CN101974550B

CN101974550B - Rsv和rbsdv的rna干涉载体、构建方法及应用

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Publication number: CN101974550B
Application number: CN2010102761013A
Authority: CN
Inventors: 李莉; 李红伟; 王锡锋; 刘艳; 吴蓓蕾
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-11-01
Also published as: CN101974550A

Abstract

本发明涉及“RSV和RBSDV的RNA干涉载体、构建方法及应用”，属于生物技术领域。本发明将如SEQ ID NO1所示的序列作为正、反义链建立了水稻条纹病毒RNA干涉载体pMCG161+/-D和pCMBIA1301+/-D。本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用，为转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入水稻中，成功获得了抗病毒植株，实现了利用RNA干扰原理获得兼抗RSV和RBSDV水稻新材料的预期目标，为RNA干扰介导的植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA干扰介导的RSV和RBSDV抗性在本领域研究中的空缺。

Description

RSV和RBSDV的RNA干涉载体、构建方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种适合单子叶植物遗传转化、兼抗两种病毒病的RNA干涉载体的构建及其在水稻上应用。更进一步涉及到水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白(CP)基因和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)S10部分核苷酸序列的表达载体，及其遗传转化禾本科植物水稻并获得抗性植株的方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国水稻占粮食生产和消费的40％，其在粮食安全和国民经济中占有举足轻重的作用。由水稻条纹病毒(Rice stripe virus，RSV)引起水稻条纹叶枯病是我国粳稻种植区最重要的水稻病毒病害。流行年份，一般田块减产20％～30％，严重田块达到80％以上，甚至颗粒无收。该病在江苏、安徽、河南和山东等地，曾于2001、2004、2005、2006、2007年连续爆发成灾。2004年在江苏、河南等病田率达75％以上，部分病重田的病穴率达90％以上；2005年，仅江苏省发病面积就达2800万亩，给当地水稻生产造成巨大损失。2006～2009年华北和东北稻区也呈现扩大趋势，据农业部有关部门估计2008年发病面积可达2800～3000万亩，2009年发病面积可达与2008年持平，2010年仍将为偏重发生年份(www.agri.gov.cn)。

自2000年以来，在江苏、浙江、福建、江西等稻区，由水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)引起的稻黑条矮缩病沉寂多年后再度爆发流行，流行地区约60％的稻田发病，一般田块株发病率10～30％，严重田块可高达40～80％以上。2004年，在浙江省中南部杂交稻种植区发病面积80万亩，仅台州市发病面积就达48万亩，占水稻播种面积的33％，损失产量2万余吨。2006～2007年在江苏桐城、盐城、泰州等地区的华粳6号、淮稻5号、II优084等水稻品种上，病株率一般在20-30％，严重的在80％左右，有的重病田病株率甚至高达90％以上，目前已扩展到湖南、山东等地，因此该病已成为威胁我国水稻生产的又一重要的病毒病。

这两种病毒还可以侵染我国的主要粮食作物玉米和小麦，由水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)引起的玉米粗缩病是威胁玉米生产的重要病毒病害。

流行学研究结果表明这些病害暴发、流行的主要原因是品种抗性的丧失和有效传毒介体种群数量的上升。由于抗病品种在品质上的不足，导致感病品种的大面积种植，加之灰飞虱传毒的瞬时性和持久性、病毒病防治药剂缺乏，使得防虫治病十分困难，农药的使用也存在许多弊病，因此最为经济有效的途径是利用品种自身的抗性达到主动防治病毒病害目的。然而传统的育种方法由于缺乏理想的抗源(国内尚未发现抗黑条矮缩病毒的种质资源)，抗病基因又多与劣质基因相伴随，获得抗病、高产优质的双重特性品种的难度很大。

