CN104862320A - 一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因及应用，其中编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因，是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具有负责调控植物耐逆与促进植物衰老的功能。IbERF4基因编码的蛋白质是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明从甘薯中分离出编码ERF转录因子的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明ERF转录因子能够响应逆境信号，负向调控植物的耐盐碱能力，并且转基因植株提前衰老。此基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因、该基因编码的蛋白质以及含有该基因的重组载体及基因的抗逆应用。

背景技术

在植物中许多基因都受逆境胁迫诱导表达，根据作用方式的不同，主要分为两大类：调节基因和功能基因。调节基因主要是在信号转导和基因表达中起调节作用的转录因子；功能基因主要编码一些调节渗透势、清除自由基和活性氧的酶等。一般认为，植物对干旱和高盐等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技术导入单个功能基因虽然能增加植物的某种单一抗性，但并不能从整体上综合提高植物的抗逆性。转录因子作为功能基因表达的调节开关，可以对不同的基因进行精确的调节，在植物逆境信号传递过程中发挥着关键的作用，所以通过增强某个转录因子的作用，可促使多个与抗逆有关的功能基因表达,这是使植物抗逆性状获得综合改良的一条非常有效的途径。

植物AP2/ERF是一个庞大的转录因子基因家族，含有由60～70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域而得名，存在于所有的植物中。AP2/ERF转录因子参与多种生物学过程，包括植物生长、花发育、果实发育、种子发育、损伤、病菌防御、高盐、干旱等环境胁迫响应等。AP2/ERF类转录因子参与水杨酸、茉莉酸、乙烯、脱落酸等多种信号转导途径，而且是逆境信号交叉途径中的连接因子。根据含AP2/ERF结构域的数目，AP2/ERF转录因子含5个亚组，包括AP2(APETALA 2)、RAV(related to ABI3/VP1)、DREB(dehydration-responsive element binding protein)、ERF和其他。AP2家族含2个AP2/EREBP(ethylene-responsive element binding protein)结构域，ERF和DREB家族仅含1个AP2/EREBP结构域，而RAV家族除一个AP2/EREBP结构域外还含1个B3结构域。ERF家族是AP2/ERF转录因子大家族的一个主要亚家族，在调节植物生物和非生物逆境反应中发挥重要作用。在拟南芥和水稻基因组中分别含有122和139个ERF转录因子家族成员，根据基因序列系统树和蛋白保守结构域等特征，拟南芥和水稻ERF基因分别组成12和15个不同的组。

甘薯不仅是重要的粮食作物，而且还是重要的经济作物和能源作物。甘薯广泛种植在世界上的100多个国家，我国是世界上的最大生产国，甘薯生产约占世界甘薯的80％。与其他粮食作物相比，甘薯相对较为耐旱，但品种间差异较大，世界上相当比例的甘薯种植在干旱的 环境下，而世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中居首位。我国现有边际性土地资源(非耕地)约20亿亩，主要是干旱、盐碱滩涂地。在我国农业用水紧缺、耕地面积紧张的形势下，在这些地区开发种植耐旱甘薯，既能合理的利用土地资源，又能部分缓解粮食和能源紧缺问题。通过定向改良甘薯的抗逆境能力，提高甘薯在边际性土地区的生长适应性，对确保我国的粮食安全具有重要的战略意义。因此在甘薯中克隆新的ERF类转录因子基因，研究其基本的生物学特性和功能，可为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，并为改良作物抗逆性提供一定的物质基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因。

本发明的第二个目的是提供一种该基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种含有该基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的最后一个目的在于提供该基因的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因，它是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列由684个碱基组成。所述IbERF4基因具有负责调控植物耐逆与促进植物衰老的功能。

上述基因编码的蛋白质，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。所述的序列由227个氨基酸残基组成。

一种含有上述基因的表达载体pCAMBIA1305-LcERF，它含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

一种含有表达载体农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4的构建。

上述基因在转化植物获得转基因植株中的应用，尤其是在制备转基因拟南芥中的应用。本发明的优点：

发明从甘薯中分离出编码ERF转录因子基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明IbERF4基因能够响应逆境信号，负调控植物的耐旱盐等能力，并且促进植株的衰老。此基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1.IbERF4氨基酸序列的系统进化树分析结果

图2.IbERF4基因受盐胁迫诱导表达

图3.IbERF4基因受干旱胁迫诱导表达

图4.甘薯不同叶龄中IbERF4的表达

图5.pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4载体示意图

图6.转化空载体的拟南芥株系和转IbERF4基因植株抗旱比较

图7.转化空载体的拟南芥株系和转IbERF4基因植株耐盐比较

图8.转化空载体的拟南芥株系和转IbERF4基因植株老化比较

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。

实施例1

甘薯中ERF转录因子IbERF4基因序列获得，具体如下：

利用OMEGA RNA试剂盒，从100mg的新鲜的甘薯叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒(Bioteke)合成cDNA。

