CN105779476A - 一种茶树耐寒基因CsSPMS及其植物表达载体构建与应用 - Google Patents

一种茶树耐寒基因CsSPMS及其植物表达载体构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种茶树耐寒基因<i>CsSPMS</i>。本发明还公开了一种植物表达载体。本发明还公开了一种茶树耐寒基因<i>CsSPMS</i>植物表达载体构建方法及其应用。本发明把该重组的植物表达载体遗传转化至拟南芥植株，<i>CsSPMS</i>基因在CaMV35S启动子的启动下大量表达，并合成CsSPMS蛋白，调控下游基因表达，从而提高植株耐寒性能。

Description

一种茶树耐寒基因CsSPMS及其植物表达载体构建与应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种茶树耐寒基因CsSPMS及其植物表达载体构建与应用。
背景技术
低温、涝害和高盐等非生物逆境胁迫对植物的生长发育有很大影响，植物抗逆研究一直是植物生物学领域的热点。茶树是多年生木本经济作物，茶叶是我国传统特色农产品，同时也是世界三大无酒精饮料之一，社会及经济效益较高。近年来随着茶园面积的不断扩大，茶树栽培面积的增加，茶叶生产季节的突然低温成为茶叶生产的限制性因素之一。同时茶园的霜冻问题日益突出，而茶园设施保温则需要消耗大量的能源。茶树抗逆育种一直是茶叶科研工作者关注的重要课题之一，但由于杂交育种等常规育种方法耗时长、效率低。挖掘高效抗逆调控基因并转化的分子育种手段，成为植物抗逆育种的重要有效手段。
精胺合成酶(SPMS)是植物多胺合成路径中的重要酶，能催化亚精胺形成精胺。通过基因工程技术过量表达一些SPMS能提高植物应对非生物胁迫的抗逆能力。Sagor等(2013)将精胺合成酶基因AtSPMS转入拟南芥，转基因拟南芥的耐寒性状明显增[1]。Gonzalez等(2011)获得了精胺合成酶基因AtSPMS转基因拟南芥，增强了其抵抗病原菌侵染的能力[2]。从反面来说，Yamaguchi等(2007)得到了精胺合成酶基因AtSPMS缺失的植株，植株的耐盐和耐干旱能力急剧下降[3]。
在植物遗传转化方法中，农杆菌介导是应用广泛的有效方法之一，能有效融合的植物表达载体至关重要。将耐寒、耐盐等抗逆转录因子基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化途径，能获得新的抗逆性状的种质资源。对于新品种培育、生产推广具有重要作用。
参考文献：
[1]Sagor,G.H.M.,Berberich,T.,Takahashi,Y.,Niitsu,M.,&Kusano,T.(2013).ThepolyaminespermineprotectsArabidopsisfromheatstress-induceddamagebyincreasingexpressionofheatshock-relatedgenes.TransgenicResearch,22,595-605.
[2]Gonzalez,M.E.,Marco,F.,Minguet,E.G.,Carrasco-Sorli,P.,Blázquez,M.A.,Carbonell,J.,Ruiz,O.A.,&Pieckenstain,F.L.(2011).PerturbationofsperminesynthasegeneexpressionandtranscriptprofilingprovidenewinsightsontheroleofthetetraaminespermineinArabidopsisdefenseagainstPseudomonasviridiflava.PlantPhysiology,156,2266-2277.
[3]Yamaguchi,K.,Takahashi,Y.,Berberich,T.,Imai,A.,Takahashi,T.,Michael,A.,&Kusano,T.(2007).AprotectiveroleforthepolyaminespermineagainstdroughtstressinArabidopsis.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,352,486-490.