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是指通过双链RNA的介导的特异性的降解对应序列的mRNA，从而特异性地抑制相应基因的表达，是植物对外来入侵者的一种重要的防御机制。本实验室对RSV田间分离物外壳蛋白(CP)的研究表明，我国北方粳稻产区所发生的RSV CP基因非常保守，同源性达96.7～100％，有利于siRNA的识别。本发明以近年在我国北方地区严重发生的水稻条纹病毒(RSV)和黑条矮缩病毒(RBSDV)为对象，利用植物转基因工程技术将RSV CP和RBSDV S10的部分核苷酸导入水稻，通过其特异地干扰、降解或沉默RSV和RBSDV病毒基因在水稻植株内的正常复制、积累和传播，筛选获得分别或同时抗RSV、RBSDV的水稻品系，为进一步结合常规育种工作，改良现有的优质高产但不抗病的水稻品种，以便实现利用转基因技术获得免疫或高抗RSV和RBSDV的水稻新品系的目的。

发明内容

基于上述目的，本发明提供了可用于农杆菌和基因枪遗传转化单子叶植物的2种含有水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)基因的RNA干涉(RNAi)载体，这些载体分别包含致病病毒RSV的CP基因部分核苷酸序列(RSV-HCP)和致病病毒RBSDV的S10部分片段(RBSDV-HS10)。

本发明还提供这些干涉病毒基因表达载体的构建方法及应用，为植物抗病育种工程提供了一种新的策略和思路。

RSV和RBSDV的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列为正、反义链，所述串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列如SEQ ID NO1。

所述骨架载体为pMCG161载体。

所述正义链插入在酶切位点AscI和AvrII间，反义链插入在酶切位点SpeI和SacI之间，命名为pMCG161+/-D，其结构如图6A所示。

所述骨架载体为去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301载体。

所述发夹结构为干涉载体pMCG161+/-D经BamHI、HindIII酶切得到的，命名为pCMBIA1301+/-D，其结构如图6B所示。

pMCG161+/-D干涉载体的构建方法，步骤如下：

(1)得到如序列SEQ ID NO1所示的串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸片段；(2)将步骤(1)的基因部分片断经AscI、AvrII双酶切后，与同样经AscI、AvrII酶切的载体pMCG161连接，得到插入正向目的片段的重组质粒pMCG161+D；再将步骤(1)的基因部分片断经SpeI、SacI双酶切，与经SpeI、SacI酶切的载体pMCG161+D连接，即可得到插入正反义链的RNA干涉载体pMCG161+/-D。

所述步骤(1)采用如下步骤方式：(1)以感染水稻条纹病毒RSV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到PCR产物I，

SEQ ID NO2：5’-AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ ID NO3：5’-AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3’；

(2)以感染水稻黑条矮缩病毒RBSDV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到PCR产物II，

SEQ ID NO4：5’-CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，

SEQ ID NO5：5’-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’；

(3)以PCR产物I和II的1∶1混合物为模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO5为引物对，经PCR扩增得到PCR产物III，

SEQ ID NO2：5’-AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ ID NO5：5’-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。

(4)以PCR产物III为模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO5为引物对，经PCR扩增得到串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸片段。

pCMBIA1301+/-D干涉载体的构建方法，步骤如下：(1)用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体，得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-；(2)将pMCG161+/-D用BamHI、HindIII酶切，得到的发夹结构连入pCMBIA1301-hpt^-，得到无标记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-D。

所述干涉载体在转基因植物中的应用。

所述应用为将上述干涉载体转化有关受体植物，使之对水稻条纹病毒和黑条矮缩病毒同时产生抗性。

所述干涉载体为pMCG161+/-D，所述转化的方法为基因枪法。

所述干涉载体为pCMBIA1301+/-D，所述转化的方法为农杆菌介导法。

所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。

所述受体植物为禾本科植物。

所述禾本科植物为水稻。

所述水稻品种为爱知旭(Oryza sativa cv.Aichiasahi)或皖粳97(Wanjing 97)。

根据已公开的RSV CP基因和RBSDV S10设计了重叠引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，以感染水稻条纹病毒RSV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO2(上游引物)和SEQ ID NO3(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增得到RSV-CP基因部分片段，即为RSV-HCP，以感染水稻黑条矮缩病毒RBSDV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO4(上游引物)和SEQ ID NO5(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增得到RBSDV-S10基因部分片段即RBSDV-HS10，以上述两个扩增产物1∶1混合作为模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO4为引物对，PCR扩增得到PCR产物III；以PCR产物III为模板，以SEQ ID NO2和SEQ ID NO5为引物对扩增得到串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10目的片段，将其作为正义链和反义链插入骨架载体中得到本发明的干涉载体。将本发明的干涉载体转入受体植物中，将使RSV和RBSDV发生基因沉默而不表达，从而使该受体植物产生RSV和RBSDV的抗性。

