CN106688685A - 一种缓解猕猴桃果树高温胁迫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种缓解猕猴桃果树高温胁迫的方法，该方法包括如下步骤：当猕猴桃幼苗长至五叶一心时，浇灌浓度为50‑200μmol/L的褪黑素，每隔2天浇灌一次，共5次。本发明可以保护高温胁迫下植物细胞膜的完整性，促进植物体内游离脯氨酸含量的增加，缓解高温胁迫下猕猴桃蛋白质的降解，促进植物体内可溶性糖含量的增加，增强维持细胞内渗透势能力，可以刺激和诱导高温逆境条件下植物体内SOD、CAT、POD活性，使其在长时间的高温胁迫下维持较高的活性状态，从而更有利于清除H₂O₂，维持细胞膜的稳定性，提高猕猴桃的抗高温能力。

Description

一种缓解猕猴桃果树高温胁迫的方法

技术领域

本发明属于果树栽培领域，具体涉及一种缓解猕猴桃高温胁迫的方法。

背景技术

温度是植物自然地理分布的主要限制因素，也是植物生长发育的必需条件之一，还是植物的生育动力的数量因子，因为植物要实现一定的生长量或完成某一生育时期必须要有一定量的活动积温。但是，随着全球气候环境的日益恶化，温室效应的加剧，温度也成为了影响植物生长发育的一大胁迫因子。大量的研究发现，无论是园艺植物还是大田植物在高温胁迫下其正常的生长发育均会受到影响，最终导致作物生产量和产量的下降。

猕猴桃(Actinidia)属猕猴桃科、猕猴桃属多年生藤本植物，雌雄异株。猕猴桃果实为典型的浆果，主要是以含维生素高，适口和特异的风味见著，该产业在全球都具有极好的经济发展前景，是一种重要的果树资源。然而，温度是限制猕猴桃分布和生长发育的主要因素，猕猴桃大多数种要求温暖湿润的气候，即亚热带或温带湿润半湿润气候，主要分布在北纬18～34度的广大地区，超过这个范围则生长不良或不能生存。因此，提高猕猴桃的耐热性，保证猕猴桃在高温胁迫下能够维持正常的生理水平，对取得较理想的产量和品质有重要意义。

目前，对于缓解猕猴桃高温胁迫的方法较少，主要集中在使用茉莉酸甲酯、油菜素内酯和抗坏血酸，如《油菜素内酯对高温胁迫下猕猴桃苗耐热性相关生理指标的影响》、《抗坏血酸对高温胁迫下猕猴桃苗抗热性相关生理指标的影响》和《茉莉酸甲酯对高温胁迫下猕猴桃苗膜脂过氧化及相关抗氧化酶的影响》。研究更多的处理方法，对于猕猴桃产业而言，具有重大的产业实用价值。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种缓解猕猴桃果树高温胁迫的方法，该方法包括如下步骤：

当猕猴桃幼苗长至五叶一心时，浇灌浓度为50-200μmol/L的褪黑素，浇灌量为200ml，每隔2天浇灌一次，共5次。

所述猕猴桃幼苗的获得方法为：将种子在800mg/L的赤霉素溶液中浸泡1天，4℃层积2个月，然后在培养箱中25℃、8h/4℃、16h变温处理2周，之后25℃恒温培养至种子萌芽；将发芽的种子播种到育苗盘中，上面覆盖2mm的营养土，于人工气候室中培养，光暗周期为12h/12h，昼夜温度为25℃/20℃；当幼苗长到2—3片真叶时，选取长势一致的幼苗移到装有珍珠岩的花盆中，每盆3株；移苗后注意保湿遮阴，浇营养液。

所述猕猴桃为野生中华猕猴桃。

优选的，褪黑素的浓度为100μmol/L。

所述高温为45℃。

褪黑素(melatonin,MT),又称松果素,1958年被美国科学家Lerner从牛松果体中首次提取出来,其化学成分为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。它具有助眠,抗氧化衰老,提高免疫等方面的功效,已在临床医疗方面得以应用。经研究发现植物中也存在有微量的褪黑素,最主要的生物学功能是作为抗氧化物质保护细胞，减轻自由基的伤害作为抗氧化物质保护细胞。近年对外源褪黑素研究发现，在植物胁迫逆境中起到缓解的作用，如提高黄瓜高温下的抵抗程度，提高黄瓜的耐盐性。

