CN105925589B - 一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用 - Google Patents

一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的基因开放读码框全长1068bp，编码355个氨基酸。具有SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，利用此序列信息，克隆该基因，构建MsFLS基因的克隆载体以及植物表达载体，并将该基因以农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsFLS基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsFLS基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供了理论依据。

Description

一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用。
背景技术
黄酮类物质是植物次生代谢产物中的一个庞大家族。在植物中，黄酮类化合物广泛参与各种生物学过程，包括对病原体的响应、授粉、光通路、种子发育等。另外，许多黄酮类化合物的生物合成受到环境胁迫的诱导，因此，在植物受到生物或非生物胁迫时，黄酮类物质的表达水平会显著增加，例如病原体，营养缺乏，盐碱胁迫等。这些环境胁迫因素的共同特点是，他们都会产生和积累次生活性氧，如超氧阴离子(O2 –)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH)和单线态氧(1O2)等。而活性氧的积累会导致胞内产生氧化胁迫从而造成细胞组分的损伤，例如核酸，脂质，蛋白和多糖等物质。植物细胞有一个复杂而完整的活性氧代谢系统，包括酶促和非酶促调节机制。
类黄酮物质中包括多种广为人知的抗氧化物质参与植物活性氧代谢，例如抗坏血酸，α-生育酚等。体外实验中，黄酮类物质作为氢离子和电子供体参与细胞的抗氧化代谢中，抵御氧化胁迫的损伤。黄酮醇合成酶(FLS)是类黄酮合成代谢中的关键酶之一，催化3-羟基黄酮生成黄酮醇，在盐碱胁迫条件下受诱导大幅上调，进而调控类黄酮物质在胁迫下的响应。
土壤盐碱化是影响农业生产重要因素之一，研究植物耐受机理和提高作物耐盐碱性已经日渐成为广泛关注的问题。盐碱胁迫通常会引起植物细胞离子和渗透压的失衡，并因此引发次级的胁迫伤害，例如活性氧积累而形成的氧化胁迫，盐碱胁迫伴随的高pH更是可以直接对细胞质膜造成氧化损伤。长期以来，研究者利用形态学和生理学的研究方法已经初步认识了植物应对盐碱胁迫的响应机制，并以基因克隆和遗传转化等技术分析上述过程中部分关键基因的功能，基因芯片技术也用于研究盐碱胁迫下植株的转录组变化特征，例如拟南芥，水稻等植物。尽管近年来已经鉴定了一系列逆境胁迫信号转导途径及相关基因，但是目前对植物耐盐碱机制研究的资料仍然十分匮乏，完善的植物盐碱耐受机制尚未建立，值得进行更加深入的研究。
紫花苜蓿作为种植广泛的牧草，有“牧草之王”的美称，在世界范围内广泛种植，是美国第三大作物，在我国也有大面积种植，是一种极具经济价值的豆科牧草。紫花苜蓿属于中等耐盐碱植物，对盐碱胁迫具有一定的耐受能力，但盐碱胁迫仍是影响中国东北地区紫花苜蓿产量的主要环境因素之一，严重限制了该地区紫花苜蓿的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS及其编码蛋白与应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS，该抗盐碱基因MsFLS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
该抗盐碱基因MsFLS全长为1068bp，编码355个氨基酸。
本发明公开了由上述紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明公开了含有上述的紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的表达载体，该表达载体为植物表达载体pCBM-FLS。
本发明还公开了上述的紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用。
构建含有权利要求1所述紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，筛选获得盐碱抗性增强的植物。