具体反应体系如下：

在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：1、50℃，45min；2、70℃，10min；之后冰上冷却。

将提取的总RNA送华大基因(Beijing Genomic Institute,BGI)，通过高通量测序获得甘薯转录组数据库，并通过De novo拼接获得甘薯Unigene数据库，其中Unigene23081与NR数据库 比对后发现该基因可能参与逆境响应。将Unigene23081通过OFR FINDER(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在线软件预测基因完成的ORF，并利用Primer Premier 5设计扩增完整ORF引物：

IbERF4(F):5'CCTCTTTCGATTTCCACCTTAT 3'

IbERF4(R):5'CAATTCGCTCTGTCGGCTGTA 3'

利用TAKARA公司Primerstar GXL DNA聚合酶进行扩增，具体步骤如下：

反应条件如下：94℃，4min；98℃，10Sec；55℃，15Sec；68℃，l.5min；72℃，10min；30个循环。使用OMEGA DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化，纯化后的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接(本过程使用TransGEN的pEASY-Blunt Vector Cloning Kit试剂盒)，反应体系如下:IbERF4基因的cDNA片段4ul，pEASY-Blunt载体1μL。反应条件:20-30℃，30min。连接产物转化E-Coli.DH5α感受态，涂布在含有40ul 25mg/ml的X-Gal、16ul 50mg/ml的IPTG、100mg/mL Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用菌落PCR法确认pEASY-Blunt载体中插入片段的长度大小，与预期一致。送南京金斯瑞生物科技公司测序获得基因序列SEQ ID NO.1。

实施例2

IbERF4蛋白序列同源分析，具体如下：

测序获得cDNA全长907bp，ORF为684bp，编码227个氨基酸SEQ ID NO.2，将翻译获得蛋白序列与NCBI蛋白数据进行比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得了与IbERF4蛋白序列相似的植物种属同源基因。在多重比较分析的基础上，建立了各同源植物种属基因的系统进化树，详见图1。包括烟草(Nicotiana tabacum)，土豆(Solanum tuberosum)，蕃茄(Solanum lycopersicum)，辣椒(Capsicum annuum)，黄花螺旋狸藻(Genlisea aurea)，咖啡(Coffea arabica)，橡胶树(Hevea brasiliensis)，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，苜蓿(Medicago truncatula)， 巨桉(Eucalyptus grandis)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)。利用MEGA 5.1软件进行系统进化树的构建，得到IbERF4亲缘关系与茄目类作物关系最近。

实施例3

IbERF4在甘薯中受盐、旱胁迫以及不同叶片中的表达(如图2、图3所示)，具体如下： 

剪取宁紫1号25cm的苗，并保留3张完全展开叶，放入1/2Hogland营养液中25℃培养15天，分别用20％PEG6000和150mM NaCl处理3h、6h、12h、24h、48h，取3个重复，液氮速冻后存于-80℃冰箱。提取RNA并反转成cDNA，方法如实施例1所述。采用是TOYOBO公司的荧光定量试剂盒。反应在定量PCR仪(Applied Biosystems stepone plus)上进行，按照相对定量的方法检测基因的表达量，反应程序按照TOYOBO提供的操作手册进行，甘薯Tubulin基因作为反应中的内参,Tubulin引物序列：

F,CAACTACCAGCCACCAACTGT,R，CAAGATCCTCACGAGCTTCAC；IbERF4定量引物：

F，ATCTGGTAACGGCGGGAAGG，R，GAACGCAGCACAATCGTAGGC；结果发现该基因同时受干旱和盐的胁迫诱导表达。取宁紫1号不同部位的叶片，从新叶开始算第1张叶片，依次往下去第1、3、5、7、9张叶片，第9张叶片最老，对这九张叶片进行定量PCR研究，结果见图4，结果发现，IbERF4在老叶中的表达要高于新叶。

实施例4

双元植物表达载体pCAMBIA1305-IbERF4的构建，具体如下：

pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4载体示意图如图5所示，首先以pEASY-Blunt-IbERF4质粒为模板，采用引物

IbERF4-PstI(F):5'aaCTGCAGCCTCTTTCGATTTCCACCTTAT 3' 

IbERF4-BamHI(R):5'ccGGATCCCAATTCGCTCTGTCGGCTGTA 3' 

在IbERF4前后分别引入酶切位点PstI和BamHI，其反应体系和条件如实施例1中所述。然后PCR产物和pCAMBIA1305空载体质粒分别用BamHI和PstI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得 到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4构建正确。

实施例5

用于植物转基因的农杆菌菌种EHA105:pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4的构建，具体如下：

本发明使用的农杆菌菌株为EHA105。采用的是液氮冻融法将构建好的表达载体转入农杆菌。具体过程为：1)冰浴融化EHA105感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20～30min；2)液氮速冻5min，37℃热击5min，迅速置于冰上1～2min；3)加入800μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm复苏3.5h；4)4000rpm离心3min，吸掉培养基；5)混匀剩余菌液，涂抹于添加100mg/ml卡纳霉素和100mg/ml利福平的固体LB培基上；6)28℃倒置培养30～48h；7)PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