发明内容
发明目的：为了解决植物抗逆性问题，本发明的所要解决的第一个技术问题是提供了一种茶树耐寒基因CsSPMS。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种植物表达载体，其含有所述的茶树耐寒基因CsSPMS。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种茶树耐寒基因CsSPMS植物表达载体构建方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种茶树耐寒基因CsSPMS，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
本发明内容还包括一种茶树耐寒基因CsSPMS，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
本发明内容还包括一种植物表达载体，其含有所述的茶树耐寒基因CsSPMS。
其中，上述植物表达载体为XbaI和BamHI双酶切CsSPMS后连接到pBI121载体质粒进行重组反应得到。
本发明还包括一种宿主细胞，其含有所述的植物表达载体。
本发明还包括一种茶树耐寒基因CsSPMS植物表达载体构建方法，包括如下步骤：
a.‘迎霜’茶树耐寒基因CsSPMS的克隆：
以‘迎霜’茶树幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增基因；
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，产物连接到pMD-18T-simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定；
b.植物表达载体pBI121-CsSPMS的构建：
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，在CsSPMS基因的上下游分别引入XbaI和BamHI酶切位点；
产物连接到pMD-18T-simple载体，转化DH5a感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经XbaI和BamHI双酶切的CsSPMS基因片段与pBI121连接，转化，提取质粒，进行序列测定，植物表达载体pBI121-CsSPMS构建完成。
一种耐寒拟南芥的培养方法，包含上述步骤；另外还包括以下步骤：将构建的植物表达载体pBI121-CsSPMS在农杆菌菌株GV3101感受态中转化；选取阳性克隆摇菌，花序侵染及纯合子种子筛选；提取拟南芥抗性苗叶片DNA，用引物SPMS-F、SPMS-R进行PCR鉴定。
本发明内容还包括上述的茶树耐寒基因CsSPMS在拟南芥耐寒性状方面的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明提供的茶树‘迎霜’CsSPMS是一个新的抗逆转录因子，该基因可提高植物耐寒性；本发明构建的茶树‘迎霜’CsSPMS植物表达载体，可用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐寒新种质，提高植物的耐寒特性。
附图说明
图1为CsSPMS琼脂糖凝胶电泳分析。
1:CsSPMS；2:pMD18-TSimple-CsSPMS双酶切电泳图；3:pBI121-CsSPMS双酶切电泳图。
图2野生型与转基因拟南芥耐寒性评价。
图3植物表达载体pBI121图谱。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1CsSPMS的克隆
以提取的茶树‘迎霜’幼嫩叶片为材料，取500mg嫩叶，按照TrizolRNA提取试剂盒(Takara)说明书方法提取叶片总RNA，按照PrimeScript反转录试剂盒(Takara)取0.5μgRNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照CsSPMS的碱基序列(SEQIDNo:1)，用Primer5软件设计引物扩增CsSPMS。
上游引物SPMS-F:5′-AGGGTTCTGTCCACTATGC-3′
下游引物SPMS-R:5′-GGACGAAGAGCCTTTGCTACCG-3′
以幼嫩叶片的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。
50μL反应体系：10×PCRBuffer5.0μl，CsSPMS的上下游引物(SEQIDNo:2和SEQIDNo:3)各1.0μl(10μM)，dNTPmix2.5μL(2.5mM)，cDNA模板1.0μl，ddH2O39.3μl，TaqDNAPolymerase0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec,反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD18-TSimple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。
实施例2：植物表达载体pBI121-CsSPMS的构建
设计引物进行聚合酶链式反应，在目的基因CsSPMS的上下游分别引入XbaI和BamHI酶切位点，产物连接到pMD-18T-simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经XbaI和BamHI双酶切的CsSPMS基因片段与pBI121连接，转化，提取质粒，进行序列测定。
上游引物SPMS-Z-F:5′-GCTCTAGAATGAATTTTTTTAGAAAACTA-3′
下游引物SPMS-Z-R:5′-CGGGATCCCTATGAAACACAAATTTGTTG-3′
(1)以茶树‘迎霜’幼嫩叶片cDNA为模板进行PCR反应(PrimeSTARDNAPolymerase,Takara)，50μl反应体系：10×PCRBuffer5.0μl,AtHsfB1的上下游引物(SEQIDNo:4和SEQIDNo:5)各1.0μl(10μM)，dNTPmix2.5μl(2.5mM)，cDNA模板1.0μl，ddH2O39.3μl，TaqDNAPolymerase0.2μl；PCR程序：95℃预变性4min，后95℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应35个循环，72℃延伸7min；片段连接到pMD18-TSimple载体(TaKaRa公司，下同)，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，测序结果准确无误。