本发明还公开了上述紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS编码的蛋白在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明从紫花苜蓿中获得MsFLS基因的全长cDNA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明克隆了紫花苜蓿MsFLS基因，并通过农杆菌介导法转化烟草，获得过表达MsFLS基因烟草，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的盐碱耐受能力，说明MsFLS基因的过表达提高了转基因植株对盐碱的抗性，说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsFLS基因为研究苜蓿抗逆分子机理及育种提供理论依据。
附图说明
图1为MsFLS的核苷酸和氨基酸序列信息；
图2为MsFLS与其他物种同源蛋白系统进化关系；
图3为植物表达载体pCBM-FLS构建示意图
图4为过表达MsFLS转基因烟草幼苗叶片PCR检测图；
其中，“+”为阳性对照，“-”为阴性对照，0为空白对照，1-12为PCR获的目的条带，与阳性一致，为转基因植株；
图5为MsFLS转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-1碳酸氢钠胁迫处理0天和7天后的叶片表型；
图6为MsFLS转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-1碳酸氢钠胁迫处理0天和7天后烟草叶片的叶绿素含量；
图7为MsFLS转基因烟草L6与野生型烟草WT在30mmol L-1碳酸氢钠胁迫处理0天和7天后烟草叶片MDA的含量；
图8为MsFLS转基因烟草L16与野生型烟草WT在30mmol L-1碳酸氢钠胁迫处理0天和7天后进行的NBT染色。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、紫花苜蓿MsFLS基因的克隆
从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索紫花苜蓿近源物种蒺藜苜蓿的核苷酸序列并保存，通过对紫花苜蓿盐碱胁迫下的转录组测序获得紫花苜蓿中受盐碱胁迫诱导表达的FLS基因，通过BLAST比对和进化树分析确定FLS基因的核苷酸序列。利用该序列设计克隆引物，引物为：
MsFLS-F：5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3'；
MsFLS-R：5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3'。
具体流程如下：
1)RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取紫花苜蓿(Medicago sativa)全株RNA，经RT-PCR反转录为cDNA，以该cDNA为模板进行MsFLS基因的克隆；
2)RT-PCR反应：用反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit,Toyobo)进行RT-PCR反应，反应程序：37℃延伸15min；98℃变性5min。反转录植物全株RNA，获得单链cDNA，以内参引物Actin为引物，以该cDNA为模板进行PCR评估cDNA质量无误，用以进行后续实验；
3)重组质粒转化到大肠杆菌DH5α(Toyobo)中，将插入的核苷酸序列利用CEQ8000DNA Sequencer(Beckman Coulter,California,USA)进行测序；
4)最终拼接获取MsFLS基因ORF的CDS全长序列。MsFLS基因CDS全长为1068bp，编码355个氨基酸。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与MtFLS(Medicagotruncatula.L)相比，氨基酸同源性为97％，具备2个保守结构域，包括一个氨基端的铁离子依赖的DIOX结构域和一个2OG-FeII_Oxy结构域，结果如图1所示。通过对其它物种中近源基因的比对及进化树构建可见，紫花苜蓿FLS基因与蒺藜苜蓿，大豆，鹰嘴豆等植物中的同源基因进化关系较近，与小麦等植物进化关系较远，结果参见图2。
2、紫花苜蓿MsFLS基因植物表达载体构建
1)以本发明中MsFLS的cDNA序列，设计引物如下：
MsFLS-F：5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3'；
MsFLS-R：5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3'。
以紫花苜蓿cDNA为模板，扩增MsFLS基因序列。
反应条件：
Figure BDA0001016354770000051
PCR产物低温保藏备用；
