CN103740723A - 受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。本发明所提供的启动子是下述a）-c）中任一的DNA片段：a）序列表中序列1所示DNA片段；b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。实验证明，将本发明启动子驱动Gus基因的植物表达载体导入水稻中，获得转基因水稻；接种水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌，发现转基因水稻叶片的Gus可受水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌诱导表达。本发明所提供的启动子对于培育食用安全的转基因植物抗病新品种具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。
背景技术
植物在生长过程中经常各种病虫害的危害。因此通过基因工程手段获得抗病种质将极大的促进农业生产及消除病害的防治时施用农药带来的环境污染。
基因的表达与启动子密切相关，自1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。诱导型表达启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊的信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是：它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所的浪费。
TALEs（transcription activator–like effectors）是在植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）中发现的一种转录激活子样效应因子，TALEs的发现和结合DNA的特点为开发更简易的新型基因组定点修饰技术提供了新途径。植物病原体黄单胞菌将TALEs蛋白通过III型分泌系统注入植物细胞，TALEs细菌蛋白与转录因子行为相似，穿过核膜进入细胞核内与特定的UPT（Up-regulated by TALE）盒结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。目前，在植物病原菌中发现的该类蛋白已达到10余种。TALEs具有特殊的结构特征，包括N端分泌信号、中央的DNA结合域、1个核定位信号和C端的激活域。通过对目前发现的所有TALEs蛋白分析发现，TALEs蛋白中DNA结合域有1个共同的特点，不同的TALEs蛋白的DNA结合域是由数目不同的（12～30）、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有33～35个氨基酸。这些重复单元的氨基酸组成相当保守，除了第12和13位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeatvariabledi-residues，RVD）。TALEs识别DNA的机制在于每个重复序列的2个RVD可以特异识别DNA的4个碱基中的1个，目前发现的RVD共有26种.统计分析发现，HD(氨基酸名称)主要特异识别C碱基，NI主要识别A碱基，NK主要识别G碱基，NG主要识别T碱基等。
水稻是最重要的粮食作物之一，属于黄单胞菌属的水稻白叶枯病与细菌性条斑病是严重影响水稻生产的病害，受两种病害诱导表达的启动子的出现将助于抗病品种的培育。
发明内容
本发明的目的是提供一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。
本发明所提供的启动子，是下述a）-c）中任一的DNA片段：
a）序列表中序列1的第7-359位核苷酸所示DNA片段；
b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；
c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述DNA分子（启动子）的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
在本发明中，所述重组载体为用所述DNA分子（启动子）替换掉pCAMBIA1301载体中自身启动子后得到的重组质粒（ptale promoter::Gus载体）。
更加具体的，所述重组载体为用所述DNA分子（启动子）替换掉pCAMBIA1301载体的Kpn I和Noc I之间的小片段后所形成的重组质粒
所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
在本发明的一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为Gus基因（来源于所述pCAMBIA1301载体）；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为NOS转录终止子（来源于所述pCAMBIA1301）。
所述DNA分子（启动子）在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
在所述应用中，所述表达具体为受水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌诱导表达。
在所述应用中，所述表达可为植物体内表达；如在植物叶片表达。
进一步，在本发明中，所述诱导具体为：将转入所述DNA分子（启动子）和所述目的基因的植株或器官（如叶片）置于浓度为109CFU/mL的水稻白叶枯病菌的菌悬液或浓度为109CFU/mL的水稻细菌性条斑病菌的菌悬液中进行诱导。诱导的时间可为2天，温度可为28℃，光周期可为L16：D8（16h光，8h暗）。
所述DNA分子（启动子）在如下任一种的应用也属于本发明的保护范围：
（1）提高植物抗病性；
（2）培育抗病性提高的转基因植物。
