CN113287506A

CN113287506A - 一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法

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Publication number: CN113287506A
Application number: CN202110658506.1A
Authority: CN
Inventors: 韩丹; 邵惠芳; 张璐翔; 黄五星; 贾玮; 许自成
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2021-08-24

Abstract

本发明公开了一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法，属于农业领域，采取水培法，通过低温驯化、脱驯化、低温处理三个阶段提高了烟叶幼苗的抗冻性，通过12至24h的脱驯化对烟苗再次经受低温时使其抗逆相关基因表达量有所提高，从而促进植株的氧化还原及渗透调节平衡保持稳定。解决了目前寒冷地区烟草抗冻能力不足的问题，对冷寒烟区烟叶生产稳定发展、烟农持续增收具有重要意义，对越冬作物避免短时回暖影响驯化效果和通过驯化避免春播作物遭遇短时降温的危害提供了一定的依据与探索途径。

Description

一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法

技术领域

本发明涉及一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法，属于农业领域。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，其种植面积和总产量都居世界第一。北方冷寒烟区种植烟草已有百年历史，是我国传统、典型优质烟叶产区，历史上曾有麦烟套作、烟薯间作等多种间套作模式，现有烟草种植模式主要为“烟草-冬闲-烟草”的单作连作模式，较少部分为“烟草-小麦-玉米-冬闲-烟草”的两年三熟轮作模式。单作连作模式存在缺点：常年连作导致烟田土壤养分失调、有害物质积累、物理结构变差、烟草病虫害加重、烟叶产量、质量下降、经济效益降低等。两年三熟轮作模式存在缺点：轮作周期较长，周年平均经济效益较烟草连作低，导致该模式应用面积有限，仅在连作烟田无以为继时采用。

低温冻害等逆境胁迫对农作物生长有极大的危害，我国每年因为植物逆境造成的损失以百亿元计，目前通常通过改进田间管理技术或使用化学农用制剂来应对这些逆境胁迫。但化学农用制剂的过度使用，逐渐暴露出利用率低、环境污染、食品安全等问题，对农业生产及生态环境造成了极大的负面影响，引起世界范围的广泛关注。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法，采取水培法，通过低温驯化、脱驯化、低温处理三个阶段提高了烟叶幼苗的抗冻性，解决了目前寒冷地区烟草抗冻能力不足的问题，对冷寒烟区烟叶生产稳定发展、烟农持续增收具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法，步骤如下：

1)将烟草种子置于含有网格缝隙的育苗海绵上，每个网格缝隙点入3粒种子，点种完毕后覆盖上锡箔纸，使种子保持于黑暗环境中培养至种子萌发，期间每2d浇灌一次超纯水，每次浇灌至纯水液面高于育苗海绵底面；

2)种子萌发周期大约21d，种子萌发后立即移除锡箔纸培养成烟草幼苗，每1d浇灌一次1/4的营养液，使得营养液接触到带有网格的育苗海绵，待烟草幼苗长至4片叶片时，将烟草幼苗移植至装有平整蛭石的1.5L黑色塑料盆并每2d浇灌一次1/2的营养液，每次浇灌至营养液液面低于蛭石平面；

3)烟草幼苗生长至4片真叶时，将烟草幼苗移植至盛有营养液的5L水培盒中，每3d更换一次营养液，在更换营养液后第2d使用通气泵对水培盒中的营养液进行通氧，培养7d；

4)取烟苗依次进行低温驯化48h、脱驯化12-24h、低温处理72h后，移栽定植。

进一步，步骤1)中所述烟草种子在置于含有网格缝隙的育苗海绵前预先经10％过氧化氢(H₂O₂)消毒10min，随后超纯水冲洗并浸种8h。

进一步，步骤2)中所述移植的操作为：在移植过程中保持烟苗直立，烟叶不接触蛭石，保持烟苗根系的完整。

进一步，步骤4)中所述低温驯化条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃；

所述脱驯化条件为：昼/夜温度26-30/18-22℃；

所述低温处理条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃。

进一步，上述方法的环境条件为：光照强度为400μmol·m^-2·s^-1，昼/夜温度28℃/18℃，昼/夜时长14h/10h，湿度65％-75％。

进一步，营养液由A液100ml、B液50ml、C液5ml、铁盐溶液5ml混合后加入去离子水定容至5L后调节pH值至5.2-5.8得到；

所述A液由50.555g/L的KNO₃和118.075g/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O等体积混合得到；

所述B液每升含有49.294gMgSO₄·7H₂O和13.609gKH₂PO₄；

所述C液每升含有2.782gH₃BO₃、1.979gMnCl₂·4H₂O、0.230gZnSO₄·7H₂O、0.097gNa₂MnO₄·2H₂O和0.075gCuSO₄·5H₂O。

进一步，铁盐溶液中含有5.561gFeSO₄·7H₂O和7.485gEDTA·Na₂，配置营养液前所述铁盐溶液保存于4℃的冰箱中，其中铁盐溶液配制过程中将FeSO₄·7H₂O和EDTA·Na₂分别溶于水后再进行混溶。

进一步，营养液调节pH值的操作为以0.1mmol/L的NaOH和/或HCl调节。

本发明的有益效果在于，本发明驯化—脱驯化—再驯化的过程可以类比为人体接种疫苗—获得免疫力—免疫力下降再次补种疫苗的过程。现代医学已经证实人体可以通过接种疫苗来获得特定的免疫能力，因此通过适当的胁迫锻炼来提升对逆境胁迫的抗性正在成为植物学研究的热点领域。从接种疫苗获得抵抗力到需要再次补种疫苗的这段时间便与植物脱驯化过程相类似，而对这一过程的时间长短的把握是关乎植物对外界逆境胁迫抗性强弱的关键。众所周知，人体具有免疫记忆能力。而已有的研究同样表明拟南芥关键酶基因P5CS1的转录表达在再次响应盐胁迫是具有“记忆”功能。根据前人的研究结果和本发明所得到的结论可以推断，植物响应低温胁迫也有类似于人体免疫系统的应答机制，并能够通过驯化与适当的脱驯化相结合来锻炼这种“记忆”能力，从而在自然状态下提升植株抗冻性而不依靠人工施用其他外源物质，进而实现绿色农业这一全球性命题的目的。

本发明12至24h的脱驯化对烟苗再次经受低温时其抗逆相关基因表达量有所提高，从而促进植株的氧化还原及渗透调节平衡保持稳定。相对含水量、相对电导率及其他多个生理生化指标有随脱驯化时长的增加而改变的趋势，激活或抑制了一些与低温胁迫相关的关键基因表达。驯化使得植物NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70等抗逆相关基因在脱驯化的短暂恢复后得以保持较高的表达量从而提升氧化还原及渗透调节能力从而保护植物组织和细胞，以维持正常生长。而在恢复正常生长条件一段时间后，烟株主要经济性状虽小于正常生长处理，但无显著差异。对越冬作物避免短时回暖影响驯化效果和通过驯化避免春播作物遭遇短时降温的危害提供了一定的依据与探索途径。

附图说明

图1为本发明实施例2时长筛选试验烟草幼苗叶片相对电导率结果图；

图2为本发明实施例2时长筛选试验烟草幼苗叶片SPAD值结果图；

图3为本发明实施例2时长筛选试验烟草幼苗叶片SOD酶活性结果图；

图4为本发明实施例2时长筛选试验烟草幼苗叶片MAD含量结果图；

图5为本发明实施例3不同时长脱驯化处理对烟草幼苗表型的影响结果图；

图6为本发明实施例6不同时长脱驯化处理对烟草幼苗相对含水量的影响结果图；

图7为本发明实施例7不同时长脱驯化处理对烟草幼苗相对电导率的影响结果图；

图8为本发明实施例8不同时长脱驯化处理对烟草幼苗光合色素含量的影响结果图；

图9为本发明实施例10不同时长脱驯化处理对烟草幼苗根系活力的影响结果图；

图10为本发明实施例11不同时长脱驯化处理对烟草幼苗抗氧化酶活性的影响结果图；

图11为本发明实施例11O₂ ^-定位染色结果结果图；

图12为本发明实施例12不同时长脱驯化处理对烟草幼苗ASA-GSH循环相关物质的影响结果图；

图13为本发明实施例14不同时长脱驯化处理对烟草幼苗MDA和超氧阴离子含量的影响结果图；

图14为本发明实施例15不同时长脱驯化处理对烟草幼苗叶片目标基因相对表达量的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例于河南农业大学品质生态实验室人工气候室内进行，环境条件为：光照强度为400μmol·m^-2·s^-1，昼/夜温度28℃/18℃，昼/夜时长14h/10h，湿度65％-75％。

