CN102618561A - 与抗逆性相关基因及在提高植物对环境胁迫抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与抗逆性相关基因及在提高植物对环境胁迫抗性中的应用。本发明从地热芽孢杆菌Geobacillus sp)中分离得到了3种SOD基因，即：Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。本发明进一步提供了所述SOD基因在提高植物对环境胁迫抗性中的应用，包括：构建含有所述SOD基因的植物表达载体；将所构建的植物表达载体转化到植物细胞或植物组织中，再生获得对非生物胁迫抗性提高的转基因植物株系。

Description

与抗逆性相关基因及在提高植物对环境胁迫抗性中的应用

技术领域

本发明涉及抗逆性相关基因及其应用，尤其涉及从地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)中分离、克隆的三种SOD基因及其在提高植物对非生物胁迫抗性中的应用，属于植物抗逆性分子生物学领域。

背景技术

干旱、盐碱等非生物胁迫严重影响了植物的生长和作物产量，其对农业生产所造成的危害是世界性的(Boyer JS，Science，1982；218：443-448)。非生物胁迫是作物减产的主要原因，可导致作物平均减产50％至80％。植物本身具有各种分子、细胞和生理生化机制以抵御和适应各种非生物胁迫.至今虽尚未完全阐明植物耐非生物胁迫的基因和分子机理，但从遗传、细胞和生理生化等多方面对抗逆机理的研究已取得了显著的进展。在诸多科技工作者的不懈努力下，一系列逆境相关基因得到克隆和功能鉴定，有用的基因被转入各种作物，从而提高了作物的抗非生物逆境的能力。

非生物胁迫已经成为限制农业发展的一个瓶颈，其中干旱和土壤盐碱化问题是制约农业可持续发展的主要因素。由于降雨量偏低或雨量分布不均，中国耕地的50％都受到不同程度的干旱困扰，直接导致农作物减产，严重时甚至颗粒无收，使农业生产饱受困扰。在中国的东西部地区都分布着不同类型的盐碱化土壤，全世界大约有20％的可耕农田受到盐渍化的影响。盐碱地对于中国以及世界很多国家来说都是重要的土地资源之一，我国约有5亿多亩的盐碱地，其中已开垦利用的仅有20％左右，等待被开发利用的还有3亿多亩盐荒地。另外，由于不合理耕作方式和气候条件的影响，中国还有1亿多亩次生盐碱地，并且这种土壤盐碱化的程度和总面积还有逐年增加的趋势。因此，对盐碱土地的改良及利用是国内外许多科学家研究的重点。但是众多改良措施中均或多或少存在一些不可克服的缺点，如利用淡水排盐则会将土壤中其它养分一同排走，其余则存在效果不能持久或费用昂贵等缺点，所以提高植物的抗旱、耐盐性，即对植物本身的基因进行改造，是提高农作物产量和耕地使用率的根本而有效的方法。

发明内容

本发明目的之一是提供从地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)菌株中分离、克隆得到三种SOD基因；

本发明目的之二是提供含有所述SOD基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的SOD基因应用于提高或改善植物对非生物胁迫的抗性。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

从地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)菌株中分离、克隆的三种SOD基因，即：Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因，其多核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了含有所述Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因的植物表达载体以及含有该植物表达载体的宿主细胞。

将所述Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因与表达调控元件可操作的连接，得到在植物中表达所述基因的植物表达载体；其中，所述“可操作的连接”是指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作连接的元件可为邻接或非邻接的；所述的植物表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1、SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

本发明所述植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达。

本发明分别构建了含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1所示多核苷酸序列的植物表达载体，通过农杆菌介导方法转化烟草细胞或组织，将转化的烟草经组织培养获得转基因烟草株系(转化体)，转基因烟草株系的耐盐性和抗旱性都明显高于对照(未转基因烟草)株系，由此证明所述Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因具有提高植物耐非生物胁迫抗性的功能，尤其具有提高植物耐盐、抗干旱等非生物胁迫抗性的功能，因此，可以将所述Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因转化到植物中以提高或改善植物的耐非生物胁迫抗性或培育得到抗逆性植物品种。

由此，本发明提供了一种培育抗逆转基因植物的方法，包括：构建含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1所示多核苷酸序列的植物表达载体；将所构建的植物表达载体转化到植物细胞或组织中，再生获得耐盐、抗干旱的转基因植物株系。

