CN104946666B - 水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用 - Google Patents

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CN104946666B CN201510370321.5A CN201510370321A CN104946666B CN 104946666 B CN104946666 B CN 104946666B CN 201510370321 A CN201510370321 A CN 201510370321A CN 104946666 B CN104946666 B CN 104946666B
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Abstract

本发明公开了一种水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用。本发明根据同源性分析,在水稻中克隆拟南芥AtACBP3的同源基因OsACBP5。该基因的全长5579 bp,CDS长1710 bp,编码570 aa的蛋白。用CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测,该蛋白有跨膜域和ACBP结构域。通过比较野生型和过表达转基因植物对细菌性病菌的耐受性,结果表明OsACBP5基因可以提高植物的抗病能力,可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。

Description

水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用
技术领域
本发明涉及植物抗病技术领域,具体地,涉及水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用。
背景技术
水稻是我国的重要粮食作物,全世界一半以上的人口以水稻为主食,病虫害浸染直接影响水稻的生长和产量。例如,由水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)引起的白叶枯病是水稻生产中的最严重的细菌性病害,在我国南北各稻区包括广东地区普遍存在,造成的损失巨大。据估计白叶枯病发生时,会导致水稻产量减产20~30%,严重的甚至导致绝收。因此,改善和提高水稻对病原菌胁迫的抗性、培育具有高抗病性的新种质,在促进水稻生产稳步发展、保障我国的粮食安全上具有重要的作用。
开发水稻抗病基因是提高水稻对病原菌胁迫的抗性、培育具有高抗病性的新种质的有效途径。目前,水稻中已定位至少30个稻瘟病抗性位点和25个白叶枯病抗性位点。其中,抗稻瘟病的Pib和Pi-ta和抗白叶枯病的Xa21和Xa1基因已经被克隆鉴定。但是,目前水稻的抗病基因资源还不够丰富,而且已报道的这些抗病基因大多都是针对某一特定病害起作用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种水稻抗病基因OsACBP5。
本发明的另一个目的是提供一种抗病基因OsACBP5在提高水稻抗病性中的应用,尤其是提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病。
为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:
一种水稻抗病基因OsACBP5,该基因的全长5,579 bp(如SEQ ID NO:1所示),CDS长1,710 bp(如SEQ ID NO:2所示),编码570 aa的蛋白(如SEQ ID NO:3所示)。
发明人通过研究发现,该基因能够提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病。
经序列比对发现,本发明水稻抗病基因OsACBP5编码的蛋白与拟南芥AtACBP3蛋白是同源蛋白,同AtACBP3一样,OsACBP5是唯一一个其ACB结构域存在于C末端的ACBP蛋白,其N末端也同样检测到了与AtACBP3相似的信号肽/转膜结构域;氨基酸序列比对分析结果显示,AtACBP3和OsACBP5蛋白中氨基酸序列的相同率为56%。
水稻OsACBP5基因在提高水稻抗病中的应用,所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1或2所示。
本发明通过比较野生型和过表达转基因(OsACBP5基因)植物对细菌性病菌的耐受性,结果表明OsACBP5基因可以提高植物的抗病能力,尤其是抗稻瘟病和白叶枯病,可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。实施例中虽然中做了对日本晴品种的抗病情况,但是,本发明在保护基因的用途时,对于水稻的品种并不局限于日本晴这种品种。
水稻OsACBP5基因在提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病中的应用,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
一种抗黄单胞菌引起的白叶枯病的水稻的构建方法,包括如下步骤:
S1.将SEQ ID NO:1或2所述的OsACBP5基因克隆到PCXSN-MYC载体;
S2.用农杆菌转化法侵染水稻,得到稳定表达的转基因植株。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明在水稻中首次发现了OsACBP5基因,该基因的全长5,579 bp,CDS长1,710bp,编码570 aa的蛋白。用CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测,该蛋白有跨膜域和ACBP结构域。通过比较突变体、野生型和过表达转基因水稻的对细菌性病菌的耐受性,发现OsACBP5基因可以提高水稻的抗病能力,可以广泛应用于基因工程领域有着巨大的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为SMART程序预测OsACBP5蛋白的结构域,含有跨膜结构域和ACBP结构域。
图2为黄单胞菌(Xoo)处理16天后野生型、过表达转基因水稻植株的生长情况,CK为野生型水稻。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1水稻OsACBP5基因的克隆