选取广泛种植的红花烟草品种K326，种质资源由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。

各指标测定工具及仪器为：皮尺、千分位电子天平、烘箱、电导仪、纯水机、Spark多功能微孔板检测仪(瑞士TECAN公司)、超净工作台、研钵、高压灭菌锅、高速冷冻离心机(德国Eppendorf国际贸易有限公司)、荧光定量PCR仪等。

所用Hoagland营养液为实验室自配，试剂均从天津市科密欧化学试剂有限公司购买，具体配方为：A液100ml、B液50ml、C液5ml、铁盐溶液5ml，混合后加入去离子水定容至5L后以0.1mmol/L的NaOH和/或HCl调节pH值至5.2-5.8

A液由50.555g/L的KNO₃和118.075g/L的Ca(NO₃)₂·4H₂O等体积混合得到，B液每升含有49.294gMgSO₄·7H₂O和13.609gKH₂PO₄，C液每升含有2.782gH₃BO₃、1.979gMnCl₂·4H₂O、0.230gZnSO₄·7H₂O、0.097gNa₂MnO₄·2H₂O和0.075gCuSO₄·5H₂O，铁盐溶液中含有5.561gFeSO₄·7H₂O和7.485gEDTA·Na₂，配置营养液前铁盐溶液保存于4℃的冰箱中，其中铁盐溶液配制过程中将FeSO₄·7H₂O和EDTA·Na₂分别溶于水后再进行混溶。

实施例1

提高烟叶幼苗抗冻性的方法，步骤如下：

1)烟草种子预先经10％过氧化氢(H₂O₂)消毒10min，随后超纯水冲洗并浸种8h，随后将烟草种子置于含有网格缝隙的育苗海绵上，每个网格缝隙点入3粒种子，点种完毕后覆盖上锡箔纸，使种子保持于黑暗环境中培养至种子萌发，期间每2d浇灌一次超纯水，每次浇灌至纯水液面高于育苗海绵底面；

2)种子萌发周期大约21d，种子萌发后立即移除锡箔纸培养成烟草幼苗，每1d浇灌一次1/4的营养液，使得营养液接触到带有网格的育苗海绵，待烟草幼苗长至4片叶片时，将烟草幼苗移植至装有平整蛭石的1.5L黑色塑料盆中，在移植过程中保持烟苗直立，烟叶不接触蛭石，保持烟苗根系的完整，每2d浇灌一次1/2的营养液，每次浇灌至营养液液面低于蛭石平面；

4)取烟苗依次进行低温驯化48h、脱驯化12-24h、低温处理72h后，移栽定植，低温驯化条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃，脱驯化条件为：昼/夜温度26-30/18-22℃，低温处理条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃。

实施例2

脱驯化时长筛选试验

为探究合理的脱驯化时长，预实验共设置7个处理，各处理均为低温驯化+脱驯化+低温，时长筛选试验共设置7个处理(表1)：(1)T1：低温驯化48h+不进行脱驯化+低温处理72h、(2)T2：低温驯化48h+脱驯化4h+低温处理72h、(3)T3：低温驯化48h+脱驯化6h+低温处理72h、(4)T4：低温驯化48h+脱驯化12h+低温处理72h、(5)T：5低温驯化48h+脱驯化24h+低温处理72h、(6)T6：低温驯化48h+脱驯化48h+低温处理72h、(7)T7：低温驯化48h+脱驯化72h+低温处理72h。各处理仅改变脱驯化时长，其余条件均保持一致，具体操作如实施例1步骤1)-3)。其中正常生长条件为：低温驯化条件为为：昼/夜温度(4±2/4±2)℃；脱驯化条件为：昼/夜温度(28±2/20±2)℃；低温处理条件为：昼/夜温度(4±2/4±2)℃。处理结束后测定烟草幼苗叶片相对电导率、相对含水量、SPAD、SOD酶活性、MDA含量以筛选合适的处理时间。

表1实施例2试验设计

时长筛选试验叶片相对电导率测定结果如图1所示。结果表明：相对电导率随脱驯化时间增长有先下降后上升的趋势。T1处理相对电导率最高，为78.94％，T5处理相对电导率达到最低，为22.35％，与其他处理呈现显著差异，24h的脱驯化使得植株再次经受冷害时其相对电导率明显优于其他处理，而过长时间的脱驯化则会使得相对电导率的上升。

SPAD值可以用于衡量植株叶片叶绿素含量，用于时间筛选试验当中可以较快得到各处理的叶绿素相对含量，并以此判断最优处理时长。试验结果如图2所示，SPAD值同相对电导率有相反的变化趋势，随脱驯化时间增长其值先上升后下降，于T5处理达到最高。T5处理与T4处理差异不显著，与其他处理差异显著。从T3处理SPAD值的13.15上升到T5处理SPAD值水平用时16h，而随脱驯化时间增长从T5水平下降到13.15则需要24至48h。说明长时间脱驯化的SPAD值单位时间变化速率远小于12h以下的脱驯化处理。

时长筛选试验叶片SOD酶活性测定结果如图3所示。结果表明SOD酶活性同SPAD值有相同的变化趋势，同样于T5处理达到最大值，相较于T1处理升高99.19％，相较T7处理升高43.42％。SOD酶活性保持较高水平时植物体能够保持较好的氧化平衡，保护膜系统不被过量的活性氧破坏，使得光合作用顺利进行，叶绿素能够继续合成，这可能是导致SPAD值保持较高水平的原因之一。

时长筛选试验中叶片丙二醛含量的变化如图4所示。MDA测定结果表现出先降低后升高的趋势，24h之内的脱驯化使得MDA含量逐步下降，但高于24h的脱驯化处理则使得MDA含量快速上升，且T6、T7处理差异不显著，表明短时间的脱驯化对植物体作用十分迅速，能够在短时间内产生，而过长时间的脱驯化则会使得驯化效果减弱甚至消失。

脱驯化时长筛选试验结果显示大多数处理的生理指标于4至8h的脱驯化处理中与相邻的处理差异不显著，因此于生长调控试验中设置脱驯化时长为6h的C1处理；保留各指标表现相对较好的12、24h脱驯化的C2、C3处理；72h脱驯化处理的测定指标相较于其他处理已十分接近未经脱驯化的处理T1，因此在调控生长试验阶段仅保留脱驯化时长为48h的处理C4。

实施例3

脱驯化时长调控幼苗生长试验

经过时长筛选试验后，正式试验共设置6个处理已显示幼苗抗冻性随时间的变化趋势，此外为说明脱驯化对低温逆境的影响程度，在时间筛选试验的基础上增设正常生长的烟苗处理N。处理包括：正常生长48h+不进行脱驯化+正常生长72h(N)、低温驯化48h+不进行脱驯化+低温处理72h(CK)、低温驯化48h+脱驯化6h+低温处理72h(C1)、低温驯化48h+脱驯化12h+低温处理72h(C2)、低温驯化48h+脱驯化24h+低温处理72h(C3)、低温驯化48h+脱驯化48h+低温处理72h(C4)。其中正常生长条件为：昼/夜温度(28±2/20±2)℃；低温驯化条件为为：昼/夜温度(4±2/4±2)℃；脱驯化条件为：昼/夜温度(28±2/20±2)℃；低温处理条件为：昼/夜温度(4±2/4±2)℃。以上条件除处理时间不同外，其余条件均保持一致。具体试验设计详见表2。

