CN115504828B - 一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法 - Google Patents

一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，该方法包括在低钙胁迫下向冬瓜苗施加0.1～30μmol/L的褪黑素。本发明采用外源性褪黑素可以显著提高冬瓜植株的根系长度、根尖数、植株干重、钙含量以及叶片叶绿素指数，同时可以缓解或抵御低钙胁迫对冬瓜根系的损害，促进冬瓜植株吸收钙的能力，提高冬瓜的抗氧化能力、降低脂质过氧化伤害，缓解低钙胁迫引起的生长抑制。

Description

一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法
技术领域
本发明属于植物栽培领域，具体涉及一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法。
背景技术
钙是植物生长发育必需的营养元素之一，具有重要的生理功能。钙在植物体内的吸收和运输主要依靠蒸腾拉力，因而蒸腾速率较低时极易出现缺钙现象，导致细胞膜和细胞壁解体、破坏植物细胞内活性氧(ROS)产生和清除平衡状态，降低抗氧化能力，引起ROS和丙二醛含量升高，从而使植物受到胁迫伤害，间接影响植株生长。植物缺钙的原因一方面是土壤缺钙，另一方面是生理缺钙，蔬菜、果树等生长快、需钙量大的园艺作物经常会出现生理缺钙症状，从而导致花端腐烂、缘腐病、脐腐病、裂果等。近年来，由于缺钙引起的冬瓜生理病害日益严重，对冬瓜品质和生产效益造成不利影响。多阴雨、光照不足的气候环境会致使冬瓜植株蒸腾速率低，直接补钙效果不显著。
褪黑素作为一种天然的、多功能生物活性分子，不仅参与调控植物的多种生理进程，其在促进植物对营养元素的吸收和利用上也发挥积极作用。例如，低钾和盐胁迫下，褪黑素均能促进植物组织积累K+，维持细胞渗透压，缓解伤害。低氮供应条件下，褪黑素还可以提高小麦根系和地上部分对氮的利用能力，提高硝态氮水平。在番茄中的研究发现，外源褪黑素对番茄低钙胁迫具有一定的缓解效应，但该研究集中在褪黑素和低钙胁迫对番茄叶片的影响，而忽略了褪黑素对番茄根系的影响，仅通过对番茄叶片的观察而认为褪黑素可以缓解番茄的低钙胁迫，但实际上，对于番茄植株整个生长周期而言，褪黑素实际上是否能够缓解番茄的低钙胁迫仍是未知的。此外，番茄和冬瓜在生长过程中对钙元素的需求差异较大，且番茄的钙通道基因和钙转运基因均与冬瓜存在较大的区别，因此，对番茄造成低钙胁迫的钙浓度和缓解低钙胁迫的褪黑素浓度并不能直接应用于冬瓜的研究中。通过上述分析，现有技术存在一定的问题和缺陷，为此，本发明利用水培方法，研究低钙胁迫下褪黑素处理根系对冬瓜幼苗生物量和根系形态变化、抗氧化能力的影响，并分析根系中钙通道和转运基因的表达，对褪黑素在提高冬瓜钙利用能力上的应用具有重要的参考价值。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种适用于冬瓜在低钙胁迫下生长的营养液。
本发明的目的之二在于提供一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法。
本发明的目的之三在于提供褪黑素在冬瓜种植中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面提供了一种适用于冬瓜在低钙胁迫下生长的营养液，所述营养液中含有0.1～30μmol/L的褪黑素。
优选地，所述营养液中含有1～15μmol/L的褪黑素；进一步优选地，所述营养液中含有1～2μmol/L的褪黑素；再进一步优选地，所述营养液中含有1.5μmol/L的褪黑素；
优选地，所述营养液是由0.1～30μmol/L的褪黑素组成；进一步优选地，所述营养液是由1～15μmol/L的褪黑素组成；再进一步优选地，所述营养液是由1～2μmol/L的褪黑素组成。
本发明的第二个方面提供了一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，包括以下步骤：向低钙胁迫下的冬瓜幼苗施加0.1～30μmol/L的褪黑素。
优选地，所述冬瓜的培育条件为：温度为18～30℃，湿度为60～70％，光通量密度为80～120μmol/m2/s，光照周期为10～14h。
优选地，所述温度为20～30℃；进一步优选地，所述温度为25～30℃。
优选地，所述湿度为65～70％。
优选地，所述光通量密度为90～120μmol/m2/s；进一步优选地，所述光通量密度为100～120μmol/m2/s；再进一步优选地，所述光通量密度为100～110μmol/m2/s。