所述转化方案以及将所述多核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞或组织的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。本发明优选采用农杆菌介导的转化方式将SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.1所示核苷酸序列转化到植物细胞或组织中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生获得稳定转化植株(McCormick etal.Plant Cell Reports.1986.5：81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是高粱、大麦、玉米、水稻、小麦、大豆、马铃薯、番茄、菜豆、花生或棉花等。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，MolCell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

附图说明

图1为pZP211-MnSOD载体结构简图。

图2为pZP211-Cu/ZnSOD载体结构简图。

图3为pZP211-Fe/MnSOD载体结构简图。

图4为pRTL2-Mn-SOD和pRTL2-Cu/Zn-SOD的SacI+BamHI酶切鉴定图。

图5为pRTL2-Fe/MnSOD的BamHI+XbaI酶切鉴定图。

图6为pZP211-Mn-SOD的Ps tI酶切鉴定图。

图7为pZP211-Cu/Zn-SOD的HindIII+XbaI酶切鉴定图。

图8为pZP211-Fe/MnSOD的PstI酶切鉴定图。

图9为转Mn-SOD基因烟草的PCR鉴定图。

图10为转Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因烟草的PCR鉴定图。

图11为转Mn-SOD基因烟草的SOD活性测定图。

图12为转Cu/Zn-SOD基因烟草的SOD活性测定图。

图13为转Fe/Mn-SOD基因烟草的SOD活性测定图。

图14为转基因烟草植株盐胁迫0天生长情况；a为转Mn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫0天生长情况；b为转Cu/Zn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫0天生长情况；c为转Fe/Mn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫0天生长情况；d为野生型烟草植株200mmolL^-1NaCl胁迫0天生长情况。

图15为转基因烟草植株盐胁迫35天生长情况；a为转Mn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫35天生长情况；b为转Cu/Zn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫35天生长情况；c为转Fe/Mn-SOD基因烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫35天生长情况；d为野生型烟草植株200mmol L^-1NaCl胁迫35天生长情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

植物表达载体pZP211为转基因植物用通用载体，本领域技术人员可通过文献中所介绍的构建方法构建得到植物表达载体pZP211或通过商业途径购买得到植物表达载体pZP211；此外，本发明中所用的植物表达载体pZP211也可用任何一种通用的植物表达载体来代替，均能实现本发明的技术效果。

实施例1转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因烟草的培育

一、转基因表达载体的构建

1、Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因的获得

本发明从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)的菌株中克隆得到三种SOD基因。PCR所用引物分别为：Mn-SOD基因的上游引物CGAGCTCATGCCATTTGAATTGCCAGC，引入酶切位点SacI，下游引物CGGATCCTTACTTCGCTTTCGCTTCGC，引入酶切位点BamHI；Cu/Zn-SOD基因的上游引物CGAGCTCATGCGAAAAACGTACGGTGTG，引入酶切位点SacI，下游引物CGGATCCTCACGACGACTTGATTTCCC，引入酶切位点BamH I；Fe/Mn-SOD基因的上游引物CGGATCCATGCGTGGGGCAAGCAC，引入酶切位点BamHI，下游引物CTCTAGATTAAAACGGCTGCCAACG，引入酶切位点XbaI。PCR扩增体系为50μL，取1μL基因组DNA为模板，扩增条件是预变性95℃，5min；变性95℃，1mi n；退火56℃，40s；延伸72℃，1min；循环数30cycles；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收目的基因片段并克隆到pEASY-T3Vector载体上进行测序分析，测序结果表明，三段PCR扩增产物分别是序列表中的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的多核苷酸序列，其分别是Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因的多核苷酸序列。

2、转基因植物表达载体pZP211-MnSOD、pZP211-Cu/ZnSOD和pZP211-Fe/MnSOD的构建

(1)pZP211-MnSOD的构建

将克隆到pEASY-T3 Vector载体上的Mn-SOD基因用引物中设计的酶切位点SacI和BamH I进行双酶切，回收615bp的目的条带，同时也用SacI和BamHI双酶切中间载体pRTL2。利用T4DNA连接酶连接Mn-SOD基因和中间载体，得到重组质粒pRTL2-MnSOD，酶切鉴定结果如图4所示。其中，泳道1、2为SacI和BamHI双酶切pRTL2-MnSOD的结果，M为DNA marker。