(2)用XbaI和BamHI双酶切连接有CsSPMS片段的pMD18-TSimple(图1)，与XbaI和BamHI双酶切的表达载体pBI121(Promega公司，美国)构建重组质粒，酶切体系40μl：10×HBuffer4.0μl，ddH2O18μl，pMD18-TSimple(连接有CsSPMS片断)15μl，XbaI和BamHI各1.5μl；37℃反应2h；产物经过琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(Axygen)回收质粒pBI121大片段和CsSPMS小片段。用T4连接酶连接两个回收产物，连接反应体系10μl：10×LigaseBuffer4.0μl，pBI121大片段2.5μl，CsSPMS小片段2.5μl，T4DNA连接酶1.0μl；16℃过夜连接反应，取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑选单克隆，待菌落PCR验证后，扩大培养，提取质粒pBI121-CsSPMS，进行酶切和测序(图1)。植物表达重组质粒构建成功。
实施例3：植物表达载体pBI121-CsSPMS转化拟南芥及其耐寒性鉴定
(1)农杆菌菌株GV3101感受态制备及农杆菌转化
从YEB(50ug/mL利福平)平板中挑取单菌落，接种于50mLYEB液体培养基(50ug/mL利福平)中，28℃培养箱震荡培养(160rpm)至OD600值至0.5，后将菌液放置于冰上30分钟，离心收集菌液于2mL预冷的100mMCaCl2溶液，分装待用。
取5mL载体pBI121-CsSPMS，加200uL感受态细胞，冰浴30分钟后迅速液氮冷却，再转移至37℃培养5分钟，加入1mLYEB液体培养基，28℃培养箱震荡培养(160rpm)4小时后，在YEB固体培养基上涂板(50ug/mL利福平+100ug/mL氨苄)，28℃培养箱黑暗培养48小时，挑取单克隆菌落PCR检测后，选取阳性克隆摇菌，用于后一步拟南芥花序转化。(2)拟南芥花序侵染及纯合子种子筛选
将上一步的阳性克隆接种于50mLYEB液体培养基(50ug/mL利福平+100ug/mL氨苄)中，震荡培养24小时后离心(5000rpm)20分钟，用转化液(1/2MS，50g/L蔗糖，调节pH值5.8，加200ul/LSilwetL-77混合)剧烈悬浮沉淀。将拟南芥地上部浸泡于转化液中1分钟，用保鲜膜和锡箔纸包裹植株，培养箱培养24小时后，去除保鲜膜和锡箔纸，待采收种子。
种子筛选：将采收的种子放于离心管中，加1ml75％酒精，再加0.1％Tween-20摇晃15分钟，用蒸馏水洗两次后，放置30分钟以吹干种子。将种子均匀播于筛选培养基上(1/2MS+25mg/L草铵膦+25mg/L氨苄)培养14天后，将抗性苗移植到培养土中。
(3)PCR鉴定及耐寒性评价
提取拟南芥抗性苗叶片DNA，用引物SPMS-F、SPMS-R进行PCR鉴定。经鉴定的抗性苗T1继续生长，准备采收T2种子。对计野生型和T2抗性转基因苗进行低温处理7天后比较耐寒性，成活率以子叶变绿和露出小白芽为统标准，发现转基因拟南芥(70颗中52颗成活，成活率74.3％)成活率高于野生型(70颗中24颗成活，成活率34.3％)。
综上所述，本发明构建了含抗逆转录因子的植物表达载体pBI121-CsSPMS，其中CsSPMS耐寒性为首次报道。所构建的植物表达载体，可导入植物中以提高耐寒性。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种茶树耐寒基因CsSPMS，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.一种茶树耐寒基因CsSPMS，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.一种植物表达载体，其含有权利要求1所述的茶树耐寒基因CsSPMS。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为XbaI和BamHI双酶切CsSPMS后连接到pBI121载体质粒进行重组反应得到。
5.一种宿主细胞，其含有权利要求3或4任一项所述的植物表达载体。
6.一种茶树耐寒基因CsSPMS植物表达载体构建方法，其特征在于，
包括如下步骤：
a.‘迎霜’茶树耐寒基因CsSPMS的克隆：
以‘迎霜’茶树幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增基因；
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，产物连接到pMD-18T-simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定；
b.植物表达载体pBI121-CsSPMS的构建：
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，在CsSPMS基因的上下游分别引入XbaI和BamHI酶切位点；
产物连接到pMD-18T-simple载体，转化DH5α感受态细胞，进行序列测定，提取质粒，经XbaI和BamHI双酶切的CsSPMS基因片段与pBI121连接，转化，提取质粒，进行序列测定，植物表达载体pBI121-CsSPMS构建完成。
7.权利要求1所述的茶树耐寒基因CsSPMS在拟南芥耐寒性状方面的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求3或4的植物表达载体转化拟南芥。
9.一种耐寒拟南芥的培养方法，其特征在于，包含权利要求6的所有步骤，另外还包括以下步骤：将构建的植物表达载体pBI121-CsSPMS在农杆菌菌株GV3101感受态中转化；选取阳性克隆摇菌，花序侵染及纯合子种子筛选；提取拟南芥抗性苗叶片DNA，用引物SPMS-F、SPMS-R进行PCR鉴定。
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