2)用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)，回收PCR产物，获得的PCR产物与T载体pMD-18T进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取转化阳性的克隆提取质粒送交上海生工公司进行测序，经过测序获得正确序列的克隆用于后续实验；
3)将pCBM质粒用PstI进行酶切，去磷酸化，并用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段，同时用PstI进行酶切连接在T载体的FLS片段，并回收，将回收的FLS片段与pCBM载体片段连接，然后后转化DH5α感受态细胞，获得重组克隆，结果酶切和PCR检测后将正确的克隆命名为pCBM-FLS，载体图如图3所示。
3、农杆菌介导法转化烟草
1)烟草的培养
野生性烟草SR-1种子40粒以75％的乙醇浸没3min后用灭菌蒸馏水反复冲洗6次，然后以10％的次氯酸钠原液浸泡15min，再用灭菌蒸馏水清洗6次，将种子置于MS固体培养基中。待种子萌发后，移至含有MS固体培养基的大瓶中继续培养，待其叶片足够大时进行侵染。
2)农杆菌菌液制备
挑取-80℃冻存的带有MsFLS重组表达载体的农杆菌甘油菌在YEB+50mg/L Rif+50mg/L Km+50mg/L Str的固体培养基上活化菌株，并在28℃培养箱中倒置培养36-48h，将活化得到的农杆菌单菌落接种于相同成分的YEB液体培养基中，28℃振荡培养约16-24h，OD600＝0.4-0.6。取出培养液按照1：10接种相同成分的YEB液体培养基中进行二次活化，当OD600＝0.4-0.6时，将菌液倒入无菌的50ml的离心管，于4℃条件下，5000rpm离心10min，去掉上清液，用MS培养液重悬菌体至OD600为0.4左右，用于转化。
3)烟草的侵染
在超净工作台内，将重悬的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将培养的烟草SR-1叶片切至0.8mm的方形，作于外植体置于菌液中浸泡8min，其间不断震荡。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着菌液，叶背面朝上接种于诱导愈伤组织形成的培养基MS1(MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA)，在25±2℃条件下暗培养48-72h。然后接种到MS2(MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.1mg/L PPT+500mg/L Cef)培养基上进行筛选培养，每20d更换一次诱导培养基。经过侵染的叶片长出新的幼芽时，放入到MS3(MS+1.3mg/L PPT+500mg/L Cef)培养基中进行生根，以待后续分子鉴定。
4)转基因烟草小量DNA的提取
称取植物样品0.1g，液氮研磨，向管中加入700μl预热到65℃的2×CTAB Buffer缓冲液，混匀，65℃水浴45min，每5min轻轻的颠倒混匀，之后将离心管取出置于冰上，冷却至室温，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇摇匀，12000rpm离心10min，取上清，向管中加入与上清等体积的氯仿-异戊醇(24：1)轻轻混匀，4℃，12000rpm离心10min，取上清，加1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积预冷乙醇(或等体积异丙醇)，轻轻摇匀至出现絮状沉淀，置-20℃醇沉30min，之后离心15min，弃上清，加入500μl预冷的70％乙醇冲洗，离心10min，弃上清，空气干燥，加入20μl去离子水溶解。
4、转MsFLS基因的烟草转化体的获得以及转化体的PCR检测
PCR鉴定：FLS内部基因引物如下
Primer 1：5’-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3’
Primer 2：5’-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3’
反应条件：
Figure BDA0001016354770000071
参见图4，以提取的阳性植株的DNA为模板，用MsFLS内部基因引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示编号16为PCR获得的目的条带，与阳性一致(即能扩增出大约500bp的目标DNA条带)，为转基因植株。其中，“+”为阳性对照，“-”为阴性对照(即以野生型植株基因组DNA为模板的PCR检测结果)，0为空白对照，M为Marker DL2000。
5、转基因烟草植株功能的初步验证
1)配制30mmol L-1NaHCO3溶液。
2)烟草叶绿素含量测定