RNA干涉载体pMCG161+/-D，适合于基因枪转化单子叶植物，可获得兼抗RSV和RBSDV的转基因后代，该载体携带有氯霉素抗性基因和除草剂筛选标记基因。采用的骨架载体是双向表达载体pMCG161，将串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10片段的正义链插入在酶切位点AscI和AvrII间，将负义链插入在酶切位点SpeI和SacI之间，通过载体上的intro(rice Waxy-a intron 1)形成发夹结构，这样可用于基因枪转化单子叶植物。

本发明将用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体，得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-；然后将pMCG161+/-D干涉载体用BamHI、HindIII酶切，得到的发夹结构连入pCMBIA1301-hpt^-，得到无标记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-D。由于该干涉载体不仅适合于超毒力菌株，且不含有抗生素基因，有利于将来转基因植物的安全释放。

最终构建的无标记基因RNA干涉载体pCMBIA1301+/-D不携带抗生素或除草剂抗性基因，适合农杆菌介导的单子叶植物遗传转化，可获得兼抗RSV和RBSDV的转基因后代；与携带潮霉素和卡那霉素抗性的抗性基因的pCMBIA1301的空白载体经农杆菌EHA105介导进行单子叶植物的遗传转化对比，这样即可方便抗性愈伤组织的筛选，又可通过后代分离，方便得到无标记基因的转基因再生植株，减少转基因植物带来的生物安全性隐患。

根瘤农杆菌介导的植物遗传转化方法是目前应用最为广泛的转化方法之一，已成功的应用于单、双子叶植物的转基因研究中。本发明最终构建的干涉载体pCMBIA1301+/-D适合超毒力菌株EHA105等农杆菌介导的植物遗传转化。利用根瘤农杆菌EHA105将其导入水稻，所得到的转基因植株可以使入侵的致病病毒发生RNA沉默现象，使病毒不能繁殖或积累，从而使植物具备对病毒的抗病性。

本发明利用根癌农杆菌介导的转化的方法进行水稻的遗传转化，借助水稻细胞RdRp的转录作用，产生RSV部分CP基因、RBSDV的S10部分片段的dsRNA的形式，再由DicerIII的作用产生SiRNA，当水稻受RSV和RBSDV侵染时，就可产生SiRNA，从而达到利用RNA干扰介导对RSV和RBSDV抗性，最终筛选出免疫或高抗RSV和RBSDV的转基因水稻植株。

本发明已得到以水稻模式品种爱知旭为受体的水稻T0代再生植株，转化载体pCMBIA1301+/-D的植株是267株，在病毒病重发区河南郑州经田间抗病性筛选评价。其中转化双价载体的24株未表现症状(0级)，97株表现轻微症状(I级)，109株表现中等症状(II级)，37株严重症状(III)。经PCR检测，未表现症状的24株中19株扩增到目的基因，表现轻微症状的97株中有38株有阳性条带，同时受体爱知旭发病严重，全部为II或III级，发病株率为100％，这说明转基因水稻植株较受体有明显的抗病性。

本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用，为转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入水稻中，成功获得了抗病毒植株，实现了利用RNA干扰原理获得抗RSV和RBSDV水稻新材料的预期目标，为RNA干扰介导的植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA干扰介导的RSV和RBSDV抗性在本领域研究中的空缺。

利用本发明的干扰载体转化所得的抗性生物体可以是任何微生物、植物或其组织、细胞，以及由此所获得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代。