根据拟南芥中的AtACBP3的同源蛋白的同源性,在水稻基因组数据中利用Blastp程序进行搜索,得到水稻OsACBP5蛋白,其是唯一一个其ACB结构域存在于C末端的水稻ACBP蛋白,其N末端也同样检测到了与AtACBP3相似的信号肽/转膜结构域。设计正反向引物
XS258:CATGGAGCTGTTCTACGAGCTGCTCCTC;
XS259:TCATTCAGCAGGGATGTCAGAACTCTGT;
提取水稻叶片RNA,反转录成cDNA后,以上述引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行克隆测序。水稻OsACBP5基因的全长5579 bp(如SEQ ID NO:1所示),CDS长1710 bp(如SEQID NO:2所示),编码570 aa的蛋白(如SEQ ID NO:3所示)。用CDD、PFAM、SMART、Interproscan程序分析预测,水稻OsACBP5蛋白有跨膜域和ACBP结构域,见图1。
实施例2水稻OsACBP5基因的功能研究
将实施例1所述的OsACBP5基因连接到pCXSN-MYC载体上,具体步骤如下:将通过XS258和XS259引物克隆后的序列(即SEQ ID NO:2所示)序列),通过TaKaRa的加“A”试剂盒,与用XcmⅠ进行酶切的pCXSN-MYC载体相连接,在含卡那平板上进行筛选后,通过PCR鉴定并送测序,正确后转化农杆菌。
将阳性载体利用农杆菌转化法转化到日本晴水稻中,得到稳定表达的转基因植株OsACBP5-OE,具体步骤如下:
将成熟水稻种子消毒后,经盾片诱导培养基诱导产生胚性愈伤,用含有鉴定正确的农杆菌侵染,侵染20 min后将愈伤组织转至加有一张滤纸的共培养基上,然后转入筛选培养基上进行筛选培养。生长旺盛的水稻愈伤在预分化光照培养2-3周,转移到分化培养基上培养至分化出苗,再转至壮苗生根培养基中,最后移栽到人工气候室种植。
黄单胞菌处理野生型和转基因水稻:分别将野生型(日本晴水稻,Oryza sativajaponica. cv. Nipponbare,后续简称为CK)和转基因水稻OsACBP5-OE的成熟种子,去颖壳,用75%酒精浸泡30~45秒,无菌水洗3次,再用20%的次氯酸钠浸泡30分钟,不时摇晃,水洗5次以上;消毒完成后,将三种类型的种子分别置于含有1/2 MS液体培养液的无菌烧杯内培养。 然后再种植在1/2 MS固体培养基上,并移入28℃(16-h光照/8-h黑暗)的人工气候室。
待以上三种水稻生长到20天大小的植株,分别接种黄单胞菌,具体步骤如下:采用剪叶法进行接种,利用剪出2 - 3cm的缺口,将菌龄为3 d,菌液浓度3×108 cfu,,接种后于湿度大于85%的环境中培育。
选取己完全展开的水稻野生型和转基因植株叶片,用手术剪蘸取菌液,剪切叶片2-3 cm的缺口,接种后90%的环境中培育。
接种Xoo(Pxo99)处理后16天,发现转基因水稻OsACBP5-OE的叶片比对照野生型水稻的叶片病斑长度与叶片总长比值低(见图2),这说明OsACBP5基因可以提高植物对黄单胞菌的抗性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 水稻OsACBP5基因及其在提高水稻抗病性中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5580
<212> DNA
<213> OsACBP5基因DNA序列全长
<400> 1
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tttccgcttt cccttttccc ccctcctcga tccgcggcgc aaccgaacac gaaagcgaga 120
gagagaggag tgcagccgct gccctgtccc ctcaccgcgc cgcgccgaca tggagctgtt 180
ctacgagctg ctcctcacgg cggctgcctc cctcctcgtc gccttcctgc tggccaggct 240
gctggcctcc gccgccaccg ccagtgatcc ccgccgccgc gcgcccgatc acgccgccgt 300
gatcgcggag gaggaggcgg tggtggtgga ggaggagagg atcatcgagg tcgatgaggt 360
cgaggtgaag agcgcgcgcg cgagggagtg cgtggtttcg gaggggtggg tcgaggtggg 420
gagggcctcg tcggcggagg ggaagctcga gtgcttgccg gaggaagagg aggctcccgc 480
gaaggccgct cgggagcttg ttctcgatgc cgttttggag gaacgcgagg aggaaggaca 540
agttggcgaa gagcggtgcg atttggccgc tgcggtggcg gaggtcgtgg gagtgaagcc 600
gcatgagttg ggggttgaag ctgctcccgg ggaggtatct gacgtgacgc tggaggaagg 660
gaaggtgcag gatgttgggg tggagcagca tgatttggtc gccgaggctg ctccaaggga 720
agctcttgac acagggttgg agaaacaggg tgttcccatc attgaagcgg ttgaaatcaa 780
gcggcaggat gatctgggtg ctgaggtagc tccgagtgac gttcctgagg tggaatttga 840
gcaacaggga gttcgcatta ttgaagctat tgatgtgaat caacatcatc gggttgctct 900
ggctgctcct gcggaagttg ttgatgcggg attggaggag agggtccaag ctattgaagc 960
agggtcatct ggattgactt ccgagacagt tcctgaagag gttcttgacg agttatctga 1020
gaagcaagaa gagcaagtta ttgaagagaa ggaacatcaa ttggctgcag cgactgctcc 1080
agtagcaatt cctggtgtgg cattggcaga gacggaggaa cttaaagaag aacaatcctc 1140
tgaaaaagct gtcaatgttc atgaagaagt tcagagtaag gacgaagcta aatgcaagct 1200
