CN102080100A

CN102080100A - 农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法

Info

Publication number: CN102080100A
Application number: CN 201010572321
Authority: CN
Inventors: 于喜艳; 马乐园; 郝慧; 单文英; 范建光
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2011-06-01

Abstract

本发明提供了一种高效的甜瓜遗传转化方法，包括以甜瓜子叶或子叶节为外植体，将外植体浸入农杆菌菌液中浸泡，随后在培养基中诱导、培养芽，待芽长到高1-3cm高时，在培养基中生根、移栽。本发明建立的优化转化方法，显著提高了甜瓜的转化效率，解决了甜瓜利用农杆菌转化的难度问题，对甜瓜植物的基因工程研究与应用具有重要价值。

Description

农杆菌介导的甜瓜遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效基因转化方法。

技术背景

转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法，并使其成为基因工程和育种的最有效途径，目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等，其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。通过基因工程技术将外源基因导入植物细胞是现代遗传育种的重要途径，外源基因转化，整合到受体植物细胞基因组中是植物基因工程的重要环节。但目前研究的瓶颈在于遗传转化的效率，因此高效遗传转化方法的研究在生物工程领域中尤其重要。

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，1970年人们发现它是植物致瘤的起因，它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，植物细胞被侵染后形成肿瘤，能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌，诱发毛状根的称为发根农杆菌。其中根癌农杆菌在转基因技术中的应用相对较多。根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA(T-DNA)，具有向植物细胞传递外源基因的能力，而细菌本身并不进入受体细胞。

根癌农杆菌一植物DNA转移步骤包括：1)植物敏感细胞和根癌农杆菌的相互作用。植物受伤后产生大量对根癌农杆菌感染敏感的细胞。受伤细胞产生一些低分子量的酚类物质可以明显刺激根癌农杆菌Ti质粒上的Vir区基因表达，其中刺激效果较好的两种分子为乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这两种化合物是由代谢活跃的受伤细胞特异合成和分泌的。根癌农杆菌染色体上的基因是细菌体内持续表达的基因，大多编码一些膜相关蛋白，植物受伤后水解生成的单糖与根癌农杆菌相应蛋白结合，使细菌向植物受伤细胞趋化移动。另一些基因编码的蛋白帮助细菌附着于植物受伤细胞。2)Ti质粒毒性区基因的激活。农杆菌附着到植物受伤细胞后，Vir区基因的激活主要通过VirA-VirG二元调节系统进行。植物分泌的乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮信号分子与VirA蛋白结合并激活VirA蛋白，VirA蛋白又使VirG蛋白磷酸化结构改变而被激活，激活的VirG蛋白对VirG基因本身也有诱导作用，结果产生一种放大式的瀑布效应，然后VirG蛋白与各毒性区5’端非转录区的“毒性盒”序列相结合，启动各毒性区的转录。后来人们发现，在缺少乙酰丁香酮的情况下，一些小分子量的糖类，如半乳糖和葡萄糖，也可极大促进Vir区基因的表达。这说明Vir区基因的表达受酚类化合物和糖类的双重调节。VirH有两个基因，其编码的蛋白与细胞色素P450酶相似，可能对植物产生的某些杀菌或抑菌化合物起解毒作用，从而使农杆菌的生长不受这些物质的抑制，可增强附着和致癌能力。3)T-DNA的切割和T-复合体的生成。在Vir区，VirD编码两种蛋白VirD1，VirD2。VirD蛋白与T-DNA的加工有关，它决定在边界重复序列的特定位点上形成切口，产生T链断裂。切割分两步进行：首先是VirD1与25bp边界序列亲合结合使边界序列松弛，然后是VirD2在特异位点剪切。VirD2至少有两个功能，一是特异剪切，并与T链5’端共价结合；二是作为核定位信号的导向功能，即引导T链进入植物的细胞核。VirC编码两种蛋白VirC1及VirC2，VirC1蛋白可特异地与章鱼碱型Ti质粒上的超驱动序列结合，从而促进T-DNA边界序列的缺口剪切。VirC2的功能目前尚不清楚，但VirC2突变能导致缺刻形成的减少，因此它可能也对缺刻形成有一定贡献。T-DNA链必须横向跨越细菌细胞膜、植物细胞膜及核膜，才能整合进植物基因组。在整个运转过程中，T-DNA链必须被保护形成T-DNA-蛋白复合体才能避免被核酸酶降解。4)T-复合体由根癌农杆菌经细菌细胞膜进入植物细胞膜。经过包被，有了核定位信号，有了助推蛋白T-复合体要实现转移的第一个关口是细菌细胞膜。这需要形成跨膜通道，需要有跨膜或膜结合蛋白的参与。VirB操纵子的各个基因在T-复合体穿过细菌膜而运转中起着重要作用。章鱼碱型VirB区有11个开放阅读框架。按功能可将VirB蛋白分成五类：A：在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T-复合体的受体。B：蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促使T-复合体被泵出细菌细胞。C：起形成通道的作用。S：载体蛋白，起运载T-复合体穿过通道的作用。P：位于外膜上作为结合植物细胞膜的一种受体。从它们的氨基酸序列推导它们编码的蛋白质具有穿膜或膜相关蛋白的特性。5)T-DNA整合到植物染色体上。T-DNA整合的过程类似于在哺乳动物细胞中发现的非正常重组。非正常重组包括两个基本步骤：I.DNA末端的生成；II.DNA末端再连接。DNA非正常重组有几个特点：a.T-DNA瞄准整合的位点没有序列特异性。从理论上讲，T-DNA整合可以在植物染色体上的任何部位发生，T-DNA整合位点随机分布于植物基因组。b.整合部位的植物DNA有一小段与T-DNA端点附近区域同源的序列，这种序列一般只需要几个碱基的长度。C.在重组发生部位可能找到一些额外的核苷酸序列，它们被称作填充DNA。T-DNA可以一到多拷贝插入植物基因组。