将pRTL2-MnSOD用PstI单酶切后回收2016bp的含有Mn-SOD基因的目的片段条带，同时也用PstI单酶切植物表达载体pZP211。再利用T4DNA连接酶连接带有Mn-SOD基因的目的片段和表达载体，得到重组质粒pZP211-MnSOD，酶切鉴定结果如图6所示。其中，泳道1为PstI酶切pZP211-MnSOD的结果，M为DNA marker。

(2)pZP211-Cu/ZnSOD的构建

将克隆到pEASY-T3 Vector载体上的Cu/Zn-SOD基因用引物中设计的酶切位点SacI和BamHI进行双酶切，回收522bp的目的条带，同时也用SacI和BamHI双酶切中间载体pRTL2。利用T4DNA连接酶连接Cu/Zn-SOD基因和中间载体，得到重组质粒pRTL2-Cu/ZnSOD，酶切鉴定结果如图4所示。其中，泳道3为SacI和BamHI双酶切pRTL2-Cu/ZnSOD的结果，M为DNA marker。

将pRTL2-Cu/ZnSOD用PstI单酶切后回收1923bp的含有Cu/Zn-SOD基因的目的片段条带，同时也用PstI单酶切植物表达载体pZP211。再利用T4DNA连接酶连接带有Cu/Zn-SOD基因的目的片段和表达载体，得到重组质粒pZP211-Cu/ZnSOD，酶切鉴定结果如图7所示。其中，泳道1、2、3、4、5、6、7为HindIII和XbaI双酶切pZP211-Cu/ZnSOD的结果，M为DNA marker。

(3)pZP211-Fe/MnSOD的构建

将克隆到pEASY-T3 Vector载体上的Fe/Mn-SOD基因用引物中设计的酶切位点BamHI和XbaI进行双酶切，回收1236bp的目的条带，同时也用BamHI和XbaI双酶切中间载体pRTL2。利用T4DNA连接酶连接Fe/Mn-SOD基因和中间载体，得到重组质粒pRTL2-Fe/MnSOD，酶切鉴定结果如图5所示。其中，泳道1、2、3、4为BamHI和XbaI双酶切pRTL2-Fe/MnSOD的结果，M为DNA marker。

将pRTL2-Fe/MnSOD用PstI单酶切后回收2649bp的含有Fe/Mn-SOD基因的目的片段条带，同时也用PstI单酶切植物表达载体pZP211，再利用T 4DNA连接酶连接带有Fe/Mn-SOD基因的目的片段和表达载体，得到重组质粒pZP211-Fe/MnSOD，酶切鉴定结果如图8所示。其中，泳道1、2、3为PstI单酶切pZP211-Fe/MnSOD的结果，M为DNA marker。

二、农杆菌介导的遗传转化

1、含有pZP211-MnSOD、pZP211-Cu/ZnSOD和pZP211-Fe/MnSOD的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株的制备

将0.5μL的pZP211-MnSOD、pZP211-Cu/ZnSOD或pZP211-Fe/MnSOD质粒分别加入到50μL根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1感受态细胞中，混合均匀后冰浴30min，然后放入液氮中1min，从液氮中取出放入37℃水浴锅中1min，最后冰上放置3min后加入300μL LB液体培养基，26℃摇2h。通过此液氮冻融法可将三种质粒转化进入农杆菌细胞。农杆菌C58C1有利福平和庆大霉素抗性，pZP211-MnSOD质粒有壮观霉素和链霉素抗性。取100μL转化后的菌液涂布在含壮观霉素、利福平、链霉素和庆大霉素四种抗生素的LB固体培养基上，28℃培养两天。分别挑取单菌落于4ml含有四种抗生素的LB液体培养基中，28℃摇两天。取1μL菌液PCR扩增Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因和Fe/Mn-SOD基因进行初步验证。对初步PCR验证正确的菌液取3μL提质粒，将三种质粒分别反转入大肠杆菌中再提质粒进行酶切，从而进一步验证pZP211-MnSOD、pZP211-Cu/ZnSOD和pZP211-Fe/MnSOD质粒已经被成功转入根癌农杆菌C58C1中。