然而，褪黑素并非一定可以提高植物的抗逆性。本发明的发明人发现，利用褪黑素无法缓解高盐胁迫和重金属胁迫。另外，褪黑素对于蔬菜的高温胁迫也没有效果。

通过对不同植物进行大量的实验，本发明的发明人发现，在众多胁迫中，褪黑素对于猕猴桃的高温胁迫有着较好的缓解作用。

本发明的有益效果：

本发明可以保护高温胁迫下植物细胞膜的完整性，促进植物体内游离脯氨酸含量的增加，缓解高温胁迫下猕猴桃蛋白质的降解，促进植物体内可溶性糖含量的增加，增强维持细胞内渗透势能力，可以刺激和诱导高温逆境条件下植物体内SOD、CAT、POD活性，使其在长时间的高温胁迫下维持较高的活性状态，从而更有利于清除H₂O₂，维持细胞膜的稳定性，提高猕猴桃的抗高温能力。

附图说明

图1为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃丙二醛含量的影响结果图；其中，图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图2为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃相对膜透性的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图3为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃脯氨酸含量的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图4为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃可溶性蛋白含量的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图5为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃可溶性糖含量的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图6为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃SOD活性的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图7为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃CAT活性的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图8为外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃POD活性的影响结果图；图中不同的字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

猕猴桃(Actinidia)生长需要温暖湿润的气候，高温胁迫对于猕猴桃的正常生长发育具有极大的影响。本试验以猕猴桃幼苗为材料，在五叶一心时进行褪黑素灌根处理5次，24h后进行高温胁迫处理，测定丙二醛、过氧化氢、叶绿素、电导率、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、CAT和POD的酶活性。

植物材料为2015年9月采得的野生中华猕猴桃种子，将种子在800mg/L的赤霉素溶液中浸泡1天，4℃层积2个月，然后在培养箱中25℃8h/4℃16h变温处理2周，之后25℃恒温培养至种子萌芽。将发芽的种子播种到育苗盘中，上面覆盖2mm的营养土，于人工气候室中培养,光暗周期为12h/12h，昼夜温度为25℃/20℃。当幼苗长到2—3片真叶时，选取长势一致的幼苗移到装有珍珠岩的花盆中，每盆3株。移苗后注意保湿遮阴，浇营养液。

当猕猴桃幼苗长至5片叶时，进行试验处理，选择整齐一致的壮苗分别用0-200μmol·L^-1外源MLT(褪黑素)灌根，2d一次，五次后将所有苗移入25℃培养箱中适应24h，再进行高温胁迫处理(表1)，并于未升温PT(25℃未浇灌褪黑素处理组，下同)和高温胁迫8h后进行取样(根基向上第3至5片真叶)，液氮保存后，置于-80℃超低温冰箱中。

表1处理组对照表

3.3.1相对电导率的测定

相对电导率测定参照Campos等(2003)的方法。在干净的50ml离心管中加入30ml去离子水，用0.5cm直径的打孔器打孔叶片，打孔尽量避开叶脉，称取0.1g小圆片放入离心管中，盖上离心管盖，放在摇床上150r/min遮光摇6h，至叶片沉到离心管底部。用便携式电导仪测定去离子水电导率S0，浸泡液电导率S1，再将浸泡液沸水浴30min以杀死植物组织，冷却至室温后测溶液电导率S2。相对电导率计算公式为：相对电导率(％)＝(S1-S0)×100/(S2-S0)。每个处理三次重复。

