CN105039354A - 紫花苜蓿MsSOS3基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3及其编码蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的基因开放读码框全长647bp，编码215个氨基酸。具有SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，利用此序列信息，克隆该基因，构建MsSOS3基因的克隆载体以及植物表达载体，并将该基因以农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsSOS3基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsSOS3基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供理论依据。

Description

紫花苜蓿MsSOS3基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3及其编码蛋白和应用。

背景技术

土壤盐碱化是影响农业生产重要因素之一，研究植物耐受机理和提高作物耐盐碱性已经日渐成为广泛关注的问题。盐碱胁迫通常会对植物造成离子失衡，氧化胁迫，渗透胁迫等伤害，碱胁迫的高pH更是可以直接对细胞质膜造成伤害。长期以来，研究者利用形态学和生理学的研究方法已经初步认识了植物应对盐碱胁迫的代谢机制，并以基因克隆和遗传转化等技术分析上述过程中部分关键基因的功能，基因芯片技术也用于研究盐碱胁迫下植株的转录组变化特征，例如拟南芥，水稻等植物。尽管近年来已经鉴定了一系列逆境胁迫信号转导途径及相关基因，但是目前对植物耐盐碱机制研究的资料仍然十分匮乏，完善的植物盐碱耐受机制尚未建立，值得进行更加深入的研究。

植物在适应盐碱胁迫的过程中，形成了一系列胁迫响应机制以提高植株对胁迫的耐受能力，如渗透调节，离子区域化，活性氧清除系统等。其中，胁迫信号感受和转导是引起植物产生胁迫响应的关键骤。SOS信号转导途径，作为植物耐盐性相关的重要信号转导途径之一，不仅参与植物胁迫响应，还可以和其他信号途径交叉形成信号网络共同发挥对不同生物学过程的调控作用。

由SOS家族基因构成的SOS代谢通路可以在钙离子信号通路的调节下将胞内过量的钠离子排出体外，维持胞内离子稳态。SOS3是SOS途径中重要的钙离子响应蛋白，起到下游离子转运蛋白SOS1和调控蛋白SOS3之间的关联作用。

紫花苜蓿作为种植广泛的牧草，一直缺少适应于盐碱地栽培的抗盐、抗碱、高产、优质的品种。苜蓿产业的发展对我国畜牧业发展具有极其重要的意义。紫花苜蓿在复合盐碱胁迫下的生态与生理特征指标表明，低浓度的盐碱对苜蓿的生长的影响较弱，紫花苜蓿能够较好地适应低浓度盐碱胁迫的环境条件。肇东苜蓿是豆科车轴草属多年生草本植物，属于四倍体紫花苜蓿，中等耐盐植物，对盐碱环境有较强的耐受能力，是我国东北地区紫花苜蓿的当家品种。

因此，对肇东苜蓿中SOS家族成员的克隆和功能鉴定可以揭示肇东苜蓿的耐盐碱机制，对苜蓿的遗传育种，品种改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3及其编码蛋白和应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3，该基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本发明还公开了编码上述的紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了含有上述的紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3的表达载体。

本发明还公开了上述紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性的应用。

进一步地，构建含有上述基因MsSOS3的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体转化到植物烟草组织中，筛选获得盐碱抗性增强的植株。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明克隆了紫花苜蓿MsSOS3基因，并构建植物表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，获得转MsSOS3基因烟草，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsSOS3基因的过表达提高了转基因植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsSOS3基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供理论依据。

附图说明

图1为MsSOS3在Pfam中功能比对结果；

图2为MsSOS3与其他物种蛋白系统进化树；

图3为植物表达载体pCBM-SOS3构建示意图

图4为转MsSOS3基因烟草幼苗(T₀)叶片PCR检测图；

其中，“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，0为空白对照，1-12为PCR获得的目的条带，与阳性一致，为转基因植株；

图5为MsSOS3转基因烟草与野生型烟草在盐胁迫处理下的表型实验；其中，CK为300mmolL^-1NaCl胁迫处理0天和5天后的野生型烟草叶片，L1为300mmolL^-1NaCl胁迫处理0天和5天后的转基因烟草叶片。

图6为MsSOS3转基因烟草L1与野生型烟草WT在300mmolL^-1NaCl胁迫处理0天和5天后烟草叶片的叶绿素含量；

图7为L1与WT烟草叶片在300mmolL^-1NaCl胁迫处理5天后叶绿素含量变化量。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、紫花苜蓿MsSOS3基因的克隆

