGTTCAATTTCTCTC 3′

CmACS-7，5′-R AGAAAACAAGGATTTCTTTTTCTTTTTCCTCAG 3′

npt II-F GACTGGGCACAACAGACAATC

npt II-R ATACCGTAAAGCACGAGGAAG。