优选地，所述光照周期为11～14h；进一步优选地，所述光照周期为11～13h；再进一步优选地，所述光照周期为12h。
优选地，所述低钙胁迫是指冬瓜生长环境中钙含量低于1％。
优选地，所述方法还包括促使冬瓜种子发芽的步骤；所述促使冬瓜种子发芽的步骤具体为：将冬瓜种子在温度为50～60℃的水中浸泡10～60min；再在温度为15～40℃下的水中浸泡4～10h，然后在温度为30～40℃的培养箱中黑暗培养40～60h；进一步优选地，所述方法还包括促使冬瓜种子发芽的步骤；所述促使冬瓜种子发芽的步骤具体为：将冬瓜种子在温度为55～60℃的水中浸泡20～50min；再在温度为25～35℃下的水中浸泡4～8h，然后在温度为30～35℃的培养箱中黑暗培养40～55h；再进一步优选地，所述方法还包括促使冬瓜种子发芽的步骤；所述促使冬瓜种子发芽的步骤具体为：将冬瓜种子在温度为55～58℃的水中浸泡25～45min；再在温度为25～35℃下的水中浸泡4～6h，然后在温度为30～32℃的培养箱中黑暗培养45～50h。
优选地，所述方法包括将发芽的冬瓜种子播种在育苗基质上直至生长出第一片真叶，然后移至基础营养液中培养8～12天直至冬瓜幼苗生长出两叶一心。
优选地，所述育苗基质包括草炭、蛭石和珍珠岩；所述草炭、蛭石和珍珠岩的质量比为(1～3)：(0.5～2)：1；进一步优选地，所述育苗基质包括草炭、蛭石和珍珠岩；所述草炭、蛭石和珍珠岩的质量比为(1.5～2.5)：(1～1.5)：1；再进一步优选地，所述育苗基质包括草炭、蛭石和珍珠岩；所述草炭、蛭石和珍珠岩的质量比为2：1：1。
优选地，所述基础培养液中，氮的含量为20～30mmol/L，磷的含量为1～3mmol/L，钾的含量为8～12mmol/L，硫的含量为1～3mmol/L，钙的含量为6～10mmol/L，镁的含量为1～3mmol/L，铁的含量为0.01～0.1mmol/L，锰的含量为0.01～0.1mmol/L，锌的含量为0.005～0.02mmol/L，铜的含量为0.001～0.01mmol/L，硼的含量为0.01～0.1mmol/L，钼的含量为0.0005～0.005mmol/L，钠的含量为0.01～0.05mmol/L。进一步优选地，所述基础培养液中，氮的含量为27～29mmol/L，磷的含量为1.75～2.25mmol/L，钾的含量为9～11mmol/L，硫的含量为1.75～2.25mmol/L，钙的含量为7～9mmol/L，镁的含量为1.75～2.25mmol/L，铁的含量为0.02～0.04mmol/L，锰的含量为0.01～0.03mmol/L，锌的含量为0.007～0.015mmol/L，铜的含量为0.001～0.003mmol/L，硼的含量为0.04～0.06mmol/L，钼的含量为0.0005～0.0015mmol/L，钠的含量为0.02～0.04mmol/L。
本发明的第三个方面提供了褪黑素在冬瓜种植中的应用。
优选地，所述褪黑素的浓度为0.1～30μmol/L；进一步优选地，所述褪黑素的浓度为1～15μmol/L；再进一步优选地，所述褪黑素的浓度为1～2μmol/L；更优选地，所述褪黑素的浓度为1.5μmol/L。
优选地，所述冬瓜的种植条件为：温度为18～30℃，湿度为60～70％，光通量密度为80～120μmol/m2/s，光照周期为10～14h。
优选地，所述褪黑素应用在冬瓜种植中时提高冬瓜幼苗的钙转运基因和钙通道基因的表达。
优选地，所述褪黑素应用在冬瓜种植中时提高冬瓜幼苗根的抗氧化能力。
本发明的有益效果是：本发明采用外源性褪黑素可以显著提高冬瓜植株的根系长度、根尖数、植株干重、钙含量以及叶片叶绿素指数(SPAD)，同时可以缓解或抵御低钙胁迫对冬瓜根系的损害，促进冬瓜植株吸收钙的能力，提高冬瓜的抗氧化能力、降低脂质过氧化伤害，缓解低钙胁迫引起的生长抑制。
此外，在低钙胁迫下，采用含1～2μmol/L褪黑素处理冬瓜幼苗可以显著提高冬瓜幼苗根系活力，促进钙通道和转运基因表达，并显著提高抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性、降低MDA和H2O2含量及O2 -·产生速率。
本发明中的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法通过施加0.1～30μmol/L的褪黑素，可以实现缓解甚至消除低钙胁迫造成的伤害，使冬瓜可以在低钙环境中生长，对于冬瓜的种植有重要的意义。
附图说明
图1为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜植株根系形态测试图。
图2为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜的叶片图。
