CN102590109A - 一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶检测领域，公开了一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。该方法本发明以茶树叶片为提取材料，包含标准曲线制作，GSH-Px粗酶液提取，其中用含1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP的pH6.2的0.2mol/L磷酸缓冲液进行提取，测得的GSH-Px活性最大；10％TCA配制时操作简单，沉淀效果较好；显色反应在6min时达最大值，且5-硫代-2-硝基苯阴离子在412nm处有最大吸光值。本实验方法具备材料容易获得、操作简单、容易控制、测定结果可靠的特点。

Description

一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法

技术领域

本发明属于酶检测领域，涉及一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。

背景技术

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)是重要的抗氧化物酶。人们普遍认为谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是哺乳动物体内的含硒酶，对动物中GSH-Px研究较多而对植物体中的GSH-Px研究甚少。同时随着世界环境的急剧变化，植物时常遭受着各种非生物胁迫，茶树也不例外。抗氧化酶是植物非生物胁迫中重要的防御系统，它们可通过降解的方法去除活性氧来抵抗非生物胁迫诱导产生的氧化伤害，从而减少对植物造成伤害。茶树中GSH-Px的提取和测定方法的确定，对于研究茶树非生物胁迫下抗氧化酶系统中各种酶的活性变化及彼此间的关系有重要意义。

虽然近年来已有人从部分植物中检测到该酶的活性，但对植物GSH-Px的提取和测定方法报道较少，在茶树上尚未有报道，且由于植物的种类不同，GSH-Px在其中的存在不同或存在形式不同，其检测体系会有很大不同。

经多次重复实验，发现《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中谷胱甘肽过氧化物酶的测定方法在测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性时无显色反应，同时发现实验过程中1.67％偏磷酸沉淀液配制相当麻烦、为剧毒试剂不利于实验人员的身体健康，同时其沉淀蛋白效果并不理想。本发明根据茶树的生理生化特性，以龙井43为材料，对GSH-Px的提取和测定方法进行了探索。

与《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中谷胱甘肽过氧化物酶测定方法相比，本发明在标准曲线绘制中调整了GSH的浓度、反应沉淀剂；根据茶树生理生化特性(富酚)，谷胱甘肽过氧化物酶提取时，于缓冲液中添加4％PVPP，避免提取过程中茶多酚对酶活性的影响；酶活性测定时，根据比较实验，筛选出合适的酶液用量、反应液用量、反应时间及测定波长。由于GSH-Px活性的测定是通过底物还原型谷胱甘肽(GSH)量的减少来间接反应酶活性。虽然GSH是GSH-Px高活性基质，GSH-Px对GSH作用生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)具有高度特异性，但GSH本身就是抗氧化剂，也可被非特异地氧化成GSSG，即GSH在没有酶的条件下也能进行氧化还原反应，称非酶反应。本发明中以双蒸水代替酶液作为空白对照，非酶管加热使酶失活，同时测定酶管和非酶管的吸光度，以排除非酶反应的干扰。《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中采用蒸馏水做非酶反应对照管，此管只能扣除试剂的非酶反应，并不能扣除提取液中非酶反应。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，包含如下步骤：

(1)标准曲线的制作：配制一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液，分别取各浓度的GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6～7min，于412nm比色，同双蒸水调零，以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线，获得的标准曲线R2值都能达到0.999以上，且重复性较好；

(2)GSH-Px粗酶液提取：在pH6.2～pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP作为酶提取液，提取茶树品种龙井43的叶片中的GSH-Px，得到GSH-Px粗酶液；

(3)酶活力测定：取酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，向酶管和非酶管中分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H₂O₂0.5ml，于37℃下反应3min，再向酶管和非酶管中分别加入10％TCA3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液；另取2支试管分别加入上述酶管和非酶管的上清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA 1.2ml作为空白管，向这3支试管中各加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6～7min，在412nm处比色读取OD值；将所得OD值带入代入下式，即可得到茶树中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力：