3.3.2丙二醛含量的测定

丙二醛含量测定参照Hodges等(1999)的方法。称取0.3g叶片，加入少量石英沙和5ml 5％TCA(三氯乙酸)溶液研磨成匀浆，在10000r/min下离心10min。取上清液2ml于试管中，加2ml用10％TCA配置的0.67％TBA(硫代巴比妥酸)，混合摇匀后封口，沸水浴30min，取出试管冷却，如果有沉淀，10000r/min离心10min。吸取上清液，分别在450nm、532nm、600nm波长处测定吸光值。每个处理三次重复。MDA浓度计算公式为：C(μmol·L^-1)＝6.45×(A₄₅₀-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀。式中A₄₅₀、A₅₃₂、A₆₀₀分别代表450nm、532nm、600nm波长下的吸光值。进一步计算出叶片中MDA含量(μmol·g^-1)＝C×V/(1000×W)，V为样品提取液体积(ml)，W为叶片质量(g)。

3.3.3 H₂O₂含量的测定

H₂O₂含量测定参照Lin等的方法。取0.3g叶片用预冷丙酮研磨至匀浆，转入离心管，定容至5mL，10000r/min离心10min。取1mL上清液加0.1ml 5％的硫酸钛和0.2mL浓氨水，生成复合物后4000r/min离心10min，弃上清，用丙酮反复洗涤沉淀3到5次，直至出去植物色素，最后向沉淀中加入5mL 2M硫酸，待沉淀完全溶解后，加蒸馏水定容至10mL，于415nm波长下测定吸光值。每处理三次重复。H₂O₂含量(μmol·g^-1FW)＝(C×V_t)/(W×V_s)，C为标准曲线上查的H2O2浓度(umol)，V_t为提取液体积(mL)，V_s为测定时取用的样品体积(mL)，W为样品质量(g)。

可溶性糖含量的测定

可溶性糖含量测定参照李合生等的方法。取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.2g，放入刻度试管中，加入5ml蒸馏水，于沸水中提取30min，提取液过滤至10ml试管中，提取2次，反复冲洗试管及残渣，定容至10ml。若有沉淀，静置。吸取样品提取液0.5mL于10mL干燥刻度试管中，加蒸馏水1.5mL，按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂，加盖，充分摇匀，让乙酸乙酯水解，沿各管管壁缓慢加入5mL浓硫酸，加盖，充分振荡(猛摇试管数次)，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后置于试管架上自然冷却至室温，以空白作参比(0号管)，在630nm波长下测其光密度。每处理三次重复。样品可溶性糖含量(％)＝C×V_总/(W×V_测×10⁶)×100％，C为标准曲线上查出的糖含量(μg)，V_总为提取液总体积(mL)，V_测为测定时取用体积(mL)，W为样品鲜重(g)，10⁶为样品重量单位由g换算成μg的倍数。

可溶性蛋白含量的测定

可溶性蛋白含量测定参考李合生等的方法。取待测植物叶片(去主叶脉)0.3g于预冷的研钵中，加适量石英砂，使用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)研磨至匀浆，转入离心管中，定容至5ml。于4℃下10000r/min离心10min，取上清液于4℃下保存。吸取上清液1ml，加5ml考马斯亮蓝G—250，盖塞，反转混合数次(摇匀)，放置2min后在595nm下比色，测定其吸光度，比色应在1h内完成。样品中蛋白质的含量(mg·g^-1)＝C×V₁/(M×1000)，C为查标准曲线值(μg/ml)，V₁为提取液总体积(ml)，M为样品鲜重(g)。

游离脯氨酸含量的测定

游离脯氨酸含量测定参考李合生等的方法。取叶片0.3g，加入5ml3％磺基水杨酸，加盖，在沸水浴中提取10min，提取过程中要经常摇动，冷却后，以10000r/min离心10min。取2mL上清液于干燥的带塞刻度试管中，依次加入2mL冰醋酸；3mL茚三酮试剂，并混匀后在沸水浴中加热30min，溶液呈红色。冷却后向各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，取上层液至离心管中3000r/min下离心5min。用吸管或移液枪吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中，以0浓度为对照较零，于520nm波长处测定吸光值。样品中脯氨酸含量(μg·g^-1)＝m×V/(W×V₁)，m为标准曲线上查得的脯氨酸的质量(μg)，V为提取液总体积(mL)，V₁为测定时提取液体积(ml)，W 为样品质量(g)。