图3为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜的根系长度测试图。
图4为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜的根尖数测试图。
图5为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜叶片的叶绿素指数测试图。
图6为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜植株干重测试图。
图7为实施例1～4和对比例1～2中的冬瓜钙含量和钙浓度测试图。
图8为实施例2和对比例1～2中的冬瓜根系钙通道基因和钙转运基因的表达量测试图。
图9为实施例2和对比例1～2中的冬瓜的根系表型图。
图10为实施例2和对比例1～2中的冬瓜的根系活力测试图。
图11为实施例2和对比例1～2中的冬瓜根系抗氧化性能测试图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1：
本例提供了一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：选取冬瓜种子“铁柱2号”，种子在55℃水中浸种30min后，再在室温下用水浸泡6h，之后用湿纱布包好种子，放置在32℃的培养箱中暗培养，催芽，48h后种子萌发，播种在育苗基质(草炭：蛭石：珍珠岩的质量比为2:1:1)中。待幼苗长至第一片真叶完全展开时，选取长势一致的幼苗，洗干净根部，18株一组转移至含有营养液(营养液成分表见表1)的水培箱，继续生长10天，直至幼苗长至两叶一心。
表1步骤(1)中的营养液成分表
步骤(2)：构建低钙胁迫环境和褪黑素处理，具体为：将步骤(1)中的幼苗移至含有1％钙含量和0.15μmol/L褪黑素的营养液(营养液的成分表见表2)的新的水培箱中进行培养，在该营养液中生长10天，湿度60-70％，光通量密度100μmol/m2/s，光周期12h，白天温度为26℃，夜间温度为18℃。
褪黑素配置方法为：所用褪黑素购买自上海源叶生物科技有限公司，纯度达99％；先将褪黑素粉末用少量无水乙醇溶解，之后用蒸馏水配置成3mmol/L的母液，然后向水培箱中加入褪黑素母液，使水培箱中营养液中的褪黑素浓度为0.15μmol/L。
表2步骤(2)中营养液成分表
实施例2：
本例中的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法的具体步骤与实施例1基本相同，本例与实施例1的不同之处在于步骤(2)中的褪黑素浓度不同，具体为：本例中的冬瓜幼苗在含有1％钙和1.5μmol/L褪黑素的营养液的新的水培箱中进行培养。
实施例3：
本例中的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法的具体步骤与实施例1基本相同，本例与实施例1的不同之处在于步骤(2)中的褪黑素浓度不同，具体为：本例中的冬瓜幼苗在含有1％钙和15μmol/L褪黑素的营养液的新的水培箱中进行培养。
实施例4：
本例中的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法的具体步骤与实施例1基本相同，本例与实施例1的不同之处在于步骤(2)中的褪黑素浓度不同，具体为：本例中的冬瓜幼苗在含有1％钙和30μmol/L褪黑素的营养液的新的水培箱中进行培养。
对比例1：
本例提供了一种水培冬瓜的育苗方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤(1)：选取冬瓜种子“铁柱2号”，种子在55℃水中浸种30min后，再在室温下用水浸泡6h，之后用湿纱布包好种子，放置在32℃的培养箱中暗培养，催芽，48h后种子萌发，播种在育苗基质(草炭：蛭石：珍珠岩的质量比为2:1:1)中。待幼苗长至第一片真叶完全展开时，选取长势一致的幼苗，洗干净根部，18株一组转移至含有培养液(该营养液的成分与实施例1表1中营养液的成分相同)的水培箱，继续生长10天，直至幼苗长至两叶一心。
步骤(2)：在上述营养液(该营养液的成分与实施例1表1中营养液的成分相同)中继续生长10天，湿度60-70％，光通量密度100μmol/m2/s，光周期12h，白天温度为26℃，夜间温度为18℃。
对比例2：
本例中的冬瓜育苗方法与对比例1中的方法基本相同，本例与对比例1的不同之处在于：步骤(2)的步骤不同，步骤(2)具体为：将步骤(1)中的冬瓜幼苗在含有1％钙的营养液(营养液成分表见表3)的新水培箱中继续生长10天，湿度60-70％，光通量密度100μmol/m2/s，光周期12h，白天温度26℃，夜间温度为18℃。