表2实施例3试验设计

经历2d冷驯化后和脱驯化后再经历3d低温胁迫的烟草幼苗表型如图5所示。试验结果表明，在2d冷驯化后除CK自上而下第三片叶外，其他叶片均能保持挺立，但各叶片均在一定程度上发生萎蔫，表明各植株在经历2d低温环境后均受到一定的冷害侵袭。在脱驯化处理后再对烟株进行低温处理发现，CK、C4处理叶片萎蔫更加严重，且C4处理叶片明显变黄、皱缩。C1、C2、C3处理在不同时长脱驯化处理后未发生进一步萎蔫，甚至发生萎焉的程度有所减轻。

实施例4

较长生育期幼苗生长状况对比试验

设置生长调控试验14d后的幼苗生长对比试验，以期从较长的生育期的角度说明脱驯化时长对烟草幼苗生长的调控效果。该部分共设置3个处理(表3)：(1)L0：生长调控试验中的CK处理在处理结束后继续对烟草幼苗进行7d和14d的4℃低温处理；(2)L1：生长调控试验中的C3处理在处理结束后保持正常生长状态7d和14d；(3)L2：生长调控试验中的N处理在处理结束后继续保持正常生长状态7d和14d。以期望通过L0与L1、L2的对比说明低温对植物生长的影响，通过对比L1与L2说明移栽期24h脱驯化在较长生育期后对烟株生长的影响。该部分主要测定烟株的叶长、叶宽、叶面积、干重、鲜重等主要经济指标。

表3实施例4试验设计

处理时低温人工气候室参数除昼/夜温度(4/4±2℃)外其余条件均保持不变。除测定光合参数的指标外(保证于上午09：00-11：00进行测定)，为避免光照对实验的影响，设置7:00至21:00为人工气候室光照时间，每日光照14h。处理日早上8:00将烟苗移至低温人工气候室，使得各取样时间点均处于白天，从而避免光照差异对试验结果产生影响。

L0处理7d的烟苗相较于调控试验阶段萎蔫进一步发生。14d时L0部分烟苗已经开始严重萎蔫变黄甚至停止生长，因此对于L0处理仅测定了7d时烟苗的生长发育状况。测定结果如表4所示。可以发现，7d后除L0表现为明显的生长发育受阻外，L1、L2处理在经历脱驯化后的正常生长过程中的单叶重无显著差异，相较于L0处理分别提升226.54％和247.04％。L1、L2处理最大叶长无显著差异，相较于L0处理分别提升28.96％和22.10％。最大叶宽无显著差异，相较于L0处理分别提升40.88％和45.34％。最大叶面积无显著差异，相较于L0处理分别提升81.14％和76.69％。7d后各处理农艺性状除最大叶面积外其他指标在平均数水平上L2处理高于L1处理。调控试验结束后再生长发育14d后L1、L2处理无显著差异，各测定指标均显示为平均数水平上的L2处理高于L1处理。

表4不同生育期烟株农艺性状

SPAD值可以反映植物叶绿素含量，叶绿素含量不仅能够体现植株的生长状况，其降解产物还是烤烟重要的香气成分。因此通过测定较长生育期后的SPAD值来反映烟草幼苗生长状况有一定的实际意义。同样因L0处理的烟苗在14d时其叶片已经开始严重萎蔫变黄甚至停止生长，因此对于L0处理仅测定了7d时叶片SPAD值。测定结果如表5所示。可以看出L0处理SPAD值相较于幼苗早期甚至有所下降，而L1、L2处理的SPAD值差异不显著，L1、L2处理相较L0处理叶片SPAD值均显著提高。以上结果表明幼苗在脱驯化后的处理中表现出和正常生长幼苗相同的SPAD值，从而正常进行光合作用并维持植物正常生长。

表5不同生育期烟株SPAD值

为进一步反映植株生长状况，遂对植株叶片相对电导率进行测定。同样由于14d低温处理的植株萎蔫严重甚至死亡，L0处理14d的相对电导率不进行测定。测定结果如表6所示。测定结果表明，与农艺性状和SPAD值不同，相对电导率在L0处理中较高，同L1、L2处理差异显著。延长7d的生育期时L1、L2处理相对电导率相较于L0下降78.54％和78.31％，L1、L2处理相对电导率总体维持较低水平。延长14d生育期后，L1、L2处理的差异仍不显著，说明脱驯化未对植物细胞进入正常生长发育后造成不可逆的损害，能够与正常生长植株一样保持较好的生长发育状态。

表6不同生育期烟株相对电导率

实施例5

实施例3中烟草幼苗农艺性状及生物量的测定

农艺性状及生理特性选取整株烟苗进行测定，叶片生理及分子指标选取自下而上完全展开的第2、3片叶为混合样品，根系指标选取生物活性较高的距离主根最远、分生能力最强的部分进行测定。同一处理不同植株为1个重复，每个处理设置3次重复。取样时将取下的样品迅速用锡箔纸包好并投入液氮中快速冷冻保存，取样结束后迅速将样品移入超低温冰箱(-80℃)以备后续测定使用。

采用皮尺进行测定。取烟叶样品前，将烟株洗净并用滤纸吸干水分后充分伸展并平铺于水平台面，测量从烟茎最高点到主根最远点的直线距离为株高。选取自下而上完全展开的第3片叶分别测定最大叶长(cm)、最大叶宽(cm)，并计算最大叶面积(cm²)，计算公式为最大叶面积＝最大叶长*最大叶宽*0.6345，其中0.6345为叶面积系数。

采用千分位电子天平进行测定。生物量包括：株鲜重、株干重。干重测定方法为：将烟株洗净吸干水分测定结果即为烟株鲜重。待鲜重测定完毕，将烘箱设置为105℃对待测样品进行杀青，15min后设定烘箱温度为85℃将样品烘干至恒重，此时测定样品重量即为干重。

低温胁迫会限制植株的正常生产从而导致株高和生物量的降低。株高和生物量的测定结果如表7所示。正常生长的处理在株高、株鲜重、株干重三个方面均为最高，CK处理的测定结果在以上三个中均处在最低水平。株高方面，各经历低温胁迫的处理无论是否经历过脱驯化均显著小于N处理，其中CK处理下降幅度最大，达到26.98％，C4处理下降较小，为17.17％。株干重方面，经历脱驯化的植株有明显的上升趋势，CK处理最低，C4处理最高，分别相较于N处理下降46.43％、34.82％。株干重同株鲜重变化趋势基本相同，随脱驯化时间增加呈现出波动上升的趋势，C1至C4处理均与正常生长的烟草幼苗无显著差异，但均与CK呈显著差异，其中株干重最高的C4处理相较于CK上升38.11％。

表7不同时长脱驯化处理对烟草幼苗农艺性状的影响

处理	株高(cm)	株鲜重(g)	株干重(g)
				N	27.77±2.04a	18.31±1.76a	1.75±0.43a
CK	20.10±1.35b	8.88±1.35c	1.26±0.19b
				C1	21.00±1.51b	9.16±0.71c	1.37±0.18ab
C2	21.50±1.57b	9.56±1.08bc	1.47±0.10ab
				C3	22.00±0.62b	10.31±1.04bc	1.41±0.25ab
C4	21.90±1.23b	11.19±0.33b	1.67±0.17ab

叶片的长短及大小是衡量烟草经济价值的重要指标。试验测定的烟株叶长、叶宽、叶面积如表8所示。可以看出正常生长的N处理在叶长、叶宽、叶面积上均显著大于其他各处理，而经历低温的各处理总体上不存在显著差异，但可以看出CK处理的叶长、叶宽、叶面积最低，而后随着生长时间的增长各处理的叶长、叶宽、叶面积呈现波动上升的趋势。同时标准差的增大表明生长时间越长，植株个体对于脱驯化时间和生长发育的差异愈发明显。

表8不同时长脱驯化处理对烟草幼苗最大叶长、最大叶宽和最大叶面积的影响

处理	最大叶长(cm)	最大叶宽(cm)	最大叶面积(cm<sup>2</sup>)
				N	19.42±1.01a	12.90±2.13a	159.76±33.65a
CK	14.78±1.06b	7.41±1.06b	69.12±6.49b
				C1	15.48±0.95b	8.04±0.71b	78.99±8.79b
C2	16.62±1.03b	9.21±0.37b	97.21±8.96b
				C3	16.52±1.79b	8.68±1.71b	89.74±7.34b
C4	16.37±0.67b	9.18±1.49b	95.75±18.20b