取野生型和转基因烟草相同状态的叶片，用7mm直径的打孔器打孔，用NaHCO3培养液胁迫处理7天，观察叶片变化，记录并拍照。参见图5，在30mM盐碱胁迫处理下，野生型烟草明显变黄，转基因株系维持绿色，表明转基因株系对盐胁迫的耐受性显著高于野生型，30mM盐碱胁迫条件下转基因株系叶片丙二醛含量，NBT染色结果表明转基因型植株的叶片在胁迫条件下生成的超氧阴离子显著低于野生型，以上实验结果表明MsFLS基因在烟草中的过表达提升了烟草对盐的耐受能力。
取上述胁迫处理7天的叶片，提取叶绿素，测定叶绿素含量，计算盐胁迫处理7天后植株叶绿素含量的变化量。测叶绿素含量方法如下：
①0.1g叶片放入预冷的研钵中，加1ml预冷80％丙酮，加入少量石英砂研磨
②转移液体到大离心管中，用80％丙酮洗研钵直至无色。
③10000rpm，离心5min，4℃。
④取上清(记取上清量)。
⑤像沉淀中加入80％丙酮，洗沉淀，再离心，直至沉淀无色(记取上清量)。
注：取上清的离心管暗处理。
⑥样品测定：取3ml上清液在645nm和663nm处测吸光值。80％丙酮调零。
⑦结果计算：Ca＝12.72A663—2.59A645
Cb＝22.88A645—4.67A663
Ca十b＝20.21A645+8.02A663
叶绿素含量(mg·g-1或mg·dm-2)＝C×V/A×1000
式中：C为叶绿素浓度(mg·L-1)；V为提取液总体积(ml)；A为取样鲜重(g)。
转基因植株和野生型植株在30mM NaHCO3胁迫下，叶绿素含量因胁迫下降，转基因植株在胁迫7天条件下，叶绿素含量明显高于相同胁迫条件下野生型植株，如图6所示。
3)转基因叶片MDA含量测定
取上述胁迫处理7天的叶片，测定MDA含量。
①植物叶片置于预冷研钵中，加入三氯乙酸研磨，离心取上清。
②4℃1000rpm离心10min，取上清，上清即酶液。
③测定液：2ml酶液+2ml TBA；对照调零：2ml蒸馏水+2ml TBA。
④100℃20分钟，降至常温。
⑤4℃5000rpm离心15min，取上清。测532nm和450nm处OD值。
计算公式如下：
丙二醛含量(μmol/g)＝(6.45×A532-0.56×A450)×V1/(W×V2)
V1：样品液体总体积(ml)
V2：测定时样品体积(ml)
W：样品鲜重(g)
将生长状态相同的野生型烟草和MsFLS转基因烟草用含30mM NaHCO3的MS培养基胁迫处理7天，测定丙二醛(MDA)的含量。结果如图7所示，转基因株系在胁迫下的MDA积累量显著低于野生型烟草。
4)胁迫下烟草叶片NBT染色
取胁迫处理的转基因和野生型烟草叶片于小瓶中，加入NBT染液(1mg/mL)直至浸没样品，将处理过的野生型和转基因烟草叶片浸泡在染色液中，在室温黑暗培养过夜。吸去染色液，加入乙醇：甘油：乳酸(3:1:1)漂洗液，沸水浴10分钟，迅速冷却，换漂洗液，至去除全部叶绿素。染色结果如图8所示。在30mM盐碱胁迫处理下，转基因植株的着色范围显著小于野生型烟草。
综上所述，本发明公开了紫花苜蓿的MsFLS基因及其克隆方法和应用，该基因开放读码框全长1068bp，编码355个氨基酸。利用此序列信息，克隆该基因，构建MsFLS基因的克隆载体以及植物表达载体，并将该基因以农杆菌介导法转入模式植物烟草中，转基因烟草在含盐碱成分的MS培养基上培养，结果表明转基因植株与对照相比具有较强的耐盐碱能力，说明MsFLS基因的过表达提高了植株对盐碱的抗性，进一步说明该基因能够参与植物的抗逆过程。本发明中的MsFLS基因为进行植物抗逆分子育种提供了新的基因资源，为研究植物抗逆分子机理奠定了基础。
Figure IDA0001016354850000011
Figure IDA0001016354850000021

Claims (3)

1.紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS在提高烟草盐碱抗性中的应用，其特征在于，构建含有紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的植物表达载体，再将所构建的植物表达载体通过农杆菌介导法转化到烟草组织中，用含30mM NaHCO3的MS培养基胁迫处理7天，筛选获得盐碱抗性增强的植物；其中，紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
3.由紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS编码的蛋白在提高紫花苜蓿对环境盐碱胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述的紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述的由紫花苜蓿抗盐碱基因MsFLS编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
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