表3对比例2中的营养液成分表
性能测试：
(1)冬瓜幼苗生长状态测试
分别测试实施例1～4和对比例1～2中的方法培育的冬瓜幼苗的根系形态，具体测试方法为：采用MICROTEK ScanMaker i800plus根系扫描仪进行测定和分析，具体测试结果如图1、图3和图4所示，其中，冬瓜植株根系形态测试图如图1所示，冬瓜的根系长度测试图如图3所示，冬瓜的根尖数测试图如图4所示，冬瓜苗叶片图如图2所示，冬瓜苗叶片的叶绿素指数(SPAD)的测定采用HT-YLS型叶绿素测定仪读数，具体测试结果如图5所示。通过对比分析图1～图5可以得出如下结论：通过对比分析对比例1和对比例2可知：低钙胁迫显著抑制了冬瓜幼苗生长，使对比例2中的冬瓜幼苗的根系长度、根尖数和新叶的叶绿素指数明显小于对比例1。通过对比分析对比例2和实施例1～4可知：在营养液中添加褪黑素可以有效缓解低钙胁迫对冬瓜幼苗的生长抑制，具体为褪黑素处理可以显著提高冬瓜的根系长度、根尖数和新叶的叶绿素指数，其中1.5μmol/L的褪黑素处理使冬瓜的根系长度、根尖数和新叶的叶绿素指数达到甚至显著高于对比例1。
分别测试实施例1～4和对比例1～2中的方法培育的冬瓜植株干重，具体测试方法为：烘干至恒重后用天平测量重量，每组测量5株，重复3次，取平均值，具体测试结果如图6所示。由图6可知，与对比例1相比，对比例2中的冬瓜幼苗因受低钙胁迫干重降低了37.5％，实施例1～4采用不同浓度的褪黑素进行处理后，冬瓜植株干重随褪黑素处理浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，且1.5μmol/L的褪黑素处理后植株干重达到甚至略超过正常水平，以上结果表明，1.5μmol/L褪黑素处理可以消除低钙胁迫引起的生长抑制。
(2)冬瓜植株钙含量和钙浓度测试
分别测试实施例1～4和对比例1～2中的方法培育的冬瓜的钙含量和钙浓度，具体测试方法为：测试方法参考鲍士旦的方法，具体步骤如下：(1)称取1g样品于坩埚中，将坩埚移至高温电炉上，加热至约525℃进行高温灰化处理，持续约2h，烧至灰分近于白色为止，取出放冷；(2)冷却后用少量水湿润灰分，然后小心滴加1.2mol/L HCl约20mL，期间注意防止灰分飞溅损失，加热至沸以溶解残渣，用热水将样品全部转入100mL容量瓶中，冷却后定容过滤；(3)吸取2mL滤液于50mL容量瓶中，加入50g/L氯化锶1mL，用蒸馏水定容至刻度，然后用原子吸收分光光度计测定钙的含量；(4)标准曲线的制作：配置100μg/L的钙标准溶液，分别吸取标准溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于50mL容量瓶中，然后加入20mL 1.2mol/LHCl，再加入50g/L氯化锶1mL，蒸馏水定容至刻度，即得0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL钙标准溶液，用原子吸收分光光度计测定，绘制钙标准曲线。计算公式为Ca(mg/g DW)＝c×V×ts×10-3/m，其中c为标准曲线查得的Ca浓度(μg/mL)；V为测定时定容体积(mL)；ts为稀释倍数；m为干样品质量；DW代表干重。具体测试结果如图7所示，其中，图7(a)为钙浓度测试图；图7(b)为钙含量测试图，钙含量是指整株冬瓜的钙总量，即用钙浓度乘以植株干重所得。由图7可知，与对比例1相比，对比例2中的冬瓜幼苗在低钙胁迫下对钙的吸收能力明显减弱，导致冬瓜植株中钙元素的浓度和含量均显著低于对比例1，而实施例1～4采用适宜浓度的褪黑素处理后可以有效促进冬瓜幼苗吸收钙。与对比例2中的单独低钙胁迫相比，实施例2采用1.5μmol/L褪黑素处理后，冬瓜苗的钙浓度和全株钙含量分别升高了32.9％和138.0％。以上结果表明：1.5μmol/L褪黑素处理可以显著提高冬瓜幼苗对钙的吸收能力，缓解低钙胁迫引起的生理缺陷。
(3)冬瓜幼苗根系钙通道和转运基因表达水平测试
分别测试实施例2和对比例1～2中的方法培育的冬瓜苗的钙通道基因和钙转运基因的表达水平，具体测试方法为：采用qRT-PCR技术测定了2个钙通道基因(BhiCNGC17、BhiCNGC20)和2个钙转运基因(BhiECA1、BhiACA1)的表达水平，具体测试结果如图8所示；图8(a)为BhiCNGC17的表达水平测试图；图8(b)为BhiCNGC20的表达水平测试图；图8(c)为BhiECA1的表达水平测试图；图8(d)为BhiACA1的表达水平测试图；由图8可知，与对比例1相比，对比例2采用低钙胁迫处理降低了钙通道基因表达而显著升高了钙转运基因表达。与对比例1～2相比，实施例2采用低钙胁迫结合褪黑素处理均显著上调了4个基因的表达水平，即钙通道基因和钙转运基因的表达均获得了显著的提高，此结果与低钙胁迫下褪黑素可以提高冬瓜幼苗的钙含量和钙浓度的结论相一致。冬瓜根系钙通道和转运基因表达水平测试结果表明低钙胁迫下，采用褪黑素处理可以通过上调钙通道和转运基因的表达增加冬瓜中钙含量，尤其是对钙通道基因影响较大。