实施例6

实施例3中烟草幼苗相对含水量的测定

采用千分位电子天平进行测定单叶相对含水量。选择每个样本自下而上完全展开的第2片叶进行测定。其中W_f为样品鲜重，W_d为样品干重，W_t为将鲜烟样放入纯水中浸泡至充分饱和后的重量。

相对含水量是衡量植物抗冻能力的关键性指标之一。试验测定的相对含水量结果如图6所示，测定结果可以发现相较于被低温大幅度限制的株高，作为抗冻性指标的相对含水量随脱驯化时间增长出现了先上升后下降的趋势，其中C1处理相对含水量最低，与CK差异不显著。C3处理的相对含水量达到最高，与N处理差异不显著，而至C4处理开始相对含水量有一定幅度的下降，但没有明显差异。C3处理相较CK、C1相对含水量分别提高33.38％和38.15％。

实施例7

实施例3中烟草幼苗叶片相对电导率的测定

采用电导仪利用浸泡法进行测定。取每个样本自下而上完全展开的第3片叶进行冲洗并用滤纸吸干水分，剪成不含叶脉的条状，称取0.1g置于试管中。其中R1为试管中样品被纯水完全浸泡12h后其浸提液电导率；R2为沸水浴30min并冷却摇匀后其浸提液电导率。

相对电导率可以反映植物受到逆境胁迫的危害程度。如图7所示，处理间均存在显著性差异。在低温胁迫的处理中，随脱驯化时间增长，相对电导率呈现出先下降后上升的趋势。其中CK处理相对电导率最高，是N处理的5.19倍。C3处理的相对电导率最低，相较于CK下降64.80％，但仍是N处理的1.83倍。并于48h的脱驯化处理时相对电导率开始上升，但测定结果仍显著小于24h以下时长的脱驯化处理。

实施例8

实施例3中烟草幼苗光合色素含量的测定

时长筛选试验中叶绿素含量测定由SPAD-502叶绿素测定仪(日本Konica公司)，于处理结束后在每个叶片主脉两侧中部测定，每次测定重复3次。生长调控试验中取新鲜植物叶片0.5g剪碎-置于25mL刻度试管-加95％乙醇25mL，在暗处保存24小时，以95％的乙醇为空白，分别在波长为665、649、470nm处比色，采用混合样品测定叶片叶绿素、类胡萝卜素含量。

N处理总叶绿素及类胡萝卜素含量分别为51.30、4.6207mg·g^-1。其他不同处理的叶绿体色素含量见图8。结果显示总叶绿素及类胡萝卜素含量分别处于5.91至10.21mg·g^-1之间和0.50至1.25mg·g^-1之间。C3处理总叶绿素含量及类胡萝卜素含量达到峰值，总体上随脱驯化时间增长呈现先升后降的趋势，且N处理总叶绿素及类胡萝卜素含量均显著高于经过低温胁迫的各处理。其中C3处理叶绿素与类胡萝卜素含量与CK、C1存在显著差异。处理C1至C4相较CK总叶绿素含量分别上升17.87％、45.69％、72.90％和44.26％；相较N处理分别下降87.47％、79.12％、73.08％和82.59％。类胡萝卜素含量方面，经过一定时长脱驯化处理的烟株相较未经脱驯化处理的烟株分别上升13.26％、88.72％、143.32％和57.36％；相较N处理分别下降98.87％、98.12％、97.57％和98.43％。

类胡萝卜素和总叶绿素的比值(Car/Chl)常用来衡量植株抗逆性。经计算各处理Car/Chl如表9所示。结果表明Car/Chl随脱驯化时间变化的规律与植物叶绿体色素含量变化趋势基本相同，于经过24h脱驯化处理的植株中比值最高。说明冷驯化后的脱驯化时长能够影响植株叶绿体色素含量且低温会使叶绿体色素含量快速下降，总叶绿素的降解速度大于类胡萝卜素。通过比较叶绿素a与叶绿素b的比值可以发现，经历低温的处理其比值大幅度降低，正常生长的处理比各处理叶绿素a与叶绿素b的比值平均高约5倍，说明低温对胁迫对叶绿素a的影响大于叶绿素b，随着脱驯化时间的增长，对叶绿素a破坏更为严重的现象有所缓解。

表9总叶绿素与类胡萝卜素和叶绿素a与叶绿素b的比值

实施例9

实施例3中烟草幼苗叶片光合参数测定

叶片光合参数采用Li-6000(LI-COR，美国)便携式光合作用测定仪于试验处理结束后进行测定。测定时间为上午09：00-11：00。为保证测定时间，遂对测定该指标的烟株处理时间进行特殊安排。设置8:00至22:00为人工气候室光照时间，每日光照14h。其中处理日前一天晚21:00将处理C2移入人工气候室，早上05：00将C1处理移至人工气候室，早上9:00将CK、C3、C4处理移至低温人工气候室，使得烟苗光合参数测定时间为上午09：00-11：00，从而避免光照及测定时间对试验结果产生影响。

脱驯化时长对烟草幼苗光合参数的影响如表10所示。通过光合参数可以直观的反映植物光合作用的强弱从而体现植物受到低温危害的程度。试验结果显示适宜时长的脱驯化处理植株的净光合速率(Pn)随时间增长有逐步上升的趋势，其中最高的C2处理相较于CK处理上升70.45％，且与C3、C4处理差异不显著，但总体上仍小于正常生长的处理N。蒸腾速率(Tr)方面则有随时间先升高后降低的趋势，其中C1处理最高与N处理差异不显著，相较于CK处理上升116.06％。而气孔导度(Gs)和胞间二氧化碳浓度(Ci)则显示出与前两者相反的规律，两项指标分别于C2和C3处理达到最小值，分别相较于CK处理下降20.69％、13.74％。水份利用效率(WUE)则在整体上呈现一定的波动性。总体上适宜的脱驯化时长对提升植株光合参数有一定的促进效果，但是未能完全免除低温胁迫对植物的伤害。

表10不同时长脱驯化处理对烟草幼苗光合参数的影响

实施例10

实施例3中烟草幼苗根系活力的测定

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系样品的植株根系活力。

根系活力是反映植物体生长状况的重要指标之一。试验表明(图9)，正常生长的烟草幼苗根系活力分别相较于CK、C1、C2、C3和C4处理上升108.19％、101.50％、91.84％、102.15％和88.00％。正常生长的处理与其他各个经历低温胁迫的处理呈显著差异，各经历低温胁迫的处理间根系活力差异不显著，表明本试验条件下根系活力未受到脱驯化时长的显著影响，但对比未经历脱驯化的烟草幼苗根系活力呈波动上升趋势，在48h脱驯化的处理中达到最高，相较于经历低温胁迫的C1、C2、C3、C4分别提升10.74％、7.18％、2.05％、7.53％。

实施例11

实施例3中烟草幼苗氧化还原酶活性的测定

分别采用氮蓝四唑光还原法、愈创木酚法测定混合样品的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及过氧化物酶(peroxidase，POD)活性；采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)染色法对烟草幼苗叶片进行定位叶片·O₂ ^-。

超氧化物歧化酶(SOD)通过清除细胞内多余的超氧根阴离子(·O₂ ^-)来使细胞免受低温导致的氧化损伤。SOD催化产物H₂O₂等则主要通过POD清除。一般情况下酶活性越高，细胞内·O₂ ^-含量就越低，植物抗逆性越强。SOD、POD酶活性测定结果见图10。结果显示SOD酶活性随脱驯化时间增长呈先上升后下降的趋势，酶活性在脱驯化6至24h的处理中活性最高，与CK呈显著差异，平均增幅80.61％，且与N处理无显著差异。48h脱驯化处理的幼苗酶活性相较于24h脱驯化处理开始降低，且与CK差异不显著。POD测定结果显示C2、C3处理酶活性差异不显著，且C3处理与N处理之间无显著差异。C1、C4处理相较其他处理酶活性提高较快，与N处理相比分别提高53.54％和66.05％。