在（2）所述应用中，所述培育抗病性提高的转基因植物，为：将含有所述DNA分子（启动子）的表达盒导入目的植物中，得到所述转基因植物；所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的抗病基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述抗病基因连接，且所述抗病基因与所述转录终止序列连接。
在所述应用中，所述病为由黄单胞菌属菌株引起的病；所述黄单胞菌属菌株具体为水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌。
在本发明中，以上所有的所述水稻白叶枯病菌均为水稻白叶枯病菌PXO99；以上所有的所述水稻细菌性条斑病菌均为水稻细菌性条斑病菌RS105。
在所述应用中，所述目的基因可为Gus基因，所述抗病基因为Xa27基因（序列2）。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的一个实施例中，所述植物具体为水稻，如水稻品种台北309。
实验证明，将本发明启动子驱动Gus基因的植物表达载体导入水稻中，获得转基因水稻；接种水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌，发现转基因水稻叶片的Gus可受水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌诱导表达。本发明所提供的启动子对于培育抗病性更强的植物新品种具有重要的意义。
附图说明
图1Tale promoter启动子结构示意图。其中，KpnI，NcoI，BamHI为限制性内切酶；Xoc开头为水稻细菌性条斑病菌的Tale识别序列；其他为水稻白叶枯病菌的Tale识别序列。
图2为部分转基因水稻的分子检测结果。其中，A为潮霉素基因hpt的PCR分子鉴定结果；B为目标基因Tale promoter的鉴定结果；A和B中，泳道1-12为T0代转ptale promoter::Gus水稻，泳道Tale::GUS为阳性对照（重组载体ptale promoter::Gus），泳道TP309CK为阴性对照（未转基因的水稻品种台北309），泳道Marker为DNA分子量标准为DL2000，从大到小的条带的大小分别为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。
图3为部分转基因水稻Gus染色结果。其中，Line2、Line3和Line7为经实施例3步骤二鉴定阳性的3个T0代转ptale promoter::Gus。H2O为水对照，Xoo P6为水稻白叶枯病菌PXO99，Xoc RS105为水稻细菌性条斑病菌RS105。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
水稻白叶枯病菌PXO99：记载在“夏志辉，赵显峰，范海阔，金良，高利芬，罗越华，翟文学.分子标记辅助选择Xa23基因改良杂交稻亲本的白叶枯病抗性,分子植物育种，2010,8(4):652-656”一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
水稻细菌性条斑病菌RS105：记载在“陈现朝，黄立钰，周永力.分水稻类受体激酶基因OsBAK1L调控细胞坏死机制,作物学报，2013,39(11):1992-1999”一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所。
pCAMBIA1301载体：购于上海捷兰生物技术有限公司，货号CPC054。
水稻品种台北309：记载在“曹孟良.农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立；湖南农业大学学报，1999，25(5)：349-356”一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
农杆菌LBA4404：宝生物工程(大连)有限公司：产品号：D9115。
下述实施例中所涉及的培养基配方如下：
基本培养基配方
N6D愈伤诱导培养基：N6D大量元素+N6D微量元素+MS有机+Fe盐+2.0mg/L2.4-D+0.3g/L水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+30g/L蔗糖+4.0g/L植物凝胶，pH5.8。
YEB培养基：溶剂为水，每升含有牛肉浸膏5g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4·H2O0.5g，pH7.0。
AAM培养基配方：AAM大量元素+AAM微量元素+AAM有机+AAM氨基酸+Fe盐+68.5g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+0.5g/L水解酪蛋白+100uM乙香丁香酮，pH5.2。其中，AAM大量元素、AAM微量元素、AAM有机和AAM氨基酸见下表：
RE-III培养基：MS大量元素+MS微量元素+RE有机+Fe盐+0.02mg/L NAA+2mg/LKT+2g/L+水解酪蛋白+30g/L蔗糖+30g/L山梨醇+50mg/L潮霉素B++250mg/L羧芐青霉素+4.0g/L植物凝胶，pH5.8。
HF培养基：MS大量元素+MS微量元素+MS有机+Fe盐+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+50mg/L潮霉素B++200mg/L羧芐青霉素+3.0g/L植物凝胶，p H5.8。
实施例1、受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子的获得