从NCBI数据库中((http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索紫花苜蓿近源物种蒺藜苜蓿的EST序列并保存，用数据库中已知的拟南芥AtSOS3序列在BioEdit软件中对保存的蒺藜苜蓿EST序列文本文件进行LocalBlast，这样就获得了蒺藜苜蓿中SOS3基因EST序列。利用该序列设计引物，引物为：

MsSOS3-F：5'-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3'；

MsSOS3-R：5'-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3'。

具体流程如下：

1)RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取紫花苜蓿(Medicagosativa)幼叶RNA，反转录为cDNA，并以此cDNA为模板RT-PCR扩增MsSOS3全长序列；

2)RT-PCR反应：用KOD-plusDNA聚合酶(Toyobo)进行RT-PCR反应，反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15sec；57℃退火30sec；68℃延伸50sec；25个循环；72℃延伸10min。将RT-PCR产物5'末端磷酸化，将磷酸化后的片段克隆到pBluescriptIIsk+(Stratagene,California,USA)质粒载体中的EcoRV位点；

3)重组质粒转化到大肠杆菌DH5α(Toyobo)中，将插入的核苷酸序列利用CEQ8000DNASequencer(BeckmanCoulter,California,USA)进行测序；

4)最终鉴定得到MsSOS3基因ORF的全长序列。MsSOS3基因cDNA全长为647bp，该基因编码215个氨基酸。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与MtSOS3(Medicagotruncatula.L)相比，氨基酸同源性为98％，具备3个保守的EFhind结构域，如图1所示。通过对其它物种中近源基因的比对及进化树构建可见，紫花苜蓿SOS3基因与模式植物拟南芥及水稻等物种中近源基因的进化关系较远，见图2。

2、紫花苜蓿MsSOS3基因植物表达载体构建

1)以本发明中MtSOS3的cDNA序列，设计引物如下：

MsSOS3-F：5'-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3'；

MsSOS3-R：5'-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3'。

以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增MsSOS3基因序列。

反应条件：

PCR产物低温保藏备用。

2)用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收PCR产物，将回收的PCR产物与pMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10，挑取转化阳性的克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的克隆用于后续实验。

3)将pCBM质粒用PstI进行酶切，去磷酸化，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段，同时用PstI进行酶切连接在T载体的SOS3片段，并回收，将回收的SOS3片段与pCBM载体片段连接，然后后转化Top10感受态细胞，获得重组克隆，结果酶切和PCR检测后将正确的克隆命名为pCBM-SOS3，载体图如图3所示。

3、农杆菌介导法转化烟草

1)烟草的培养

野生SR-1种子30到40粒用75％的酒精浸泡3min，之后用灭菌的蒸馏水冲洗5到6次，在用10％的次氯酸钠原液浸泡15min，用灭菌的蒸馏水冲洗5到6次，将种子倒入装有MS固体培养基的皿中。培养出小苗之后，放到装有MS的大瓶中继续培养，等待用其叶片进行侵染。

2)农杆菌菌液制备

挑取-80℃冻存的带有MsSOS3基因的农杆菌甘油菌在YEB+50mg/LRif+50mg/LKm+50mg/LStr的固体培养基上活化培养，并在28℃培养箱中倒置培养36-48h，将活化得到的农杆菌单菌落接种于相同成分的YEB液体培养基中，28℃振荡培养约16-24h，OD₆₀₀＝0.4-0.6。取出培养液按照1：10接种相同成分的YEB液体培养基中进行二次活化，当OD₆₀₀＝0.4-0.6时，将菌液倒入无菌的50ml的离心管，于4℃条件下，5000rpm离心10min，去掉上清液，用MS培养液重悬菌体至OD₆₀₀为0.4左右，用于转化。

3)烟草的侵染

在超净工作台内，将重悬的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将培养的烟草SR-1叶片切至0.8mm的方形，作于外植体置于菌液中浸泡8min，其间不断震荡。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着菌液，叶背面朝上接种于诱导愈伤组织形成的培养基MS₁(MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA)，在25±2℃条件下暗培养48-72h。然后接种到MS₂(MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.1mg/LPPT+500mg/LCef)培养基上进行筛选培养，每20d更换一次诱导培养基。经过侵染的叶片长出新的幼芽时，放入到MS₃(MS+1.3mg/LPPT+500mg/LCef)培养基中进行生根，以待后续分子鉴定。