氮蓝四唑(NBT)可以将细胞内的·O₂ ^-染成蓝色，直观的显示叶片O₂ ^-含量并以此反映SOD活性。NBT染色结果显示(图11)，不同处理中均存在·O₂ ^-，但含量不尽相同。处理C1、C2、C3蓝色部位主要位于叶脉及靠近叶柄处，叶尖未显示出过多的着色部位，总体来说蓝色部分相对较少。而CK和C4蓝色部位则分布于整个叶片，蓝色部分相对较多。这与之前的酶活性测定结果存在一致性。进一步说明适宜时长的脱驯化处理能够显著提升幼苗SOD酶活性，降低叶片·O₂ ^-含量，减少低温导致的氧化损伤。而过长时间的脱驯化处理则会造成驯化效果减弱，SOD酶活性下降，·O₂ ^-含量上升。

实施例12

实施例3中烟草幼苗ASA-GSH循环相关物质测定

采用苏州科铭生物技术有限公司提供的试剂盒，根据说明书指示测定抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性，谷胱甘肽还原酶(GR)活性、还原型抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量。

ASA-GSH循环相关物质主要包括抗坏血酸过氧化物酶(aseorbateperoxidase,APX)、还原型抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)，以上物质是构成植物体非酶促氧化还原系统的关键。ASA-GSH循环相关物质测定结果如图12所示。结果显示APX及AsA具有良好的一致性，均表现出随脱驯化时间增长而升高的趋势，在C4处理达到最大值。APX活性方面C4处理活性与N处理差异不显著，其活性达到N处理水平，与CK处理相比上升104.97％。AsA含量方面，C4处理相较CK处理AsA含量分别上升118.84％。GR和GSH两者具有良好的一致性，但其趋势则有别于APX及AsA。实验结果显示，经历脱驯化的植株其GR活性和GSH含量无显著差异，且均显著小于正常生长的N处理。不过在平均数水平上，随着脱驯化时间的增长GR活性和GSH均有所上升，C4处理相较于CK处理分别上升10.25％和14.50％。

实施例13

实施例3中烟草幼苗渗透调节物质含量的测定

分别采用硫酸蒽酮比色法、酸性茚三酮法、考马斯亮蓝G-250法测定混合样品的可溶性糖含量、脯氨酸(proline,Pro)含量及可溶性蛋白含量。

在逆境胁迫下，植株通过累积渗透调节物质来应对胁迫。一般情况下胁迫程度越重，渗透调节物质含量越高。如表11所示，叶片可溶性糖含量在12h脱驯化的处理中达到峰值，与CK、C1处理差异显著且分别提高54.12％、95.24％，和C3、C4处理差异不显著。此外与C2、C3处理相较于N、C1处理的可溶性糖含量差异显著，分别提升472.09％、45.56％和418.60％、31.95％。以上结果表明，脱驯化时长能够显著影响植物再次经受冷害时可溶性糖含量，且随脱驯化时间增长呈现出先升高后降低的趋势。

表11不同时长脱驯化处理对烟草幼苗渗透调节物质的影响

经过12h以上脱驯化处理的幼苗脯氨酸含量差异不显著，且与处理N之间差异同样不显著，但均显著小于CK、C1处理。其中脯氨酸量最低的C3处理相较于CK处理降幅为67.42％大于N处理的降幅65.17％。说明幼苗受到冷害的程度较CK相比有所缓解，脱驯化能够影响植物体脯氨酸含量，但更长的脱驯化时间对脯氨酸含量影响较小。

可溶性蛋白含量与可溶性糖含量类似，在较长时间脱驯化的处理中显现出较高水平。其中C4处理可溶性蛋白含量最高，C3处理次之。相较CK处理分别提高107.84％、58.82％，并且C4处理CK、N均呈现显著差异，C3处理与N处理呈显著性差异。

实施例14

实施例3中烟草幼苗丙二醛含量的测定

采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid method)法测定混合样品的MDA含量。

非生物胁迫会导致植株产生氧化应激反应从而提升叶片丙二醛含量。如图13所示，在所有低温胁迫处理中烟草幼苗MDA含量随脱驯化时长呈先降低后升高的趋势。叶片MDA含量C1、C2、C3处理与N处理无显著差异。N处理相较于CK和C4处理MDA含量分别下降24.31％和43.79％。C2处理MDA含量最低，与CK、C4处理差异显著，并相较于CK和C4处理MDA含量分别下降60.97％和71.01％，降幅均大于N处理。同样C3处理相较于CK和C4处理MDA含量分别下降34.34％和51.23％，降幅也大于N处理。此外MDA含量与SOD酶活性有不同的变化趋势，在经历低温胁迫的处理中呈现出先下降再升高的趋势，但与相对电导率存在一定的正相关关系。以上数据说明短时间的脱驯化有利于烟草幼苗植株抗氧化系统较快响应下次低温胁迫，从而提升抗寒性。但过长时间脱驯化会对烟草幼苗的冷驯化效果产生不利影响。

烟草幼苗超氧阴离子含量测定

采用羟胺氧化法测定超氧阴离子含量。将0.5g烟叶样品用1.5ml65mM的磷酸钾(pH7.8)匀浆，5000r/min离心10分钟。在25℃水浴锅中放置20分钟后，向混合物中加入8.5mM的磺胺和3.5mM的α-萘胺，再25℃反应20分钟后，与530nm处读取水溶液中的吸光度，之后根据标准曲线计算O₂ ^-含量。

实验结果如图13，超氧阴离子同样会在低温胁迫时快速积累，从而影响植株的正常生长发育。试验结果表明，超氧阴离子的变化趋势与MDA的变化趋势基本一致，但是总体变化幅度较小。正常生长的植株超氧阴离子含量保持较低水平，与持续低温胁迫处理相比降低47.45％，植株氧化平衡维持较好。在经历脱驯化的处理中，C3处理中的超氧阴离子含量达到最低值，相较于正常生长的处理无显著差异，相较于始终经受低温胁迫的CK处理下降51.95％。C4处理的超氧阴离子含量快速上升，与CK、C1处理无显著差异。

实施例15

实施例3中烟草幼苗关键基因荧光定量PCR的测定

荧光实时定量PCR采用SYBRGreen法，具体步骤如下：

(1)提前将提取所用的研钵，离心管，DEPC水等用高温高压灭菌锅灭菌并置于超净工作台内。正式试验前对超净工作台进行紫外光消毒并通风，并将研钵和离心管进行预冷1h以上。

(2)总RNA的提取：烟草叶片RNA利用TRIpure进行提取。

(3)拷贝DNA(cDNA)的合成：采用cDNA合成试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，

II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper))进行。

(4)Real Time PCR

1.引物的设计与合成

利用NCBI数据库中找寻烟草目标基因的基因序列。以NtL25为内参基因，利用NCBI-BLAST为所选目标基因(NtDREB1、NtbHLH、NtNAC、NtCDPK)设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物，设计原则为：每条引物碱基数在18-23bp，产物长度150-250bp，退火温度60-70℃，GC含量为40％-60％。引物序列如表12；

表12 qRT-PCR引物序列表

2.Real Time PCR反应液配制

采用10μL反应体系，在超净工作台中以Real Time PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，AceQ^TM qPCR

Green Master Mix)于冰上配制PCR反应液；

3.将步骤2所得溶液进行Real Time PCR反应。

以上农艺性状及生理特性测定遵照YC/T 142-2010标准执行。生理指标采用Spark多功能微孔板检测仪，依照使用说明及试验设定相应参数进行检测。关键基因荧光定量应用相应试剂盒于超净工作台操作，并使用荧光定量PCR仪进行检测。