2、转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因烟草的获得

烟草大烟叶(Nicotiana Tobaccum)种子用70％乙醇浸泡1min，然后去乙醇，无菌水清洗一遍，用10％次氯酸钠灭菌12min，无菌水清洗4-5遍，播种于MS₀培养基(不含任何激素的MS)，约6-8周后取无菌苗叶片转化。

选择适宜大小的烟草无菌苗，将发育正常、叶面平展的叶片剪成5.0mm×5.0mm大小，平铺于MS基本培养基(含MS维生素)+1.0mg L^-16-BA+0.2mg L^-1 IAA的培养基上，25℃、光照16h条件下预培养3d。

在侵染前4d，将含有三种植物表达载体的C58C1农杆菌分别接种于含有四种抗生素的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于4ml含有四种抗生素的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡小量培养2d。转入100ml含有相应抗生素的YEP液体培养基中大量培养，200rpm、28℃恒温震荡器上培养至OD₆₀₀值为0.5左右。

室温条件下，3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，用100ml MS₀重悬液(pH6.0)重悬。将预培养3d的烟草愈伤组织转移至农杆菌菌液中侵染20min，然后用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，转移至MS基本培养基(含MS维生素)+1.0mg L^-16-BA+0.2mg L^-1 IAA上，25℃黑暗条件下共培养2d。

将共培养后的愈伤组织转至MS基本培养基(含MS维生素)+1.0mgL^-16-BA+0.2mg L^-1 IAA+Cb(Carbenicillin，Cb)300mg L^-1+Kan100mg L^-1的培养基上，25℃光照16h条件下培养至愈伤组织周边不定芽长至0.5cm，每隔2周更换一次培养基。

长有不定芽的愈伤组织转移至含有1/2MS基本培养基(含MS维生素)+Cef 300mg L^-1+Kan 100mg L^-1培养基的三角瓶中培养，通过无性繁殖得到抗性再生植株。

三、转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因烟草的分子检测

1、转基因植株的PCR鉴定

对得到的完整的转基因烟草抗性再生植株取叶片，CTAB抽提法提取转化体(转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因的烟草NC 89或大烟叶)及对照(烟草NC 89或大烟叶)的基因组DNA，用于PCR鉴定。

PCR引物分别为：Mn-SOD基因的上游引物

CGAGCTCATGCCATTTGAATTGCCAGC，下游引物

CGGATCCTTACTTCGCTTTCGCTTCGC；Cu/Zn-SOD基因的上游引物

CGAGCTCATGCGAAAAACGTACGGTGTG，下游引物

CGGATCCTCACGACGACTTGATTTCCC；Fe/Mn-SOD基因的上游引物

CGGATCCATGCGTGGGGCAAGCAC，下游引物CTCTAGATTAAAACGGCTGCCAACG。

PCR反应体系(25μL体系)：DNA聚合酶Taq 0.5μL，10×Taq缓冲液2.5μL，dNTPs 0.5μL，上、下游引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，ddH₂O 19.5μL。

PCR反应程序：预变性95℃，5min；变性95℃，1min；退火56℃，40s；延伸72℃，1min；循环数30循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

检测结果如图9、图10所示，检测结果表明三种转基因烟草可分别扩增出615bp、522bp和1236bp的目的基因条带，而对照未扩出相应条带，说明Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因确已转入烟草。图9中，M：Marker；WT：对照；其余泳道为转Mn-SOD基因烟草单株。其中，1-15中转入的是Mn-SOD基因。图10中，M：Marker；WT：对照；其中，Marker左侧泳道为转Cu/Zn-SOD基因烟草单株；Marker右侧泳道为转Fe/Mn-SOD基因烟草单株，4为阳性对照。

2、转基因植株的Southern blot分析

(1)对得到的完整的转基因烟草抗性再生植株取叶片，CTAB抽提法提取转化体(转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因的烟草NC89或大烟叶)及对照(烟草NC89或大烟叶)的基因组DNA，根据转入的Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因序列以及质粒本身酶切位点，选择EcoRV和XbaI对转Mn-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因的烟草DNA进行双酶切消化，选择HindIII和BamHI对转Fe/Mn-SOD基因的烟草DNA进行双酶切消化，酶切完全后，用1×TAE缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳，电压60V，4h；