农杆菌介导法起初只被用于一些双子叶植物转化中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化方法是目前研究最多，理论机理相对清楚，技术方法最成熟的基因转化途径。但是，对于一些组培再生能力极其困难的植物来说，该方法的应用却存在着一定的局限性。

甜瓜(Cucumis melo L.)虽属双子叶植物，但是组培再生能力很差。所以利用农杆菌介导的基因工程手段进行甜瓜的遗传改良存在着很大的局限性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的甜瓜组织培养难、基因转化效率低的问题，本发明提供了一种高效的甜瓜遗传转化方法，包括以下步骤：

1)将甜瓜外植体浸入农杆菌菌液中浸泡10-15min，接入MS+6-BA 6.0mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基中，暗培养两天；

2)将共培养后的外植体转入芽诱导培养基中诱导芽，芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+羧苄青霉素500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L；

3)将诱导芽转入芽伸长培养基中培养，芽伸长培养基为MS+6-BA 0.1mg/L+羧苄青霉素500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L；

4)待芽长到高1-3cm，转入生根培养基MS+羧苄青霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L上生根培养；

上述步骤2)-4)的培养条件为温度25℃，光照16hr/d，光照强度为3000Lx。

上述的外植体优选为子叶或子叶节。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1.本发明提供的方法，操作比较容易，费用低，需要仪器设备简单，易于推广。

2.农杆菌介导的转化，外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料。

3.利用甜瓜无菌苗子叶或子叶节作为遗传转化的外植体，具有取材不受季节限制，诱导再生快，转化突变频率低等优点。

4.本发明建立的优化转化方法，显著提高甜瓜的转化效率，解决了甜瓜利用农杆菌转化的难度问题，对甜瓜植物的基因工程研究与应用具有重要价值。

附图说明

图1正义CmSPS1基因表达载体结构示意图。

图2甜瓜子叶外植体与农杆菌的共培养。

图3芽诱导培养基上诱导芽的形成。

图4芽伸长培养基上芽的伸长。

图5芽转入生根培养基诱导根的形成。

图6转基因植株和对照植株在发育过程中的株高(A)，茎粗(B)，叶面积(C)和净光合速率(D)的变化。

图7非转基因植株(对照)(A)和转基因植株(B)在果实发育过程中糖的含量变化。蔗糖(▲)，葡萄糖(●)，果糖(○)，和总糖(◆)浓度。

具体实施方式

1.目的基因的克隆及正义表达载体的构建

本发明所提供的方法对于目的基因没有限制。

本实施方式以甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)为例。基因全长为3373bp，编码1054个氨基酸，在GenBank中登记号为DQ521271，命名为CmSPS1。与GenBank中登录的其它植物的SPS基因进行氨基酸同源性比较，与番茄同源性最高，达到98.96％，其次与马铃薯的同源性为96.77％，与甜菜、猕猴桃、甘薯的同源性分别为84.72％、75.65％和73.72％。