转化单子叶植物的RNA干涉载体的构建方法，包括如下步骤：

1)串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列的获得

以感染水稻条纹病毒(RSV)水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.3(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增RSV-HCP，得到PCR产物III，目的片段约为250bp。回收PCR产物I，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α(购自北京全式金公司)得到阳性质粒pMD18-T-HCP，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于下述试验。所述SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的序列如下：

SEQ ID NO2：5’-AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ ID NO 3：5’-AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3’

以感染水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.4(上游引物) 和SEQ ID NO.5(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增RBSDV-HS10，得到PCR产物II，目的片段约为290bp。回收PCR产物II，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α(购自北京全式金公司)得到阳性质粒pMD18-T-HS10，进行序列验证，测序正确目的片段即可用于下述试验。所述SEQ IDNO.4和SEQ IDNO.5序列如下：

SEQ ID NO4：5’-CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，

SEQ ID NO5：5’-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’

以PCR产物I和II的混合物(1∶1)为模板，以SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.5(下游引物)为引物对，经重叠PCR扩增得到PCR产物III，目的片段约为540bp。回收PCR产物III。

再以PCR产物III为模板，以SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.5(下游引物)为引物对，经PCR扩增得到PCR产物IV，此即为串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10-双价目的片段，大小为537bp。回收PCR产物IV，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α，得到阳性质粒pMD18-T-HCP/HS10，进行序列验证。测序正确的目的片段即可用于双价RNA干涉载体的构建。

2)病毒RNA干涉载体(中间载体)的构建

将PCR产物IV分别经AscI、AvrII双酶切后，分别与同样经AscI、AvrII酶切的载体pMCG161连接，分别得到插入正向目的片段的重组质粒-pMCG161+D。同样将PCR产物IV分别经SpeI、SacI双酶切，分别与经SpeI、SacI酶切的载体pMCG161+D连接，即可得到插入正反义链的RNA干涉载体pMCG161+/-D，经PCR扩增检测、核苷酸序列分析，目的片段序列正确的干涉载体可用于基因枪转化单子叶植物，获得兼抗RSV、RBSDV两种病毒的转基因植株。这些干涉载体携带有氯霉素抗性基因和除草剂筛选标记基因。

由于pMCG161载体带有氯霉素抗性基因，而农杆菌EHA105抗氯霉素，因此上述构建的适合基因枪转化水稻的干涉载体不能直接用于农杆菌介导的水稻遗传转化。而pCAMBIA1301载体是农杆菌法转化水稻的常用载体，具有潮霉素抗性和卡那霉素抗性。

3)无标记基因载体pCMBIA1301-hpt^-的获得

用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体，经电泳检测、回收、纯化大片段后，再经T4DNA连接酶16℃连接过夜，即可得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-。

4)无标记载体基因病毒RNA干涉载体的构建

将上述中间载体pMCG161+/-D和pCMBIA1301-hpt^-用BamHI、HindIII酶切，回收大片段，在T4DNA连接酶作用下(16℃连接过夜)，将中间载体上的发夹结构连入 pCMBIA1301-hpt^-，得到无标记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-D。经PCR检测、序列分析正确的干涉载体即可用于农杆菌介导的单子叶植物遗传转化，获得不含有标记基因的兼抗RSV、RBSDV两种病毒的转基因再生植株。

附图说明

图1.PCR扩增获得串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10的结果(PCR产物III)；泳道1.DL2000，2-5.PCR产物I和II的混合物(1∶1)，6.空白对照

图2.串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10的PCR扩增产物(IV)；泳道1.DL2000，2.空白对照，3-5.PCR产物III

图3.连入病毒正义链重组质粒pMCG161+D的PCR鉴定结果

图4.连入正负义链重组质粒pMCG161+/-D的鉴定结果

图5.无标记基因载体pCMBIA1301-hpt^-的PCR检测结果泳道1.DL2000，2.空白对照，3-15.pCMBIA1301-hpt^-

图6.重组质粒pCMBIA1301+/-D的PCR鉴定结果泳道1.DL2000，2.空白对照，3.空白质粒pCMBIA1301，4-8.重组质粒

图7.pMCG161+/-D干涉载体图谱

图8pCMBIA1301+/-D干涉载体图谱

图9.RSV-HCP/RBSDV-HS10重组农杆菌的PCR鉴定结果(泳道1.DL2000，2.空白对照，3.DH5α，4-10.重组质粒)