(2)将DNA转移到尼龙膜上，转移后的尼龙膜装入杂交管，加入10ml预杂交液对尼龙膜进行预杂交，42℃，90min；

(3)弃预杂交液，将配制好的杂交液(1.6μL标记反应液，Marker探针0.1ul，加入到8mL新预杂交液中)加入杂交管进行杂交，42℃，20h；

(4)杂交结束后，将杂交液倒出，-20℃冻存。往杂交管中加入50mL 2×SSC/0.1％SDS，室温洗涤30min，重复一次；

(5)往杂交管中加入66℃预热的50mL 0.5×SSC/0.1％SDS，66℃洗涤60min，重复二次；

(6)洗涤结束后，将尼龙膜小心从杂交管中取出，放入盛有wash buffer的大培养皿中，浸泡5min；

(7)将尼龙膜放回杂交管中，加入100mL blocking buffer(用MaleicAcid Buffer将10×Blocking solution稀释10倍)。室温30min-60min；

(8)配制抗体溶液，取1.6μL试剂盒中的抗体，加入到20mL blockingbuffer中，混匀。倒掉杂交管中的blocking buffer，加入抗体溶液，室温，20min-40min；

(9)抗体反应结束后，将抗体溶液倒掉，往杂交管中加入50mL washbuffer，室温，2h(中途换2-3次新的wash buffer)；

(10)将尼龙膜从杂交管中取出，放入盛有detection buffer的大培养皿中，浸泡5min；

(11)将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上，均匀滴加800μL CSPD溶液，将另一侧的尼龙膜平整地覆盖到膜上，轻轻挤走气泡，37℃，温育15min；

(12)将尼龙膜铺到暗匣中，在暗室中压上X光胶片，压片2h；

(13)洗片：暗室中，依次将胶片放入显影液3min，定影液1min。然后用自来水将胶片充分涮洗后晾干。

其中，标记探针按照如下方法制备：

①以构建好的三种植物表达载体为模板进行PCR反应。

PCR引物分别为：

Mn-SOD基因的上游引物CGAGCTCATGCCATTTGAATTGCCAGC，下游引物CGGATCCTTACTTCGCTTTCGCTTCGC；

Cu/Zn-SOD基因的上游引物CGAGCTCATGCGAAAAACGTACGGTGTG，下游引物CGGATCCTCACGACGACTTGATTTCCC；

Fe/Mn-SOD基因的上游引物CGGATCCATGCGTGGGGCAAGCAC，下游引物CTCTAGATTAAAACGGCTGCCAACG。

PCR反应体系(50μL体系)：DNA聚合酶Taq 1μL，10×Taq缓冲液5μL，dNTPs 1.5μL，上、下游引物各1μL，质粒DNA 1μL，ddH₂O39.5μL。

PCR反应程序：预变性95℃，5min；变性95℃，1min；退火56℃，40s；延伸72℃，1min；循环数30循环；最后72℃延伸10min。

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，EB染色，凝胶成像仪照相。照相后将目的条带用刀切下后，回收目的片段。

②将基因片段回收后，用分光光度计进行定量，取1μg回收DNA，定容到16μL，沸水浴煮10min，快速放到冰中，然后快速离心10秒，再放回冰浴中10min，然后加入4μL 5×标记反应液，混匀，37℃反应20h。标记结束后，沸水浴10min，冰上速冻，然后放入-20℃冰箱备用。

结果三种转化体可以杂交出条带，对照没有，进一步证明烟草转化成功。

四、转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因烟草的SOD酶活性测定

(1)酶液提取。取PCR检测正确的转基因烟草和野生型烟草的叶片，称重后置于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1ml于离心管中，1000rpm，20min，上清液即为SOD粗酶液。

(2)显色反应。按照下表向试管中加入各种溶液，即为反应液。混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于20,000Lx日光下反应10min(要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长)。

表1

(3)SOD活性测定与计算。至反应结束后，以不照光的对照管调零，分别测定其它各管在560nm处的吸光值。SOD活性以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位。计算公式为：SOD总活性＝(Ack-Ae)×V/(Ack×0.5×W×Vt)。其中，Ack为照光对照管的吸光值；Ae为样品管的吸光值；V是酶液总量(ml)；W为样品鲜重(g)；Vt为测定时样品的用量(ml)。