将CmSPS1基因克隆到pMD18-T载体上，用BamH I和Kpn I于37℃条件下进行酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒回收约3373bp的片段，将该片段与经BamH I和Kpn I酶切的植物表达载体PROK2(也可用其它的类似植物表达载体构建)，用T₄DNA连接酶于16℃条件下进行连接反应，过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a，从卡那霉素(Km)平板上挑取单菌落提取质粒进行酶切及PCR鉴定。

从Km平板上挑取单菌落，用碱变性法从培养的大肠杆菌中提取重组质粒，做酶切、PCR及测序验证。鉴定结果表明成功构建了甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因的正义表达载体。利用冻融法将该表达载体转入农杆菌LBA4404。制备农杆菌菌液，OD600＝0.3左右。

构建完成的正义CmSPS1基因表达载体结构示意图如图1所示。上述表达载体的构建方法仅是示例性的，目的基因表达载体的构建方法并不限于此，本领域技术人员可根据现有技术适当构建。

2.农杆菌介导的甜瓜的高效遗传转化

(1)外植体与农杆菌共培养(设非转基因对照)

将甜瓜种子小心去壳，在0.1％HgCl₂中消毒5min，用无菌水小心冲洗5次，将种子接种于MS基本培养基中，在27℃培养箱中培养，待子叶完全展开后，在超净台上切取无菌苗子叶，将其切去顶部和基部，再横切为二备用。也可用子叶节。

农杆菌菌液用消毒过的MS液体培养基稀释20倍，将上述处理过的子叶浸入稀释后的农杆菌菌液中浸泡10min，再用消毒滤纸吸干外植体表面水分，接入MS+6-BA 6.0mg/L+乙酰丁香酮(Acetosyringone)100μmol/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L的培养基中，暗培养两天(如图2所示)。

(2)芽诱导培养

共培养之后，将外植体用无菌双蒸水冲洗三次，然后转入芽诱导培养基MS+6-BA3.0mg/L+羧苄青霉素(Cab)500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，根据目的基因表达载体中的抗生素标记基因可适量加入抗生素进行初级筛选，本实施方式中加入卡那霉素(Km)70mg/L，在温度25℃，光照强度为3000Lx，光照16hr/d的培养条件下，诱导芽产生(如图3所示)。

(3)芽伸长培养

待外植体分化出芽后，将不定芽转入芽伸长培养基MS+6-BA 0.1mg/L+羧苄青霉素500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，如同步骤(2)可适量加入抗生素，在温度25℃，光照强度为3000Lx，光照16hr/d的培养条件下培养(如图4所示)。

(4)生根培养

待芽长到高2cm左右，转入生根培养基MS+羧苄青霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L上，如上述步骤适量加入抗生素，在温度25℃，光照强度为3000Lx，光照16hr/d的培养条件下生根，(如图5所示)。待芽生根后移栽至大田种植。

(5)转化效果验证

A转基因植株的鉴定和转化效率提取抗性苗DNA进行PCR初步鉴定，鉴定出的阳性植株进一步做Southern Blot鉴定。鉴定结果表明此遗传转化方法的转化率为3.91％，大约是以往文献报道的转化率的三倍。

B转基因甜瓜植株生长势加强，光合作用提高在本研究中，我们发现转基因甜瓜植株株高高于对照植株，茎粗也比对照植株明显增粗。在整个植株生长发育过程中转基因植株的叶面积都比对照的大，成熟转基因植株的叶面积大约比对照增加了30％左右。在植株发育的前期，转基因植株的光合速率与对照植株的差别不大，但是在植株发育的后期，转基因植株的光合速率明显高于对照植株(如图6所示)。

C转基因甜瓜果实含糖量显著提高甜瓜品质主要决定于果实中可溶性糖的含量，甜瓜果实中主要的可溶性糖是蔗糖、果糖和葡萄糖。其中蔗糖含量达到总糖含量的60-70％左右，所以蔗糖含量是甜瓜品质优劣的主要决定因素。我们利用高压液相色谱检测了转基因植株和对照植株果实中可溶性糖的含量，结果表明转基因植株果实中果糖和葡萄糖含量几乎没有变化，而蔗糖含量显著提高，转基因植株果实中蔗糖含量比对照植株果实中蔗糖含量提高了60％左右(如图7所示)。说明甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因对甜瓜转化的成功。

Claims

1.一种高效的甜瓜遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：

4)待芽长到高1-3cm，转入生根培养基MS+羧苄青霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L上生根培养、移栽；

上述步骤2)-4)的培养条件为温度25℃，光照16hr/d，光照强度为3000Lx 。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植体为子叶或子叶节。