CN104871847A - 抗坏血酸在提高铝胁迫下植物硝态氮吸收中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗坏血酸的新用途，具体为抗坏血酸提高铝胁迫下植物硝态氮吸收中的应用；使用时，对铝敏感型大豆SB和耐铝型大豆RB在浓度梯度为0-400μmol·L-1的 AlCl3铝胁迫下处理24h，通过测定植株体内H2O2含量和对硝态氮吸收情况，实验结果表明，与对照植株相比，加入ASA后，SB大豆对不同铝浓度梯度中硝态氮的吸收能力显著增强，无论是在根和叶中，SB大豆H2O2含量都会显著下降，质膜H+-ATPase氢泵活性、调控氮代谢的质膜ATP酶的磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平则显著增加，提高了大豆对硝态氮的吸收和利用，有助于大豆的生长。
Description
技术领域
本发明属于促进植物硝态氮吸收的植物生长调节剂领域，具体涉及抗坏血酸（ASA）促进铝胁迫下植物吸收硝态氮的新用途。
技术背景
铝是地壳中含量最丰富的金属元素，其含量仅次于氧和硅，占总量的7.1％。在自然环境下，难溶性的硅酸盐或氧化铝是铝的主要存在形式，这种形式的铝对植物的生长发育和各种经济作物的产量都没有直接毒害作用。当土壤pH低于4.5时，土壤中的铝以Al3 +离子态的形式释放出来，对作物造成危害。铝毒首先对作物根系产生毒害作用，影响植物对养分和水分吸收，干扰各种生理生化过程，同时使植物叶绿素含量下降，光合速率降低，直接影响植物干物质累积和产量形成。铝毒是酸性土壤影响植物生长的主要限制因子。全世界有大面积的酸性土壤，约占40％的世界耕地面积，主要分布在热带、亚热带和温带地区，大多数分布在发展中国家。在我国，酸性土壤主要分布在南方的大部分地区，约占耕地面积的21％。为了增加作物产量，人们对土壤进行集约管理，通过施用大量化肥来提高单位面积产量，使作物总产量增加，满足人口增加对粮食的需求。然而，大量的化学肥料施用使土壤pH下降，土壤酸化使土壤释放出大量的对植物具有毒性的三价铝离子，造成了很大的环境问题。
H2O2是活性氧(Active Oxygen Species, AOS)的一种，是细胞有氧代谢的产物。植物细胞能够通过非常多的代谢途径来产生H2O2，特别是在逆境胁迫下（干旱胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等）会通过一些列的代谢活动产生大量的活性氧，如果这些扮演活性氧角色的H2O2不能够被及时清除，在细胞中累积过多，就会破坏生物大分子。植物体为了减少或者防止H2O2对自身所产生的毒害,体内形成了极其复杂的氧化应激机制。
硝态氮和铵态氮是植物吸收利用的两种主要矿质形态氮。旱地土壤硝态氮对于作物的前期供氮有着重要的作用，与植物氮素吸收量的相关性达到极显著水平，而铵态氮与植物氮素吸收量相关性很低。大量研究表明，铝对植物氮素吸收具有抑制作用, 铝干扰对NO3 －的吸收作用较NH4 +严重。植物对NO3 －的吸收是个主动运输过程，一般认为细胞膜上存在NO3 －的专性载体，这种载体借助于质膜H+-ATPase建立的质子泵驱动力，在质膜H+-ATPase的作用下，ATP供能将H+泵出胞外 (H+分泌和释放)，在H+形成的电势梯度下，伴随H+的同向运输NO3 －通过通道蛋白逆浓度梯度进入细胞内。吸收进入植物细胞内的NO3 －一部分被同化为氨基酸、蛋白质，或以氨基酸的形式运往地上部，另一部分NO3 －则被贮存在液泡中。因此，找到一种高效、低廉而又易于使用的提高植物在酸性土壤上吸收硝态氮的促进剂来解决铝胁迫抑制硝态氮吸收的问题具有重大的现实和应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高植物在铝胁迫下吸收硝态氮的增强剂，即抗坏血酸 ASA在铝胁迫下提高植物对硝态氮吸收中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：