测定结果分别如图11、图12和图13所示。转Mn-SOD基因的烟草中超氧化物歧化酶活力比野生型高出三倍多(图11)，进一步证明Mn-SOD基因已被成功地转入烟草植株，并且得到了高效的表达。而转Cu/Zn-SOD基因的烟草中SOD活性比野生型高出两倍多(图12)，证明Cu/Zn-SOD基因也已成功地进入烟草并得到表达，但表达量没有Mn-SOD基因高。图13的结果表明，Fe/Mn-SOD基因在烟草中也得到了一定的表达，但表达量远低于Mn-SOD基因和Cu/Zn-SOD基因。

对转基因烟草SOD酶活性测定结果显示，转Mn-SOD基因烟草植株中的SOD酶活力最高，证明其在烟草中的表达量在三个SOD基因中是最高的，其次为Cu/Zn-SOD基因，Fe/Mn-SOD基因表达的酶活力最低。

五、转Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因烟草的抗逆性测定

1、转基因植株的耐盐性测定

从每个烟草转基因类型的阳性植株及野生型无菌苗上剪取1cm左右的茎间组织(每个株系10个重复)，接种在含有200mmo l L^-1NaCl的1/2MS培养基上，于三角瓶中进行耐盐处理，25℃、16h光照条件下培养，观察植株生长状况，以叶片和根系生长为重点观察对象。

结果如图14和15所示。在含有200mmol L^-1NaCl的培养基上培养35d后，野生型烟草植株地上部叶片生长缓慢，且没有根系生长。3种转基因烟草植株根系均能够正常生长，其中转化Mn-SOD基因的植株根系生长状况要强于其它转基因类型的植株。

由此表明，Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因的转化提高了烟草植株的耐盐性。其中，转Mn-SOD基因对提高烟草对盐胁迫的耐受性效果最好，转Cu/Zn-SOD基因次之，转Fe/Mn-SOD基因的效果较差。

2、转基因植株的抗旱性测定

将无性繁殖获得的大小一致的阳性转基因植株移栽至10cm×10cm×10cm的塑料盆中(基质为体积相等的蛭石)，各塑料盆浇水量相同。每个转基因类型和野生型各移栽5株，待植株长至3～5片真叶时，选取生长状态一致的植株进行水分胁迫处理，直至刚长出的心叶萎焉，对所有植株进行复水处理，观察复活情况。

干旱胁迫处理46d后，野生型烟草叶片全部干枯，而三种转基因阳性植株顶部叶片仍保持绿色。复水后，野生型烟草植株未能复活，转基因植株三周后陆续有新叶长出，其中转Mn-SOD基因的烟草植株新叶出现时间和生长速度较另外两种转基因植株要好。

抗旱性测定的结果表明，Mn-SOD基因、Cu/Zn-SOD基因或Fe/Mn-SOD基因转入烟草后提高了烟草的抗旱性。三种转基因烟草相比较，与抗盐性相似，转Mn-SOD基因对提高烟草对旱胁迫的耐受性效果最好，转Cu/Zn-SOD基因次之，转Fe/Mn-SOD基因的效果较差。

                         序列表

 

<110>  与抗逆性相关基因及在提高植物对环境胁迫抗性中的应用

 

<120>  中国农业科学院生物技术研究所  江苏师范大学

 

<130>  DQXL--0026

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  615

<212>  DNA

<213>  Geobacillus sp

 

<400>  1

atgccatttg aattgccagc attgccgtat ccgtatgatg cgcttgagcc gcacatcgac       60

 

aaagaaacga tgaacattca ccacacgaag caccataaca catacgttac aaatttgaat      120

 

gcggcgcttg aagggcatcc ggatttgcaa aacaaatcgc tcgaagaatt gctcagcaat      180

 

ttggaagccc ttccggaaag cattcgcacg gcggtgcgca acaacggcgg cggtcatgca      240

 

aaccactcgc ttttctggac gattttgtcg ccaaatggcg gcggtgagcc gacgggtgag      300

 

ctggctgagg cgatcaacaa aaaattcggc agcttcaccg cgtttaaaga cgagttttcg      360

 

aaagcagcgg ccggccgttt cggttctggc tgggcatggc ttgtcgtgaa caacggcgag      420

 

ctggaaatta cgagcacgcc gaaccaagac tcgccgatca tggaaggcaa aacgccgatt      480

 

ctcggcttgg acgtttggga gcatgcgtac tacttgaaat accaaaaccg ccgtccggaa      540

 