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定参考Arnon等的方法。用0.5cm直径的打孔器打孔叶片，称取0.05g小圆片放入带塞试管中，加入8ml 80％丙酮黑暗中浸提24h，期间晃动离心管，直至叶片变白。以80％丙酮为空白对照，在470nm、646nm、663nm波长处测定吸光度，每个处理三次重复。计算公式为：C_a＝(12.21A_663-2.81A₆₄₆)×V/(1000×W)；C_b＝(20.13A₆₄₆-5.03A₆₆₃)×V/(1000×W)；C_T＝C_a+C_b＝(17.32A₆₄₆+7.18A₆₆₃)×V/(1000×W)；C_x·c＝(1000A₄₇₀-3.72C_a-104C_b)×V/(229×1000×W)，C_a、C_b分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度(mg/L)；A₄₇₀、A₆₄₆、A₆₆₃分别为470nm、646nm、663nm波长处吸光值；V为叶绿素提取液总体积(mL)；W为叶片重量(g)，C_x·c为类胡萝卜素的总浓度(mg/L)。

SOD、CAT、POD酶液提取及活性测定

酶液提取：取0.5g叶片，加入预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8，含有1％PVP，2mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA)冰上研磨，定容至8mL。10000r/min低温离心10min，取上清液进行后续酶活性测定。

超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定采用Giannopolittis和Ries的方法。在试管中分别依次加入1.5ml 0.05mol/L(pH7.8)磷酸缓冲液，0.3ml 130mmol/L甲硫氨酸溶液，0.3ml 750umol/L氮蓝四唑溶液，0.3ml 100umol/L EDTA-Na2溶液，0.3ml 20umol/L核黄素，0.05ml样品提取液、0.25ml蒸馏水充分混匀。以缓冲液代替样品提取液分别做两支对照，一支对照管置于黑暗条件下，另一支对照管与样品反应管同时置于4000lx光照下，反应20min。反应反应结束后，以黑暗条件下的对照管作为空白对照，在560nm波长处测吸光值。每处理三次重复。SOD总活性(U·g^-1)＝2(A_CK-A_E)×V_t/(A_CK×W×Vs)，A_CK为对照吸光值，A_E为各样品管吸光值，V_t为提取液体积(mL)，Vs为测定时取用的样品体积(mL)，W为样品质量(g)。

过氧化氢酶(CAT)活性测定采用改良后的Kato和Shimizu的方法。在试管中分别加入1.5ml 0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)，1ml蒸馏水，0.2ml提取液，加入0.3ml 0.1mol/L的过氧化氢激活反应，以时间扫描方式，测定3min内反应液在240nm下的吸光值变化，每个处理三次重复。以每分钟A₂₄₀变化0.1为1个过氧化氢酶活性单位(U)，过氧化氢酶活性(U·g^-1·min^-1)＝△A₂₄₀×Vt/(2×W×Vs×0.1×t)，△A₂₄₀为反应时间内A₂₄₀的变化，Vt为提取液体积(mL)，Vs为测定时取用的样品体积(mL)，W为样品质量(g)，t为反应时间(min)。

过氧化物酶(POD)活性测定采用Scebba等的方法。首先配置反应液：在试管中加入50ml 50mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝5.5)，加入28ul愈创木酚和19ul 30％的过氧化氢，充分混匀，即为反应液。吸取3ml反应液于比色皿中，加1ml酶提取液，以未加酶液的反应液为空白对照，迅速混匀后，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内反应液在470nm下的吸光值变化，计算每分钟吸光度变化值。以每分钟A₄₇₀变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，过氧化物酶活性(U·g^-1·min^-1)＝△A₄₇₀×Vt/(W×Vs×0.01×t)，△A470为反应时间内A₄₇₀的变化；Vt为提取液总体积(mL)；V_s为测定时取用的样品体积(mL)；W为样品质量(g)；t为反应时间(min)。结果分析