图10.水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

图11.水稻成熟胚愈伤组织的继代培养

图12.愈伤组织与农杆菌的共培养

图13.抗性愈伤组织的筛选

图14.抗性愈伤组织的分化

图15.分化小苗的壮苗培养

图16.T0转基因水稻幼苗

图17.T0代转基因再生植株的PCR鉴定

图18T0代转基因爱知旭植株和对照在大田的抗病性表现

具体实施方式

实验中所用的pMD18-T购自大连宝生物公司(Takara公司)，感受态细胞DH5α购自北京全式金公司。

实验中使用的载体pMCG161保存在中国农业科学院植物保护研究所植物病毒实验室(可向公众发放)，是专门适用于禾本科植物转化的RNA干扰载体，它含有来源于水稻的Rice waxy-a intron 1，位于5442bp-6576bp，在它的上游含有AscI和AvrII两个酶切位点，用来连接目的基因的正向片段，在它的下游含有SpeI和SacI位点，可用来连接目的基因的反向片段，最终获得双链发夹结构。

载体pCMBIA1301是农杆菌介导法转化水稻的常用载体(该载体保存在中国农业科学院植物保护研究所病毒组实验室内，可向公众发放)，具有潮霉素抗性和卡那霉素抗性。

经本实验室改造的pCMBIA1301-hpt^-也可向公众发放，通过单酶切位点BamHI和HindIII可以将来自中间载体pMCG161+/-D上的目的基因的发夹结构插入其中，获得无标记基因、且适合农杆菌介导的单子叶植物遗传的RNA干涉载体。

实施例1、兼抗RSV、RBSDV的双价无标记基因RNA干扰载体的构建

步骤1：设计RSV-HCP和RBSDV-HS10的重叠引物

根据已经公布的RSV CP基因和RBSDV S10的核苷酸序列，设计重叠PCR引物SEQ IDNO 3和SEQ ID NO 4。

SEQ ID NO 3：5’-AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3’

SEQ ID NO 4：5’-CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3’

步骤2：串联RSV和RBSDV特异性核苷酸序列的获得

以采集自江苏南京的感染水稻条纹病毒(RSV)水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.3(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增RSV-HCP，得到PCR产物I，目的片段约为250bp。回收PCR产物I，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α得到阳性质粒pMD18-T-HCP，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于串联片段的扩增。

以采集自山东济宁的感染水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.4(上游引物)和SEQ ID NO.5(下游引物)为引物对，经RT-PCR扩增RBSDV-HS10，得到PCR产物II，目的片段约为290bp。回收PCR产物II，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α(购自北京全式金公司)得到阳性质粒pMD18-T-HS10，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干涉载体的构建。

以PCR产物I和II的混合物(1∶1)为模板，以SEQ ID NO.2(上游引物)和SEQ ID NO.5(下游引物)为引物对，经PCR扩增得到PCR产物III，目的片段为538bp(图1)。回收PCR产物III。

再以PCR产物III为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5为引物对，经PCR扩增得到PCR产物IV，此即为串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10-双价目的片段，大小为538bp。回收PCR产物IV(图2)，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH 5α，得到阳性质粒pMD18-T-HCP/HS10，进行序列验证。测序正确的目的片段即可串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列，可用于双价RNA干涉载体的构建。

步骤3、干涉载体pMCG161+/-D的获得

将PCR产物IV和载体pMCG161分别经AscI、AvrII双酶切后，65℃处理20min，使内切酶失活，在T4DNA Ligase作用下连接，将正向目的片段插入载体pMCG161，转化大肠杆菌DH 5α，经PCR鉴定(图3)、序列分析正确的重组质粒就是含有串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10的正向片段的重组质粒，命名为pMCG161+D。