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gcgaaagcga agtaa                                                       615

 

 

<210>  2

<211>  522

<212>  DNA

<213>  Geobacillus sp

 

<400>  2

ttgcgaaaaa cgtacggtgt ggtgctggcg gcagcgctcg tgttgtccgg ctgcggccaa       60

 

gagaatggaa cgagccggac ggtggagatg atcaatgcgg atggcgattc gatcggtacg      120

 

atcgagttga ctgaacaggc ggaaggggtg cggctgaagc ttgacttgga aggcctcccg      180

 

ccgggagagc acgccattca catccatgaa aacggaagct gcaaaccgcc cgatttccaa      240

 

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gccggcggac ggatcgcctg cggggaaatc aagtcgtcgt ga                         522

 

 

<210>  3

<211>  1236

<212>  DNA

<213>  Geobacillus sp

 

<400>  3

ttgcgtgggg caagcacgga tggcgcttcg tcgctgctcg agtttattgc cgagcatgac       60

 

ggcgagtgga cggaagaggc cgtccgcgag cttcagcgcc ttgccgatga cgtgtatgtc      120

 

ggtgcgcttc gccagtatgt catggaagcg gctgcgtggg gaagacaagt tgaacaggcg      180

 

ctgtctgcac gcaggatggc tgaggatgtt gggctttcgt ctttgttggc gtacatcgat      240

 

ggacacggcg atgaatggac cgaagaagcg atttacgagc tccagcgtct tgtcgatgac      300

 

gtatacactc gggccgtccg cctggctgat tcgtcagctg ccgatcggga agaagaggcg      360

 

acgcaagaac aagtcgaagg ggaatcggtg tcgcctgaac tggagagtga aaacaaagag      420

 

aacgaagacg gatggcttga caccagcggg acggcagagc gggttgagga cgcaaaagag      480

 

ccggctttta tggcggagct ctccgactcg ccgactgatg cagctgacgg cgagccggat      540

 

caagcggaca acgtgaccga tggaaagcga cgctgggtgg atgcggacga cggcggtgag      600

 

ccgcgtcaac aagtagcgcc cggccgtcat gtcttgccgc cgctgccgta ccgttatgat      660

 

gcgctcgagc cgcatatttc cgaagaaatc atgcgccttc accatacgaa gcatcatcaa      720

 

agctatgtcg acggtcttaa tcaggcggag cggatgatgg ccgaggcgcg ccggacgaac      780

 

aattttgatc tgttgaaaca ttgggagcgg gaagcggcgt tccacggctc cgggcattat      840

 

ttgcatacaa tcttttggta caacatgcat ccagagggcg gcggcgagcc gcgcggggag      900

 

ctgcgggcgc aaatcgagcg cgattttggc agttttaccg cctttcgccg tcatttcacc      960

 

gaagcggcga aaagcgccga aggggtcggc tgggcgctgc tcgtttgggc gccgcgagcg     1020

 

caccgtctgg aaattttgca ggcggaaaaa caccagctca tggcgcaatg ggatgtgatc     1080

 

ccgcttctcg tgcttgatgt gtgggagcat gcctactatt tgcaatacaa aaatgatcgg     1140

 

gcggcgtaca tcgaacattg gtggaacgtc gtcaactggc gcaacgttga agaacgcttt     1200

 

catgaggcgc agaagcttcg ttggcagccg ttttaa                               1236

Claims (9)

1.地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)Mn-SOD基因，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)Cu/Zn-SOD基因，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.地热芽孢杆菌(Geobacillus sp)Fe/Mn-SOD基因，其特征在于，其多核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

4.含有权利要求1-3任何一项所述基因的表达载体。

5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是植物表达载体。

6.权利要求1-3任何一项所述基因在提高植物对环境胁迫抗性中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，包括：构建含有权利要求1-3任何一项所述基因的植物表达载体；将所构建的植物表达载体转化到植物细胞或植物组织中，再生获得对非生物胁迫抗性提高的转基因植物株系。

8.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的非生物胁迫包括盐碱或干旱。

9.按照权利要求6所述的应用，包括：所述的植物包括双子叶植物和单子叶植物。

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