1、下载水稻白叶枯病菌基因组数据及水稻细菌性条斑病菌基因组数据，然后Bioedit软件建立本地数据库，Tale保守序列进行BlasX，查询出所有水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌的Tale的蛋白序列。排除不包转录激活区的Tale。根据RVD分别为HA，HH，NH，NK，HN，NN，SN，NT优先识别G；RVD分别为HD，ND，H*，N*，S*优先识别C；RVD分别为HG，IG，IG，YG，NP优先识别T，RVD分别为HI，NI，IS，NS，SS优先识别A原则，推导出选定的各个Tale识别的最优DNA序列。
2、将步骤1所得序列按离转录启始位点距离，按照水稻白叶枯病菌tale和水稻细菌性条斑病菌tale相间排列原则，将其组装成353bp的人工启动子（序列1的第7-359位），命名为Tale promoter。为了满足构建载体的需要，在人工启动子的5’端添加限制性内切酶Kpn I的识别位点，在3’端依次添加限制性内切酶Noc I和BamH I的识别位点，得到序列表中序列1所示DNA片段。
3、将步骤2获得的人工启动子序列用启动子在线预测软件promoter Scan（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）进行预测，结果表明不具有植物启动子的特征，从而避免合成的人工启动子被植物内源转录因子识别激活。
人工合成序列表中序列1。其结构如图1所示。其中，第1-6位核苷酸为Kpn I的识别序列，第7-24位核苷酸为Xoc48识别序列，第25-45位核苷酸为Tal6a识别序列，第46-65位核苷酸为Xoc22识别序列，第66-83位核苷酸为avrXa27识别序列，第84-100位核苷酸为Tal5a识别序列，第101-118位核苷酸为Xoc44识别序列，第119-132位核苷酸为Tal9d识别序列，第133-148位核苷酸为Xoc20识别序列，第149-172位核苷酸为PthXo6识别序列，第173-194位核苷酸为Xoc11识别序列，第195-217位核苷酸为PthXo7识别序列，第218-236位核苷酸为Xoc7识别序列，第237-257位核苷酸为Tal9a识别序列，第258-273位核苷酸为Xoc1识别序列，第274-290位核苷酸为Xoc18识别序列，第291-318位核苷酸为Tal9b识别序列，第319-334位核苷酸为Tal2a识别序列，第235-359位核苷酸为Tal9e识别序列，第360-365位核苷酸为限制性内切酶Nco I识别序列，第366-373位核苷酸为限制性内切酶BamH I识别序列。
实施例2、构建Tale promoter驱动报告基因Gus表达的重组表达载体
用限制性内切酶Kpn I和Noc I双酶切实施例1人工合成得到的两端带有相应酶切位点的人工启动子Tale promoter（序列1），胶回收后于经过同样双酶切的pCAMBIA1301载体骨架大片段相连，得到重组质粒。
将经限制性内切酶Kpn I和Noc I双酶切初步鉴定正确（得到大小约为373bp和11Kb的两个目的条带）的重组质粒送样测序。将经测序表明将pCAMBIA1301载体中位于限制性内切酶Kpn I和Noc I之间的小片段替换为序列表中序列1的第7-359位核苷酸后得到的重组质粒命名为ptale promoter::Gus。
实施例3、转基因水稻对水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌的诱导反应
一、转基因水稻的获得
将实施例2所得重组表达载体ptale promoter::Gus用电激法转化农杆菌LBA4404。对转化后的重组农杆菌用由TaleF和TaleR组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有启动子Tale promoter（PCR目的条带大小约为373bp）的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/ptale promoter::Gus。
TaleF：5′-GGTACCTCCTATCTACGCTT-3′（序列1的第1-20位）；
TaleR：5′-GGATCCTACCATGGAGTTC-3′（序列1的第355-373位的反向互补序列）。
同时设置转入pCAMBIA::Gus空载体的对照。将转入pCAMBIA::Gus空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pCAMBIA::Gus。其中，pCAMBIA::Gus空载体为用限制性内切酶Kpn I和Noc I双酶切pCAMBIA1301载体后，将骨架载体大片段末端补平后自连所得。与pCAMBIA1301载体相比，pCAMBIA::Gus空载体中缺少启动GUS转录的35S启动子。
用所得重组农杆菌（LBA4404/ptale promoter::Gus或LBA4404/pCAMBIA::Gus）转化水稻品种台北309。具体转基因方法参照Toki S的快速转化方法（Toki S等.Earlyinfection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.PlantJ.2006,47(6):969-76）进行；具体如下：
1、预培养
（1）水稻品种台北309去壳种子用70％乙醇浸30秒，无菌水冲洗2-3次；
（2）30％（体积分数）NaClO（原液为有效氯10％）浸30min；
（3）重复步骤2，无菌水冲洗3-5次；
（4）灭菌后的种子接种于N6D愈伤诱导培养基上，32℃持续光照培养5天。
2、农杆菌侵染及转化苗筛选
（1）重组农杆菌（LBA4404/ptale promoter::Gus或LBA4404/pCAMBIA::Gus）在YEB+Rif(25-50mg/L)+Kan(50mg/L)培养基上28℃暗培养2-3天，挑单菌落于3-5mLYEB+Rif(25-50mg/L)+Kan(50mg/L)培养基中，28℃暗摇床中培养约24-36h至OD=0.6左右，取500μL接于50mL AAM培养基中，过夜培养至OD600约0.1；
（2）愈伤浸于农杆菌菌液中，120rpm轻轻晃动约20min，然后静置10min；倒掉菌液，将愈伤置于无菌滤纸上吸去多余菌液，吹干；