本次试验所进行荧光定量PCR的NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70基因都是与烟草逆境胁迫相关的基因，其表达量的高低能够在一定程度上说明脱驯化时长对烟草幼苗抗逆性的影响。以上4个基因的相对表达量如图14所示。参考N处理和CK处理可以发现，试验所测定的4个基因在受到低温胁迫时均为正反馈基因，相对表达量分别提升6.84倍、5.42倍、2.73倍和4.45倍。NtNAC、NtHSP70两个基因随着脱驯化时间的增加，其相对表达量显示出升高、降低再升高的趋势，均在C3处理中相对表达量达到最低，且与N处理差异不显著。其相对表达量分别相较于N处理下降4.27倍和3.39倍。NtbHLH的相对表达量则显示出随脱驯化时间增长而升高的趋势。相对较短时间的脱驯化处理的相对表达量均处于较低水平，且与N处理差异不显著。NtCDPK与其他几个基因相对表达量的趋势有所不同，其他三个目标基因在24h的脱驯化处理其相对表达量相较于CK均有所降低，而NtCDPK在该处理中则有所升高，其表达量相较于CK处理上升3.46倍，而后又在48h的脱驯化处理中下降，随脱驯化时长的不同其表达量相较于其他基因更具多样性。

由上实施例可知，低温是植物生长过程中所面对的主要胁迫之一，对植物生长有着显著的抑制作用。若植物一直存在于寒冷环境中这个过程应当被视为低温胁迫，而只有在一定周期的回暖后，植物再次接触低温环境才能验证其驯化的效果。通过脱驯化时长筛选试验发现，不同脱驯化时长将会影响到烟草幼苗再次进入低温环境时的相对电导率、SPAD值、超氧化物歧化酶活性和MDA含量。通过分析发现，4和8h的脱驯化处理差异不显著，72h的脱驯化使得植株驯化效果几乎完全消失。

株高和生物量的积累是反映作物产量的关键指标。低温导致植物生长变缓，生长量及干物质积累量均会降低，其减少量与胁迫程度呈现正相关。实施例结果表明，脱驯化时长对株高变化无显著影响，但冷害可以显著的限制植物株高的增加，经受低温胁迫的烟草幼苗株高相较于N处理平均下降19.93％。株鲜重、株干重在经历低温胁迫后，其测定结果均低于正常生长的处理，同样表明烟苗生长受到了抑制，干物质积累停滞。同时呈现出随脱驯化时间增长而逐渐增大的趋势，这可能是因为在处理进行的过程中植株仍然保持一定程度的营养生长，从而导致C4处理在以上两方面测定结果相对较大，特别是株鲜重与多个处理都呈现显著差异。结合试验涉及的其他显示抗冻性指标，株高和生物量受到抑制的可能性是由于在寒冷环境中为保持正常生长需要消耗大量的能量，促使抗冻性物质产生从而使得植株营养生长受阻。同样的影响也产生在烟草作物最重要的叶片上。无论经历多长时间的脱驯化，低温胁迫对植株叶片的影响持续存在，各经历低温处理的烟苗其叶长、叶宽、最大叶面积均小于正常生长处理，而随着脱驯化时间的增长叶长、叶宽、最大叶面积呈现波动增长的趋势。

低温胁迫常导致植物细胞水分含量的变化，一方面低温使得植物根系吸水受到阻碍，另一方面低温也使得蒸腾作用发生异常，因此细胞脱水是常见的低温环境下植物细胞的死亡方式。通常情况下逆境胁迫会导致植物的相对含水量下降，甚至是在经过基因转化的烟草中仍会有一定程度的下降。上述实施例发现，相对含水量随脱驯化时长呈现出先升高后下降的趋势，温度快速变化对植株的生长有不利影响，使植物细胞水分保有能力会有所下降。适宜时长的脱驯化有助于植株保持较高的相对含水量，从而提升抗冻性。

膜系统是低温胁迫对于植物体侵害的首要作用目标，而相对电导率则能够反映植物膜系统的完整性，从而体现出植物抗冻性水平。已有的研究表明，低温胁迫程度与植物叶片相对电导率呈正相关关系，烟草叶片在梯度低温胁迫试验中同样遵循这一规律。试验结果表明，适宜时长的脱驯化有助于烟草幼苗保持相对较为稳定的膜系统，相对电导率随脱驯化时长有先降低后升高的趋势，同时也可以发现，即使C3处理的相对电导率在经历低温胁迫的处理中水平较低，但其测定结果仍然高于正常生长时的烟草幼苗，说明低温对叶片膜系统的破坏在一定程度上是不可逆的，从而导致相对电导率的上升。

低温胁迫程度的加深常伴随植株叶绿素含量的降低，同样弱光低温环境会使得同为茄科作物辣椒的LOC108740293、NCED3、ZDS、CA2基因表达量有所下调，因此植物受逆境胁迫的程度可以通过叶绿体色素含量来反应。试验结果显示，C3处理的两种叶绿体色素含量均达到最大值，随脱驯化时间增长呈先升后降的趋势。正常生长的烟草幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量均数十余倍的高于经历低温处理的各组烟苗，而前人研究表明低温会使得植物叶片叶绿素的合成受阻，降解速度加快，从而使得叶绿素降解为叶黄素和花青素，且该过程叶绿体所产生的代谢产物无法被重复利用进而使得植物叶片叶绿体色素含量下降，以上结论与上述实施例研究结果相一致。说明适宜时长的脱驯化会使得植株抗冻性有所提升，并保持较高水平的叶绿素含量，这有利于植物在低温环境中进行光合作用从而抵消低温对光系统的抑制，减轻过剩光能对细胞造成的伤害。

除了进行辅助光合作用外，相较于较为脆弱的叶绿素，保护其免受非生物胁迫的伤害是类胡萝卜素的另一个重要作用。类胡萝卜素含量及其与叶绿素的比值(Car/Chl)与总叶绿素含量有相同的变化趋势，除C1处理略低于CK外，其他处理的比值均高于CK甚至高于正常生长的烟草幼苗。Car/Chl大小变化的趋势说明，24h脱驯化的烟草幼苗不仅能维持较高水平的光合作用，还能通过大量合成类胡萝卜素以起到保护叶绿素免受低温胁迫的伤害。两种叶绿体色素的变化规律说明，脱驯化时长会对再驯化过程中类胡萝卜素和总叶绿素的生成速率产生影响，相同时间内类胡萝卜素含量变化的倍率大于总叶绿素。

低温胁迫下光合作用受到气孔及非气孔因素两方面的影响，其中气孔因素是因为气孔扩张阻力增加，非气孔因素是因为细胞二氧化碳浓度升高所导致。上述实施例光合参数测定结果显示，净光合速率方面有随脱驯化时间增长而上升的趋势，虽然在C2处理时达到最大值，但与长时间的脱驯化处理差异不显著；蒸腾速率在C1处理中达到最大值，这可能是由于其他处理测定时间均为上午09：00左右，此时环境温度相较于C1处理的测定时间上午11：00稍低。环境温度的差异可能是导致C1处理的蒸腾速率较高的原因。而水分利用效率(WUE)为净光合速率和蒸腾速率的比值，因此以上原因也是WUE产生波动性的原因。而气孔导度和胞间二氧化碳浓度虽有波动，但总体上与光合色素含量的测定结果一致，表明脱驯化时长对植株的光合作用有一定的促进作用但是无法抵消低温对光和系统的伤害。

根系活力的大小是植物吸收外界养分能力的直接反映，其数值大小对植株的生长状况和农产品产量起着决定性作用。大量研究表明，低温对植物根系生长有抑制作用，促使植物根系活力下降。上述实施例结果显示，N处理的根系活力最高且显著高于其他处理，其他经历低温的处理之间根系活力差异不显著。这可能是由于本发明采用的方法为水培法，试验过程中幼苗根系始终处于营养液中，而幼苗的叶片却完全暴露于外界空气当中。众所周知的是，水溶液的比热容较大，溶液的升温速度较为缓慢，根系所处的营养液脱离4℃环境后温度变化幅度较小，能够与脱驯化所需的28℃的室温环境保持相对较长一段时间的温度差。因此本发明中幼苗的根系与叶片不同，当植株幼苗从低温人工气候室中移出时，叶片可以快速接触到室温28℃的空气，但根系仍然长时间处于营养液中并伴随低温营养液缓慢升温，从而较长时间处于相对低温的环境，进而影响到植株脱驯化效果。以上可能是导致植物根系驯化效果不佳，经历脱驯化的处理与全程处于低温环境中的处理之间差异不显著的原因。