（1）选择云南本地的铝敏感大豆SB（下称SB）、耐铝型大豆RB（下称RB）的饱满种子进行24小时过夜消毒，25℃黑暗下催芽萌发，待根长出2cm左右转入0.5mmol/L CaCl2溶液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液培养一周，长出二叶后转移至Hoagland完全培养液培养；
（2）待SB、RB苗长到四对叶片时选择长势一致的健壮植株，分别在Hoagland培养液加不同铝浓度梯度（0、50、100、200、400μmol·L-1）AlCl3梯度浓度胁迫处理24h后，取样进行硝态氮吸收和体内H2O2含量的测定；
（3）用浓度为2mmol/L的ASA和100μmol·L-1的 AlCl3浓度处理铝敏感型（SB）和抗铝型（RB）大豆幼苗，24h后取样进行硝态氮吸收以及各项生理生活指标测定。
本发明提供的抗坏血酸 ASA作为植物在铝胁迫下对硝态氮吸收的调节剂,使用方便，成本较低。该调节剂显著提高了植物对硝态氮的吸收能力，开辟了用调节剂提高植物对营养元素吸收的新途径，有助于研究水体富营养化治理的科学工作者提供解决的新思路，同时也为设施农业栽培，尤其是有利于土壤酸化引起阻碍植物硝态吸收问题解决提供科学依据。此方法无论是在农业还是环境治理领域都显得切实可行。
本发明的有益效果：本发明所述的铝胁迫下ASA作为植物吸收硝态氮的增强剂，具有投入低、操作简单、效率高的特点。常温下，ASA是比较理想的植物吸收硝态氮的增强剂，ASA处理可以减少在不同铝浓度胁迫下大豆叶片细胞内H2O2积累，增强植物根系对硝态氮的吸收，提高细胞膜上H+-泵活性，以及提高质膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平等，在不同铝胁迫的大豆，通过ASA处理，不仅能够减缓了植株受到的铝胁迫作用，同时叶增加了氮吸收相关酶的活性，提高了大豆对硝态氮的吸收和利用，从而提高大豆的生长，对提高大豆的经济效益具有重要意义。
附图说明
图1是本发明中不同浓度ASA处理SB、RB幼苗24h的H2O2含量（A图）和叶片净光合作用速率（B图）的变化；
图2本发明中不同铝浓度胁迫处理下1天，SB、RB幼苗对硝态氮吸收情况；
图3是本发明中100 mM铝胁迫1天，添加ASA或不添加ASA大豆SB（A图）、RB（B图）幼苗根和叶片中H202的测定结果，其中CK为不添加ASA和AlCl3溶液；
图4是本发明中不同浓度铝胁迫处理1天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗对硝态氮吸收情况，其中CK为不添加ASA；
图5是本发明中100 mM铝胁迫1天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗叶片中的H+ATPase活性（A图）、氢泵活性（B图）测定结果，其中CK为不添加ASA；
图6是本发明中100 mM铝胁迫1天，添加ASA或不添加ASA大豆SB幼苗根中的H+ATPase活性（A图）、氢泵活性（B图）测定结果，其中CK为不添加ASA；
图7是本发明中100 mM铝胁迫1天，添加ASA或不添加ASA（CK）大豆SB幼苗根和叶片中的质膜ATP酶磷酸化水平（A图）、14-3-3蛋白表达水平(B图)检测结果，其中CK为不添加ASA。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：SB、RB植株的栽培和处理，步骤如下：
1、实验材料为SB、RB幼苗
SB、RB种子消毒催芽后，25℃黑暗下催芽萌发，待根长出2cm转入0.5mmol/L CaCl2溶液中平衡一天，再转移至1/4的Hoagland培养液一周，长出二叶后转移至Hoagland完全培养液培养，待幼苗长至四对叶时用于本实验；
2、配置不同浓度 (0、0.5、1、2、5、10 mmol/L)的ASA处理液，配置不同浓度 (50、100、200、400μmol·L-1)的AlCl3处理液；