（3）愈伤接于添加100μM的乙酰丁香酮的N6D愈伤诱导培养基，培养基上预先垫一层浸有AAM培养基（0.5毫升即可）的无菌滤纸；
（4）25℃共培养3天；
（5）共培养后的愈伤先用无菌水冲洗2-3次用，再用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗2-3次，并用之浸泡30分钟左右（若浸染愈伤的菌液浓度OD600>0.1，可将浸泡时间增加到1小时左右，30分钟左右更换一次），以彻底去除农杆菌；
（6）无菌滤纸上吸去水分，并吹干，接种于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄青霉素的N6D愈伤诱导培养基上32℃持续光照培养两周；
（7）将生长旺盛的愈伤转移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧苄青霉素的RE-III培养基上32℃持续光照培养诱导分化。愈伤变绿后很快就会分化出幼苗；
（8）转移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧苄青霉素的HF培养基上诱导生根，得到两种T0代转基因水稻，即T0代转ptale promoter::Gus水稻，以及T0代转入pCAMBIA::Gus空载体的水稻。
二、转基因水稻的分子鉴定
取步骤一获得的T0代转ptale promoter::Gus水稻，以及T0代转入pCAMBIA::Gus空载体的水稻的叶片，提取基因组DNA。以所得基因组DNA为模板，以hptF和hptR为引物进行PCR扩增检测潮霉素基因hpt是否整合到水稻基因组；以Tale F和Tale R为引物进行PCR扩增检测目标基因片段Tale promoter是否整合到水稻基因组。同时设置以重组质粒ptale promoter::Gus为模板的阳性对照，以及以未转基因的水稻品种台北309的基因组DNA为模板的阴性对照。
hptF：5′-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3′；
hptR：5′-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3′；
TaleF：5′-GGTACCTCCTATCTACGCTT-3′（序列1的第1-20位）；
TaleR：5′-GGATCCTACCATGGAGTTC-3′（序列1的第355-373位的反向互补序列）。
结果如图2所示。与阳性对照一致，A中得到大小约845bp目的条带且对应的B中得到大小约为373bp目的条带的植株为阳性Tale promoter转基因植株，共获得38个阳性T0代转ptale promoter::Gus水稻。T0代转入pCAMBIA::Gus空载体的水稻植株只能扩增hpt的DNA片段，不能扩增出Tale promoter的DNA片段，而作为阴性对照的未转基因的水稻品种台北309，均未扩增出如上两个DNA片段。
三、检测ptale promoter::Gus转基因植株受水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌的诱导反应
供试植株：5个经步骤二鉴定阳性的T0代转ptale promoter::Gus水稻试管苗，5个T0代转入pCAMBIA::Gus空载体的水稻试管苗，以及5个未转基因的水稻品种台北309试管苗。
供试病菌：水稻白叶枯病菌PXO99和水稻细菌性条斑病RS105。
取各供试植株的幼嫩苗叶片，将其剪成长度为3-4mm左右的小片，分别将其浸泡于浓度为109CFU/mL的供试病菌的菌悬液中，同时设置以无菌水替代供试病菌菌悬液的对照。置于28℃光照培养箱（16h光，8h暗）。2d后取出，用无菌水冲洗干净后，加入GUS染液，37℃过夜培养。倒掉染液，加入70%（体积分数）酒精脱色，期间勤换脱色液（70%酒精）直至叶片透明。观察各处理中供试植株叶片的染色情况。其中，GUS染液的配方：溶剂为100m mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)，溶质及其浓度如下：1mmol·L-1铁氰化钾、1mmol·L-1亚铁氰化钾、10mmol·L-1Na2EDTA和1g/L X-Gluc。100m mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)的溶剂为水，制备方法如下：首先制备A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml；B液：称取Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml；最后取61ml B液与39ml A液混合即为100m mol·L-1磷酸钠缓冲液(pH7.0)。
结果如图3所示，经步骤而鉴定阳性的T0代转ptale promoter::Gus水稻叶片在水稻白叶枯病菌PXO99或水稻细菌性条斑病RS105的诱导下表达Gus基因（叶片蓝色），而蒸馏水对照组不表达Gus基因（叶片未被染色）。而未转基因的水稻品种台北309，无论是水稻白叶枯病菌PXO99处理组、水稻细菌性条斑病RS105处理组，还是蒸馏水对照组，叶片均未被染色。T0代转入pCAMBIA::Gus空载体的水稻的实验结果与未转基因的水稻品种台北309相比基本一致，无统计学差异。
实施例4、人工启动子Tale promoter在植物抗病中的应用
为了检测人工启动子Tale promoter在水稻抗病中的应用价值，本发明的发明人将前述ptale promoter::Gus载体中报告基因Gus基因用水稻抗白叶枯病基因Xa27（Keyu Gu,Bing Yang，Dongsheng Tian，et al.R gene expression induced by a type-III effectortriggers disease resistance in rice,nature,2005,435(7045):1122-5）替代。具体如下：
以水稻品种TP309的基因组为模板，采用引物Xa27F和Xa27R（序列如下）进行PCR扩增，将所得PCR产物（CCatgg+序列2+ggtgacc）用限制性内切酶Nco I与BstE II双酶切，回收大小约为350bp的片段与利用NcoI与BstE II双酶切的ptale promoter::Gus载体大片段连接，获得重组质粒。将经测序表明将ptale promoter::Gus载体中酶切位点NcoI与BstE II之间的含有GUS的部分替换为序列表中序列2所示DNA片段后形成的重组质粒命名为ptale promoter::Xa27。
Xa27F：5’-CCatggcggattgggcgatgc-3’（下划线部分为酶切位点NcoI的识别序列，其后的序列为序列2的第1-21位）；
Xa27R：5’-ggtcacctagagagaccagagaccac-3’（下划线部分为酶切位点BstE II的识别序列，其后的序列为序列2的第325-350位的反向互补序列）。
将所得重组表达载体ptale promoter::Xa27用电激法转化农杆菌LBA4404。对转化后的重组农杆菌用由Xa27F和Xa27R（序列同上）组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有Xa27基因（PCR目的条带大小约为350bp）的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/ptale promoter::Xa27。
采用实施方法3中的农杆菌介导的遗传转化方法将所得重组农杆菌LBA4404/ptalepromoter::Xa27转化水稻品种台北309中，获得11个T0代转ptale promoter::Xa27水稻，分别编号为1-11。
取T0代转ptale promoter::Xa27水稻的叶片，提取基因组DNA。以Tale F和Tale R（序列同上）为引物进行PCR扩增检测目标基因片段Tale promoter是否整合到水稻基因组；以Xa27F和Xa27R（序列同上）为引物进行PCR扩增检测Xa27基因是否整合到水稻基因组。采用引物Tale F和Tale R扩增得到大小约为373bp目的条带，且采用引物Xa27F和Xa27R扩增得到大小约为350bp目的条带的植株为阳性转基因植株。结果显示，11个T0代获得转ptale promoter::Xa27水稻中除编号5和8的两个植株外，其余植株均为阳性。
在分蘗盛期采用剪叶法对所有的11个T0代转ptale promoter::Xa27水稻植株接种水稻白叶枯病菌PXO99（浓度为109CFU/mL），15天后观察植株表型，测定病斑大小。同时设置实施例3获得的T0代转ptale promoter::Gus水稻，以及未转基因的水稻品种台北309作为对照。
结果如表1所示，可见9个PCR鉴定阳性的T0代转ptale promoter::Xa27水稻植株的病斑长度都低于5cm以下；而另外2个PCR鉴定阴性的T0代转ptale promoter::Xa27水稻植株（编号为5和8），与实施例3获得的T0代转ptale promoter::Gus水稻以及未转基因的水稻品种台北309的病斑长度都超过14cm。以上结果说明用Tale启动子调控抗病基因的表达能有效改良水稻的抗病性。
表1ptale promoter::Xa27转基因水稻植株对水稻白叶枯病的抗性
| 转基因植株编号 | 病斑长度（cm） | PCR检测结果 |
| 1 | 2.2±0.2 | + |
| 2 | 4.7±0.4 | + |
| 3 | 3.3±0.1 | + |
| 4 | 3.3±0.3 | + |
| 5 | 14.2±0.7 | - |
| 6 | 2.0±0.2 | + |
| 7 | 2.4±0.2 | + |
| 8 | 14.4±0.9 | - |
| 9 | 3.1±0.3 | + |
| 10 | 3.9±0.3 | + |
| 11 | 4.8±0.3 | + |
| ptale promoter::Gus | 14.6±1.3 | - |
| 水稻TP309 | 14.8±0.6 | - |
注：“+”为PCR鉴定阳性植株；“-”为PCR鉴定阴性植株。病斑长度为5片叶的平均值。
Claims (10)
1.DNA分子，是下述a）-c）中任一的DNA片段：
a）序列表中序列1的第7-359位核苷酸所示DNA片段；
b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；
c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为用权利要求1所述DNA分子替换掉pCAMBIA1301载体中自身启动子后得到的重组质粒。
4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
5.权利要求1所述DNA分子启动目的基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述表达为受水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌诱导表达。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述表达为植物体内表达。
8.权利要求1所述DNA分子在如下任一种的应用：
（1）提高植物抗病性；
（2）培育抗病性提高的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述病为由黄单胞菌属菌株引起的病；
所述黄单胞菌属菌株具体为水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
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| CN103740723B (zh) | 2015-05-20 |
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