ccatctggtt gatcaacaag aaggttcggc ttctaaggtg gagctggtgg ggaggaatac 1260
cgacaatgtg gaaattagcc atggaagcag ttctggtgac aaaatgattg ctgagttgac 1320
cgaggaggaa ttgacattgc aaggtgtgcc cgcagatgag actcagacag acatggaatt 1380
tggggagtgg gaagggattg aaagaactga gatagaaaag aggtttggtg tggcagcagc 1440
gtttgcatct agtgacgccg ggatggctgc cctgtcaaag cttgatagtg atgtgcagct 1500
gcagctgcag ggactcctta aggttgccat tgatggtcca tgctatgact ctacacagcc 1560
acttaccttg aggccttcat ctcgtgcaaa atggtaattg tttttctcat tgatatccta 1620
gctccaactt tttttttggt atgctgcaca actgcggtag gttatatagt tcaaggacaa 1680
caaaaccaat atactaccca aatgccttac tttgcactgg ctagaatgta atcggcaatg 1740
gacttgtgat ttataggcag atcaggtata ctggtctgaa atagcttaaa ctagtccttt 1800
ttttggcaaa agaccaaagt acagaacttt gaactctgaa ttctgggtag ttggtagata 1860
gactgtaatg acatattaga aaactgaatt gtttgatctg ctggtctgtt tgatctagtt 1920
gggacttctt atggctacta tgacacttat gtatgaaatt tggtcctagc tatttggcta 1980
aacctaaaaa agagccaaag aactggttca aaattttgaa tcccatttta ctgcggaaca 2040
tagaacttct ctgtggaaca ataaacgact catataatgc aaaagttttt aatcttttgc 2100
ataattgatt gttaaaatta gaaaaatatt ttcctacctt atgttgtgac ttgagacaat 2160
gagaatctgt cctctaattt gttaagggga aaaaaagctt ctgtcaactt ttctgggcta 2220
tctaaacaaa gacattaaat gtgccatttt tgttttatat tgtttaataa acttgttatg 2280
ctaaaagaag ataattatag ttgtccatca tcagtgaaga taaagataag tgaattataa 2340
ttgcccatca tcaatgggat aatgcactta aaccagtgat atagtgtgta atagtgtaag 2400
gatgtcactg atacgctgat cttctgtcat gcataatggt gtgtggttca catgagaatc 2460
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caatttttgt ttgcatagag cgcccctgtt agttctatat gtgccaccat gtaattcaat 3180
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405 410 415
Lys Arg Phe Gly Val Ala Ala Ala Phe Ala Ser Ser Asp Ala Gly Met
420 425 430
Ala Ala Leu Ser Lys Leu Asp Ser Asp Val Gln Leu Gln Leu Gln Gly
435 440 445
Leu Leu Lys Val Ala Ile Asp Gly Pro Cys Tyr Asp Ser Thr Gln Pro
450 455 460
Leu Thr Leu Arg Pro Ser Ser Arg Ala Lys Trp Ala Ala Trp Gln Lys
465 470 475 480
Leu Gly Asn Met Tyr Pro Glu Thr Ala Met Glu Arg Tyr Met Asn Leu
485 490 495
Leu Ser Glu Ala Ile Pro Gly Trp Met Gly Asp Asn Ile Ser Gly Thr
500 505 510
Lys Glu His Glu Ala Gly Asp Asp Ala Val Gly Ser Val Leu Thr Met
515 520 525
Thr Ser Asn Thr Ile Asn Gln His Asp Ser Gln Gly Asn Glu Asp Asn
530 535 540
Thr Gly Met Tyr Glu Gly His Leu Thr Ser Ser Pro Asn Pro Glu Lys
545 550 555 560
Gly Gln Ser Ser Asp Ile Pro Ala Glu
565
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> XS258
<400> 4
catggagctg ttctacgagc tgctcctc 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> XS259
<400> 5
tcattcagca gggatgtcag aactctgt 28

Claims (3)

1.水稻OsACBP5基因在提高水稻抗黄单胞菌引起的白叶枯病中的应用,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的水稻品种为日本晴。
3.一种抗黄单胞菌引起的白叶枯病的水稻的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.将权利要求1所述的OsACBP5基因克隆到PCXSN-MYC载体;
S2.用农杆菌转化法侵染水稻,得到稳定表达的转基因植株。
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