同样将PCR产物IV经SpeI、SacI双酶切，与经SpeI、SacI酶切的载体pMCG161+D在T4DNA Ligase作用下连接，即可得到插入串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10正反向片段的RNA干涉载体pMCG161+/-D，PCR检测结果见图4，载体图谱见图7。该干涉载体可用于基因枪转化单子叶植物，获得兼抗RSV和RBSDV的转基因植株，也可以用做构建无标记RNA干涉载体的中间载体。该干涉载体携带有氯霉素抗性基因和除草剂筛选标记基因。

步骤4、无标记基因载体pCMBIA1301-hpt^-的获得

用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体，经大片段柱回收、纯化后，再经T4DNA连接酶16℃连接过夜，即可得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-。通过PCR检测潮霉素标记基因的载体扩增的目的片段为189bp，含有掉潮霉素标记基因的载体扩增的目的片段约为1200bp(图5)。

步骤5、干涉载体pCMBIA1301+/-D的获得

将干涉载体pMCG161+/-D经BamHI、HindIII酶切后，回收得到约7.5Kb的目的片段，在T4DNA Ligase作用下(16℃连接过夜)，将其连入pCMBIA1301-hpt^-载体，经PCR检测(图6)、序列分析正确的载体即为无标记基因的串联的RSV-HCP和RBSDV-HS10的RNA干涉载体，命名为pCMBIA1301+/-D(其图谱见图8)，该载体可用于农杆菌介导的单子叶植物遗传转化，分别获得不含有标记基因的兼抗RSV和RBSDV的转基因再生植株。

至此本发明得到了适合单子叶转化的2种RNA干涉载体，其中一种适合基因枪的遗传转化的中间载体，另一种为适合农杆菌介导法转化的最终载体。所构建的2种干涉载体中，正向片段和反向片段间有约为1100bp的水稻内含子片段，有利于维持发夹结构的形成。最终构建的一种RNA干涉载体不含有抗除草剂基因，减少了将来转基因植物存在生物安全性的隐患。

利用pMCG161载体和pCAMBIA1301载体所构建的上述2种载体可分别用于基因枪和农杆菌介导的水稻转化。

实施例2、病毒RNA干涉载体电击转化根癌农杆菌EHA105

由于重组质粒pCMBIA1301+/-D向农杆菌EHA105进行热击转化的效率很低，本发明采取了电击转化的方法，获得了含有目的基因的重组农杆菌。具体步骤如下：

步骤1、将1μg质粒(pCMBIA1301+/-D)与150μl农杆菌EHA105感受态混匀，加入到灭菌后的电击杯中，于2.5KV电压下进行电击转化。

步骤2、然后加800μl液体培养基冲洗电击杯并转入EP管，28℃，220rpm摇培2h。

步骤3、再取100～200μl培养液涂YM(Kana：50μg/ml；利福平50μg/ml)平板，28℃培养约18小时。

步骤4、经挑取单菌落于5ml YM液体培养基(Kana：50μg/ml；利福平50μg/ml)，28℃，220rpm，摇培16-24h即可。

步骤5、重组农杆菌的PCR鉴定

菌落PCR鉴定结果(见图9)表明，阳性转化子和载体质粒为模板的阳性对照扩增到约540bp左右的条带；以未转化的空的EHA105菌液为模板的阴性对照未得到目的片段。

实施例3、病毒基因干扰病毒基因表达载体的应用。

应用上述含有目的结构的重组农杆菌转化有关受体植物-爱知旭水稻品种，使之产生对水稻病毒病的抗性(图10-16)。

本发明已得到以水稻模式品种爱知旭为受体的水稻T0代再生植株，其中转化双价载体pCMBIA1301+/-D的植株267棵，并在病毒病重发区河南郑州经田间抗病性筛选评价(图18)。

实施例4、转基因植株(T0代)的PCR鉴定

本发明以SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.5为引物对，对以爱知旭为受体的转RSV-HCP和RBSDV-HS10双价干涉载体的再生水稻植株T0代267株进行PCR检测，结果表明，结果表明51株扩增到目约540bp的目的条带(图17)，阳性为19％，说明目的基因整合进了水稻的基因组。