4)转基因烟草小量DNA的提取

称取植物样品0.1g，液氮研磨，向管中加入700μl预热到65℃的2×CTABBuffer缓冲液，混匀，65℃水浴45min，每5min轻轻的颠倒混匀，之后将离心管取出置于冰上，冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇摇匀，13000rpm离心10min，取上清，向管中加入与上清等体积的氯仿-异戊醇(24：1)轻轻混匀，4℃，13000rpm离心10min，取上清，加1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰乙醇(或等体积异丙醇)，轻轻摇匀至出现絮状沉淀，置-20℃醇沉30min，之后离心15min，弃上清，加入500μl预冷的70％乙醇冲洗，离心10min，弃上清，空气干燥，加入20μl去离子水溶解。

4、转MsSOS3基因的烟草转化体的获得以及转化体的PCR检测

PCR鉴定：SOS3内部基因引物如下

Primer1：5’-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3’

Primer2：5’-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3’

反应条件：

参见图4，以提取的阳性植株的DNA为模板，用SOS3内部基因引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示编号1-12为PCR获得的目的条带，与阳性一致(即能扩增出大约510bp的目标DNA条带)，为转基因植株。其中，“+”为阳性对照，“-”为阴性对照(即以野生型植株基因组DNA为模板的PCR检测结果)，0为空白对照。

5、转基因烟草植株功能的初步验证

1)配制300mmolL^-1NaCl培养液

2)取野生型和转基因烟草相同状态的叶片，用7mm直径的打孔器打孔，用NaCl培养液胁迫处理5天，观察叶片变化，记录并拍照。无论MsSOS3转基因烟草还是野生型烟草，在盐胁迫下，随着NaCl处理天数的增加，叶片受损伤程度也逐渐严重，但总体来说，转基因烟草叶片受损伤程度弱于对照。经300mmolL^-1NaCl处理5天后，对照株系叶片变白，转基因株系叶片变白数较少，参见图5。这说明MsSOS3基因在烟草中的表达能在一定程度上提高烟草对盐碱胁迫的抗性。

3)取上述胁迫处理5天的叶片，提取叶绿素测定叶绿素含量，得出胁迫处理5天的打孔叶片的叶绿素含量变化量。测叶绿素含量方法如下：

①0.1g叶片放入预冷的研钵中，加1ml预冷80％丙酮，加入少量石英砂研磨

②转移液体到大离心管中，用80％丙酮洗研钵直至无色。

③10000rpm，离心5min，4℃。

④取上清(记取上清量)。

⑤像沉淀中加入80％丙酮，洗沉淀，再离心，直至沉淀无色(记取上清量)。

注：取上清的离心管暗处理。

⑥样品测定：取3ml上清液在645nm和663nm处测吸光值。80％丙酮调零。

⑦结果计算：C_a＝12.72A₆₆₃—2.59A₆₄₅

C_b＝22.88A₆₄₅—4.67A₆₆₃

C_a十b＝20.21A₆₄₅+8.02A₆₆₃

叶绿素含量(mg·g^-1或mg·dm^-2)＝C×V/A×1000

式中：C为叶绿素浓度(mg·L^-1)；V为提取液总体积(ml)；A为取样鲜重(g)。

转基因植株和野生型植株在300mM氯化钠胁迫5天后，叶绿素含量皆大幅下调，参见图6。转基因植株在胁迫5天条件下，叶绿素含量变化量显著低于相同胁迫条件下野生型植株，野生型植株受到胁迫叶绿素下调变化率为62.9％，转基因植株的变化率为49.9％，较野生型有显著耐受性，如图7所示。

综上所述，本发明公开了紫花苜蓿的MsSOS3基因及其克隆方法和应用，该基因开放读码框全长647bp，编码215个氨基酸。利用此序列信息，克隆该基因，构建MsSOS3基因的克隆载体以及植物表达载体，并将该基因以农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsSOS3基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsSOS3基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供理论依据。

Claims (5)

1.一种紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3，其特征在于，该盐碱胁迫响应基因MsSOS3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.由权利要求1所述的紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3的表达载体。

4.权利要求1所述紫花苜蓿盐碱胁迫响应基因MsSOS3在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，构建含有权利要求1所述基因MsSOS3的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体转化到植物烟草组织中，筛选获得盐碱抗性增强的植株。