GSH-Px活力[U/(g·min)]＝[(OD非酶管-OD酶管)×VT]/[A×W×t×VS]

上式中，VT：提取液体积；A：标准曲线的斜率；W：叶片质量；t：反应时间；VS：酶液反应液体积；U：氧化GSH的量。

步骤(1)所述的一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液优选GSH浓度为0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L、300μmol/L的GSH标准品溶液。

步骤(2)所述的酶提取液优选为在pH6.2的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP。采用本发明的方法测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，经测定结果表明，pH6.2、pH6.5、pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP均可作为茶树GSH-Px的提取缓冲液；其中pH6.2磷酸缓冲液提取效果优于pH6.5、pH7.0的缓冲液(图3)。

步骤(3)中本发明选择10％TCA作为沉淀剂，因为10％TCA比偏磷酸更适宜作为本发明的沉淀剂，同时沉淀效果与偏磷酸差异不显著，而偏磷酸在配制时由于常温下28％NaCl浓度较高，配制时不方便，同时加入1.67％偏磷酸时，偏磷酸容易形成结晶析出，并且偏磷酸不能加热溶解，因此不适宜作为沉淀剂。

发明人比较了不同波长下的吸光值，比较了400nm，410nm，412nm，420nm，422nm，423nm，430nm，433nm下的吸光值，412nm处测得的酶管和非酶管的OD值都最大，比其他波长更适宜作为测定波长。DTNB阴离子显色不仅与反应体系中的H⁺浓度有关，还受反应时间限制。该试验对400nm、410nm、412nm、420nm、422nm、423nm、430nm、433nm处，每隔1min酶管和非酶管的OD值测定表明，3～6min内的OD值较高，其中显色6min后OD值最高，7min以后OD值下降；6min、7min时测得的酶活性最大(图4)。

有益效果：

本发明首次提供了提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，具备材料容易获得、操作简单、容易控制、测定结果可靠的特点。该方法与《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中酶测定方法相比，在标准曲线绘制中调整了GSH的浓度、反应沉淀剂；由于茶树中多酚含量较高，茶树中谷胱甘肽过氧化物酶提取时，于缓冲液中添加4％PVPP，避免茶多酚对酶活性的影响。酶活性测定时，根据比较实验，确定了茶树谷胱甘肽过氧化物酶测定中酶液和反应液的用量，经过重复实验筛选出合适的反应时间；对5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子测定波长进行了筛选，发现5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子的最大吸收于412nm，并非是422nm。目前动植物中GSH-Px活性的测定是通过底物还原型谷胱甘肽(GSH)量的减少来间接反应酶活性。由于GSH在没有酶的条件下也能进行氧化还原反应，即非酶反应。本发明中以双蒸水代替酶液作为空白对照，非酶管加热使酶失活，同时测定酶管和非酶管的吸光度，以排除非酶反应的干扰。《几种植物中谷胱甘肽过氧化物酶活性测定》中采用蒸馏水做非酶反应对照管，此管只能扣除试剂的非酶反应，并不能扣除提取液中非酶反应。

附图说明

图1 GSH(0-100μmol/L)标准曲线。

图2 GSH(0-300μmol/L)标准曲线。

图3提取介质对酶活性测定的影响。

图4显色时间对酶活性测定的影响。

具体实施方式

实施例1

试验材料：茶树品种龙井43叶片。

配制试验所需试剂：

叠氮化钠-磷酸缓冲液(NaN3-PBS，pH7.0)：磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)7.16g，磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)3.12g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)7.44mg，叠氮化钠(NaN₃)16.3mg，以双蒸水溶解，稀释至100ml，再以NaOH溶液校正pH至7.0。

10％三氯乙酸(TCA)沉淀液：10g三氯乙酸用90ml双蒸水溶解。

0.32mol/L Na₂HPO₄：11.456g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)用蒸馏水溶解定容至100ml。