在植物遭遇胁迫后，抗氧化物酶活性会明显改变以适应逆境环境。SOD的活性是保障细胞活性氧代谢平衡的关键酶，其活性的升高有助于植株提升对寒冷的耐受力，减少低温导致的氧化伤害。上述实施例结果显示，各经历脱驯化处理的植株SOD酶活性均有所提升，与CK处理差异显著，与N处理差异不显著。6至24h的脱驯化处理相较于未经历脱驯化处理的植株能够显著提升SOD活性，帮助植物在应对低温胁迫时快速清除多余的·O₂ ^-以避免膜损伤。NBT染色结果同样显示C1至C3处理的·O₂ ^-含量较少，以上结果与SOD酶活性测定结果存在一致性。SOD催化产物H₂O₂等主要通过POD清除。实施例结果显示，其活性相较于SOD则显示出一定的滞后性，在C2处理中最低，此后逐步增长并在48h的脱驯化处理中达到最高，甚至显著高于N处理。以上结果说明相较于SOD，POD活性需要较长时间的脱驯化处理才能够有效提升，从而保持幼苗正常生长所保持的酶活性。因此适当的脱驯化有助于提升植株对低温条件的应激反应，并在寒冷环境中植株通过调控基因表达来激活抗氧化系统。但长时间的脱驯化会使这一过程的响应程度有所衰减。而关于POD酶活性的上升变化趋势仍值得进一步研究。

除酶促氧化还原系统外，植物体内还存在着以ASA-GSH循环为代表的非酶促抗氧化体系。·O^2-和H₂O₂能够通过APX消除，APX以抗坏血酸ASA作为供体在氧化抗坏血酸的同时能将过氧化氢还原成水。GR能够直接消除·O^2-，也可以消除自由基和一些有机物。因此APX和GR的含量是衡量植物在胁迫条件下的重要的生理指标。实施例结果表明，脱驯化时长对APX活性和AsA含量有显著影响，适宜时长的脱驯化有助于烟草幼苗再次进入低温环境时保持较高的APX活性和AsA含量，48h的脱驯化则会使得APX活性和AsA含量开始下降，但仍高于持续低温处理的烟草幼苗。但是值得注意的脱驯化时长处理下的烟草幼苗的GR活性和GSH含量无明显影响，且均小于正常生长的处理。但随着脱驯化时间的增长，GR活性和GSH含量有上升的趋势。以上结果表明脱驯化时长对APX活性和AsA含量大于GR活性和GSH含量，但总体上能够提升ASA-GSH循环相关物质的含量及活性，从而提升植株抗逆性。

低温除影响上述因素外，还会导致植物细胞渗透调节作用的失衡。渗透调节物质是植物体维持其体内细胞水分含量相对稳定，水势相对平衡的关键影响因素。植物体维持较高的渗透调节物质含量有助于使得细胞难于脱水，提升保持水分能力，从而获得较强的抗冻能力。

当植物面对胁迫时可溶性糖含量会随着环境条件的变化而产生显著差异。可溶性糖作为重要的渗透调节物质，低温对其在叶片中的含量影响大于茎和根，在低温环境条件中对维持植物细胞渗透平衡、保护各种酶类发挥着重要作用，此外可溶性糖还可以通过糖代谢作为各种生理生化反应的能量来源或前体物质，在植物应对逆境胁迫领域中有重要的研究意义。有研究表明转基因拟南芥通过提升蔗糖含量从而实现植株耐寒程度的提高。本发明发现，可溶性糖的变化趋势基本与叶绿体色素含量变化趋势相同。表明12h的脱驯化有利于植株在后续的胁迫中更好抵御寒冷，能够通过合成大量可溶性糖来维持细胞正常的生理状态。此外可溶性糖含量在脱驯化6h的处理中反而低于CK说明植物可溶性糖含量对瞬时的温度变化较为敏感，短时间内大幅度的温度波动会使幼苗响应胁迫的相关代谢途径发生异常，从而影响渗透调节物质的含量，进而降低植物抗逆性。另外可以推测的是，植物体中可溶性糖类可以作为响应低温胁迫的信号分子，其在低温环境中能够大量累积，并能够随着冷害加重进一步诱导其他渗透调节物质的合成。这也是短时间脱驯化对可溶性糖含量影响更为显著的原因。

脯氨酸是否是植物在逆境中主动合成从而提升抗逆性的讨论尚不统一。有研究表明非生物胁迫会导致植物体代谢紊乱，是逆境造成的损伤导致脯氨酸的积累。但也有报道认为，在逆境条件下植物通过主动合成脯氨酸来提升抗逆性。此外包含上述结论的其他许多研究均证实脯氨酸含量与冷害程度呈正相关关系。结果表明，经过12h以上脱驯化处理的植株脯氨酸含量能在再次经受冷害的过程中保持较低水平，该现象说明植物体内的渗透调节未被低温胁迫破坏，烟草幼苗不必通过大量合成脯氨酸来调节自身渗透作用。同时C1处理的脯氨酸含量仍同可溶性糖一样在相对短时间的温度快速变化的处理中达到最高。

可溶性蛋白含量是衡量逆境胁迫中蛋白质受损程度的重要因素，非生物胁迫会促使植物合成适应逆境的新蛋白质。可溶性蛋白含量的变化趋势与可溶性糖基本相同，呈现出随脱驯化时长的增加有明显的上升趋势。在试验处理范围内，造成该现象的原因可能和可溶性糖相同，经过适宜时长脱驯化的烟草幼苗与正常生长的植株相比含有较高的可溶性糖及可溶性蛋白含量，保护了植物细胞不被破坏，从而使得脯氨酸含量没有因细胞损伤而进一步积累。因此结合三组测定数据，可以发现12h以上的脱驯化处理的植株抗冻性相较CK处理有了一定程度的提升。

丙二醛(MDA)通常作为衡量植物受到氧化损伤程度的重要指标。低温条件下活性氧(ROS)会在植物体内大量累积，从而导致MDA含量的显著提高，对细胞内的氧化平衡产生影响。由图可知24h的脱驯化处理可以保持叶片细胞的相对完整以此维持较低的相对电导率水平，而MDA及超氧阴离子正是导致细胞膜系统被破坏的关键原因。MDA含量与SOD活性变化趋势存在负相关关系，与SOD活性变化趋势相反。同样的超氧阴离子含量也显示出相同的变化趋势，但达到最低水平的处理则为C3。此外·O₂ ^-的测定结果同NBT染色定位结果基本一致，表明脱驯化处理总体上会对以上两种物质的含量产生不同程度的影响。以上测定结果也基本可以印证叶片相对电导率在各处理中的变化趋势。经以上分析后可以得出结论，驯化后的植物保护酶系统对寒冷条件更加敏感，植物抗氧化系统得以激活，通过消除活性氧以抑制MDA的生成，从而避免细胞受到低温引起的氧化损伤，提升对低温胁迫的抵抗能力。

本发明以NtL25为内参基因测定了NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70以上4个与烟草抗逆性相关的基因。前人研究表明，在相同基因家族中，不同基因对于同种胁迫的相对表达量具有多样性。试验结果显示，N处理与CK处理相比，在低温胁迫条件下目标基因表达量均有所上升，其中NtNAC在实验条件下对低温相对敏感，相对表达量提升幅度最大，NtCDPK则对低温胁迫响应幅度相对较小，相对表达量提升幅度较低。NtNAC、NtHSP70的变化趋势相同，6h的脱驯化使得相对表达量升高，随后于C3处理达到最小值，此后随驯化时间的增加相对表达量有所提升，但其中的NtHSP70在经历脱驯化后其相对表达量始终低于CK处理，可能表明升温过程是对该基因驯化效果的重要影响因素。而经历6至24h的脱驯化处理，使得烟苗NtbHLH始终保持较低水平，只有经历了长时间(48h)的脱驯化处理，其相对表达量才会上升，bHLH作为能够激发APX的基因同APX的测定结果有良好的一致性。与以上基因不同的是NtCDPK在脱驯化后的低温处理中存在多样性，于C3处理达到最高，随后又快速降低，表明其对脱驯化时长更为敏感。综上所述，目标基因随脱驯化时长而表现出不同的变化趋势，但均显示出对脱驯化时长处理的敏感性。