(1)外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃丙二醛含量和相对膜透性的影响

逆境条件下，植物体内边儿去氨含量的高低能够反映出细胞膜的损伤程度，是膜脂过氧化的主要产物。由图1可以看出，经过8h高温胁迫后，未施加褪黑素处理和不同浓度外源褪黑素处理的猕猴桃叶片的丙二醛含量都有明显上升。高温胁迫8h后，HT的丙二醛含量由PT的7.91nmol·g^-1增加到10.53nmol·g^-1，增加幅度达到32.49％，而HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3的增加幅度均低于HT的增加幅度，分别为4.06％、8.88％、17.40％。由此可以推测，外源褪黑素处理可以显著降低高温逆境条件下丙二醛含量的增加幅度，保护细胞膜的完整性，降低膜脂过氧化程度，从而提高猕猴桃的耐热性，减轻高温对植物的伤害程度，其中50μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

逆境条件下，胁迫因子超过一定的时间或强度，植物就会受到伤害，生物膜是逆境伤害的最直接受害者。生物膜受到损伤后，膜的选择透过性丧失，细胞内电解质大量扩散出细胞，测定细胞相对膜透性的变化，能够反映出逆境胁迫对细胞膜造成的伤害程度。从图2可以看出，高温对照处理和外源褪黑素处理的猕猴桃叶片的相对膜透性均呈增加状态，但褪黑素处理组的相对膜透性上升幅度较对照组较小。高温胁迫8h后，HT处理组的相对膜透性增幅为247.35％，HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3处理组的相对膜透性增幅分别为182.74％、127.28％、149.69％，其中HT+MLT2处理组的增幅最小，这表明外源褪黑素浓度为100μmol·L^-1对猕猴桃的保护性较强。由此可以看出，外源褪黑素能够保护高温胁迫下植物细胞膜的完整性，降低质膜的透性，提高植株的耐高温能力。

(2)外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃游离脯氨酸含量和可溶性蛋白含量的影响

游离脯氨酸及可溶性蛋白能够增加植物细胞在高温等逆境条件下的功能蛋白数量及渗透势，是植物提高抗逆能力的两个重要渗透调节物质，能够调节植物细胞在逆境条件下仍然维持正常的代谢功能，提高植物抵抗逆境的能力。同时，脯氨酸在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。由图3可知，8h高温胁迫后，猕猴桃幼苗叶片内游离脯氨酸含量显著高于PT时的含量，对照组的游离脯氨酸含量无明显变化。HT处理组的游离脯氨酸的含量较PT时的脯氨酸含量增加481.27％，而HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3处理组的脯氨酸含量显著高于HT处理组，相较其的增幅分别为141.82％、188.69％和136.60％，其中HT+MLT2处理组的脯氨酸含量最高。由此可以推测，外源褪黑素的施加有利于促进植物体内游离脯氨酸含量的增加，以来达到提高植物抵抗逆境的能力，其中100μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

植物在遭受高温胁迫时，叶片可溶性蛋白合成速率会发生变化，而可溶性蛋白含量变化可以反映蛋白质合成、变性和降解多方面信息。从图4可以看出，高温胁迫8h后，正常生长组的可溶性蛋白含量几乎没有变化，但其他处理组的含量均有下降。HT和HT+MLT3处理组的降低量最大，从PT的4.82mg·g^-1分别降至4.35mg·g^-1和4.36mg·g^-1，降幅为10.84％和10.56％。HT+MLT2、HT+MLT3处理组的降低幅度较大，分别为3.99％和1.34％。由此可以表明，外源褪黑素处理可以缓解高温胁迫下猕猴桃蛋白质的降解，其中100μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

(3)外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃可溶性糖含量的影响

可溶性糖也是重要的渗透调节物质，在植物遭受逆境时大量合成，维持细胞内渗透势，保护膜系统稳定性，因此在抵抗逆境中起重要作用。从图5可以看出，与PT时的可溶性糖含量相比，对照组的可溶性糖含量在高温胁迫后变化不大，但其他几个处理组的可溶性糖含量均增大，其中以HT+MLT2处理组的可溶性糖含量最高，显著高于其他处理组，为2.39％，与PT时对比增幅为127.08％。由此可以说明，施加外源褪黑素有利于促进植物体内可溶性糖含量的增加，增强维持细胞内渗透势能力，从而达到提高植物抵抗逆境的能力，其中100μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