3、分别用浓度 0、0.5、1、2、5、10 mmol/L的ASA处理液处理SB、RB幼苗24小时，取样进行H2O2含量、净光合作用速率的测定；
4、分别用不同浓度 (50、100、200、400μmol·L-1)AlCl3铝溶液处理RB和SB幼苗，以AlCl3浓度为0的Hoagland培养液培养为空白对照，处理24小时后取样进行硝态氮吸收和H2O2含量的测定，每个处理设置三个重复；实验期间，Hoagland培养液pH4.5，昼夜气温变化在13-22℃，光照和黑暗处理时间设定为12h/12h；
5、用浓度为2mmol/L的ASA处理浓度梯度为(0、50、100、200、400μmol·L-1)AlCl3铝溶液下的铝敏感型（SB）和抗铝型（RB）大豆幼苗，以AlCl3浓度和ASA浓度均为0的Hoagland’s培养液培养的SB幼苗为空白对照，处理24小时；取样进行硝态氮吸收和H2O2含量测定；
6、用浓度为2mmol/L的ASA处理100μmol·L-1AlCl3浓度胁迫下的铝敏感型（SB）大豆幼苗，以AlCl3浓度和ASA浓度均为0的Hoagland’s培养液培养的SB幼苗为空白对照，处理24小时，取样进行相关酶活和蛋白表达水平检测。
实施例2：采用实施例1中第3步处理后的SB、RB叶片进行H2O2含量及光合作用速率测定
1、H2O2含量测定：采用二甲酚橙法。称取新鲜植物叶片，按照材料与提取剂1:1的比例加入预冷丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管于12000g、4℃下离心20min，弃去残渣，上清即为样品提取液。分别用ddH2O配制试剂A(内含3.3 mmol/L FeSO4，3.3 mmol/L (NH4 )2SO4，412.5 mmol/L H2SO4)和试剂B (内含165 μmol/L二甲酚橙，165 mmol/L山梨醇)，使用前试剂A和试剂B按照1:10的比例混合构成工作试剂。此工作试剂与H2O2待测液按照2:1的比例混合，30℃水浴显色30min，于560nm处测定OD值，计算H2O2含量（图1A）。
2、叶片净光合作用速率测定：选取实施例1第3步中处理了1小时的植物，从下往上数第三、四叶片测定其净光合速率。叶片净光合作用速率采用北京理仪科技有限公司Yaxin-1101 植物光合仪进行测定，光合作用的测定在9∶00～10∶00进行。
从图1A可以看出，用不同浓度的ASA 处理24小时后，SB、RB大豆叶片的H2O2含量和未用ASA处理的植株相比均有不同程度的减少；2 mmol/L ASA处理组H2O2含量减少最多， ASA浓度再升高，H2O2含量不再有明显变化。
从图1B看，不同浓度ASA处理SB、RB大豆叶片净光合速率有不同程度的恢复，但2 mmol/L ASA浓度处理时叶片净光合作用速率最高，此浓度下的光合作用最强。所以，后续的实施例中我们选择2 mmol/L作为最佳ASA处理浓度。
实施例3：采用实施例1第4步处理后的SB、RB进行硝态氮吸收量的测定
1、大豆硝态氮吸收量的测定：根据中华人名共和国环境保护行业标准（HJ/T 346—2007）中的紫外分光光度法略作修改测定培养液中硝态氮的浓度。具体实施如下：取实验组和对照组植物分别处理过的水样5ml，加入1-2滴氢氧化铝悬浮液，静置絮凝，离心后上清液用于硝态氮浓度测定。测定时用光程长为10mm的石英比色皿，以新鲜去离子水为参比，分别在220nm和275nm波长处检测，硝态氮吸光度的校正值为A220-2A275。分别配置含0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/L硝酸盐氮的硝酸钾标准溶液，按水样测定相同步骤测量吸光度，以X轴为标准溶液校正后的吸光度，以Y轴为溶液中所含硝酸盐氮的浓度绘制标准曲线。从标准曲线中查得硝态氮浓度，单位：mg/L。用处理溶液起始的浓度减去处理不同时间后处理液中剩余硝态氮的浓度，即为大豆植株对处理液中硝态氮的吸收量。