烟苗移栽后存在因“倒春寒”现象而造成气温骤降后骤升的现象，不过随着生长发育期增长，环境温度逐步提升，受到“倒春寒”可能性也随之降低。通过对较长生长发育期的持续低温处理(L0)、经历脱驯化后正常生长处理(L1)和持续正常生长处理(L2)测定包括单叶重、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积的经济性状和反映植物生长及重要的香气前提物质的SPAD值以及反映细胞膜系统完整性的相对电导率发现，持续的低温处理会导致烟草幼苗的生长发育严重受阻甚至死亡，而经历适宜时长脱驯化及低温胁迫的植株在恢复正常生长环境后能够保持正常的生长状态，虽然在平均数水平上各指标低于L2处理，但不存在显著差异。结合生长调控试验，以上结果说明适宜的脱驯化时长有利于提升植株抗逆性，在此后恢复正常生长发育的过程中脱驯化则不会对植株造成负面影响。

通过目标基因荧光定量结果发现，经历不同脱驯化时长的烟草幼苗会使NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70等基因在再次经受低温胁迫时的表达量产生改变。同时试验结果证实多种受以上基因调控的抗逆性指标也随基因表达量的改变而在脱驯化过程中对植物抗逆性产生了影响。其中NAC家族基因表达有助于提升SOD酶相关基因表达量或激活细胞核中的特异性靶标，从而提升植物清楚活性氧的能力。bHLH类转录因子除有助于消除H₂O₂并降低MDA含量外还有助于提升植株的光合作用，同时其表达还有助于增强其他应激反应如SOD、APX等相关的基因表达。CDPK家族基因则被证实可以通过其表达提升植株如脯氨酸和可溶性蛋白等渗透调节物质的含量及保护酶系统的活性来提升植株抗逆性。而热激蛋白HSP70受到脱驯化的影响可能来自于两方面，一方面有报道表明4℃的低温能够促进HSP70的表达，而另一方面作为热激蛋白也存在受脱驯化回暖过程的影响的可能性。其表达同样有助提升脯氨酸含量及酶活性的同时降低MDA含量。如图所示，可以推测NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70等与温度胁迫有关的基因在驯化及脱驯化过程中受到外界环境的影响得到锻炼，在脱驯化过程中等待再次响应低温诱导，并于下次受到低温刺激时能够达到提升其表达量的效果。其中NtNAC主要激活植物体中的激活酶促还原系统，NtbHLH则综合促进酶促、非酶促两方面的氧化还原系统，分别提升植株SOD及APX活性，提升清除过量活性氧的能力，保持较低的超氧阴离子和MDA含量，以维持细胞的氧化还原平衡。NtCDPK、NtHSP70则主要参与细胞的渗透调节物质平衡，通过影响植株的可溶性糖及脯氨酸等渗透调节物质含量，保持植物细胞正常的渗透调剂平和，防止细胞膜系统被破坏，维持正常的光合作用及其他生命活动，以达到提升抗冻性保持植株正常生长的目的。而其他抗逆性指标含量的变化则可能受到除上述基因以外过程的影响，通过激活其他抗逆系统来抵御低温胁迫。

综上所述，适宜时长的脱驯化有利于烟草幼苗再次进入低温环境后提升其叶绿素含量、酶活性和渗透调节物质含量，降低对植物造成伤害的物质含量。过短时长的脱驯化使得植株频繁遭受温度变化而使得抗逆性降低，同样过长时间的脱驯化则会使得驯化效果有所减弱，从而对植株造成不利影响。

驯化—脱驯化—再驯化的过程可以类比为人体接种疫苗—获得免疫力—免疫力下降再次补种疫苗的过程。现代医学已经证实人体可以通过接种疫苗来获得特定的免疫能力，因此通过适当的胁迫锻炼来提升对逆境胁迫的抗性正在成为植物学研究的热点领域。从接种疫苗获得抵抗力到需要再次补种疫苗的这段时间便与植物脱驯化过程相类似，而对这一过程的时间长短的把握是关乎植物对外界逆境胁迫抗性强弱的关键。众所周知，人体具有免疫记忆能力。而已有的研究同样表明拟南芥关键酶基因P5CS1的转录表达在再次响应盐胁迫是具有“记忆”功能。根据前人的研究结果和本试验所得到的结论可以推断，植物响应低温胁迫也有类似于人体免疫系统的应答机制，并能够通过驯化与适当的脱驯化相结合来锻炼这种“记忆”能力，从而在自然状态下提升植株抗冻性而不依靠人工施用其他外源物质，进而实现绿色农业这一全球性命题的目的。

本发明通过较大的温度差对烟苗进行驯化—脱驯化—再驯化处理发现，12至24h的脱驯化对烟苗再次经受低温时其抗逆相关基因表达量有所提高，从而促进植株的氧化还原及渗透调节平衡保持稳定。相对含水量、相对电导率及其他多个生理生化指标有随脱驯化时长的增加而改变的趋势，激活或抑制了一些与低温胁迫相关的关键基因表达。说明在适当时长范围内的脱驯化处理对苗期抗冻性有促进作用。驯化使得植物NtNAC、NtbHLH、NtCDPK、NtHSP70等抗逆相关基因在脱驯化的短暂恢复后得以保持较高的表达量从而提升氧化还原及渗透调节能力从而保护植物组织和细胞，以维持正常生长。需要注意的是脱驯化有利于提升抗逆性，但在株高和干物质积累量方面低温造成的抑制作用却难以缓解。而在恢复正常生长条件一段时间后，烟株主要经济性状虽小于正常生长处理，但无显著差异。试验结果对越冬作物避免短时回暖影响驯化效果和通过驯化避免春播作物遭遇短时降温的危害提供了一定的依据与探索途径，而后续关于植物是否对低温胁迫有“记忆”能力以及哪些基因是再次响应低温胁迫的关键等问题仍值得进一步探讨。

Claims

1.一种提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，步骤如下：

2)种子萌发后立即移除锡箔纸培养成烟草幼苗，每1d浇灌一次1/4的营养液，待烟草幼苗长至4片叶片时，将烟草幼苗移植至装有平整蛭石的1.5L黑色塑料盆并每2d浇灌一次1/2的营养液，每次浇灌至营养液液面低于蛭石平面；

2.根据权利要求1所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，步骤1)中所述烟草种子在置于含有网格缝隙的育苗海绵前预先经10％过氧化氢消毒10min，随后超纯水冲洗并浸种8h。

3.根据权利要求1所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，步骤2)中所述移植的操作为：在移植过程中保持烟苗直立，烟叶不接触蛭石，保持烟苗根系的完整。

4.根据权利要求1所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，步骤4)中所述低温驯化条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃；

所述脱驯化条件为：昼/夜温度26-30/18-22℃；

所述低温处理条件为：昼/夜温度2-6/2-6℃。

5.根据权利要求1-4任一项所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，所述方法的环境条件为：光照强度为400μmol·m^-2·s^-1，昼/夜温度28℃/18℃，昼/夜时长14h/10h，湿度65％-75％。

6.根据权利要求1-4任一项所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，所述营养液由A液100ml、B液50ml、C液5ml、铁盐溶液5ml混合后加入去离子水定容至5L后调节pH值至5.2-5.8得到；

所述B液每升含有49.294gMgSO₄·7H₂O和13.609gKH₂PO₄；

7.根据权利要求6所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，所述铁盐溶液中含有5.561gFeSO₄·7H₂O和7.485gEDTA·Na₂，配置营养液前所述铁盐溶液保存于4℃的冰箱中。

8.根据权利要求7所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，所述铁盐溶液配制过程中将FeSO₄·7H₂O和EDTA·Na₂分别溶于水后再进行混溶。

9.根据权利要求6所述的提高烟叶幼苗抗冻性的方法，其特征在于，所述营养液调节pH值的操作为以0.1mmol/L的NaOH和/或HCl调节。