实施例5、转基因植株对水稻条纹病毒和水稻矮缩病毒的抗性测定

本发明将转基因苗移栽到病毒病的重发区的条件，通过自然发病进行了抗病性筛选，移栽30-35天的调查结果表明：转化载体pCMBIA1301+/-D的植株267棵中，24株未表现症状(0 级)，97株表现轻微症状(I级)，109株表现中等症状(II级)，37株严重症状(III)。但受体爱知旭发病严重，全部为II或III级，发病株率为100％，这说明转基因水稻植株较受体有明显的抗病性(图19)。

与PCR检测结果对比得知，未表现症状的24株中有19株扩增到目的基因，表现轻微症状的97株中有32株有阳性条带。

虽然本发明只采用了pCMBIA1301+/-D转化了水稻，但本领域的普通技术人员根据常规知识可以得知，采用基因枪法同样可以将pMCG161+/-D转化其它受体植株，得到相同的效果。

Claims

1.RSV和RBSDV的RNA干涉载体，包括骨架载体和含有正、反义链的发夹结构，其特征在于：以串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列为正、反义链，所述串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述骨架载体为pMCG161载体。

3.根据权利要求2所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述正义链插入在酶切位点AscI和AvrII间，反义链插入在酶切位点SpeI和SacI之间。

4.根据权利要求1所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述骨架载体为去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301载体。

5.根据权利要求4所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述发夹结构为权利要求3的干涉载体经BamHI、HindIII酶切得到。

6.权利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体的构建方法，步骤如下：

(1)得到如序列SEQ ID NO.1所示的串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸片段；(2)将步骤(1)的基因部分片断经AscI、AvrII双酶切后，与同样经AscI、AvrII酶切的载体pMCG161连接，得到插入正向目的片段的重组质粒pMCG161+D；再将步骤(1)的基因部分片断经SpeI、SacI双酶切，与经SpeI、SacI酶切的载体pMCG161+D连接，即可得到插入正反义链的RNA干涉载体pMCG161+/-D。

7.根据权利要求6所述的构建方法，所述步骤(1)采用如下步骤方式：(1)以感染水稻条纹病毒RSV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到PCR产物I，

SEQ ID NO.2：5’-AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ ID NO.3：5’-AGTCTTATGTCAGCCATTAACAGCCATCTTAACACCAG-3’；

(2)以感染水稻黑条矮缩病毒RBSDV水稻总RNA为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示序列为引物对，经RT-PCR扩增得到PCR产物II，

SEQ ID NO.4：5’-CTGGTGTTA AGATGGCTGTTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，

SEQ ID NO.5：5’-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’；

(3)以PCR产物I和II的1∶1混合物为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5为引物对，经PCR扩增得到PCR产物III，

SEQ ID NO.2：5’-AGACTAGT GGCGCGCCGACTATGTGCATCACCATGAG-3’，

SEQ ID NO.5：5’-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。

(4)以PCR产物III为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5为引物对，经PCR扩增得到串联的RSV和RBSDV特异性核苷酸片段。

8.权利要求5所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体的构建方法，步骤如下：(1)用限制性内切酶Xho I酶切pCMBIA1301载体，得到去除潮霉素标记基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-；(2)将权利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体用BamHI、HindIII酶切，得到的发夹结构连入pCMBIA1301-hpt^-，得到无标记基因的RNA干涉载体pCMBIA1301+/-D。

9.权利要求1-5任一所述的干涉载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物为禾本科植物。

10.根据权利要求9所述的应用，为将权利要求1-5任一所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体转化有关受体植物，使之对水稻条纹病毒和黑条矮缩病毒同时产生抗性，所述受体植物为禾本科植物。

11.根据权利要求10所述的应用，所述干涉载体为权利要求3所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述转化的方法为基因枪法。

12.根据权利要求10所述的应用，所述干涉载体为权利要求5所述的RSV和RBSDV的RNA干涉载体，所述转化的方法为农杆菌介导法。

13.根据权利要求12所述的应用，所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。

14.根据权利要求10所述的应用，所述禾本科植物为水稻。

15.根据权利要求14所述的应用，所述水稻品种为爱知旭或皖粳97。