(4)冬瓜幼苗根系抗氧化能力测试
分别测试实施例2和对比例1～2中的方法培育的冬瓜苗的外形和根系活力，其中，冬瓜苗的根系活力的具体测试方法为：采用TTC法测定(该方法记载在Clemensson-lindell,A.1994.Triphenyltetrazolium chloride as an indicator of fine-rootvitality and environmental stress in coniferous forest stands:Applicationsand limitations)，具体步骤如下：(1)称取冬瓜苗根尖样品0.5g，放入15ml离心管中，加入0.4％TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液和磷酸缓冲液(1:1)的等体积混合液10mL，把冬瓜苗的根尖样品充分浸没在溶液内，在37℃下暗室保温3h，此后加入2mL的1mol/L硫酸，以停止反应。与此同时设置空白对照实验，先加硫酸，再加根尖样品，其他操作同上。(2)把根尖样品取出，吸干水分后与3mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提取红色的TPF(三苯甲臢化合物，1,3,5-triphenylformazan)。将红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2次，转移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可得出2,3,5-三苯基氯化四氮唑的还原量。(3)标准曲线的制作：取0.4％TTC溶液0.25mL放入10mL容量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的TPF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TPF 25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。(4)计算公式：TTC的还原强度(μg·h-1·g-1FW)＝TTC还原量(μg)/[根重(g FW)×时间(h)]，其中FW为根系鲜重。实施例2和对比例1～2中的方法培育的冬瓜幼苗的根系活力的测试结果如图10所示。冬瓜根系表型测试结果如图9所示，由图9可知，与对比例1相比，低钙胁迫显著减少了对比例2中的冬瓜根系侧根数目、抑制根系生长，且根系颜色出现发黄现象。与对比例2相比，低钙胁迫下采用褪黑素处理提高了实施例2中的冬瓜根系侧根数目，促进根系生长。由图10可知，与对比例1相比，低钙胁迫显著降低了对比例2中的冬瓜幼苗的根系活力，而低钙胁迫下进行褪黑素处理的实施例2中的冬瓜幼苗的根系活力比对比例2升高了120.6％。由此可见，低钙胁迫使冬瓜苗根系发生了氧化胁迫，而通过褪黑素处理后，可以极大的缓解或消除低钙胁迫所造成的冬瓜根系氧化胁迫。
分别测试实施例2和对比例1～2中的方法培育的冬瓜幼苗的根系抗氧化能力，具体测试方法为：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法进行测试；过氧化物酶(POD)的活性使用愈创木酚法；过氧化氢酶(CAT)活性测定参照文献Patra HK,Kar M,Mishra D.1978.Catalase activity in leaves and cotyledons during plantdevelopment and senescence中记载的方法测试；H2O2含量采用辣根过氧化物酶还原法测定(具体可参照文献Willekens H,Chamnongpol S,Davey M,Schraudner M,LangebartelsC,Montagu MV,InzéD,Camp WV.1997.Catalase is a sink for H2O2 and isindispensable for stress defence in C3 plants中记载的方法)；超氧阴离子产生速率的测定采用Elstner和Heupel的方法(具体可参照文献Elstner E F,HeupelA.1976.Inhibition of nitrite formation from hydroxylammoniumchloride:a simpleassay for superoxide dismutase中记载的方法)；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法，具体步骤如下：(1)称取0.3g冬瓜根系样品，加入5mL 10％TCA(三氯乙酸)研磨成匀浆，在3000g转速下离心10min；(2)取1mL上清液，加入4mL TAB(硫代巴比妥酸)反应液；(3)95℃水浴加热30min，拿出后立刻放入冰中停止反应；(4)10000g转速下离心10min后，分别在450nm，532nm，600nm处测定上清液的吸光度值。