(4)外源褪黑素对高温胁迫下猕猴桃保护酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的大小代表了清除细胞内活性氧能力的高低，是植物逆境条件下保护细胞的重要酶类。SOD是生物体内普遍存在的参与氧化代谢的一种含金属酶。其能够催化超氧阴离子发生歧化反应，生成O₂和H₂O₂，与植物的衰老和抗逆性密切相关，对保护细胞免遭氧化伤害起着重要的作用。如图6所示，经过8h的高温胁迫后，CK处理组与PT时的SOD活性无明显差异，而HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3处理组的SOD活性与PT时相比均下降。并且，经过褪黑素处理的处理组猕猴桃叶片的SOD活性均高于HT处理组的SOD活性，HT处理组的SOD活性与PT相比降低26.96％，HT+MLT1处理组活性降低18.60％，HT+MLT2处理组活性降低15.34％，HT+MLT3处理组活性降低22.44％。由此可以表明，外源褪黑素激活了高温胁迫下猕猴桃体内的SOD活性，SOD是植物体内重要的清除活性氧的酶类，因此SOD活性的升高增强了植物体内活性氧的清除能力，有效稳定了膜质透性，增强了猕猴的抗热性，其中50μmol·L^-1和100μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

CAT具有清除植物体内H₂O₂的作用，也是植物酶促防御系统的重要组分。图7表明，HT处理组的CAT活性从PT时的26.64U·g^-1·min^-1降低至17.8U·g^-1·min^-1，降幅为49.67％；HT+MLT1处理组的CAT活性降低至20.73U·g^-1·min^-1，降幅为28.52％；HT+MLT2处理组的CAT活性降低至22.13U·g^-1·min^-1，降幅为20.41％；、HT+MLT3处理组的CAT活性降低至23.24U·g^-1·min^-1，降幅为14.63％。所有褪黑素处理组的CAT活性均高于HT处理组活性，由此可以推测，外源褪黑素激活了猕猴桃体内CAT活性，CAT活性的增加提高了猕猴桃清除H₂O₂的能力，有效缓解了高温胁迫诱导的膜脂过氧化，提高了猕猴桃的耐热性，其中200μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

POD也是清除H₂O₂的重要物质。如图8所示，8h高温胁迫后，与PT时的POD活性相比，CK处理组活性几乎不变，而HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3处理组的POD活性则均升高。高温8h后，HT、HT+MLT1、HT+MLT2、HT+MLT3的POD活性较PT分别升高12.22％、55.23％、32.16％、47.00％，其中HT+MLT1升高最多，酶活性也显著高于其他处理，HT+MLT3次之。由此可以表明，褪黑素激活了植物体内的POD活性，提高了猕猴桃清除H₂O₂的能力，有效稳定了膜质透性，从而提高猕猴桃的抗热性，其中50μmol·L^-1和200μmol·L^-1浓度的褪黑素处理效果最好。

因此，外源褪黑素可以刺激和诱导高温逆境条件下植物体内SOD、CAT、POD活性，使其在长时间的高温胁迫下维持较高的活性状态，从而更有利于清除H₂O₂，维持细胞膜的稳定性，提高猕猴桃的抗高温能力。

对比实验例1

以巨峰葡萄扦插盆栽苗为试验材料。选取长势基本一致的盆栽苗，平均分成5组，对照组(CK)和处理组(H1，H2，H3，H4)，进行褪黑素浇灌处理和高温胁迫处理(表2)。褪黑素浇灌处理在傍晚19：00进行，对照组(CK)浇灌300ml清水，处理组(H1，H2，H3，H4)分别浇灌300ml浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天浇灌一次，共5次。褪黑素最后一次浇灌结束后的第2天，擦净盆栽苗叶片上的污渍，分别将对照组和处理组放入25±1℃培养箱中适应24h，光暗(8:00—20:00)/(20:00—8:00)，湿度为70％，光照为3000lx。适应后将处理组转移到45±1℃培养箱，湿度为70％，光照为3000lx，当温度刚升到45℃时记为高温胁迫0h，此时采取对照组的3～9叶位的叶片，再分别在高温胁迫4h和8h采取各组植株3～9叶位的叶片，测定MDA含量，过氧化氢含量和相对膜透性，每处理6株，设3次重复。