DTNB显色液：20mg DTNB用1％柠檬酸三钠溶解至50ml。

4mol/L NaOH溶液：16g氢氧化钠(NaOH)用蒸馏水溶解定容至100ml。

1.0mmol/L GSH溶液(当日配制)：30.7mg GSH用NaN₃-PBS溶解定容至100ml。

1.5mmol/L H₂O₂(当日配制)：取30％H₂O₂15μl，以双蒸水定容至100ml。

(1)标准曲线的制作：取表1、表2中各GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6min，于412nm比色，同双蒸水调零。以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线。

表1 GSH标准液的配制(GSH浓度0-100μmol/L)

表2 GSH标准液的配制(GSH浓度0-300μmol/L)

(2)GSH-Px粗酶液提取：取新鲜龙井43茶树叶片1.0g，放入预冷的研钵中，用液氮研磨充分，加入0.2mol/L磷酸缓冲液(含1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP，pH6.2)5ml，研磨成匀浆后转移至10ml的离心管中，4℃下12000r/min离心10min，取上清液，供酶活力测定用。

(3)酶活力测定：取上述酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H₂O₂0.5ml，立即于37℃下反应3min，再在2支试管中加入10％TCA3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液。另取2支试管分别加入上述清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA1.2ml作为空白管，并在这3支试管中各加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6min，在412nm处比色读取OD值，按照以下公式计算GSH-Px活力：

GSH-Px活力(U·g^-1·min^-1)＝[(OD非酶管-OD酶管)×V_T]/[A×W×t×V_S]

VT：提取液体积；      A：标准曲线的斜率；

W：叶片质量；         t：反应时间；

VS：酶液反应液体积；  U：氧化GSH的量

酶活力测定：1ml反应液中，37℃每分钟催化1μmol GSH氧化的酶量为一个酶活力单位。

按以上方法，提取茶树中谷胱甘肽过氧化物酶，并进行酶反应，于412nm测定吸光度，测得酶活性均值为56.27U·g^-1·min^-1。

Claims (3)

1.一种提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)标准曲线的制作：配制一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液，分别取各浓度的GSH标准液2.0ml，加0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml，显色6～7min，于412nm比色，同双蒸水调零，以OD值为纵坐标，GSH浓度为横坐标，制标准曲线，获得的标准曲线R²值都能达到0.999以上，且重复性较好；

(2)GSH-Px粗酶液提取：在pH6.2-pH7.0的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP作为酶提取液，提取茶树品种龙井43的叶片中的GSH-Px，得到GSH-Px粗酶液；

(3)酶活力测定：取酶液各0.5ml，分别注于酶管和非酶管中，并将非酶管加热使酶失活，向酶管和非酶管中分别加入1.0mmol/L GSH 1.0ml和经37℃预热的1.5mmol/L H₂O₂0.5ml，于37℃下反应3min，再向酶管和非酶管中分别加入10％TCA 3.0ml，12000r/min离心5min，保留上清液；另取2支试管分别加入上述酶管和非酶管的上清液2.0ml；再取1支试管加双蒸水0.8ml和10％TCA 1.2ml作为空白管，向这3支试管中各加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml、4mol/L NaOH 0.12ml和DTNB 0.5ml反应6～7min，在412nm处比色读取OD值；将所得OD值带入代入下式，即可得到茶树中谷胱甘肽过氧化物酶的酶活力：

GSH-Px活力[U/(g·min)]＝[(OD非酶管-OD酶管)×VT]/[A×W×t×VS]

上式中，VT：提取液体积；A：标准曲线的斜率；W：叶片质量；t：反应时间；VS：酶液反应液体积；U：氧化GSH的量。

2.根据权利要求1所述的提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于步骤(1)所述的一系列GSH浓度为0-300μmol/L的GSH标准液为GSH浓度为0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、180μmol/L、240μmol/L、300μmol/L的GSH标准液。

3.根据权利要求1所述的提取并测定茶树中谷胱甘肽过氧化物酶活性的方法，其特征在于步骤(2)所述的酶提取液为在pH6.2的磷酸缓冲液中添加1mmol/L EDTA-2Na，4％的PPVP。

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