从图2可以看出，与CK相比，四种浓度的铝胁迫处理极大地降低了两种大豆的硝态氮吸收量，随着铝浓度的升高，RB和SB对硝态氮吸收量呈显著下降的趋势，且SB下降更为明显。经过1天处理，此时RB的硝态氮吸收能力已经远远超过了SB ，在400μmol·L-1AlCl3铝溶液下SB对硝态氮的吸收甚至还不到RB的30%。图2的结果说明，铝胁迫能够显著降低SB型和RB型大豆对硝态氮的吸收（SB尤为明显），并且随着铝浓度的升高，这种降低呈增强趋势，铝浓度越高对大豆硝态氮吸收的抑制作用越明显。
实施例4:用实施例1中第5步处理后的SB和RB进行H2O2含量的测定
1、H2O2含量测定：参照实施例4中第1步的方法；
如图3所示，CK代表没有任何处理，Al代表100μmol·L-1AlCl3铝胁迫，ASA+AL代表在100μmol·L-1AlCl3铝胁迫下添加2mmol/L的ASA处理。从图3可以看出，无论是在根中还是叶中，SB（图3A）在铝胁迫下体内的H2O2含量都会显著上升。但外源添加了ASA后，SB大豆体内的H2O2含量显著下降，充分说明了ASA能够清除铝胁迫下大豆体内过多的H2O2，从而减少其受到的毒害作用。但在RB（图3B）中，高浓度100μmol·L-1AlCl3铝胁迫下其叶片和根中的H2O2含量反而降低，在添加了ASA后，H2O2含量有所下降，但并不明显，这说明RB型大豆能够通过自身的调节消除铝胁迫下体内产生的H2O2。
图3结果说明，在铝胁迫环境下，RB型大豆由于基因上的差异比SB型大豆更能够适应高浓度的铝胁迫。也就是说，在铝胁迫下，SB型大豆受到的胁迫作用更加明显。因此，我们后期的实施例主要针对铝敏感的SB型大豆。
实施例5：采用实施例1中第5步中处理后的SB进行硝态氮吸收量的测定。
1、大豆硝态氮吸收量的测定：参照实施例3中第1步的方法；
从图4可以看出，在ASA的影响下，SB对硝态氮吸收比无ASA处理时明显增加，CK组增加了30%左右， 100、200、400μM L-1 AlCl3浓度处理组均提高了一倍左右，ASA对SB大豆硝态氮吸收的提高作用在100说明在100μmol·L-1AlCl3胁迫下接近达到峰值，此后随着铝浓度的增加，ASA对硝态氮吸收的提升作用不显著。这说明，在ASA作用下，植物能够增强对硝态氮的吸收，但这种增强作用在铝浓度达到100μmol·L-1左右时达到峰值。所以，后续实施例中我们选择这一浓度来检测相关酶活以及蛋白表达水平。
实施例6：采用实施例1中第6步处理后的SB根和叶片进行质膜H+-ATPase活性及H+泵活性测定。
1、质膜蛋白提取和浓度测定：不同ASA浓度处理的大豆叶片质膜提取使用贝博试剂有限公司的试剂盒进行。提取后的质膜蛋白用Bradford法测定质膜蛋白浓度，在800μL的ddH2O中加入5μL的质膜蛋白，混匀，然后加入200μL的Bradford溶液，室温静置10分钟，在OD595波长下检测蛋白浓度，计算50μg质膜蛋白对应的体积。
2、H＋-泵活性测定步骤如下：
（1）1.5 ml反应体系中含有5 mmol/L BTP/MES(pH 6.0)、12 μmol/L AO、300 mmol/L KCl、250 mmol/L 蔗糖、0.5 mmol/L EGTA（使用BTP调pH至6.0）、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L Na2MoO4、50 mmol/L KNO3，0.05%十二烷基聚乙二醇醚（w/v）和100 μg质膜蛋白，添加去垢剂十二烷基聚乙二醇醚使原位膜翻转，反应混合液在室温下放置20 min后，加入5 mmol/L ATP/BTP（pH＝6.0）以启动反应；
（2）以反应液调零对照，每分钟记录一次OD值，测定吖啶橙在492 nm处20分钟内吸光度猝灭速率，通过猝灭速率反映不同ASA喷施浓度的大豆叶片细胞膜囊体泵出H＋的能力，即H＋-泵活性。
从图5可知，在叶片中，未添加ASA处理前SB在铝胁迫下质膜H+-ATPase活性及H＋-泵活降低了一半，当施加了ASA处理后，CK和Al处理下均大幅提高到原来的十倍有余。