计算公式如下：MDA(nmol·g-1FW)＝[6.452×(A532-A600)-0.559×A450]×VT/(Vs*m)，其中，VT：提取液体积5mL；Vs：测定用样品体积1mL；m：根系鲜重,g FW；A450为450nm时测得的吸光度值，A532为532nm时测得的吸光度值，A600为600nm时测得的吸光度值。按照上述测试方法测得的结果如图11所示；其中，图11(a)为超氧阴离子产生速率的测试图；图11(b)为SOD活性测试图；图11(c)为H2O2含量测试图；图11(d)为POD活性测试图；图11(e)为MDA含量测试图；图11(f)为CAT活性测试图。由图11可知，与对比例1相比，而对比例2采用单独的低钙胁迫处理显著提高了冬瓜根系超氧阴离子(O2 -·)产生速率、H2O2含量和丙二醛(MDA)含量，同时在一定程度上提高了POD和CAT活性、降低了SOD活性。而实施例2在低钙胁迫下采用褪黑素处理的冬瓜根系O2 -·产生速率、H2O2含量和MDA含量均显著降低，分别降低了18.1％、20.4％和21.1％，同时SOD、POD和CAT活性显著升高，分别升高了29.8％、36.4％和340.3％。
综上所述，长期低钙胁迫对冬瓜根系造成过氧化伤害，MDA含量升高，致使冬瓜根系细胞发生膜脂过氧化，抑制根系生长、破坏根系结构，根系吸收矿质元素的面积减少，同时降低钙通道基因表达，导致钙吸收量降低。然而，低钙胁迫下进行褪黑素处理可以显著提高冬瓜根系的抗氧化能力，缓解生长抑制，使侧根数和根系活力都显著增加，并且上调钙通道基因和转运基因表达水平，从而提高根系吸收钙的能力，增加冬瓜植株钙含量。本发明中的方法有助于提高冬瓜植株吸收和利用钙的能力，对我国冬瓜产业提质增效研究具有重要意义。
以上对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (6)

1.一种提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：向低钙胁迫下的冬瓜幼苗施加0.1~30 μmol/L的褪黑素。
2.根据权利要求1所述的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：所述冬瓜幼苗的培育条件为：温度为18~30 ℃，湿度为60~70%，光通量密度为80~120 μmol/m2/s，光照周期为10~14 h。
3.根据权利要求1所述的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：所述低钙胁迫是指冬瓜幼苗生长环境中钙含量低于1%。
4.根据权利要求1所述的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：所述方法包括将发芽的冬瓜种子播种在育苗基质上直至生长出第一片真叶，然后移至基础营养液中培养8~12天直至冬瓜幼苗生长出两叶一心。
5.根据权利要求4所述的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：所述育苗基质包括草炭、蛭石和珍珠岩；所述草炭、蛭石和珍珠岩的质量比为（1~3）：（0.5~2）：1。
6.根据权利要求4所述的提高冬瓜耐低钙胁迫能力的方法，其特征在于：所述基础营养液中，氮的含量为20~30 mmol/L，磷的含量为1~3 mmol/L，钾的含量为8~12 mmol/L，硫的含量为1~3 mmol/L，钙的含量为6~10 mmol/L，镁的含量为1~3 mmol/L，铁的含量为0.01~0.1mmol/L，锰的含量为0.01~0.1 mmol/L，锌的含量为0.005~0.02 mmol/L，铜的含量为0.001~0.01 mmol/L，硼的含量为0.01~0.1 mmol/L，钼的含量为0.0005~0.005 mmol/L，钠的含量为0.01~0.05 mmol/L。
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