表2褪黑素溶液浓度和高温胁迫处理

试验方法和数据处理方法同上

结果分析：

(1)外源褪黑素对高温胁迫下巨峰葡萄叶片MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性的影响

MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性是反应植物受胁迫程度的3个重要生理指标。由表3可以看出，对巨峰葡萄根灌不同浓度褪黑素溶液后进行高温胁迫处理，随高温胁迫时间延长，MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性均呈升高趋势。高温胁迫后，各处理组MDA含量相比于对照显著升高，且8h的MDA含量显著高于4h的MDA含量，而在各处理组之间的MDA含量差异不显著。H₂O₂含量和相对膜透性的变化与MDA含量变化一致。说明根灌50-200μmol/L褪黑素溶液对巨峰葡萄高温胁迫没有缓解作用。

表3

注：不同的字母表示差异显著(P<0.05)

对比实验例2

以夏黑葡萄扦插盆栽苗为试验材料。选取长势基本一致的盆栽苗，平均分成5组，对照组(CK)和处理组(C1，C2，C3，C4)，进行褪黑素浇灌处理之后再干旱胁迫处理(表4)。褪黑素浇灌处理在傍晚19：00进行，对照组(CK)浇灌300ml清水，处理组(T1，T2，T3，T4)分别浇灌300ml浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L的褪黑素溶液，每3天浇灌一次，共5次。干旱胁迫期间对照组(CK)正常浇水，处理组(C1，C2，C3，C4)不浇水，采用自然干旱的方式进行干旱胁迫，在干旱胁迫处理的第0天(以最后一次浇灌褪黑素溶液的第二天作为干旱胁迫第0天)采取对照组(CK)和第9天分别采取各组植株3～9叶位的叶片，用于测定MDA含量，过氧化氢含量和相对膜透性，每处理6株，设3次重复。

结果与分析：

(1)外源褪黑素对干旱胁迫下夏黑葡萄叶片MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性的影响

表4褪黑素溶液浓度和干旱胁迫处理

(2)试验方法和数据处理方法同上

MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性是反应植物受胁迫程度的3个重要生理指标。对夏黑葡萄根灌不同浓度褪黑素溶液后进行干旱胁迫处理，表5结果显示，干旱胁迫后，各处理组的MDA含量、H₂O₂含量和相对膜透性相对于对照组均显著升高。干旱第0天和第9天，对照组的MDA含量差异不显著；在干旱第9天，各处理组的MDA含量差异不显著。同样，过氧化氢含量和相对膜透性的变化趋势和MDA相近：干旱胁迫第9天，各处理组过氧化氢含量和相对膜透性均显著高于对照组，但各处理组之间差异不显著。说明，根灌50-200μmol/L褪黑素溶液不能缓解干旱胁迫对夏黑葡萄的伤害。

表5

注：不同的字母表示差异显著(P<0.05)。

Claims (5)

1.一种缓解猕猴桃果树高温胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

当猕猴桃幼苗长至五叶一心时，浇灌浓度为50-200μmol/L的褪黑素，浇灌量为200ml，每隔2天浇灌一次，共5次。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猕猴桃幼苗的获得方法为：将猕猴桃种子在800mg/L的赤霉素溶液中浸泡1天，4℃层积2个月，然后在培养箱中25℃、8h/4℃、16h变温处理2周，之后25℃恒温培养至种子萌芽；将发芽的种子播种到育苗盘中，上面覆盖2mm的营养土，于人工气候室中培养，光暗周期为12h/12h，昼夜温度为25℃/20℃；当幼苗长到2—3片真叶时，选取长势一致的幼苗移到装有珍珠岩的花盆中，每盆3株；移苗后注意保湿遮阴，浇营养液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述猕猴桃为野生中华猕猴桃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，褪黑素的浓度为100μmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高温为45℃。