实施例6

IbERF4转化Col野生型拟南芥，具体如下：

将实施例5中阳性克隆接种到50mlYEP(含100μg/ml Rif、100μg/ml Kan)液体培养基中，28℃180rpm继续培养至OD600＝0.8。4000rpm离心10min，弃培养基，收集菌体。用拟南芥渗入缓冲液将菌体稀释OD600＝0.6，制备成拟南芥侵染液。当拟南芥抽苔4-5cm时即可准备侵染，侵染的前3d去除其顶生花序，以利用腋生花序的生长。待长出腋生花序后，其下部的花开始授粉时即可进行转化。转化前大量浇水，并将已授粉的花蕾及荚果摘除。共配制50ml拟南芥侵染液(5％蔗糖，0.05％SilwetL-77)，倒入培养皿，将拟南芥的花序浸入其中30s，注意莲座叶不要沾染到菌液。取出植株，横放在托盘中，暗处理24h。之后直立放置方盘正常光照培养。待果荚成熟时收获T0代种子。

将T0代种子播种前在4℃冰箱春化3d，0.5％NaClO表面消毒后，播种于1/2MS固体培养基上(大量元素、微量元素减半，含20mg/L潮霉素)培养。7～14d后挑选转化体，具有潮霉素抗性的转化植株体能在含有潮霉素培养基上生长，根明显伸长，而非转化体渐渐黄化死亡。待植株长出4-5片叶子时，提取叶片DNA进行PCR鉴定，引物及PCR程序同实施例1中的IbERF4基因中间片断的克隆。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。过PCR扩增能够得到目的片断的为拟南芥阳性转化体，将其继续培养待果荚成熟收获T1代种子。将PCR鉴定为阳性的植株所收获的T1代种子继续播种，同样经过潮霉素抗性筛选，统计其性状分离比。经卡方检验符合孟德尔遗传定律中3:1分离比。将部分抗性苗移植入土壤中，收获T2代纯合的转基因种子。

对转IbERF4基因拟南芥的抗性进行鉴定

1)耐旱鉴定

取IbERF4过表达拟南芥株系(OV-1)和转化空载体的拟南芥株系(CK)，点播在营养土中，长日照(16h/8h，白天/黑夜)条件下培养10天。将蛭石和营养土2:1(v/v)混合均匀后装至大小一致的塑料培养钵中，并称重保持各钵内培养土重量一致，钵面水平并面积大小一致。将各株系幼苗移至不同钵内，并置于同一托盘内，一次性浇足水后不再浇水。经土中培养2周左右，及时观察表型，见图6，因此，在拟南芥中过表达IbERF4可以负向调控拟南芥对干旱的响应。

2)耐盐鉴定

鉴定方法1：取IbERF4过表达的拟南芥株系(OV-1,OV-2,OV-3)、转化空载体的拟南芥株系(CK)和WT植株，点播在营养土中，长日照(16h/8h，白天/黑夜)条件下培养10天。将蛭石和营养土2:1(v/v)混合均匀后装至大小一致的塑料培养钵中，并称重保持各钵内培养土重量一致，钵面水平并面积大小一致。将各株系幼苗移至不同钵内，并置于同一托盘内，一次性浇200mM的NaCl溶液，营养土中饱和，后期浇水维持浓度。经土中培养10d左右，及时观察表型，见图7。实验设三次重复，每次重复统计20个单株，统计存活率。

鉴定方法2：取IbERF4过表达拟南芥株系(OV-1,OV-2,OV-3,OV-4)、转化空载体的拟南芥株系(CK)和WT植株点播于1/2MS培养基上5-7天，移苗至1/2MS+150mMNaCl的培养基上，1周左右观察表型，统计死苗率。转IbERF4基因家系在150mM的NaCl条件下几乎全部死亡。

因此，在拟南芥中过表达IbERF4可以负向调控拟南芥对盐的响应。

3)衰老鉴定

取IbERF4过表达的拟南芥株系(OV-1，OV-2)和转化空载体的拟南芥株系(CK)，点播在营养土中，长日照(16h/8h，白天/黑夜)条件下培养10天。将蛭石和营养土2:1(v/v)混合均匀后装至大小一致的塑料培养钵中。抽苔以后观察叶片的黄化程度以及卷曲程度，见图8。结果表明在拟南芥中过表达IbERF4能够促进拟南芥的衰老。

Claims (6)

1.一种编码甘薯ERF转录因子的IbERF4基因，其特征在于它是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述IbERF4基因具有负责调控植物耐逆与促进植物衰老的功能。

2.权利要求1所述IbERF4基因编码的蛋白质，其特征在于，它是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述基因的表达载体pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4。

4.一种含有表达载体的农杆菌宿主细胞EHA105:pCAMBIA1305-2×35s-IbERF4的构建。

5.权利要求3或4所述的表达载体在转化植物获得转基因植株中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。