在根中（图6），SB在铝胁迫下质膜H+-ATPase活性及H＋-泵活降低了20%左右，当施加了ASA处理后，CK处理下提高了7%左右，在Al处理下提高幅度更大达到了15%左右。可见，ASA对SB质膜H+-ATPase活性及H＋-泵活性的的影响非常明显，无论是在根和叶中，ASA都能够显著提高铝胁迫下大豆的质膜H+-ATPase活性及H+泵活性。
实施例7：采用实施例1中第6步处理后的SB叶片和根进行Western Blot 和免疫共沉淀（CO-IP）检测大豆质膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平。
1、大豆质膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平的检测：处理24h后，取大豆主根和新长出的叶片作为研究材料。为了确定提取的质膜蛋白样品中是否有质膜H+-ATPase，先用SDS-PAGE(4%浓缩胶和10%分离胶)分离提取的质膜，电泳后，经G250（考马斯亮蓝250）染色，最后经脱色液脱色后，观察提取的质膜蛋白中是否有质膜H+-ATPase蛋白（质膜H+-ATPase大小为97kD）和14-3-3蛋白（14-3-3蛋白大小为28-30kD左右）的条带。同时取50μg的质膜蛋白经10%SDS-PAGE分离后，经半干式转膜仪将胶上蛋白转移到PVDF膜上后，然后再分别加入Arabidopsis AHA3（拟南芥质膜H+-ATPase）的C端抗体和Malus domestica(苹果)14-3-3蛋白抗体作为一抗，常温孵育2-3h，接着用偶联过氧化物酶的羊抗兔IgG的抗体常温孵育2h，最后加入产生荧光的反应底物，通过凝胶成像仪观察结果。
通过免疫共沉淀的方法确定14-3-3蛋白与磷酸化质膜H+-ATPase结合，200μg的质膜蛋白中加入2μg用有磷酸化修饰的大豆质膜 H+-ATPase（GHA2）C末端多肽（N'-ESVVKLKGLDIDTIQQHYT(p)V-C'）制备的多克隆抗体（兔抗）GHA2p，4℃孵育振摇1h（40r质膜），然后加入20μL的蛋白A/G plus-agarose (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)，于4℃孵育振摇过夜。蛋白样品3500 rpm离心5min得到沉淀蛋白，沉淀蛋白用预冷的PBS（磷酸盐缓冲液）清洗5次，每次5min。清洗后的沉淀用40μL1×loading buffer溶解，取40μL经SDS-PAGE(12%)电泳分离后，用于western blotting分析。分离蛋白经半干式电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，PVDF膜首先用GHA2p抗体或者苹果(Malus domestica)14-3-3蛋白多克隆抗体（兔抗）常温孵育2h，然后再用偶联过氧化物酶的羊抗兔IgG的抗体常温孵育2h，最后加入产生荧光的反应底物，通过凝胶成像仪观察结果。
从图7可知，无论是在根叶片中，铝胁迫下添加ASA的SB质膜H+-ATPase表达水平（图7A）和14-3-3蛋白表达水平（图7B）都显著高于未添加ASA（CK）的处理。
可见，无论是在根还是叶中，ASA都能够显著提高铝胁迫下大豆质膜H+-ATPase磷酸化水平、14-3-3蛋白表达水平，这说明加了ASA 处理的大豆硝酸盐吸收相关的酶在蛋白水平表达量增加，这些蛋白的增加有能够增强大豆对硝态氮的吸收和利用，这就在蛋白水平上证明了ASA能够提高植物在铝胁迫下对硝态氮的吸收能力。
Claims (1)
1.抗坏血酸在提高铝胁迫下植物硝态氮吸收中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150902 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |